Summary
该协议用于测定海水和生物标本中的脂质。滤液中的脂质在固体的情况下用氯仿或氯仿和甲醇的混合物提取。脂类通过棒状薄层色谱法和火焰电离检测来测量，其总和给出了总脂质含量。
Abstract
脂质主要由碳和氢组成，因此比海洋中的其他有机大分子提供更大的比能量。由于富含碳和氢，它们还具有疏水性，可以作为有机污染物的溶剂和吸收载体，因此可以成为海洋生态系统中污染物生物蓄积的驱动因素。它们的疏水性有助于它们从海水或生物标本中分离出来：海洋脂质分析从取样开始，然后在非极性有机溶剂中提取，为它们与水生基质中的其他物质分离提供了一种方便的方法。
如果对海水进行了采样，第一步通常涉及通过过滤分离成操作上定义的"溶解"和"颗粒"派系。收集样品并从样品基质中分离脂质，通常用氯仿表示真正溶解的物质和胶体，用氯仿和甲醇的混合物分离固体和生物样品。这种提取物可能含有来自生物和人为来源的几种类别。此时，可以确定总脂质和脂质类别。总脂质可以通过对通常经过色谱分离的单独确定的脂质类别进行求和来测量。具有火焰电离检测（FID）的薄层色谱（TLC）通常用于海洋样品中脂质的定量分析。TLC-FID提供天气脂质类信息，并通过对类进行求和，提供总脂质测量值。
当与单个组分（例如脂肪酸和/或甾醇）从脂质提取物中释放出来后测量时，脂质类别信息特别有用。脂质结构和功能的广泛多样性意味着它们被广泛用于生态和生物地球化学研究，以评估生态系统健康和人为影响的程度。它们已被用于测量对海洋动物具有膳食价值的物质（例如，水产饲料和/或猎物），并作为水质的指标（例如，碳氢化合物）。
Introduction
这里描述的方法涉及在操作上被定义为海洋脂质的物质。该定义基于它们在非极性有机溶剂中对液液萃取的适应性，并且为它们与水生基质中的其他物质分离提供了一种方便的方法。它们的疏水性有助于它们与海水或生物标本的分离，以及它们的富集，以及盐和蛋白质的去除。
几十年来，海洋生物中脂质含量及其组成的测量在食物网生态学、水产养殖营养和食品科学中引起了极大的兴趣。脂质是生物体中的通用成分，作为细胞膜中的基本分子，作为生物可利用能量的主要来源，提供隔热和浮力，并作为信号分子。尽管其他领域的脂质测定程序已经得到了很好的描述，但它们在海洋样品中的使用通常需要进行修改以适应现场条件以及样品类型1。
对于海水样品，第一步通常需要通过过滤（协议步骤1）分离成操作上定义的"溶解"和"颗粒"馏分。颗粒分数是过滤器保留的内容，孔的大小对于定义截止值2很重要。通常，当我们对颗粒物进行取样时，我们希望将脂质浓度与总质量浓度相关联，在这种情况下，必须为此目的采取单独的较小样品（例如，10 mL）（协议步骤1，注意）。为了获得准确的质量测定，重要的是在过滤结束时添加甲酸铵（35 g / L）。
根据样品类型，较大样品的海水滤液应达到250 mL至1 L之间，并在分离漏斗中进行液-液萃取（实验步骤2）。脂质的疏水性质意味着它们可以通过在非极性溶剂（如氯仿）中提取与其他化合物分离。创建了一个双层系统，其中脂质分配到有机层中，而水溶性组分则保留在水层中。
在过滤器上提取颗粒样品，或生物标本用改性Folch等人提取3，也涉及氯仿（实验方案步骤3）。再次，产生有机/水系统，其中脂质分配到有机相中，而水溶性分子保留在水相中，蛋白质沉淀。事实上，对于固体，大多数实验室使用涉及氯仿和甲醇的Folch等人提取3 程序的某些变体。对于过滤器，第一步是在2 mL氯仿和1 mL甲醇中均质化。
在提取过程中，应注意通过将样品和溶剂保存在冰上以减少酯键水解或碳 - 碳双键氧化来保护脂质免受化学或酶促修饰。组织和细胞脂质受到天然抗氧化剂和区隔化的良好保护4;然而，在样品均质化之后，细胞内容物被组合在一起，使脂质更倾向于化学或酶促地改变。一些脂质，如大多数甾醇，是非常稳定的，而另一些，如那些含有多不饱和脂肪酸的脂质，更容易受到化学氧化的影响。其他的，例如具有共轭双键的甾醇，容易被光5催化氧化。提取后，脂质更容易受到化学氧化的影响，样品应储存在惰性气体（如氮气）下。温和的氮气流也可用于浓缩提取物。
浓缩后，脂质通常会被大量量化，因为它们是海洋生态系统的重要组成部分，提供高浓度的能量，是碳水化合物和蛋白质的kJ / g的两倍多。它们接下来总是被量化为单个组分：脂质的全面分析通常涉及根据其化学性质分离成更简单的类别。因此，完整的分析涉及测量总脂质，脂质类别和单个化合物。
总脂质可以通过取单独测量的脂质类别的总和来确定，这些脂质类别由色谱法6分离。海洋脂质提取物可能含有十几种来自生物和人为来源的类别。脂质结构的多样性意味着可以通过确定结构的各个分组来获得很多信息。脂质类别单独或在某些组中已被用于表示某些类型生物体的存在，以及它们的生理状态和活性2。它们还被用作有机材料来源的指标，包括溶解的有机物（DOM）以及疏水污染物。
三酰基甘油，磷脂和甾醇是更重要的生物脂质类别。前两个是生物化学相关的，因为它们具有甘油主链，其中两个或三个脂肪酸被酯化（图1）。三酰基甘油与蜡酯一起是非常重要的储存物质，而其他含脂肪酸的脂质类如二酰基甘油、游离脂肪酸和单酰基甘油通常是次要成分。游离脂肪酸以较低的浓度存在于生物体中，因为不饱和脂肪酸可能是有毒的7。甾醇（游离和酯化形式）和脂肪醇也包括在极性较小的脂质中，而糖脂和磷脂是极性脂质。极性脂质具有亲水基团，其允许形成在细胞膜中发现的脂质双层。游离甾醇也是膜结构组分，当与三酰基甘油成比例服用时，它们提供了已广泛使用的条件或营养指数（TAG：ST）8。当与磷脂（ST：PL）成比例时，它们可用于指示植物对盐的敏感性：较高的值可保持结构完整性并降低膜渗透性9。在温度适应10期间，已经在双壳类组织中研究了该比率（PL：ST）的逆比。
海洋脂质类别可以通过硅胶包覆棒上的薄层色谱（TLC）分离（协议步骤4），然后在自动FID扫描仪中通过火焰电离检测（FID）进行检测和定量。TLC/ FID已成为海洋样品的常规用途，因为它可以快速提供来自小样品的天气脂质类数据，并通过取所有类别的总和来计算总脂质的值。TLC/FID 已经过质量保证 （QA） 评估，并被发现符合一致的外部校准、低空白和精确重复分析所需的标准11。变异系数（CV）或相对标准偏差约为10%，FID扫描仪总脂质数据通常约为通过重量法和其他方法获得的90%2。重力测量给出的总脂质可能更高，因为FID扫描仪仅测量非挥发性化合物，并且由于在重量测量中可能包含非脂质材料。
脂质类别分析提供的信息在与作为个体或甾醇或两者组合的脂肪酸测定相结合时特别有用。进行这些分析的第一步涉及释放脂质提取物中的所有组分脂肪酸和甾醇（实验方案步骤5）。脂质结构和功能的广泛多样性意味着它们在评估生态系统健康状况以及它们受到人为和陆地投入影响的程度的生态和生物地球化学研究中得到了广泛的应用。它们已被用于测量对海洋动物具有膳食价值的物质的生物合成以及指示水样的质量。测量沉积物岩心样品中的脂质有助于显示沉积物对陆海边缘附近人类土地利用变化的敏感性。
传统上，鉴定和定量单个脂质化合物的主要工具是FID的气相色谱（GC）。然而，在分析之前，这些化合物通过衍生化使这些化合物更具挥发性。脂肪酸在酸性催化剂（H2SO4）存在下从酰基脂质类中释放出来（图1）。在有机化学中，酰基（R-C = O）通常来自羧酸（R-COOH）。然后将它们重新酯化为脂肪酸甲酯（FAME），从而在GC柱上提供更好的分离（实验方案步骤5）。
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Protocol
注意：要清洁玻璃器皿，仪器和过滤器以进行脂质分析，请用甲醇洗涤3次，然后用氯仿洗涤3次，或将其加热至450°C至少8小时。
1. 海水溶解和颗粒脂质的过滤程序
注意：感兴趣的特定部分由过滤程序在操作上定义。在这种情况下，孔径为1.2μm。
- 在没有过滤器的情况下设置过滤歧管，并用过滤的海水冲洗设置。
- 使用干净的镊子将经过清洗的47毫米玻璃纤维（GF / C）过滤器放入清洁过滤系统中。
- 取样并轻轻旋转以重悬可能沉淀在收集容器底部的任何材料。准确测量出已知体积，在本例中为1 L，并通过过滤器过滤。
注意：体积取决于样品中颗粒物的量：通常在250 mL和5 L之间，具体取决于季节和位置。 - 当样品被测量出来时，用过滤的海水轻轻润湿过滤器。将整个样品缓慢加入过滤系统，并用过滤的海水冲洗量筒，以确保所有颗粒都添加到过滤器中。用侧面过滤的海水冲洗装置，以确保所有颗粒都冲洗到过滤器上。
- 允许所有海水通过过滤器，但不要让过滤器完全变干，因为它会破坏过滤器上的细胞;当最后一个水消失时，打破吸力。
- 使用干净的镊子和干净的移液器，将过滤器对折，然后分成三部分，然后纵向对半，将过滤器卷成管中。将其放入干净的，有标签的10 mL玻璃小瓶中。
- 用2 mL氯仿盖住过滤器。用氮气填充头部空间，并用PTFE胶带密封。放入-20°C冰箱中的架子中。样品将在此温度下稳定长达一年。
注意：要将脂质浓度与总质量浓度相关联，还需要进行干重测量。这涉及将24 mm预称量的过滤器放入干重过滤装置中，搅拌样品并取一个小样品，该子样品被过滤到小过滤器上。当过滤器接近干燥时，向过滤器中加入约10mL的3.5%甲酸铵。将过滤器对折，返回带有标签的培养皿并放入冰箱中。
2. 海水或液体样品的液液萃取
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准备示例
- 测量已知体积的滤液到脂质清洁玻璃量筒中。将此样品放入干净的1 L分离漏斗中。然后向样品中加入20 mL氯仿，摇匀2分钟，经常通风。
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去除第一个提取物，并在第一个分离后加入酸
- 将漏斗包裹在铝箔中，等待5至10分钟以发生分离。剥开铝箔的底部，看看两层。通过旋塞阀将底部有机层收集到干净的圆形底部烧瓶中，注意不要包含任何顶层。将圆底烧瓶盖在氮气下，放入冰箱。
- 每升样品向分离漏斗中的样品中加入0.25 mL浓缩H2SO4， 并轻轻摇动漏斗。
- 加入 10 mL 氯仿，用力摇晃 2 分钟，同时频繁排气。允许分离发生。
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第二次和第三次分离
- 等待分离，然后将底层加入圆底烧瓶中。
- 加入第三个10毫升氯仿，摇晃2分钟，再次频繁通风。分离后，将底层加入圆底烧瓶中。
- 将圆底烧瓶中的提取物转移到旋转蒸发器中，蒸发并转移到2 mL小瓶中。
3. 固体提取方案（改性Folch等人3 提取）
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设置
注意：提取装置需要一个装满冰的绝缘容器。溶剂包括甲醇、提取的氯仿水和2∶1的氯仿：甲醇。所有溶剂都应放在冰上，以便在开始提取时冷却。样品也放在冰上，所以一切都保持寒冷。- 用甲醇冲洗所有试管和PTFE衬套3次，然后用氯仿冲洗3次。每次提取都需要一个离心管和一个带盖子的15 mL小瓶。
- 将样品置于含有2mL氯仿的离心管中。样品的大小取决于存在的脂质量，优选约5至10mg脂质。
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研磨和提取
- 加入约1 mL冰冷甲醇，用干净的均质机或PTFE/金属端棒快速研磨样品成纸浆。
- 用约1 mL冰冷的2：1氯仿：甲醇和1/2 mL冰冷的氯仿提取水将棒洗回管中。如有必要，在洗涤前使用一组干净的镊子将颗粒压回小瓶中。盖上管子，在超声波浴（35 - 42 kHz）中超声处理混合物4分钟。
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双重移液： 将样品在1800×g下离心2分钟。 使用双移液技术收集整个有机层（底层），其中将5 3/4"移液器松散地推过两层，同时挤压灯泡，导致气泡出来。
- 当到达第二层的底部时，用拇指取下灯泡，不要将有机层吸入移液器中。将9"移液器放入5 3/4"移液器内，并通过5 3/4"移液器取下底层。
- 将提取物放入干净的小瓶中。继续取下底层，直到全部取下。
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清洗移液器：使用1.5 mL冰冷的氯仿冲洗9"移液器到含有有机层的小瓶中，以冲洗移液器的外部，并使用1.5 mL冲洗内部。在洗涤时轻轻转动移液器，并确保所有氯仿都顺着移液器流入小瓶。
- 以相同的方式将5 3/4"移液器冲洗到含有水层的管中。
- 对样品进行超声处理并离心，分离时使用双移液器，每次使用新的移液器。重复至少三次，并将所有有机层汇集在一起。第三次除去有机层后，将两个移液器洗涤到含有有机层的小瓶中。
- 使用温和的氮气流，浓缩至体积，然后用PTFE胶带密封并储存在冰箱中。
4. 开发海洋脂质类棒状TLC分离的系统和步骤
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为 TLC 准备棒材
- 在自动FID扫描仪中对棒材进行空白扫描三次
- 发现样品：用注射器将样品和标准品涂抹在原点或正下方的杆上。分配0.5μL，并将液滴触摸到棒上。让其干燥，然后再将下一滴液滴放在同一位置。在杆上发现一条线上的所有样品。
- 丙酮聚焦： 将样品聚焦两次（如果样品非常浓缩，则为三次）在70 mL丙酮中。观察溶剂前部爬上杆，直到斑点的底部与顶部合并。取出棒材，干燥约5秒，然后重复该过程，在棒材底部附近产生窄带的脂质物质。
- 在恒定湿度室中干燥并调节棒材5分钟。恒湿室是一个干燥器，在板下有氯化钙的饱和溶液。
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导致第一个色谱图的序列（碳氢化合物到酮）
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第一个开发系统：第一个开发系统是己烷：乙醚：甲酸，98.95：1：0.05。使用注射器加入甲酸，但首先用甲酸冲洗注射器3×。之后立即用氯仿从注射器中冲洗甲酸。使用30 mL混合物润湿纸张并冲洗罐。丢弃漂洗液，将剩余的70 mL加入罐中。
- 拿起架子，轻轻地将它们放入水箱中。观察直到溶剂前端到达样品点，然后启动计时器。25分钟后，从显影室中取出棒，在恒定湿度室中干燥5分钟，然后在相同的溶液中再重新开发20分钟。
- 在自动FID扫描仪中将棒干燥5分钟，然后使用25的PPS扫描扫描到酮峰后面的最低点。
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第一个开发系统：第一个开发系统是己烷：乙醚：甲酸，98.95：1：0.05。使用注射器加入甲酸，但首先用甲酸冲洗注射器3×。之后立即用氯仿从注射器中冲洗甲酸。使用30 mL混合物润湿纸张并冲洗罐。丢弃漂洗液，将剩余的70 mL加入罐中。
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导致第二个色谱图的序列（三酰基甘油到二酰基甘油）：
- 在恒定湿度室中将棒材调理5分钟。
- 第二个开发系统：第二个开发系统是己烷：乙醚：甲酸，79：20：1。将约 30 mL 加入显影槽中，润湿纸张并冲洗显影槽。然后丢弃并在剩余的70 mL中将杆发育40分钟。为了在TAG（饱和）和TAG（多不饱和）峰之间实现最佳分离，请使用79.9：20：0.1的混合物，但对于ST和DAG峰的分离，请使用79：20：1的混合物。
- 干燥并扫描到使用PPS扫描11进行第二次局部扫描中二酰基甘油峰后面的最低点。
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导致第三色谱图的序列（丙酮移动极性脂质和磷脂）
- 在恒定湿度室中将棒材调理5分钟。
- 将杆在70 mL丙酮中发育两次，持续15分钟。在开发之间，空气干燥杆约30秒。
- 在恒定湿度室中将棒材调理5分钟。
- 第三种开发系统：第三种开发系统是氯仿、甲醇和氯仿提取水的混合物，50：40：10。将棒在70 mL混合物中发育两次，持续10分钟。在开发之间，风干棒约30秒。
- 干燥并扫描整个长度的杆。
5. MEOH中H2SO4 的FAME衍生化
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制造希尔迪奇试剂
- 制备甲醇：将100毫升MeOH放入干净的容量瓶中，然后轻轻撒入无水NaSO4 中，直到烧瓶底部被覆盖。一旦被覆盖，反转两次，使甲醇中的任何水被NaSO4吸收。倒置和摇晃后，让它静置至少5分钟。
- 加入酸：将甲醇缓慢倒入玻璃罐中（现在NaSO4 是烧瓶底部的硬块），然后加入H2SO4。 使用移液器将1.5 mL硫酸缓慢加入甲醇中。一次加入几滴，一旦加入所有的酸，盖上盖子，轻轻搅拌混合。该解决方案现已准备好用于衍生品，但必须每周补一次。
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制作衍生品
- 将大约200μg脂质从已经将体积提高到已知量的提取物小瓶中转移到干净的15mL小瓶中，并在氮气下蒸发至干燥。去除的量将由样品从TLC / FID的浓度决定。使用干净的移液器取出样品。
- 样品干燥后，加入1.5 mL二氯甲烷和3 mL新制的Hilditch试剂。
- 涡旋样品，并在超声波浴中超声处理4分钟，以除去粘附在玻璃瓶上的脂质。用氮气填充小瓶，盖上盖子，用PTFE胶带密封，并在100°C下加热1小时。
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停止反应
- 从烤箱中取出后，让样品完全冷却至室温10分钟，然后小心打开小瓶。
- 缓慢加入约0.5 mL饱和碳酸氢钠溶液（9 g / 100 mL氯仿提取水），然后加入1.5 mL己烷。摇晃或涡旋小瓶，然后静置，使其分离成2层。
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收集名声
- 去除顶层：一旦衍生化停止，并且有明确的分离，除去上层有机相并放入脂质干净的2 mL小瓶中。
- 将2 mL小瓶中的溶剂蒸发至干，然后用己烷重新填充至约0.5 mL。
- 用氮气填充小瓶的顶部空间，盖上盖子并用PTFE胶带密封小瓶，再超声处理4分钟以重新悬浮脂肪酸，然后准备进入GC。
注意：如果需要脂肪酸浓度，必须用己烷洗涤水层三次，并将所有有机层汇集到2 mL小瓶中。这涉及加入2mL己烷，涡旋样品，离心和去除有机层，全部重复3次。
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Representative Results
作为增长最快的食品生产部门，水产养殖在技术创新和适应方面不断发展，以满足不断变化的需求。其中之一是减少对野生来源鱼粉和鱼油的依赖，这些鱼粉和鱼油为许多水产养殖物种提供饲料成分。陆生植物油正在被研究作为水产饲料中鱼油的可持续和经济替代品，肝脏是分析的目标组织，因为它是脂质代谢的主要部位12。 图2 显示了从我们的九组份标准中获得的原始TLC-FID色谱图，我们用7%的鱼油和5%的菜籽油配制的饮食，以及来自大西洋鲑鱼喂养该饮食的肝脏组织。 表1 显示了分析来自不同鱼类的日粮重复和样品后获得的数据。这些数据是在使用Peak Simple软件（版本4.54）从扫描仪FID响应构建标准曲线以量化提取物中的脂质类别后获得的。数据显示了饮食和肝脏中甘油三酰基甘油的患病率，以及膜磷脂在肝脏中的重要性。
大陆边缘通常具有非常高的生物生产力，它们在碳循环中尤为重要。在较浅的水域中，地表初级生产力更能到达海底，因此测量从上层混合层沉降到底栖食物网的颗粒的数量和质量是非常有趣的。脂质富含碳，能量含量非常高，是大陆架生产力的重要组成部分。从历史上看，纽芬兰和拉布拉多附近的水域支持着世界上最大的渔业之一，大约五个世纪以来，我们一直在研究该系统中脂质的生产和转移13。 图3 显示了从我们在纽芬兰海岸220米处收集的沉降颗粒物中的脂质中获得的TLC-FID色谱图，以及收集在接近相同深度的小型mysid，Erythrops 红细胞中的 脂质。这一次，色谱图通过绘图软件进行了处理，两个部分扫描与最终的完整扫描相结合。 表2 显示了在分析沉降颗粒物和mysid的重复样品后获得的数据。在5个门的19个分类群中，小的mysid平均具有最高的脂质浓度（湿重的6%）13。
图1：海洋样品中的主要脂质类别，大致呈极性增加的顺序。 每个结构都用分子中最疏水的部分绘制，指向图的右侧。脂质类的代表性化合物是：- 碳氢化合物：十九烷;蜡酯：棕榈酸十六烷基酯;甾醇酯：棕榈酸胆固醇酯;甲酯：棕榈酸甲酯;酮： 3-己酮;三酰基甘油：三棕榈素;游离脂肪酸：棕榈酸;酒精：植物醇;甾醇：胆固醇;二酰基甘油：二棕榈酰甘油;单酰基甘油：单棕榈酰甘油;糖脂：二乳糖基二酰基甘油;磷脂：二棕榈酰磷脂酰胆碱。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：水产养殖投饲实验中脂质组成的TLC-FID色谱图。 在硅胶包被的TLC棒上发现提取物，并使用三阶段开发系统来分离脂质类别。第一个和第二个开发系统分别是己烷：乙醚：甲酸（98.95：1：0.05）和（79.9：20：0.1），以分离中性脂质，包括三酰基甘油，游离脂肪酸和甾醇，以便在自动FID扫描仪中扫描。第三种开发系统由氯仿：甲醇：水（5：4：1）之前的100%丙酮组成，以分离丙酮移动极性脂质和磷脂。使用标准曲线（即壬烷，棕榈酸胆固醇，3-己酮，三棕榈素，棕榈酸，鲸蜡醇，胆固醇，单棕榈酰甘油，二棕榈酰磷脂酰胆碱）使用Peak Simple软件（版本4.54）量化提取物中的脂质类别。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：来自纽芬兰沿海近底样品的脂质组成的TLC-FID色谱图。 a）九组分标准，b）来自纽芬兰Conception Bay的220米沉降颗粒物，c）mysid，Redthrops redthrops redthrophtalma中的脂质类别 。请单击此处查看此图的放大版本。
| 鱼油/菜籽油饮食 | 大西洋鲑鱼肝 | |
| 碳氢化合物 | 1.3±0.9 | 0.5±0.2 |
| 甾醇酯/蜡酯 | 0.4±0.6 | 0.6±0.3 |
| 乙酯 | 0 | 0 |
| 甲酯 | 0 | 0 |
| 乙基酮 | 0 | 0.3±0.2 |
| 甲基酮 | 0 | 0 |
| 甘油醚 | 0 | 0 |
| 三酰基甘油 | 145.0±26.3 | 16.9±8.1 |
| 游离脂肪酸 | 21.9±2.2 | 1.2±0.9 |
| 醇类 | 0 | 1.4±0.4 |
| 甾 醇 | 6.8±2.1 | 2.6±0.2 |
| 二烯基甘油 | 0 | 0 |
| 丙酮移动极性脂质 | 14.0±2.5 | 2.2±0.6 |
| 磷脂 | 12.5±4.0 | 22.0±2.0 |
| 总脂质 | 201.8±27.4 | 47.7±11.8 |
表1：水产养殖投饲实验中的脂质组成。 数据是（平均±标准偏差）含有6.80%鱼油和4.80%菜籽油的实验性饮食，作为喂养（mg g-1 湿重），以及大西洋鲑鱼肝脏（mg g-1湿重）喂养该饮食12周后。
| 沉降颗粒物 | 红细胞红斑 | |
| 甾醇酯/蜡酯（%总脂质） | 10.2±8.28 | 8.85±1.67 |
| 三酰基甘油（%总脂质） | 19.7±5.35 | 58.5±9.19 |
| 磷脂（%总脂质） | 16.2 ± 3.51 | 21.4±5.35 |
| 中性脂质（%总脂质） | 12.5±4.0 | 73.4±5.46 |
| 脂肪分解指数（%） | 18.1±5.20 | 2.77±2.78 |
| 总脂质 | 0.57±0.25 | 5.86±1.44 |
| 中性脂质：碳氢化合物，蜡和甾醇酯，酮，三酰基甘油，游离脂肪酸;（FFA），醇（ALC），甾醇，二酰基甘油;LI： 脂解指数 [（FFA + ALC） （酰基脂质 + ALC）–1];总脂质（TLC/FID测定的脂质类之和）颗粒物 - 干重百分比，密斯 - 湿重百分比 | ||
表2：来自纽芬兰沿海的近底部样品的脂质组成。 数据是（平均±标准偏差）来自纽芬兰概念湾的220米沉降颗粒物，以及神秘的 红细胞红细胞。
脚注：中性脂质：碳氢化合物，蜡和甾醇酯，酮，三酰基甘油，游离脂肪酸;（FFA），醇（ALC），甾醇，二酰基甘油;LI： 脂解指数 [（FFA+ ALC） （酰基脂质 + ALC）-1];总脂质（FID确定的脂质类的总和）颗粒物 - 干重百分比，Mysid - %湿重。
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Discussion
TLC-FID系统从小样品中提供天气脂质类信息的速度使TLC-FID成为在进行更多涉及的分析程序之前筛选海洋样品的可行工具。在气相色谱法的情况下，这种分析通常需要从脂质提取物中释放组分化合物并衍生化以增加挥发性。TLC-FID与GC-FID相结合已被发现是海鲜和其他食品提取物的强大组合14。为了成功进行海洋脂质分析，至关重要的是要保护样品免受降解和污染，并且将样品涂在杆上时要格外小心。一种方法是使用微毛细管移液器15将整个海洋样品施加到杆上，而海洋样品类型的创新是将海面微层和气溶胶样品添加到海水样品16中。
自动扫描仪中的FID系统提供快速微克定量，无需衍生化或清理;然而，它不像气相色谱仪那样灵敏，精确或线性。这意味着必须构建校准曲线，并且有时可能需要分析两种不同负载下的样品，以便将较小和较大的脂质类峰保持在校准范围内。
通过使用FID扫描仪中的部分扫描工具，可以将多类脂质从单个样品应用分离到杆上。然而，硅酸的色谱法无法分辨蜡酯（WE）和甾醇酯（SE），并且少数类别可以包括在"丙酮移动极性脂质"（AMPL）峰17中。WE-SE是骨鱼卵母细胞中的主要脂质类别，建议它们用于支持浮力和/或能量储存18。
在来自光合生物的AMPL中，糖甘油脂通常与丙酮中的单酰基甘油和色素一起洗脱。这可能会引起定量问题，因为叶绿素 a 和糖脂单半乳糖基二酰基甘油（MGDG）和二乳糖基二酰基甘油（DGDG）在扫描仪中具有不同的FID反应;但是，我们使用1-单棕榈酰甘油作为AMPL类的标准，其中有一个反应中间体17。
虽然一些FID扫描仪峰可以包含多个脂质类，但有时在功能上重新组合分离的脂质类是有用的。例如，AMPL和PL已被分组为极性脂质，然后通过添加甾醇19而分组为结构脂质。这些分组用于研究无脊椎动物发育过程中脂质使用的关键时期19。其他涉及游离脂肪酸和醇的分组可用作降解指标，如脂解指数（表2）或水解指数1。LI是所有酰基脂质的脂解指数，而HI是非极性酰基脂质的水解指数。对于任何样品，LI值始终低于HI值，因为包括所有酰基脂质。
由于存在高水平的多不饱和物质，因此在海洋样品提取物的杆分离中偶尔会发生峰分裂，这可能使鉴定变得困难。这已经用蜡酯（图3）、三酰基甘油和游离脂肪酸20、21观察到，并且需要与真实标准品共同发现和/或与其他色谱技术确认。类似地，峰分裂可能发生在极性脂质区域（图2和图3），并且可以进行进一步的发展以分离出组分糖脂和色素17，22和磷脂类22，23。
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Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）资助，编号为C.C. Parrish 105379。纪念大学的核心研究设备和仪器培训（CREAIT）网络帮助资助了该出版物。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
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