Summary
このプロトコルは、蛍光レポーターと細胞分類を使用して、マクロファージおよびT細胞株におけるノックイン実験を簡素化します。これらの単純なノックイン実験、すなわちCRISPR/Cas9-およびDsRed2発現プラスミドと、免疫細胞内の Rosa26 遺伝子座に永久に統合されたEBFP2を発現する相同組換えドナープラスミドの2つのプラスミドが使用されます。
Abstract
免疫系の機能ゲノミクス研究は、標的遺伝子の欠失と目的のタンパク質への要素の追加の両方を含む遺伝子操作を必要とする。細胞系モデルにおける遺伝子機能の同定は、細胞固有のメカニズムの遺伝子発見と探索に重要である。しかし、特に静止状態では、これらの細胞のトランスフェクション効率が低いため、CRISPR/Cas9を介したノックインを用いたT細胞やマクロファージ細胞株などの免疫細胞の遺伝子操作は困難である。免疫細胞の遺伝子を改変するために、薬物耐性選択およびウイルスベクターは、通常、CRIPSR/Cas9系を発現する細胞を濃縮するために使用され、必然的に細胞の望ましくない介入をもたらす。以前の研究では、エレクトロポレーション後に一時的に発現したCRISPR/Cas9に結合した二重蛍光レポーターを設計しました。この技術的なソリューションは、免疫細胞の迅速な遺伝子欠失につながります;しかし、薬剤耐性選択やウイルスベクターを使用しないT細胞やマクロファージなどの免疫細胞における遺伝子ノックインはさらに困難です。本稿では、細胞選別を用いて、ドナープラスミドと組み合わせて Rosa26 遺伝子座を標的とするCRISPR/Cas9構築物を一時的に発現する細胞の選択を支援することで、薬剤耐性濃縮のないT細胞とマクロファージの両方で遺伝子ノックインを達成できることを示す。一例として、現在のCovid-19大流行を担うSARS-Cov-2の受容体であるヒトACE2を、ノックイン実験を行ってRAW264.7マクロファージで発現させる方法を示す。このような遺伝子ノックイン細胞は、幅広く、機械研究に使用することができる。
Introduction
免疫細胞は病原体に対する防御に不可欠です。感染者のクリアランスと組織恒常性の維持のためには、自然免疫と適応免疫の両方が必要です1,2.細胞株モデルは、哺乳類の免疫系の分子基礎を理解するための不可欠なツールです。それらは、ヒトT細胞活性化をモデル化するもののようなインビトロ機能アッセイにおいて用いられ、免疫応答を活性化または減衰させる遺伝的要因の機能を決定する際に3、4。哺乳類の免疫系は非常に異質であり、同様に重要な、膨大な数の分子が、所定の細胞型5、6の分化、移動、および機能を制御することに注意することが重要である。
クラスター化された定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR)/Cas9ゲノム編集ツールは、特定の細胞タイプの遺伝子操作を可能にし、遺伝子の機能的注釈を正確な方法7,8に容易にする。いくつかの公表されたプロトコルは、HEK293細胞におけるリボヌクレオタンパク質(RnPs)として知られているCas9ガイドRNA複合体の形態でCRISPR/Cas9の送達を説明している、ジュルカット細胞株、原発性T細胞9、10、マクロファージ11、12、13、幹細胞14、および他の15、16。これらのプロトコルにおいて、遺伝子タグ付けは、通常、内因性タンパク質17,18に蛍光タグを融合させることによって達成される。しかし、単一細胞選別に対応する二重蛍光レポーターを用いて、特に免疫細胞におけるノックイン実験19,20を容易にする試みがなされている。
免疫細胞における新しい遺伝的因子の機能を理解することを目的とした詳細な機械分析は、一般的に遺伝子の細胞型特異的な欠失、遺伝子救助実験、および理想的には、そのインターアクターの同定を必要とする。免疫細胞の遺伝子の遺伝的欠失の最適化方法は9、15、21に公表されているが、免疫応答を理解するために多目的な機能を持つノックイン対立遺伝子を導入する方法ははるかに少ない報告を受けている。したがって、このプロトコルでは、ヒトおよびマウスの両方の免疫細胞株において、目的のタンパク質(POI)を安全な港のLocus Rosa26で発現させる効率的で再現性の高いプロトコルを詳細に記述することを目指しています。CRISPR/Cas9(DsRed2)を発現するプラスミドを導入した細胞に対して、細胞選別で分離できる組換えDNAテンプレート(EBFP2)を用いて濃縮する2色レポーターシステムを設計しました。このプロトコルに従って、我々は、研究が不十分なタンパク質の機能解析のためにヒトT細胞株JurkatとマウスマクロファージRAW264.7の複数のノックインラインを得た。
一例として、このプロトコルでは、ヒトACE2(SARS-Cov-2の受容体)を安定的に発現するマクロファージRAW264.7マクロファージを安定的に得る方法を本プロトコルで示す。自然免疫細胞は、Covid-1923、24およびヒトACE2の病因に関与しているため、複製前に細胞へのウイルス侵入に必要な主要な受容体とみなされるため、ヒトACE2のノックインを伴うマクロファージは、マクロファージ内のウイルス増殖の機械化研究に有用なツールとして役立つ。また、ヒトROSA26遺伝子のノックイン例を、アミノ末でアフィニティツインストレップタグ(OST)と融合したRASGRP1タンパク質を発現させる例も紹介しています。T細胞は免疫療法における主要な標的細胞であり、癌25,26に対する応答性の操作に焦点を当てた研究が増えている。Rasgrp1はT細胞受容体の下流にある重要なシグナル伝達分子であることが知られており、そのインターアクターは27を十分に解明されていないので、OST-RASGRP1ノックインモデルは、T細胞の腫瘍および感染に対する応答を調節する界発体を同定するための基盤を提供する。これらのツールを組み合わせることで、Covid-19の研究やRasgrp1と相互作用する新しい分子の発見に使用できます。
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Protocol
1. Rosa26遺伝子座を標的としたsgRNAの設計とプラスミド構築
- 目的の挿入部位の周りの設計ガイドのRNA
- マウスRosa26の挿入部位 (以下、mRosa26と指定される) ノックイン実験がmRosa26の最初のイントロンに位置していることを確認します。このサイトは、以前の研究で使用されています28,29.ヒト細胞におけるノックイン実験の場合、挿入部位が、mRosa2630のヒト同族体として同定されたヒトROSA26遺伝子座(以下、hROSA26と呼ばれる)に存在することを確認する。
- マウスゲノム情報学(http://www.informatics.jax.org/)とEnsemblゲノムブラウザ(http://www.ensembl.org/index.html)から得られたマウスとヒト種のゲノム配列をそれぞれ使用します。所望の挿入部位を横取る各側のmRosa26 または hROSA26 軌跡のゲノム配列の50塩基対(bp)をコピーする。
- オンライン Web ツール CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31を使用して設計ガイド RNA .1.1.2 から入力シーケンスの 100 bp を貼り付けます。高い特異性スコア、高効率スコア、および低いオフターゲットアクティビティを持つ2つのガイドRNAを選択します。さらに、より高いDoenchスコアを持つRNAガイドを選択し、「非効率的」32としてラベル付けされたものを避ける。
注: 代替 CRISPR デザイン ツールは貴重で、一般に公開されている、たとえば、ベンチリング CRISPR デザイン ツール (https://benchling.com/crispr) です。CRISPR/Cas9媒介性ノックイン変異細胞の周波数を増加するには、可能な場合は、目的の挿入部位に近い2つのガイドRNAを選択します。 - mRosa26遺伝子座の場合は、mR26-sg1 (5'- CTCCACTCtTCTAGAAGAT -3') および mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAGAGAC -3') として指定された 2 つの隣接するガイド RNA を使用します (図 1A)。hROSA26遺伝子座の場合、2つの隣接するガイドRNA、すなわちhR26-sg1(5'-GGCGATGAGCATCACGCG -3')およびhR26-sg2(5'-AATCGAGAGCGCGCGCgACA-3')を使用します(図1B)。
注: mR26-sg1 および mR26-sg2 のゲノム編集活動と hR26-sg1 および hR26-sg2 のゲノム編集活動は、それぞれ RAW264.7 細胞およびジュルカット細胞で評価されました ( 補足ファイル、 図 S1を参照)。
- Rosa26遺伝子座を標的とするsgRNAを含むCRISPR発現ベクターのクローニング
- 1つのガイドRNAの前方および逆オリゴを合成する( 補足ファイルを参照)。
注: U6プロモーターによって駆動される発現に役立つガイド配列の開始に'G'ヌクレオチドを追加することが好ましいです。例えば、前述のmR26-sg1をクローン化するために、フォワードオリゴはCACCGCTCCAGTTCTAGAAGAGAT及び逆オリゴがAAAACATCTTCTAGAAGACTGGAGCである。フォワードオリゴの追加Gと逆オリゴの補数は太字で示されています。 - ガイドRNAに対応する合成オリゴを、Zhangの研究室(https://www.addgene.org/crispr/zhang/)が開発したgRNAクローニングの一般的なプロトコルを使用して、前作21(図1C)で生成された全1個のCRISPR発現ベクターpX458-DsRed2にクローン合成オリゴを作製する。ただし、ゲル精製ステップをスキップし、PCR精製キットを使用して消化されたベクターを精製します(材料表を参照)。
注: 以前のプロトコルでは、BbsI消化ベクターのゲル精製が行われました。ただし、この手順には時間がかかります。本プロトコルでは、消化された生成物をPCR精製キットを使用して精製し、下流のライゲーション反応に直接使用し、一般に同等の効率で正のコロニーを生成する。 - ライゲーション製品(ステップ1.2.2)の10 μLを、メーカーの指示に従って、大腸菌 DH5αコンピテントセルの50 μLに変換します。ランダムにアンピシリン(100 μg/mL)とLB寒天プレートから3コロニーを選び、一晩培養するためのアンピシリンでLB培地の3mLにそれぞれを接種します。
- サンガーシーケンシングに一晩細菌培養液の1 mLを使用し、残りを4°Cに保ち、構築物が正しいことが確認されるまで:pDsR-mR26-sg1およびpDsR-mR26-sg2は mRosa26 遺伝子座ノックイン、 hROSA26 遺伝子座の pDsR-hR26-sg1 および pDsR-hR26-sg2 を示す。
- トランスフェクショングレードのプラスミドを精製するためのマキシプレップキットで高濃度のプラスミドDNA(約2μg/μL)を調製します( 材料表を参照)。
- 1つのガイドRNAの前方および逆オリゴを合成する( 補足ファイルを参照)。
2. 相同組換えテンプレートとしてのターゲットベクターの設計と構築
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相同性指向の修復テンプレートを設計する
- CAGハイブリッドプロモーター、POIのcDNAのクローニングを許可するAscI制限部位、IRES-EBFP2レポーター、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化(bGH-polyA)シグナル(図1Bおよび補足ファイル)を含む、以前の研究29から最適化された発現カセットを使用してPOIを構成的に発現させる標的ベクトルを設計する。
- mRosa26またはhROSA26遺伝子座のゲノム配列と相同性を共有するデザイン相同性アーム(HA)。カセットの左側に所望の挿入部位から上流ゲノム配列に対応する5'HAの〜1kbを含む。同様に、発現カセットの右側に挿入部位から下流ゲノム配列に対応する3'HAの〜1kbを含む。
注:式カセットは、CRISPR / Cas9切断部位34にできるだけ近くに挿入されます。CRISPR/Cas9による標的アレルの再切断を避けるために、標的ベクトル34,35にプロトススペース隣接モチーフ(PAM)配列(5'-NGG-3')にヌクレオチド変化を組み込む。 - ターゲットベクトルの線形化を可能にするために、5'HAのすぐ上流にあるユニークなEcoRIサイトと、3'HAのすぐ下流にあるユニークなBamHIサイトを挿入します。
- 市販ベンダーがターゲットベクターを合成し、それぞれmRosa26 および hROSA26ノックイン用 pKR26-iBFP および pKhR26-iBFP として指定します。
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相同性指向の修復テンプレートとしてターゲットベクターを構築する
- POIを発現させるために、EnsemblゲノムブラウザからcDNA配列(コード配列)を取得し、最も長いタンパク質配列を有する転写産物を選択します。例えば、ヒト ACE2 遺伝子のcDNAはACE2-202 ENST0000427411.2であり、ヒト RASGRP1 遺伝子のcDNAはRASGRP1 ENSG00000172575である。
- 商用ベンダーの助けを借りてPOIのcDNAを合成します。また、PCR増幅を介してcDNAをクローン化することも可能です(ここでは説明しません)。cDNAの停止コドンの後に、CDNAのATG開始コドンと別のAscI制限部位(5'-GGCGCGCC-3')の直前に、AscI制限部位(斜体および太字)およびコザックコンセンサス翻訳開始部位(下線付き)を含むGGCGCGCCACC(5'-3')の配列を置く。
- AscIで合成された配列を消化し、制限消化後のDNA断片を精製するために設計されたPCR精製キットを使用して、製造業者の指示に従って精製する( 材料表を参照)。
- 精製されたcDNAインサートを、メーカーの指示に従ってT4 DNAリガーゼを使用して、AscI線形化されたバックボーンベクターpKR26-iBFPまたはpKhR26-iBFPにリゲートします。
- シーケンシングにより、最終的なターゲットベクトル pKR26-POI-iBFP または pKhR26-POI-iBFP を検証します。maxiprep を使用して、製造元のプロトコルに従って検証済みの構成を浄化します。
- EcoRI または BamHI を使用してターゲットベクターを消化し、製造者の指示に従って PCR 精製キットを使用して消化産物を精製します。線形化されたターゲットベクター(約0.8 μg/μL)を-20°Cでエレクトロポレーションまで保存します。
3. マクロファージとT細胞株のエレクトロポレーション
- エレクトロポレーションのための細胞培養を準備する
- ジュルカットT細胞の完全な成長培地として10%胎児ウシ血清(FBS)を補充ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640を準備します。RAW264.7マクロファージを培養するための10%FBSでダルベッコの修正イーグルミディアム(DMEM)を準備します。細胞の選別前にトランスフェクション後の培養に使用された媒体を除き、100 U/mLペニシリンと100 μg/mLストレプトマイシン(ペン/ストレップ)を使用して、すべての完全な成長培地を補います。
- サプライヤーの指示に従ってRAW264.7およびJurkat T細胞のサブカルリングを実行します ( 資料表を参照)。RAW264.7細胞をサブカルテリングする場合は、トリプシン-EDTA溶液(0.25%)を使用して細胞を取り外します。RAW264.7およびJurkat細胞の凍結保存媒体として10%(v/v)DMSOを添加したFBSを使用してください。
- 250×gで、RAW264.7マクロファージの場合は5分間、ジュルカットT細胞では8分間90×gの細胞を収集します。その後、5~10mLのDPBS×(Ca2+またはMg2+イオンを使用しない)で洗浄します。DPBS を削除します。
- 2 mLの1×DPBSを用いて細胞ペレットを再懸濁する。細胞の10 μLを使用し、0.2%のトリパンブルーの等しい体積と混合して、細胞数と生存率を推定します。
注:細胞培養がトランスフェクションの日に>90%生存率を有することを確認してください。 - 1回のノックイン実験では、5回繰り返しの10 μL核の先端でエレクトロポレーションを行います。2.0 × 106 細胞に必要な体積を計算し、遠心分離によって細胞をペレットします。ステップ3.1.3で説明したように、1×DPBSで細胞ペレットを再度洗浄する。
注:10 μL核の切除チップを使用する場合、4.0 ×105個の細胞がエレクトロポレーションごとに必要となります。したがって、1回のノックイン実験のために少なくとも2.0×106細胞を調製する。 - ペン/ストレップなしで完全な成長培地(ステップ3.1.1で準備される)の0.5 mLと24ウェルプレートを準備し、37°Cインキュベーターでプリウォーム。
- CRISPR/Cas9成分のエレクトロポレーションとターゲティングベクター
- エレクトロポレーションシステムをオンにします。以前の研究で最適化されたエレクトロポレーションパラメータを使用します 21: 1,400 V / 20 ms/2 パルス RAW264.7 マクロファージと 1350 V/20 ms/2 パルス Jurkat T 細胞のパルス.
- ピペットによるサンプル損失を考慮し、各CRISPR/Cas9ベクターの2.5 μg、2.4μgの線形ターゲリングベクター、およびリサスペンションバッファRを含む無菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに55 μLエレクトロポレーション混合物を調製します。
注:時間を節約するために、エレクトロポレーション混合物は遠心分離の間に準備することができます(ステップ3.1.5)。 - ステップ3.2.2から55 μLエレクトロポレーション混合物中に2.0×106細胞(ステップ3.1.5で調製)を再懸濁します。
- ピペットを用いた10 μL核の核の先端を使用してステップ3.2.3から細胞/エレクトロポレーション混合物を吸引する。
注:ピペッティング中に、エレクトロポレーションの障害を引き起こす可能性のある気泡の導入は避けてください。 - エレクトロポレーションキットから3 mLのバッファEを充填したチューブにサンプルを追加します。
- ステップ 3.2.1 で説明したように、2 つのセルタイプのエレクトロポレーション パラメータを適用します。
- ステップ3.1.6からプリウォームされた媒体と24ウェルプレートの1つの井戸にサンプルを移します。
- 他の 4 つの繰り返し、およびターゲットベクトルのみおよび CRISPR 発現ベクトルのみのコントロールに対して、手順 3.2.4 ~ 3.2.7 を繰り返します。
注:別の細胞タイプ/プラスミドDNAに切り替えるときに核切除チップとチューブを交換してください。 - 48-72時間のトランスフェクト細胞を培養し、フローサイトメトリー分析または蛍光活性化細胞選別(FACS)の前にCRISPR/Cas9成分のエレクトロポレーションおよび発現後の回復を可能にする。トランスフェクション後24時間で赤色チャネルを搭載した蛍光顕微鏡を用いてDsRed2の発現を調べてください。
注:DsRed2蛍光セルを監視する利点は、エレクトロポレーションの効率を推定することができ、さらなる細胞分類に対する適合性を予測できることです。
4. 推定ノックイン細胞を分離する細胞の並べ替え
- FACSの選別前に、トランスフェクトされた細胞を完全な増殖培地で1回洗ってください。ステップ3.1.3に記載した遠心分離によるペレット細胞を、ペレットを500μLの新鮮培地で再懸濁した。
- 85 μmノズルと低流量のセルソーター(バイオセーフティキャビネットに設置)を設定します。ソートのための「単一セル」モードを選択し、96ウェルマイクロプレートのカバーに20〜30セルをソートすることによって、単一セルの並べ替え効率と精度をテストします。各ウェルの中央に局在する1つの液滴は、機器の適切なセットアップを示します。
- ステップ4.1から無菌FACSチューブに細胞懸濁液を移し、SYTOXレッドデッドセル染色を1nMの最終濃度に加えます。
- 細胞ソーター上のサンプルを分析します。SYTOX RedおよびEBFP2は405 nmレーザーで励起され、それぞれV450/BV421およびAPCチャネルによって検出される。DsRed2は488 nmレーザーで励起され、PEチャネルによって検出される。スペクトル補正のコントロールとして、トランスフェクトされていない細胞と EBFP2-および DsRed2- 単一陽性細胞を使用します。
- 10個の単一細胞を、温め込んだ完全成長培地のウェルあたり150 μLを含む96ウェルマイクロプレートの各ウェルにソートします。ユルカットT細胞や平底マイクロプレートなどの懸濁液細胞株を、付着性RAW264.7マクロファージ用の平底マイクロプレートを培養するために、丸底マイクロプレートを使用します。
注:ウェルあたり10細胞のソートは、細胞の生存率を改善し、播種する必要がある96ウェルマイクロプレートの数と、フローサイトメトリーとジェノタイピングによってスクリーニングする必要があるサンプルの数を最小限に抑えるために最適化された戦略です。ウェルごとに 1 つのセルだけを並べ替える場合、正しく編集されたセルを取得する可能性を高めるために、より多くのマイクロプレートのシードが必要です。
5. 陽性ノックイン細胞のスクリーニングと検証
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フローサイトメトリーによる候補ノックイン細胞のスクリーニング
- ステップ4.5から10〜15日間細胞をインキュベートし、蒸発によって失われた液体を置き換えるために3日ごとに完全な成長培地を加える。Jurkat T細胞の場合、丸底96ウェルプレートで成長した細胞を平底プレートに移して細胞増殖を最適化します。
- さらに拡張するために、拡張されたソートされたセルを48ウェルプレートに移します。
- 細胞が合流に近い場合は、培養の半分を使用して、フローサイトメトリーによるEBFP2発現をスクリーニングする(図3)。通常、コンフルエント成長後の48ウェルプレートの培養の半分は、105細胞×0.5〜10個 に相当し、フローサイトメトリーによる1つのサンプルの分析に十分である。
- 残りの細胞を24ウェルプレートに移してさらに増殖させます。
- さらなるジェノタイピング実験のために、EBFP2陽性細胞の高い割合を有する候補細胞集団を保持する。
注:96ウェルマイクロプレートの各ウェルに10個の細胞が分類されるため、ノックイン遺伝子を発現しない細胞でノックイン細胞が増殖する可能性があります。したがって、EBFP2陽性細胞を陰細胞から分離するために細胞ソーティングの追加ラウンドを行うことが正常である。
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PCRとシーケンシングによる候補ノックイン細胞のスクリーニング
- 2×105候補 セルを収集します。DNA準備キットを使用してゲノムDNAを抽出します(「 材料表」を参照)。
- 正確な相同性指向修復(HDR)が、候補のノックイン細胞のゲノム内のランダムな部位ではなく、mRosa26 遺伝子座で起こったことを確認するために、HAの両側に及ぶプライマーを用いてPCRを行う(図4)。ターゲットベクターの外側のゲノム領域にあるプライマー(外部オリゴ)と、ターゲティングベクター(内部オリゴ)の内側に配置された別のプライマーを選択します。
注: hROSA26 軌跡で HDR を検証する場合も同様の設計が使用されています。PCRプライマーは、POI配列の挿入を検出するために容易に設計することもできる。また、野生型とノックインアリール型遺伝子型は、3プライマーPCRを用いて同時に検出することができる( 補足ファイル、 図S2を参照)。 - 高速クローニングキットを使用してポジティブ PCR 製品をクローン化します( 資料表を参照)。反応混合物をDH5αのコンピテントセルに変換します。
- ランダムに変換ごとに8〜10個の細菌コロニーを選び、サンガーシーケンシングによってステップ5.2.3からPCR産物を配列します。
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免疫ブロット解析と親和性精製による陽性ノックイン細胞の検証
注:候補細胞は、POIの挿入の検証、またはタンパク質とタンパク質相互作用の研究のためのアフィニティー精製(AP)のための免疫ブロット分析を受ける。- 抗体メーカーの指示に従って免疫ブロット分析を行います。一次抗体および二次抗体の使用については、 資料表 を参照してください。
- OST タグ付き POI を発現するノックイン セルのライセートを、製造元の指示に従ってストレップ タクチン セファローズビーズを使用して AP に適用します ( 資料表を参照)。
- イメージャーを使用して化学発光を検出します。
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Representative Results
mRosa26遺伝子座でのノックイン実験を行うプロトコルに従って、マウスRAW264.7マクロファージを用いて、SARS-Cov-2ウイルスの受容体であるヒトACE2を発現させる標的ベクターを設計した(図2A)。同様の設計を用いて、OST タグ付き RASGRP1融合タンパク質のノックインを持つヒト Jurkat T 細胞を生成しました (図 2C)。3つのプラスミドのトランスフェクション後、そのうちの2つはCRISPR/ Cas9(DsRed2;pDSR-mR26-sg1およびpDsR-mR26-sg2 mRosa26ノックイン用)の発現に使用された。 pDsR-hR26-sg1およびpDsR-hR26-sg2は、相同組換え用DNAテンプレートとして用いられる(EBFP2)、2つの蛍光レポーターを発現する二重陽性細胞を96ウェルプレートに選別した。単一細胞のソートモードを用いてソートされたRAW264.7細胞のうち、0.91%がDsRed2+EBFP2+であったが、各ウェルに10個の細胞が集められた(図2B)。 Jurkat T細胞はトランスフェクション効率が高く、この代表的な実験では二重陽性細胞の割合が7.91%であり、OST-RASGRP1融合タンパク質のノックインに成功したことを示した(図2D)。
次のステップでは、フローサイトメトリーを使用して、EBFP2陽性細胞を有する候補ウェルをスクリーニングした。代表的なヒストグラムは、明らかなEBFP2陽性集団があることを示した(図3)。細胞分類の2週間後にフローサイトメトリーを行った場合、ノックイン細胞がDsRed2を発現しなかったことは注目に値する。
正確なノックインとランダム挿入の識別のために、EBFP2陽性細胞からのゲノムDNAをさらに、標的ベクターのHAおよび発現カセット内の特定領域の外のゲノム配列を認識するプライマーを用いてPCRを行って試験した(図4A および 4B)。これらのPCR産物の配列分析は 、mRosa26 標的部位におけるHDRの発生を確認した(図4C)。同じジェノタイピング戦略を適用して、Jurkat T細胞のhROSA26 遺伝子座に発現カセットが正確に挿入されることを検証することができます。
hACE2発現性RAW264.7細胞の純粋な集団を得るために、我々はさらに細胞を選別し、コントロールとして野生型細胞を用いて拡大後の蛍光レポーターの存在を検証した(図5A)。拡大した細胞はEBFP2陽性であり、hACE2タンパク質はマウスRAW264.7マクロファージで容易に検出可能であった(図5Bおよび5C)。同様に、スクリーニング後のヒトジュルカットT細胞における蛍光レポーターおよびOST-RASGRP1タンパク質の発現と、細胞選別の第2ラウンドを検証した(図6Aおよび6B)。また、OST-RASGRP1タンパク質の親和性精製は、市販のビーズを用いて行った。我々は、野生型細胞の細胞よりもノックインユルカット細胞の総細胞ライセートにおけるRASGRP1タンパク質の量が多いことを発見した。RASGRP1ノックアウトユルカット細胞をコントロールとして使用した(図6C)。OSTタグを使用して精製した後、ノックインサンプルのみが検出可能なRASGRP1を持っていました(図6D)。
図 1.目的のタンパク質を過剰発現するmRosa26/hROSA26ノックイン細胞株を生成するための遺伝子標的戦略。(A)mRosa26特異的ガイドRNA標的配列および所望の挿入部位におけるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAC)は、それぞれ青色および赤色の文字で示される。 Cas9は通常、緑色の矢印で示されるPAMシーケンスの3〜4 bpのアップストリームを切断します。標的ベクターは、マウスまたはヒトゲノムに発現カセットを正確に挿入する相同性指向修復(HDR)の鋳型として使用されます。目的の標的部位の上流および下流の1kbの配列のそれぞれは、ターゲットベクトルにおいて5'および3'相同性アーム(HA)として使用される。このHAは、CAGプロモーター、対象タンパク質のcDNA配列(POI)、OSTタグ、IRES-EBFP2レポーター、およびbGH-polyAシグナル(pA)からなる発現カセットによって分離される。制限サイトAscIはPOIのクローニングに使用され、EcoRIとBamHIはターゲットベクトルの線形化に使用されます。hROSA26遺伝子座でのCRISPR/Cas9媒介型ノックインの戦略は似ています。(B)ヒトROSA26軌跡の図。hR26-sg1 および hR26-sg2 ターゲティングシーケンスは、青色の文字と対応する PAM 配列を赤で示します。(C)ヒトU6駆動sgRNA発現カセットとCas9-T2A-DsRed2蛍光レポーターカセットを含むオールインワンCRISPR発現ベクターpX458-DsRed2の概略図。2つのBbsI制限部位はガイドRNAのクローニングを可能にする。U6, ヒト U6 RNA ポリメラーゼ III プロモーター;sgRNA、キメラ単一ガイドRNA;CBh, チキンβアクチンハイブリッドプロモーター;NLS,核局在化シグナル;T2A, ナッサアシニャウイルス 2A 自己スプライシングペプチド;bGH-pA, ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.CRISPR/Cas9ベクターを用いて転化したRAW264.7およびジュルカット細胞の単一細胞選別と、相同組換え用標的ベクターRAW264.7(A)およびジュルカット(C)細胞における安定した遺伝子発現に使用される標的ベクター。代表的なフローサイトメトリックプロットは、マウスRAW264.7マクロファージ(B)およびヒトジュルカットT細胞(D)をCRISPR/Cas9ベクターでトランスフェクトし、DsRed2レポーターを発現し、EBFP2レポーターを発現する標的ベクターを発現する。DsRed2とEBFP2を共発現させる細胞を細胞選別を行い、増殖のために培養した。アウトライン領域に隣接する数字は、各ゲートの細胞の割合を示し、非トランスフェクトされた細胞は陰性対照として使用された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.EBFP2発現の検出によるノックイン細胞のスクリーニングEBFP2+及びDsRed2+RAW264.7マクロファージ(A)及びジュルカットT細胞(B)のフロー細胞量分析をエレクトロポレーション後14日目に行った。 ヒストグラムでは、EBFP2+またはDsRed2+細胞の蛍光強度(FI)がX軸に表示され、各蛍光チャネルの事象数がY軸に表示されます。(A) EBFP2およびhACE2の発現は、RAW264.7マウスマクロファージのRosa26遺伝子座で同じプロモーターによって駆動された。(B)ユルカット細胞では、OST-RASGRP1発現は、ヒトROSA26遺伝子座におけるEBFP2発現に関連している。エレクトロポレーション後14日間で、フローサイトメトリック分析は、分類された細胞の中でほぼゼロDsRed2+細胞を明らかにした。野生型(WT)細胞を陰性対照として使用し、KIはノックイン細胞の略である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.PCRおよびシーケンシングによる候補ノックイン細胞のスクリーニング。(A) hACE2ノックイン細胞を生成する戦略。正確なHDRとランダム挿入を区別するために使用されるPCRプライマーの位置は、緑色の矢印で示されます。(B)図3に例示したEBFP2発現に対するフローサイトメトリースクリーニングによって同定された5個の候補細胞(#4、#15、#22、#25、および#43)のPCR遺伝子型化は、5'接合部(1472 bp)および3'接合部(1472 bp)の両方が正しいことを示した。M、DNAラダー;WT、野生型RAW264.7コントロール。H2O、陰性制御。(C)BからPCR産物のサンガーシーケンシングは、突然変異のないmRosa26遺伝子座へのhACE2発現カセットのノックインに成功したことを明らかにした。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.hACE2発現カセットのマクロファージのRAW264.7マクロファージにおけるmRosa26遺伝子座へのノックインの成功の検証を行った。(B)EBFP2陽性細胞をネガティブ細胞から分離するために、さらに細胞選別を行い、hACE2 KI細胞として指定された約100%のEBFP2+ノックイン細胞からなる集団を得た。DsRed2発現は、CRISPR/Cas9プラスミドがRAW264.7マクロファージのゲノムに組み込まれていないことを確認するためにも検討した。ヒストグラムでは、EBFP2+またはDsRed2+細胞の蛍光強度(FI)がX軸に表示され、各蛍光チャネルのイベント数がY軸に表示されます。(C)ウサギ抗ヒトACE2モノクローナル抗体を用いた免疫ブロット解析によるhACE2発現の検出。hACE2の発現は、複数のウェル(#4、#15、#22、#25、および#43)からの細胞で観察された。WT RAW264.7マクロファージを負のコントロールとして使用し、GAPDHをローディング制御として使用した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.OST-RASGRP1発現カセットの正常なノックインをJurkat T細胞のhROSA26遺伝子座に検証した。(A)WTジュルカットT細胞は、フローサイトメトリック解析のための陰性制御として使用された。(B) EBPF2+ Jurkat細胞の亜集団は、細胞のソートの追加ラウンドによって濃縮され、拡大された。これらの細胞は、OST-RASGRP1 KI細胞として指定された。ノックイン細胞をフローサイトメトリーで解析し、DsRed2発現ベクターを保持しなかった。ヒストグラムでは、EBFP2+またはDsRed2+細胞の蛍光強度(FI)がX軸に表示され、各蛍光チャネルの事象数がY軸に表示されます。(C)抗RASGRP1抗体を用いた免疫ブロット解析による2つの独立したノックイン細胞(#1および#2)におけるOST-RASGRP1発現の検出。WTユルカットおよびRASGRP1ノックアウトユルカット細胞をコントロールとして使用し、ローディングコントロールとしてβアクチンを使用した。(D) OST媒介性アフィニティー精製を用いて、RASGRP1ノックアウト細胞を陰性対照として用いたOST-RASGRP1の発現を検証した。細胞ライセートからの同量のタンパク質のイムノブロット分析は、ストレップタクチンセファロースビーズ上でアフィニティー精製(アフィニティー精製)を行ったか(アフィニティー精製)、または直接分析(総ライセート)、RASGRP1またはGAPDH(負荷制御)抗体でプローブした。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
実験では、ヒトのJurkat T細胞とマウスRAW264.7マクロファージを例に、構築設計からノックイン細胞スクリーニング、検証まで、免疫細胞のノックイン編集を行う方法を実証しました。T細胞およびマクロファージ細胞株は両方トランスフェクション36、37に耐性である。しかし、CRISPR/Cas9送達の低効率の問題は、蛍光レポーターの助けを借りて細胞の選別と組み合わせることで克服することができます。このプロトコルは、遺伝子救助実験やタンパク質とタンパク質相互作用実験に適していますが、書き起こし因子の結合部位などの調節DNA配列の研究には適用できません。
デュアル蛍光レポーターがCRISPR/Cas9ノックイン編集を支援
我々は、免疫細胞におけるCRISPR/Cas9ベクターの独立したセットを一過性に発現させるために二重蛍光レポーターシステムを適用し、これまでの研究21でDNAの大きな断片を欠失させることに成功した。DsRed2蛍光タンパク質をレポーターとして使用したCRISPR/Cas9ターゲティングツールと、ノックイン修飾用のDNAテンプレートの送達を追跡するためのスペクトル的に異なる蛍光タンパク質を追加設計しました。ノックインアレル修飾を実現可能にするために、RFP(当社の場合はDsRed2)とスペクトル波及のないEBFP2蛍光タンパク質レポーターを使用して、相同組換え時に鋳型となるドナーDNAのトランスフェクションを監視しました。POIと蛍光レポーターを発現するカセットを最適化するために、独立したタンパク質を得るためにIRES配列を導入しました。我々の以前の研究では、P2AまたはT2Aリンカーからの残留アミノ酸が、転写後の切断後に細胞表面上のタンパク質局在化に影響を及らした後に残っていることを指摘した。IRES配列は、このような残留アミノ酸を残さない。前の研究で説明したように、IRESは、CAGプロモーター38によって駆動されるCas9タンパク質の発現に続いて、蛍光レポーターのより高いレベルを生じさせる。
オールインワンクリスプ/Cas9プラスミド
CRISPR/Cas9系の様々な形式および組み合わせは、化学的に合成されたsgRNA39と共にmRNAまたはタンパク質としてのCas9トランスフェクションのような以前の研究で説明されてきた。CRISPR/Cas9 RNP複合体も哺乳類細胞に送達されています。この戦略は、ヌクレアーゼ活性の早期発症と短い半減期の利点を提供します。しかし、RMPの標識は、オールインワンプラスミドの構築に比べて費用対効果が低くなります。これまでの研究では、CRISPR/Cas9(DsRed2陽性)およびノックインタンパク質(EBFP2陽性)を発現する希少細胞を単一細胞選別して分離することは、RNP送達を用いたよりもはるかに複雑ではなく、プラスミドを調製することが容易であることがわかりました。このプロトコルは単一セルのソートに依存しているのは事実です。しかし、当社のプロトコルは実行が容易で、高い再現性を持つノックイン修正を成功させます。
Rosa26遺伝子座からのPOIの発現
CRISPR/Cas9編集40,41,42を用いて、内因性タンパク質を蛍光レポーターとタグ付けする方法を説明する文献には複数の報告がある。内因性のタグ付けの利点は、細胞内局在を決定し、内因性タンパク質のインビボ追跡を行うことが可能であることです。しかし、内在性の遺伝子座で適切なCRIPSRガイドRNAを設計することができない場合、問題が発生する可能性があります。ここでは、POI-IRES-EBFP2をゲノムセーフハーバー軌跡Rosa26に組み込むことで、内因性タグの位置付けに関する適切なガイドを見つけるという限界を克服し、代替のノックイン法を開発しました。
技術的再現性を確保するために、実験中に考慮する必要があるいくつかの重要なポイントを要約します。まず、セルソーターは、EBFP2の励起用405 nmの紫色レーザーと488 nmの青色レーザー、またはDsRed2の励起用の561 nm黄色のレーザーを備える必要があります。このような構成では、EBFP2 と DsRed2 をスペクトル波及なく検出でき、誤検知の結果を招く可能性があります。我々の実験では、DsRed2+ EBFP2+ 二重陽性細胞の割合は0.9%と低かった。したがって、実験を成功させるためには、適切な集団の適正な人口の適正化が不可欠であった。2回目のソートを行い、EBFP2+ 陽性細胞をゲートし、続いてPCR検証を行いました。また、ノックインタンパク質検出のためには、OSTまたは他のタイプのタグなどのタンパク質タグを導入することが好ましい。 Rosa26 遺伝子のノックイン実験の前に遺伝子をノックアウトすることは、抗体が望ましい特異性を有するかどうかを評価する良い機会を提供する。抗体特異性が十分でない場合、ノックインタンパク質の検出は、タンパク質タグを介してプルダウン後に行われるべきである。最後に、ノックインアリールを発現する細胞のFACSスクリーニング中に、EBFP2の強度を使用して、ノックインアレーレの2つのコピーまたは1つのコピーが存在するかどうかを評価することができる。
アプリケーション
本プロトコルでは、T細胞活性化27に関与する鍵分子であるRASGRP1のノックイン修飾について説明した。まず、機能喪失の研究に使用できるRASGRP1ノックアウトジュルカット細胞を取得し、hROSA26遺伝子座でOST-RASGRP1を発現するジュルカット細胞を追加で生成しました。Jurkat細胞は、T細胞生物学43を研究するための最も使用されるヒト細胞株である。がん患者のT細胞枯渇を予防する免疫療法の成功により、免疫学者やがん生物学者は、候補分子の機能研究のためにJurkat細胞を改変することに大きな関心を持っています。また、Jurkat T細胞株はシグナル伝達経路の解剖に一般的に使用されているが、この細胞株を用いるのに制限があるが、Jurkat細胞は刺激44でIFN γの生産者が乏しい。これまでの研究では、ヒトユルカット細胞でノックイン実験を行うためにhROSA26遺伝子座46で内在性軌跡修飾45と遺伝子工学の両方を使用した。どちらの戦略にも独自の利点があります。内因性の遺伝子座を改変することにより、タンパク質は「生理学的」レベルで発現すると考える。hROSA26遺伝子座でのノックイン修飾は、mRNAの代替スプライシングが回避され、改変タンパク質の存在も容易に検出できるため、予測可能な結果を生み出します。アデノ関連ウイルス部位1(AAVS1)及びケモカイン(CCモチーフ)受容体5(CCR5)47、48のような他のゲノム安全な港は、より多くの探査に値する。
我々の前の研究では、Vav1-OSTが非常に頻繁に使用されるマクロファージ細胞であるRAW264.7細胞のマウス Rosa26 遺伝子座でより高いレベルで発現されたとき、我々は高レベルのベイトタンパク質とOSTアフィニティー精製の高効率のために低発現Vav3分子との相互作用を検出することができた。また、豊富な発現が保証されるSARS-CoV-2の受容体であるhACE2を安定的に発現するマクロファージ細胞株を確立するためのノックイン実験についても述べた。単一細胞RNAシーケンシングデータベースでは、マウスAce2が肺マクロファージで発現しており、我々が開発したhACE2を発現する遺伝的細胞モデルは、SARS-CoV-2感染時のマクロファージの研究に有用であり得る。
その他の考慮事項
このプロトコルは、蛍光レポーター(我々の場合はEBFP2レポーター)のフローサイトメトリック分析の助けを借りてPOIを発現するノックイン細胞を同定するように設計されています。しかし、FACSによって検出可能な表面標識抗体が表面タンパク質49に対して利用可能である場合には、レポーターシステム50を使用する必要はない。T細胞およびマクロファージ細胞株は、相互作用研究に用いられるOSTタグ付きタンパク質の例と同様に、主にシグナル伝達研究に使用され、これらのシグナル伝達分子の大部分は細胞のサイトゾルまたは核に局在している。したがって、望ましいノックイン細胞の同定のために蛍光レポーターが必要となる場合がある。
このプロトコルは細胞株のために開発され、T細胞のような原発免疫細胞への応用は検証されなかったことを指摘することが重要である。増殖する細胞の能力が限られているため、このプロトコルは原発性免疫細胞で使用することはお勧めしません。蛍光レポーターEBFP2は、IRES要素を用いてノックイン遺伝子またはPOIと同じプロモーターで発現したため、ノックイン遺伝子の存在しない場合には蛍光レポーターを発現する細胞を観察しなかった。蛍光タンパク質発現細胞の回収は、相同組換えの成功に大きく依存していると考えています。前回の研究で報告されているように、ノックイン効率が非常に低い42の場合、単一細胞の並べ替えによって正しいノックインセルを並べ替え、拡大し、識別するのは面倒です。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
新郷医科大学のフローサイトメトリーコア施設に感謝します。このような技術の開発は、LZ、81471595、および32070898に81601360のNSFC助成金によって支えられてきました。この作品は河南教育委員会第21IRTSTHN030の財団によっても支援されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amersham Imager 600 | Ge Healthcare | imaging of chemiluminescence | |
| Ampicillin, sodium salt | MP Biomedicals | 194526 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | at 1/5000 dilution |
| Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 | Merck | MABS146 | 1.0 μg/mL of working concentration |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| β-Actin (D6A8) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 8457 | at 1/1000 dilution |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | |
| BbsI-HF | New England BioLabs | R3539S | |
| Cellometer Mini Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | ||
| E.coli DH5α Competent Cells | Takara | 9057 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | MP Biomedicals | 196055 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | cell culture reagent |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14200075 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | HyClone | SH30022.01 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| FACSAria™ Fusion | BD Biosciences | equipped with biosafety cabinet | |
| FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube | BD Biosciences | 352003 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
| FlowJo version 10.7 | BD Biosciences | ||
| GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 5174 | at 1/1000 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | ThermoFisher Scientific | 31430 | at 1/5000 dilution |
| Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Immobilon-PSQ PVDF Membrane | Millipore | ISEQ00010 | |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/ |
| Kanamycin sulfate | MP Biomedicals | 194531 | |
| LB agar powder | ThermoFisher Scientific | 22700041 | |
| Multi-channel Pipette (30-300 μL) | Eppendorf, or similar | ||
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System, 10 μL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix | New England BioLabs | (M0489) | for high GC% template |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | ThermoFisher Scientific | 26616 | |
| Pipette tip 0.1-20µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.005 | |
| Pipette tip 2-200µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.021 | |
| Pipette tip 50-1000µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.064 | |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| pX458-DsRed2 | Addgene | 112219 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | purify plasmid from restriction digestion |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England BioLabs | M0494S | |
| RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | https://www.atcc.org/ |
| Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] | Abcam | ab108252 | at 1/1000 dilution |
| RPMI 1640 Medium | HyClone | SH30027.01 | |
| Strep-Tactin Sepharose beads | IBA Lifesciences | 2-1201-010 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | S34859 | |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-Rad | ||
| 1.5 mL microtubes, PCR-clean | Eppendorf, or similar | 0030 125.215 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
| 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates | Corning | 3599 | |
| 96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate | Corning | 3799 |
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