Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Определение общего количества липидов и классов липидов в морских образцах

Published: December 11, 2021 doi: 10.3791/62315
Automatic Translation
1, 1
1Department of Ocean Sciences and CREAIT Network, Memorial University of Newfoundland

Summary

Этот протокол предназначен для определения липидов в морской воде и биологических образцах. Липиды в фильтратах экстрагируют хлороформом или смесями хлороформа и метанола в случае твердых веществ. Классы липидов измеряются палочковой тонкослойной хроматографией с обнаружением ионизации пламени и их сумма дает общее содержание липидов.

Abstract

Липиды в значительной степени состоят из углерода и водорода и, следовательно, обеспечивают большую специфическую энергию, чем другие органические макромолекулы в море. Будучи богатыми углеродом и водородом, они также являются гидрофобными и могут выступать в качестве растворителя и абсорбционного носителя органических загрязнителей и, таким образом, могут быть факторами биоаккумуляции загрязнителей в морских экосистемах. Их гидрофобная природа облегчает их изоляцию от морской воды или биологических образцов: анализ морских липидов начинается с отбора проб, а затем экстракции в неполярных органических растворителях, обеспечивая удобный метод их отделения от других веществ в водной матрице.

Если морская вода была отобрана, первый этап обычно включает разделение на функционально определенные «растворенные» и «твердые» фракции путем фильтрации. Образцы собирают и выделяют липиды из матрицы образца, как правило, хлороформом для действительно растворенных веществ и коллоидов, а также смесями хлороформа и метанола для твердых веществ и биологических образцов. Такие экстракты могут содержать несколько классов из биогенных и антропогенных источников. В это время могут быть определены общие липиды и классы липидов. Общий липид может быть измерен путем суммирования индивидуально определенных классов липидов, которые обычно были хроматографически разделены. Тонкослойная хроматография (TLC) с обнаружением пламенной ионизации (FID) регулярно используется для количественного анализа липидов из морских образцов. TLC-FID предоставляет синоптиальную информацию о классе липидов и, путем суммирования классов, общее измерение липидов.

Информация о классе липидов особенно полезна в сочетании с измерениями отдельных компонентов, например, жирных кислот и/или стерилов, после их высвобождения из липидных экстрактов. Широкое разнообразие липидных структур и функций означает, что они широко используются в экологических и биогеохимических исследованиях, оценивающих здоровье экосистем и степень влияния антропогенных воздействий. Они использовались для измерения веществ, имеющих пищевую ценность для морской фауны (например, аквакормы и/или добыча), а также в качестве показателя качества воды (например, углеводороды).

Introduction

Методы, описанные здесь, относятся к веществам, которые функционально определяются как морские липиды. Это определение основано на их поддающейся жидкостно-жидкостной экстракции в неполярных органических растворителях, и обеспечивает удобный способ их отделения от других веществ в водной матрице. Их гидрофобная природа облегчает их изоляцию от морской воды или биологических образцов, а также их обогащение и удаление солей и белков.

Измерение содержания липидов и их состава в морских организмах на протяжении десятилетий представляет большой интерес для экологии пищевой сети, питания аквакультуры и пищевой науки. Липиды являются универсальными компонентами в живых организмах, действуя как необходимые молекулы в клеточных мембранах, как основные источники биодоступной энергии, обеспечивая теплоизоляцию и плавучесть и служа сигнальными молекулами. Хотя процедуры определения липидов в других областях были хорошо описаны, их использование с морскими образцами обычно требует модификации для адаптации к полевым условиям, а также к образцу типа1.

Для проб морской воды на первом этапе обычно требуется разделение на функционально определенные фракции "растворенные" и "твердые частицы", как правило, путем фильтрации (этап 1 Протокола). Фракция твердых частиц - это то, что удерживается фильтром, и размер пор важен для определения отсечки2. Часто, когда мы отбираем пробы твердых частиц, мы хотели бы соотнести концентрации липидов с общими массовыми концентрациями, и в этом случае для этой цели необходимо взять отдельную, меньшую пробу (например, 10 мл) (этап 1 Протокола, примечание). Для получения точного определения массы важно добавить в конце фильтрации аммианий -формат (35 г/л).

Фильтрат морской воды из более крупного образца должен составлять от 250 мл до 1 л в зависимости от типа образца и подвергается жидкостно-жидкой экстракции в сепараторной воронке (этап протокола 2). Гидрофобная природа липидов означает, что они могут быть отделены от других соединений путем экстракции в неполярном растворителе, таком как хлороформ. Создается двухслойная система, в которой липиды делятся на органический слой, в то время как водорастворимые компоненты остаются в водном слое.

Образцы твердых частиц на фильтре или биологические образцы экстрагируют модифицированным экстракцией Folch et al.3,также включающей хлороформ (этап 3 Протокола). Опять же, создается органическая/водная система, в которой липиды делятся на органическую фазу, в то время как водорастворимые молекулы остаются в водной фазе, а белки осаждаются. Фактически, для твердых веществ большинство лабораторий используют некоторые вариации процедуры экстракции Folch et al.3 с участием хлороформа и метанола. Для фильтров первым шагом является гомогенизация в 2 мл хлороформа и 1 мл метанола.

Во время экстракции следует проявлять осторожность для защиты липидов от химической или ферментативной модификации, сохраняя образцы и растворители на льду для уменьшения гидролиза эфирной связи или окисления углеродно-углеродной двойной связи. Ткани и клеточные липиды довольно хорошо защищены природными антиоксидантами и компартментализацией4; однако после гомогенизации образцов клеточное содержимое объединяется, что делает липиды более склонными к изменению, химически или ферментационно. Некоторые липиды, такие как большинство стеринов, очень стабильны, в то время как другие, такие как те, которые содержат полиненасыщенные жирные кислоты, более восприимчивы к химическому окислению. Другие, такие как стерины с сопряженными двойными связями, склонны к окислению, катализируемого светом5. После экстракции липиды гораздо более восприимчивы к химическому окислению, и образцы должны храниться под инертным газом, таким как азот. Мягкий поток азота также будет использоваться для концентрирования экстрактов.

После концентрации липиды обычно количественно определяются массой, поскольку они являются важным компонентом морских экосистем, обеспечивающим высокую концентрацию энергии, более чем в два раза превышающую кДж/г углеводов и белков. Затем они неизменно будут количественно оцениваться как отдельные компоненты: всесторонний анализ липидов обычно включает разделение на более простые категории в соответствии с их химической природой. Таким образом, полный анализ включает в себя измерение общего количества липидов, классов липидов и отдельных соединений.

Общий липид можно определить, взяв сумму индивидуально измеренных классов липидов, разделенных хроматографией6. Морской липидный экстракт может содержать более десятка классов из биогенных и антропогенных источников. Большое разнообразие липидных структур означает, что большая часть информации может быть получена путем определения отдельных групп структур. Классы липидов по отдельности или в определенных группах использовались для сигнализации присутствия определенных типов организмов, а также их физиологического статуса и активности2. Они также использовались в качестве индикатора происхождения органического материала, включая растворенные органические вещества (DOM), а также гидрофобные загрязнители.

Триацилглицерины, фосфолипиды и стерины являются одними из наиболее важных биогенных классов липидов. Первые два биохимически связаны, поскольку они обладают глицериновой основой, в которую этерифицированы две или три жирные кислоты(рисунок 1). Триацилглицеролы вместе с эфирами воска являются очень важными веществами для хранения, в то время как другие жирокислотсодержащие липидные классы, такие как диацилглицеролы, свободные жирные кислоты и моноацилглицеролы, как правило, являются второстепенными компонентами. Свободные жирные кислоты присутствуют в более низких концентрациях в живых организмах, так как ненасыщенные могут быть токсичными7. Стерины (как в свободной, так и в этерифицированной формах) и жирные спирты также включены в число менее полярных липидов, в то время как гликолипиды и фосфолипиды являются полярными липидами. Полярные липиды имеют гидрофильной группу, которая позволяет формировать липидные бислои, обнаруженные в клеточных мембранах. Свободные стерины также являются мембранными структурными компонентами, и при приеме в соотношении с триацилглицеролами они обеспечивают состояние или питательный индекс (TAG: ST), который широко использовался8. При приеме в соотношении к фосфолипидам (ST: PL) их можно использовать для указания чувствительности растений к соли: более высокие значения сохраняют структурную целостность и снижают проницаемостьмембраны 9. Обратное это соотношение (PL: ST) было изучено в тканях двустворчатых моллюсков во время температурной адаптации10.

Морские липидные классы могут быть разделены с помощью тонкослойной хроматографии (TLC) на стержнях, покрытых силикагелем (этап протокола 4), а затем обнаружены и количественно определены с помощью обнаружения пламенной ионизации (FID) в автоматическом сканере FID. TLC/FID стал обычно использоваться для морских образцов, поскольку он быстро предоставляет синоптические данные о классе липидов из небольших образцов и, беря сумму всех классов, значение для общего количества липидов. TLC/FID был подвергнут оценке обеспечения качества (QA) и было установлено, что он соответствует стандартам, необходимым для последовательной внешней калибровки, низких заготовок и точного анализа репликации11. Коэффициенты вариации (CV) или относительные стандартные отклонения составляют около 10%, а общие липидные данные сканера FID обычно составляют около 90% от тех, которые получены гравиметрическим и другими методами2. Гравиметрия дает более высокое общее количество липидов, вероятно, потому, что сканер FID измеряет только нелетучие соединения, а также в результате возможного включения нелипидного материала в гравиметрические измерения.

Информация, полученная при анализе класса липидов, особенно полезна в сочетании с определением жирных кислот как отдельных лиц, или стерилов, или двух в комбинации. Первый шаг к этим анализам включает высвобождение всех компонентов жирных кислот вместе со стеринами в липидных экстрактах (этап протокола 5). Широкое разнообразие липидных структур и функций означает, что они широко используются в экологических и биогеохимических исследованиях, оценивающих здоровье экосистем и степень, в которой на них влияют антропогенные и наземные ресурсы. Они использовались для измерения биосинтеза веществ, имеющих диетическое значение для морской фауны, а также для указания качества проб воды. Измерение липидов в образцах керна отложений помогает показать чувствительность отложений к изменениям в землепользовании человека вблизи края суши и моря.

Основным инструментом для идентификации и количественной оценки отдельных липидных соединений традиционно является газовая хроматография (ГХ) с FID. Однако перед анализом эти соединения делаются более летучими путем дериватизации. Жирные кислоты высвобождаются в присутствии кислотного катализатора(Н2SO4)из ациллипидных классов(фиг.1). В органической химии ацильная группа (R-C= O) обычно получается из карбоновой кислоты (R-COOH). Затем они повторно этерифицируются в метиловые эфиры жирных кислот (FAME), что дает лучшее разделение на колонках GC (этап протокола 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки стеклянной посуды, приборов и фильтров для анализа липидов промыть их 3 раза метанолом с последующим 3 промывками хлороформом или нагреть их до 450°C в течение не менее 8 часов.

1. Процедура фильтрации растворенных в морской воде и твердых частиц липидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретная интересуемая фракция функционально определяется процедурой фильтрации. В этом случае размер пор составляет 1,2 мкм.

  1. Установите фильтрационный коллектор без фильтра и промойте его фильтрообразующей морской водой.
  2. Используя чистые щипцы, поместите 47-миллиметровый фильтр из стекловолокна (GF / C), который был промыт, в чистую систему фильтрации.
  3. Возьмите образец и осторожно закрутите, чтобы повторно суспендировать любой материал, который, возможно, оседал на дне контейнера для сбора. Точно отмерьте известный объем, в данном случае 1 л, и отфильтруйте его через фильтр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем будет зависеть от количества твердых частиц в образце: обычно от 250 мл до 5 л в зависимости от сезона и местоположения.
  4. Когда образец будет отмеряться, осторожно смочите фильтр отфильтроированной морской водой. Медленно добавьте весь образец в систему фильтрации и промойте градуированный цилиндр отфильтроированной морской водой, чтобы убедиться, что все частицы добавлены в фильтр. Промойте установку фильтроированной морской водой по бокам, чтобы убедиться, что все частицы смываются на фильтр.
    1. Позвольте всей морской воде пройти через фильтр, но не позволяйте фильтру полностью высохнуть, так как это может нарушить работу ячеек на фильтре; прерывают всасывание, так как последняя вода исчезает.
  5. Используя чистые щипцы и чистую пипетку, сложите фильтр пополам, затем в трети, а затем пополам вдоль, чтобы свернуть фильтр в трубку. Поместите его в чистый, маркированный стеклянный флакон 10 мл.
  6. Накройте фильтр 2 мл хлороформа. Заполните пространство головки азотом и запечатайте лентой из PTFE. Поместите в стеллаж в морозильную камеру с -20 °C. Образцы будут стабильны при этой температуре до года.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для увязки концентраций липидов с общими массовыми концентрациями необходимо также провести измерение сухого веса. Это включает в себя помещение предварительно взвешенного фильтра диаметром 24 мм в установку фильтрации сухим весом, перемешивание образца и взятие небольшого подвыборки, который фильтруется на небольшой фильтр. Когда фильтр почти высох, в фильтр добавляют около 10 мл 3,5% 3,5% фориата аммония. Фильтр складывают пополам, возвращают в маркированную чашку Петри и помещают в морозильную камеру.

2. Жидкостно-жидкостная экстракция морской воды или жидких проб

  1. Подготовка образца
    1. Измерьте известный объем фильтрата в липидный чистый стеклянный градуированный цилиндр. Поместите этот образец в чистую сепараторную воронку 1 л. Затем добавьте 20 мл хлороформа в образец и встряхните в течение 2 минут, часто вентилируя.
  2. Удаление первого экстракта и добавление кислоты после первого разделения
    1. Оберните воронку в алюминиевую фольгу и подождите от 5 до 10 минут, пока произойдет разделение. Отклеить дно фольги, чтобы увидеть два слоя. Соберите нижний, органический слой через запорный кран в чистую колбу с круглым дном, стараясь не включать ни один из верхних слоев. Колбу с круглым дном заложить под азот и поместить в морозильную камеру.
    2. Добавьте 0,25 мл концентрированногоH2SO4 на каждый литр образца, к образцу в сепараторной воронке и осторожно встряхните воронку.
    3. Добавьте 10 мл хлороформа и энергично встряхните в течение 2 минут, часто вентилируя. Позвольте разделению состояться.
  3. Второе и третье разделение
    1. Дождитесь разделения и добавьте нижний слой в круглую колбу с дном.
    2. Добавьте треть 10 мл хлороформа и встряхните в течение 2 минут, снова часто вентилируя. После разделения добавьте нижний слой в колбу с круглым дном.
    3. Переложите экстракт из колбы с круглым дном во вращающийся испаритель, испарите и переложите во флакон 2 мл.

3. Протокол экстракции твердых веществ (модифицированная экстракция Folch et al.3)

  1. Настройка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки экстракции требуется изолированный контейнер, заполненный льдом. Растворители включают метанол, хлороформ, экстрагированную воду и хлороформ:метанол 2:1. Все растворители должны быть помещены на лед, чтобы они были холодными к моменту начала экстракции. Образцы также идут по льду, так что все остается холодным.
    1. Промыть все пробирки и выстренные ПТФЭ колпачки 3 раза метанолом, а затем 3 раза хлороформом. Для каждой экстракции необходима одна центрифужная трубка и один флакон объемом 15 мл с колпачком.
    2. Поместите образец в центрифужную пробирку, содержащую 2 мл хлороформа. Размер образца зависит от количества присутствующих липидов, примерно от 5 до 10 мг липидов предпочтительно.
  2. Измельчение и экстракция
    1. Добавьте приблизительно 1 мл холодного метанола и быстро измельчите образец в пульпе с помощью чистого гомогенизатора или ptfe/металлического стержня.
    2. Промыть стержень обратно в трубку примерно 1 мл ледяного хлороформа 2:1: метанола, а затем 1/2 мл ледяной хлороформ-экстрагированной воды. При необходимости используйте чистый набор щипцов, чтобы заставить частицы вернуться во флакон перед стиркой. Замаскировать трубку и обжарить смесь ультразвуком в течение 4 минут в ультразвуковой ванне (35 - 42 кГц).
  3. Двойная пипетка:центрифугирование образца в течение 2 мин при 1800 × г. Соберите весь органический слой (нижний слой) с помощью метода двойного пипетирования, в котором пипетка 5 3/4 " с неплотной колбой осторожно проталкивается через два слоя, одновременно сжимая луковицу, вызывая пузырьки.
    1. Когда дно второго слоя будет достигнуто, используйте большой палец, чтобы удалить колбу, не втягивая органический слой в пипетку. Поместите 9-дюймовую пипетку внутрь пипетки 5 3/4" и удалите нижний слой через пипетку 5 3/4".
    2. Поместите экстракт в чистый флакон. Продолжайте снимать нижний слой, пока он не будет полностью удален.
  4. Промывка пипеток:Промойте 9-дюймовую пипетку во флакон, содержащий органический слой, используя 1,5 мл ледяного хлороформа для промывки внешней стороны пипетки и 1,5 мл, чтобы промыть внутреннюю часть. Осторожно переверните эту пипетку во время стирки и убедитесь, что весь хлороформ стекает по пипетке во флакон.
    1. Промойте пипетку 5 3/4" в трубку, содержащую водный слой таким же образом.
  5. Соник и центрифугируют образцы и двойную пипетку при разделении, используя новые пипетки каждый раз. Повторите не менее трех раз и объедините все органические слои. После удаления органического слоя в третий раз вымойте обе пипетки во флакон, содержащий органический слой.
  6. Используя мягкий поток азота, сконцентрируйте до объема, затем запечатайте лентой из PTFE и храните в морозильной камере.

4. Разработка систем и ступеней для стержневого TLC разделения морских липидных классов

  1. Подготовка стержней к TLC
    1. Пустое сканирование стержней в автоматическом сканере FID три раза
    2. Обнаружение образца:Нанесите образцы и стандарты шприцем на стержни в месте или чуть ниже источника. Дозировать 0,5 мкл и прикоснуться каплей к стержню. Дайте высохнуть, прежде чем положить следующую каплю на то же место. Наймит все образцы в леску на стержнях.
    3. Фокусировка в ацетоне:Фокусировка образцов дважды (три раза, если образцы очень концентрированы) в 70 мл ацетона. Наблюдайте за передней частью растворителя, когда он поднимается на стержень, пока нижняя часть пятна не сольется с верхней. Удалите стержни, высушите их в течение примерно 5 с, затем повторите процедуру, чтобы получить узкую полосу липидного материала вблизи дна стержня.
    4. Высушите и кондиционирует стержни в камере постоянной влажности в течение 5 мин. Камера постоянной влажности представляет собой адсорбатор с насыщенным раствором хлорида кальция под пластиной.
  2. Последовательность, ведущая к первой хроматограмме (от углеводорода к кетону)
    1. Первая система разработки:Первая система разработки - гексан: диэтиловый эфир: муравьиная кислота, 98.95: 1: 0,05. Используйте шприц, чтобы добавить муравьиную кислоту, но сначала промойте шприц 3× муравьиной кислотой. Смойте муравьиную кислоту из шприца сразу после этого хлороформом. Используйте 30 мл смеси, чтобы намочить бумагу и промыть резервуар. Отбросьте раствор для полоскания и добавьте оставшиеся 70 мл в емкость.
      1. Возьмите стойки и осторожно опуская их в резервуар. Следите за тем, пока передняя часть растворителя не достигнет мест образца, затем запустите таймер. Через 25 мин вынимают стержни из камеры развития, сушат в камере постоянной влажности в течение 5 мин, и перестраивают в том же растворе еще на 20 мин.
    2. Высушите стержни в течение 5 минут в автоматическом сканере FID, а затем сканируйте до самой низкой точки за пиком кетонов с помощью сканирования PPS 25.
  3. Последовательность, ведущая ко второй хроматограмме (триацилглицерин к диацилглицерилу):
    1. Кондиционирует стержни в течение 5 мин в камере постоянной влажности.
    2. Вторая система разработки:Вторая система разработки - гексан: диэтиловый эфир: муравьиная кислота, 79: 20: 1. Добавьте ~30 мл в резервуар для разработки, чтобы намочить бумагу и промыть резервуар. Затем выбрасывают и развивают стержни в течение 40 мин в оставшихся 70 мл. Для наилучшего разделения между TAG (насыщенным) и TAG (полиненасыщенным) пиками используйте смесь 79,9:20:0,1, но для разделения пиков ST и DAG используйте смесь 79:20:1.
    3. Высушите и отсканируйте до самой низкой точки за пиком диацилглицерина во втором частичном сканировании с использованием PPS-сканирования 11.
  4. Последовательность, ведущая к третьей хроматограмме (ацетон-подвижный полярный липид и фосфолипид)
    1. Кондиционирует стержни в течение 5 минут в камере постоянной влажности.
    2. Развивайте палочки дважды в течение 15 минут в 70 мл ацетона. Между разработками воздухом высушивают стержни в течение примерно 30 секунд.
    3. Кондиционирует стержни в течение 5 минут в камере постоянной влажности.
    4. Третья система разработки:Третья система разработки представляет собой смесь хлороформа, метанола и хлороформ-экстрагированной воды, 50:40:10. Развивайте стержни дважды в течение 10 минут в 70 мл смеси. Между разработками воздух сушит стержни в течение примерно 30 секунд.
    5. Сушить и сканировать стержни по всей длине.

5. Дериватизация FAME с H2SO4 в MeOH

  1. Изготовление реагента Хильдича
    1. Приготовление метанола:Поместите 100 мл MeOH в чистую объемную колбу, а затем осторожно посыпьте безводным NaSO4 до тех пор, пока дно колбы не будет покрыто. После покрытия инвертируете дважды, чтобы любая вода в метаноле поглощалась NaSO4. После переворачивания и встряхивания дайте ему постоять не менее 5 минут.
    2. Добавление кислоты:Медленно декантирует метанол в стеклянную банку (к настоящему времени NaSO4 представляет собой твердый комок в нижней части колбы) и добавляется H2SO4. Медленно добавляйте 1,5 мл серной кислоты в метанол с помощью пипетки. Добавьте несколько капель за раз и, как только вся кислота будет добавлена, крышкой и аккуратно перемешайте, чтобы перемешать. Решение теперь готово к использованию для деривативов, но оно должно составляться еженедельно.
  2. Изготовление деривативов
    1. Переложите приблизительно 200 мкг липидов из флакона с экстрактом, объем которого был доведен до известного количества, в чистый флакон объемом 15 мл и испарите под азотом до сухости. Количество, удаленное, будет определяться концентрацией образца из TLC/FID. Используйте чистую пипетку для удаления образца.
    2. Когда образец высохнет, добавьте 1,5 мл дихлорметана и 3 мл вновь изготовленного реагента Хилдитча.
    3. Вихрь образца и обжаривают его ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 4 минут, чтобы удалить липиды, которые прилипли к стеклянному флакону. Наполните флакон азотом, крышкой, запечатайте лентой из PTFE и нагревайте при 100°C в течение 1 часа.
  3. Остановка реакции
    1. Дайте образцам полностью остыть до комнатной температуры в течение 10 минут после извлечения из духовки, затем тщательно откройте флаконы.
    2. Медленно добавляют примерно 0,5 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия (9 г/100 мл хлороформ-экстрагированной воды), затем 1,5 мл гексана. Встряхните или вихрь флакон, затем дайте постоять так, чтобы он разделился на 2 слоя.
  4. Сбор FAME
    1. Удаление верхнего слоя:После того, как дериватизация была остановлена, и есть четкое разделение, удалите верхнюю, органическую фазу и поместите в липидный чистый флакон 2 мл.
    2. Выпарить растворитель во флаконе объемом 2 мл до сухости и заправить его гексаном примерно до 0,5 мл.
    3. Заполните головное пространство флакона азотом, крышкой и запечатайте флакон лентой из PTFE, прозвуком еще 4 минуты повторно приостановите жирные кислоты, а затем он готов к отправке в ГК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуются концентрации жирных кислот, водный слой должен быть промыт три раза гексаном, а все органические слои объединены во флакон объемом 2 мл. Это включает в себя добавление 2 мл гексана, вихрь образца, центрифугирование и удаление органического слоя, все повторяется 3 раза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Будучи самым быстрорастущим сектором производства продуктов питания, аквакультура развивается с точки зрения технологических инноваций и адаптации к меняющимся требованиям. Одним из них является снижение зависимости от рыбной мяки диких источников и рыбьего жира, которые обеспечивают кормовые ингредиенты для многих видов аквакультуры. Наземные растительные масла исследуются в качестве устойчивых и экономичных заменителей рыбьего жира в аквакормах, а печень является целевой тканью для анализа, поскольку она является основным местом для метаболизма липидов12. На рисунке 2 показаны сырые хроматограммы TLC-FID, полученные из нашего стандарта из девяти компонентов, диета, которую мы разработали с рыбьим жиром в 7% и рапсовым маслом в 5%, и ткань печени атлантического лосося, получающего эту диету. В таблице 1 приведены данные, полученные после анализа диетических реплик и образцов из разных рыб. Эти данные были получены после построения стандартных кривых из fiD-ответов сканера для количественной оценки липидных классов в экстрактах с использованием программного обеспечения Peak Simple (версия 4.54). Данные показывают распространенность триацилглицеринов в рационе и печени, а также важность мембранных фосфолипидов в печени.

Континентальные окраины, как правило, отличаются очень высокой биологической продуктивностью, и они особенно важны в круговороте углерода. Поверхностная первичная продуктивность достигает морского дна в большей степени в более мелкой воде, и поэтому измерение количества и качества частиц, оседающих из верхнего смешанного слоя в бентическую пищевую сеть, представляет большой интерес. Будучи богатыми углеродом и имеющими очень высокое содержание энергии, липиды являются важными компонентами продуктивности континентальных шельфов. Исторически сложилось так, что воды, прилегающие к Ньюфаундленду и Лабрадору, поддерживали один из величайших рыбных промыслов в мире около пяти веков, и мы изучали производство и перенос липидов в этой системе13. На рисунке 3 показаны хроматограммы TLC-FID, полученные из нашего стандарта, липиды в оседающих твердых частицах, собранных на 220 м у побережья Ньюфаундленда, и липиды в небольшом мизиде, эритрофтальме Erythrops, собранном около той же глубины. На этот раз хроматограммы были обработаны с помощью программного обеспечения для построения графиков, и два частичных сканирования были объединены с окончательным полным сканированием. В таблице 2 показаны данные, полученные после анализа реплицированных образцов оседающего твердых частиц и мизида. Среди 19 таксонов из 5 типов малый мизид имел, в среднем, самую высокую концентрацию липидов (6% от живого веса)13.

Figure 1
Рисунок 1:Основные классы липидов в морских образцах в приблизительном порядке возрастающей полярности. Каждая структура рисуется с наиболее гидрофобной частью молекулы, указывающей справа от рисунка. Репрезентативными соединениями для липидных классов являются: - углеводородные: нонадекановые; эфир воска: гексадецилпальмитат; стериловый эфир: холестерилпальмитат; метиловый эфир: метилпалмитат; кетон: 3-гекскеканон; триацилглицерин: трипалмитин; свободные жирные кислоты: пальмитиновая кислота; алкоголь: фитол; стерины: холестерин; диацилглицерин: дипальмитоилглицерин; моноацилглицерин: монопальмитоилглицерин; гликолипиды: дигалактозилдиацилглицерин; фосфолипид: дипальмитоилфосфатидилхолин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Хроматограммы липидного состава TLC-FID из эксперимента по кормлению аквакультуры. Экстракты были обнаружены на покрытых силикагелем палочках TLC, и для разделения классов липидов использовалась трехступенчатая система развития. Первой и второй системами разработки были гексан:диэтиловый эфир:муравьиная кислота (98,95:1:0,05) и (79,9:20:0,1) соответственно, чтобы отделить нейтральные липиды, включая триацилглицерин, свободную жирную кислоту и стерин для сканирования в автоматическом сканере FID. Третья система разработки состояла из 100% ацетона до хлороформа:метанола:воды (5:4:1) для разделения ацетон-подвижных полярных липидов и фосфолипидов. Стандартные кривые (т.е. нонадекан, холестерилпальмитат, 3-гекксдеканон, трипалмитин, пальмитиновая кислота, цетиловый спирт, холестерин, монопальмитоилглицерин, дипальмитоилфосфатидилхолин) использовались для количественной оценки классов липидов в экстрактах с использованием программного обеспечения Peak Simple (версия 4.54). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:TLC-FID хроматограммы липидного состава придонных образцов из прибрежного Ньюфаундленда. а) стандарт девяти компонентов, б) 220 м оседающих твердых частиц из залива Концепция, Ньюфаундленд, в) липидных классов в мизиде, эритропов эритрофтальме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диета с рыбьим жиром и рапсовым маслом Печень атлантического лосося
Углеводороды 1.3±0.9 0,5±0,2
Эфиры стерила/эфиры воска 0,4±0,6 0,6±0,3
Этиловые эфиры 0 0
Метиловый эфир 0 0
Этилкетоны 0 0,3±0,2
Метилкетоны 0 0
Глицериловые эфиры 0 0
Триацилглицеролы 145,0±26,3 16.9±8.1
Свободные жирные кислоты 21.9±2.2 1.2±0.9
Спирты 0 1.4±0.4
Стерины 6.8±2.1 2.6±0.2
Диацилглицеролы 0 0
Ацетоновые подвижные полярные липиды 14,0±2,5 2.2±0.6
Фосфолипиды 12.5±4.0 22,0±2,0
Всего липидов 201.8±27.4 47,7±11,8

Таблица 1: Липидный состав в эксперименте по кормлению аквакультуры. Данные (среднее отклонение от стандартного ±) экспериментальной диеты, содержащей 6,80% рыбьего жира и 4,80% рапсового масла, как кормили (мгг-1 влажного веса), и печени атлантического лосося (мгг-1 влажного веса) после кормления этой диетой в течение 12 недель.

Оседание твердых частиц Эритропы эритрофтальма
Эфиры стерила/эфиры воска (% общего липида) 10.2±8.28 8.85±1.67 г.
Триацилглицеролы (% от общего липида) 19.7±5.35 58.5±9.19
Фосфолипиды (% от общего количества липидов) 16.2 ± 3.51 21.4±5.35
Нейтральные липиды (% от общего количества липидов) 12.5±4.0 73.4±5.46 г.
Индекс липолиза (%) 18.1±5.20 г. 2.77±2.78
Всего липидов 0.57±0.25 5.86±1.44
Нейтральные липиды: углеводороды, эфиры воска и стериля, кетоны, триацилглицеролы, свободные жирные кислоты; (FFA), спирты (ALC), стерины, диацилглицерины; LI: индекс липолиза [(FFA + ALC) (ациллипиды + ALC)–1]; Общее количество липидных (сумма классов липидов, определяемых TLC/FID) твердых частиц - % сухой массы, мизидов - % живого веса

Таблица 2: Липидный состав придонных образцов из прибрежного Ньюфаундленда. Данные (среднее± отклонение стандартов) 220 м оседающих твердых частиц из залива Концепция Ньюфаундленд и мизид, эритрофтальма эритропов.

Сноска: Нейтральные липиды: углеводороды, эфиры воска и стерила, кетоны, триацилглицеролы, свободные жирные кислоты; (FFA), спирты (ALC), стерины, диацилглицерины; LI: индекс липолиза [(FFA+ ALC) (ациллипиды + ALC)-1]; Общие липиды (сумма fiD определяемых липидных классов) твердых частиц - % сухой массы, мизидные - % живой массы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Скорость, с которой система TLC-FID предоставляет синоптические данные о классе липидов из небольших образцов, делает TLC-FID способным инструментом для скрининга морских образцов перед проведением более вовлеченных аналитических процедур. Такие анализы обычно требуют высвобождения компонентных соединений из липидных экстрактов и дериватизации для повышения летучести в случае газовой хроматографии. Было обнаружено, что TLC-FID в сочетании с GC-FID является мощной комбинацией для экстрактов морепродуктов и других пищевых продуктов14. Для успешного анализа морских липидов крайне важно, чтобы образцы были защищены от деградации и загрязнения во всем и чтобы при нанесении образца на стержень соблюдали большую осторожность. Один из подходов заключается в нанесении всего морского образца на стержень с использованием микрокапиллярного пипеттера15,а инновация в типах морских образцов заключается в добавлении микрослойных и аэрозольных проб морской поверхности к образцамморской воды 16.

Система FID в автоматическом сканере обеспечивает быстрое количественное получение микрограммов без дериватизации или очистки; однако он не такой чувствительный, точный или линейный, как в газовых хроматографах. Это означает, что калибровочные кривые должны быть построены, и что иногда может потребоваться анализ образцов при двух разных нагрузках, чтобы сохранить как меньшие, так и большие пики липидного класса в пределах калибровочных диапазонов.

Используя установку частичного сканирования в сканере FID, можно отделить несколько классов липидов от одного образца приложения к стержню. Однако хроматография на кремниевой кислоте не может разрешить эфиры воска (WE) и стериловые эфиры (SE), и несколько классов могут быть включены в пик «ацетон-подвижный полярный липид» (AMPL)17. WE-SE был основным липидным классом в ооцитах костистых рыб, и предполагается, что они используются для поддержки плавучести и/или накопления энергии18.

В AMPL из фотосинтезирующие организмы гликоклицеролипиды часто элюируют вместе с моноацилглицеролами и пигментами в ацетоне. Это может представлять собой проблему количественного определения, поскольку хлорофилл а и гликолипиды моногалактозилдиацилглицерин (MGDG) и дигалактозилдиацилглицерин (DGDG) имеют разные реакции FID в сканере; однако мы используем 1-монопальмитоилглицерин в качестве стандарта для класса AMPL, и это имеет промежуточный ответ среди них17.

Хотя некоторые пики сканера FID могут содержать более одного класса липидов, иногда полезно функционально перегруппировать разделенные липидные классы. Например, AMPL и PL были сгруппированы в полярные липиды, а затем в структурные липиды с добавлением стерола19. Такие группировки использовались для изучения критических периодов использования липидов в период развития у беспозвоночных19. Другие группы, включающие свободные жирные кислоты и спирты, могут быть использованы в качестве индикаторов деградации, таких как индекс липолиза(таблица 2)или индекс гидролиза1. LI - это индекс липолиза всех ациллипидов, в то время как HI - индекс гидролиза неполярных ациллипидов. Значения LI всегда ниже, чем для HI для любого образца, потому что включены все ациллипиды.

Иногда пиковое расщепление происходит при стержневом разделении экстрактов морских образцов из-за наличия высоких уровней полиненасыщенных видов, что может затруднить идентификацию. Это наблюдалось с эфирами воска(рисунок 3),триацилглицеролами и свободными жирными кислотами20, 21и требует совместного обнаружения с подлинными стандартами и / или подтверждения с другими хроматографическими методами. Аналогичным образом, пиковое расщепление может происходить в полярной липиднойобласти (фиг.2 и фиг.3),и дальнейшие разработки могут быть предприняты для отделения компонентов гликолипидов и пигментов17,22 и фосфолипидов классов22,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование финансировалось Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) под номером гранта 105379 К.C Пэрришу. Сеть Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) Мемориального университета помогла финансировать эту публикацию.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml vials VWR 66009-560
1-hexadecanol Sigma 258741-1G
1-Monopalmitoyl-rac-glycerol Sigma M1640-1g
2 ml vials VWR 46610-722
25 mm glass fibre filters Fisher 09 874 32A
2ml pipet bulbs VWR 82024-554
47 mm glass fibre filters Fisher 09 874 32
5 3/4" pipets Fisher 1367820A
9" pipets Fisher 1367820C
Acetone VWR CAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890 Agilent
Calcium Chloride ANHS 500gm VWR CACX0160-1
Caps for 2 ml vials VWR 46610-712
chloroform VWR CACX1054-1
Cholesteryl palmitate Sigma C6072-1G
Chromarod S5 Shell USA 3252
Dichloromethane VWR CADX0831-1
DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl Sigma P5911-1g
Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L VWR CAEX0190-4
Glyceryl tripalmitate Sigma T5888-100MG
Hamilton Syringe 702SNR 25µl Sigma 58381
Helium Air Liquide A0492781
Hexane VWR CAHX0296-1
Hydrogen regulator VWR 55850-484
Iatroscan MK6 Shell USA
Kimwipes Fisher 066662
Medical Air Air Liquide A0464563
Medium nitrile gloves Fisher 191301597C
Nitrile gloves L VWR CA82013-782
Nitrogen Air Liquide A0464775
Nitrogen Regulator VWR 55850-474
Nonadecane Sigma 74158-1G
Palmitic acid Sigma P0500-10G
Repeating dispenser Sigma 20943
Sodium Bicarbonate 1kg VWR CA97062-460
Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr VWR CA71008-804
Sulfuric acid VWR CASX1244-5
Teflon tape Fisher 14610120
tissue master 125 115V w/7mm homogenator OMNI International TM125-115
TLC development tank Shell USA 3201
UHP hydrogen Air Liquide A0492788
VWR solvent repippetter VWR 82017-766
VWR timer Flashing LED 2 channel VWR 89140-196
Zebron ZB-Wax GC column Phenomenex 7HM-G013-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
  2. Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045 (2013).
  3. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  4. Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
  5. Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
  6. Parrish, C. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. Arts, M. T., ainman, B. C. , Springer-Verlag. New York. 4-20 (1999).
  7. Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
  8. Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
  9. Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
  10. Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
  11. Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
  12. Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
  13. Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
  14. Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
  15. Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
  16. Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
  17. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
  18. Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
  19. Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
  20. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
  21. Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
  22. Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
  23. Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).

Tags

Науки об окружающей среде выпуск 178
Определение общего количества липидов и классов липидов в морских образцах
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parrish, C. C., Wells, J. S.… More

Parrish, C. C., Wells, J. S. Determination of Total Lipid and Lipid Classes in Marine Samples. J. Vis. Exp. (178), e62315, doi:10.3791/62315 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter