Summary
מחקר זה מתאר שיטה חדשה לבידוד אדיפוציטים חומים מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.
Abstract
רקמת שומן חום (BAT) אחראית לתרמוגנזה שאינה רועדת ביונקים, ואדיפוציטים חומים (BAs) הם היחידות הפונקציונליות של BAT. BAs מכילים גם טיפות ליפידים מולטילוקולריות וגם מיטוכונדריה בשפע, והם מבטאים חלבון 1 (UCP1) שאינו מתמזג. BAs מסווגים לשני תתי-סוגים בהתבסס על מקורם: BAs קלאסיים שמקורם בעוברים (cBAs) ו-BAs שמקורם באדיפוציטים לבנים. בשל צפיפותם הנמוכה יחסית, לא ניתן לבודד BAs מ- BAT בשיטת צנטריפוגה מסורתית. במחקר זה פותחה שיטה חדשה לבידוד BAs מעכברים לצורך ניתוח ביטוי גנים וחלבונים. בפרוטוקול זה, BAT בין-סקפולרי מעכברים בוגרים עוכל בתמיסת קולגן ותמיסת Dispase, וה-BAs המנותקים הועשרו בתמיסת יודיקסנול של 6%. לאחר מכן, BAs מבודדים הוכנסו לריאגנט Trizol לבידוד סימולטני של RNA, DNA וחלבון. לאחר בידוד RNA, השלב האורגני של הליזאט שימש למיצוי חלבונים. הנתונים שלנו הראו שתמיסת יודיקסנול 6% העשירה ביעילות BAs מבלי להפריע למחקרי מעקב אחר גנים וביטוי חלבונים. גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF) הוא גורם גדילה המווסת את הצמיחה וההתרבות של תאים מזנכימליים. בהשוואה לרקמת השומן החומה, ל-BAs המבודדים היה ביטוי גבוה יותר באופן משמעותי של Pdgfa. לסיכום, שיטה חדשה זו מספקת פלטפורמה לחקר הביולוגיה של אדיפוציטים חומים ברמה של תא יחיד.
Introduction
גם לעכברים וגם לבני אדם יש שני סוגים של רקמות שומן: רקמת שומן לבנה (WAT) ורקמת שומן חומה (BAT)1. WAT מאחסן אנרגיה בצורה של טריגליצרידים באדיפוציטים לבנים, והאדיפוציטים החומים (BAs) של BAT מפזרים אנרגיה כימית כחום2. בהתבסס על מקורם ההתפתחותי, BAs מסווגים עוד יותר ל-BAs קלאסיים (cBAs) שנוצרו במהלך התפתחות העובר ול-BAs שמקורם באדיפוציטים לבנים (תאי בז'/בריט, שהומרו מאדיפוציטים לבנים בתנאי עקה)3. BAs הם רב-לוקולריים ומבטאים את החלבון התרמוגני שאינו מתחבר לחלבון 1 (UCP1)4. מחסן BAT אינטרסקפולרי (iBAT) הוא אחד ממחסני ה-cBAs העיקריים ביונקים קטנים5, בעוד שתאי בז' מפוזרים בתוך WAT6.
בשל אופי פיזור האנרגיה שלהם, BAs קיבלו תשומת לב רבה כיעד טיפולי להפחתת השמנת יתר7. כדי לנצל את BAs לצורך טיפול בהשמנת יתר, חיוני להבין את המנגנונים המולקולריים השולטים בתפקוד, בהישרדות ובגיוס של BAs. רקמות שומן כולל BAT ו- WAT הן הטרוגניות. מלבד אדיפוציטים, רקמות השומן מכילות סוגי תאים רבים אחרים, כגון תאי אנדותל, תאי גזע מזנכימליים ומקרופאגים8. למרות שקיימים כלים גנטיים לדלדול ספציפי של גנים מועמדים בעכברים BAs, כגון UCP1::Cre line9, טכניקות לטיהור BAs מ-BAT או WAT מוגבלות, מה שמקשה על חקר BAs ברמה של תא יחיד. בנוסף, ללא קבלת BAs טהורים, היחסים בין BAs לבין אלה שאינם BAs לא יהיו מוגדרים בבירור. לדוגמה, קולטן גורם גדילה אלפא (PDGFRα) שמקורו בטסיות משמש כסמן לתאים מזנכימליים לא מובחנים, והוא מתבטא בתאי האנדותל והאינטרסטיציאליים של BAT. ב-BAT בלחץ קר, תאי אב חיוביים PDGFRα מולידים BAs10 חדש. PDGFRα מופעל על ידי הליגנד PDGF שלו, גורם גדילה המווסת את הצמיחה וההתרבות של תאים מזנכימליים11; עם זאת, לא ברור אם BAs משפיעים על ההתנהגות של תאי אב חיוביים PDGFRα על ידי הפרשת PDGF.
לאחרונה פורסם פרוטוקול בידוד BAs, המבוסס על מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS)12. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בתמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) כדי להפריד בין BAs ללא BAs, וה-BAs המועשרים טוהרו עוד יותר על ידי FACS. היישום של פרוטוקול זה מוגבל על-ידי הדרישה של תהליך FACS, המסתמך הן על ציוד והן על חוויות פעולה של FACS. במחקר זה פותח פרוטוקול חדש לבידוד BAs מ-BAT. ה-BAs המבודדים על ידי פרוטוקול זה יכולים לשמש ישירות למחקרי ביטוי גנים וחלבונים. יתר על כן, נתונים ממחקר זה מצביעים על כך ש- BAs הם משאב PDGF מרכזי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העכברים הוחזקו בתנאים נטולי פתוגנים, וכל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). UCP1::Cre9 ורוזה 26tdTomato עכברים קווים13 דווחו בעבר. כל העכברים הוחזקו בטמפרטורת החדר עם מחזור אור/חושך של 12 שעות.
1. הכנת התמיסה ורקמת השומן החום (BAT)
- הכן תמיסת עיכול ותמיסת הפרדה בצינורות צנטריפוגה 15 מ"ל.
- 10 מ"ל של תמיסת עיכול BAT: ל-10 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית עם חיץ פוספט (PBS), יש להוסיף 3.5 מ"ג/מ"ל Dispase II, 1 מ"ג/מ"ל קולגן II ו-10 מ"ל CaCl2 כדי ליצור תמיסת עיכול BAT.
- 10 מ"ל של 12% תמיסת יודיקסנול (תמיסת הפרדה): לערבב 1 מ"ל של 10x PBS, 2 מ"ל של 60% יודיקסנול, 0.01 מ"ל של 1 M MgCl 2, 0.025 מ"ל של 1 M KCl, 0.1 מ"ל של 0.2 M חומצה אתילנדיאמינטטראאצטית (EDTA) ו-6.865 מ"ל של ddH2 O כדי לקבל 12% יודיקסנול.
- המתת עכבר מבוגר אחד עם מנת יתר של CO2 . בקצרה, מלא את כלוב העכבר עם 100% CO2 בשיעור תזוזה של 10-30% נפח כלוב לדקה 5 דקות מאוחר יותר, לאשר את המוות על ידי בדיקת היעדר נשימה נראית לעין.
- נתחו את החיה ואספו BAT בין-גולגולתי. הסר את שכבות ה-WAT והשרירים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- כדי לקבל עיכול מספיק, לחתוך כל אונת BAT לתוך ~ 3 מ"מ 3 חלקים ומניחים אותם לתוך בקבוק נקי 50 מ"ל עם מוט ערבוב מתכת תמיסת עיכול5 מ" ל. לפני תחילת העיכול, תנו לבקבוקון המכיל BAT וחיץ עיכול לשבת על קרח למשך שעה אחת.
הערה: בשלבים הבאים, כ-80 מ"ג BAT שימשו לבידוד אדיפוציטים חומים.
2. הליך בידוד BAs
- מניחים את הבקבוקון על מערבל מגנטי הסגור באינקובטור. הגדר את מהירות הערבוב ב -60 סל"ד ואת הטמפרטורה של האינקובטור ב -35 מעלות צלזיוס, בהתאמה. העיכול יימשך כ-30 דקות. אם פרוסות ה-BAT יוצרות גושים סביב מוט המערבל במהלך העיכול, השתמשו בקצה פיפטה של 1 מ"ל כדי לשבש את הרקמות המצטברות.
- הניחו מסנן מסננת של 70 מיקרומטר על גבי צינור צנטריפוגה נקי של 50 מ"ל. פיפטה סביב 4 מ"ל תא השעיה דרך המסננת. לשטוף את המסננת עם 4 מ"ל של 12% יודיקסנול פתרון. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התאים ואת תמיסת יודיקסנול. העבר את תערובת התאים לשתי מבחנות פוליסטירן שקופות של 5 מ"ל.
הערה: בסוף העיכול, תמיסת העיכול צריכה להיות עכורה, מה שמעיד על עיכול מספיק. השתמש בתמיסת עיכול טרי בכל פעם. לאחר ההכנה, יש להשתמש בתמיסת העיכול תוך שעתיים. - חזור על שלב 2.2 ו -2.3 פעם נוספת אם העיכול אינו מספיק.
- השאירו את צינורות הפוליסטירן השקופים המכילים את תמיסת ההפרדה וה-BAs על הקרח למשך שעה אחת. ה- BAs ייצרו שכבה בחלק העליון.
- הוציאו 20 μL מה-BAs המבודדים לבדיקה במיקרוסקופ.
3. רנ"א וחלבון בידוד מ-BAs
- פיזמו את שכבת ה-BAs לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.7 מ"ל לבידוד RNA וחלבונים. הסר בזהירות את תמיסת היודיקסנול המוגזמת מבלי לשבש את שכבת ה- BAs.
- הוסיפו 1 מ"ל טריזול כדי לבודד בו-זמנית RNA, DNA וחלבון לתמיסת התא. מערבבים מספיק כדי lyse את התאים.
- הוסיפו 200 מיקרון ליטר של כלורופורם כדי להפריד בין הפאזות.
- צנטריפוגה את הצינור עבור 9,981 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר צנטריפוגה, השתמש בפאזה המימית לבידוד RNA. במחקר זה, RNA כולל שימש לשעתוק הפוך, ו- RT-PCR כמותי בוצע עם PCR בזמן אמת. רצפי פריימרים מפורטים בטבלת החומרים.
- העבר 300 μL של הפאזה האורגנית לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל.
- לשלב האורגני, הוסיפו 2.5 נפח 100% אתנול ומערבולת במשך 10 שניות.
- הוסף 200 μL של 1-ברומו-3-כלורופרופאן ומערבולת במשך 10 שניות.
- הוסף 600 μL של מים מזוקקים כפולים מערבולת במשך 10 שניות.
- תן לתמיסה המעורבת לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה ב 9,981 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בשלב זה יופרדו השלבים. שלב החלבון ממוקם בשכבה האמצעית.
- הסר את התמיסה המימית העליונה. הוסף 1 מ"ל 100% אתנול לתוך הפתרון הנותר.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות, 9,981 x גרם, 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, כדור החלבון ייווצר. השליכו את הסופר-נטנט.
- לשטוף את הכדור עם 1 מ"ל 100% אתנול.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות, 9981 x גרם, 4 מעלות צלזיוס. שמור את הכדור והשלך את הסופרנטנט.
- יש לייבש את הכדור באוויר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- מדוד את משקל הכדור הרטוב. הוסף 1% תמיסת SDS ביחס של 20 μL / מ"ג גלולה.
- ממיסים את הכדור על ידי הכנסת הצינור לשייקר מחומם. הגדר את הטמפרטורה ב 55 °C (75 °F), ואת המהירות ב 11 x גרם. זה בדרך כלל לוקח 5-10 דקות כדי להמיס לחלוטין את גלולת החלבון.
הערה: ריכוז החלבון המומס ניתן למדידה על ידי בדיקת BCA14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכנת BAT אינטראקפולרי לבידוד אדיפוציטים חומים
תהליך הבידוד של האדיפוציטים החומים (BAs) מתואר באיור 1A. התהליך כולו, החל מהכנת BAT ופתרונות עיכול/הפרדה ועד לקבלת BAs מבודדים ייקח כ-4 שעות.
בעכברים בוגרים, BAT בשפע קיים באזור הבין-שבדי. ה-BAT הבין-סקפולרי הזה (iBAT) מכוסה על-ידי שכבות שרירים ו-WAT (איור 1B). לפני תחילת הליך העיכול, יש להסיר את שכבות השרירים וה-WAT כדי להפיק iBAT נקי (איור 1C). בפרוטוקול בידוד BAs שפורסם, BAT טחון שימש לבידודBAs 12. במחקר זה, עיכול של BAT בגודל3 מ"מ (איור 1D) הניב יותר BAs מאשר BAT טחון.
הפרדה בין BAs ללא BAs עם פתרון BSA של 3%
לאחר עיכול iBAT, BAs מנותקים היו מעורבבים עם שאינם BAs במוצר העיכול. מכיוון ש-BAs מכילים טיפות שומנים, צפיפותם נמוכה יותר מזו שאינה BAs; עם זאת, צפיפות ה-BAs אינה נמוכה מספיק כדי לאפשר להם לצוף ביעילות לראש תמיסת PBS רגילה. PBS המכיל 3% אלבומין בסרום בקר (BSA) שימש להפרדת BAs מ-BAs שאינם BAs12, מה שחזר על עצמו בהצלחה במחקר זה (איור 2A).
Rosa 26tdTomato הוא קו עכברים מדווח, המבטא חלבון פלואורסצנטי חזק של tdTomato (tdTom) בעקבות רקומבינציה בתיווך Cre13. Ucp1::עכברים מהונדסים של Cre מבטאים רקומבינאז Cre ב-BAs9. Ucp1::קו עכבר Cre נחצה עם עכברי Rosa 26tdTomato כדי לסמן גנטית BAs עם tdTom (איור 2B). לאימות הליך הבידוד של BAs, iBAT מעכברי Ucp1::Cre;tdTom/+ נותקו. רוב התאים המועשרים בשכבה העליונה של תמיסת BSA היו בצורת פטל והכילו טיפות שומנים רב-לוקולריות. יתר על כן, רוב התאים האלה בצורת פטל היו חיוביים ל-tdTom (איור 2C), מה שאישר שהם היו אדיפוציטים חומים.
הפרדה בין BAs ללא BAs עם תמיסת יודיקסנול של 6%
3% BSA פתרון הפרדת BAs מועשר. לא היה ברור אם ה-BAs המבודדים האלה יכולים לשמש לניתוח ביטוי גנים וחלבונים. לאחר מכן הופקו RNA וחלבון מה-BAs המועשרים. מיצוי ה-RNA בוצע בהצלחה על פי נוהל בידוד ה-RNA הסטנדרטי. עם זאת, פרוטוקול בידוד החלבון הסטנדרטי של Trizol, הידוע גם בשם שיטת Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (שיטת GTPC), לא עבד טוב, וזה היה מייגע והיה בעל תפוקת חלבון נמוכה מאוד. לכן, אומצה שיטת בידוד חלבונים משופרת למיצוי חלבון מ-BAs של Trizol-lysed.
בפרוטוקול GTPC משופר זה, אתנול, ברומו-כלורופרופאן ומים שימשו לחילוץ חלבון מהשלב האורגני15. לאחר הוספת אתנול, ברומו-כלורופרופאן ומים לפאזה האורגנית, ולאחר צנטריפוגה, כדור חלבון נוצר בין הפאזה המימית לפאזה האורגנית (איור 3A). לאחר מכן נשטף כדור חלבון עם 100% אתנול והומס ב-1% SDS. שיטת GTPC משופרת זו שימשה לחילוץ חלבון מ-BAs מועשרים בתמיסות iBAT ו-BSA. למרות שכדור החלבון BAT מומס בקלות ב-1% SDS, חלק גדול מכדור החלבון המבודד-BAs לא היה מסיס. לאחר מכן נבדק החלבון המומס בג'ל SDS-PAGE. כפי שניתן לראות בג'ל SDS-PAGE מוכתם בכחול של Coomassie (איור 3B), רצועת חלבון מסיבית של כ-60 kDa הייתה נוכחת ב-BAs המבודדים, אך לא בדגימות ה-BAT. מאחר שהמשקל המולקולרי של BSA הוא 66 kDa, ו-BSA בשפע קיים בתמיסת ההפרדה של BAs, פס החלבון הדומיננטי הזה צריך להיות BSA. נתונים אלה מצביעים על כך שה-BSA מתמיסת ההפרדה BAs מפריע למיצוי חלבונים.
יודיקסנול הוא מדיום שיפוע לא-יוני ואיזו-אוסמוטי16 שנעשה בו שימוש נרחב לטיהור נגיף הקשור לתא 17 ואדנו (AAV)18. כדי למנוע הפרעה של BSA במחקרי ביטוי חלבונים, נעשה שימוש ביודיקסנול כדי להחליף BSA בתמיסת הפרדת BAs חדשה. 3% BSA פתרון יש צפיפות של 1.03, אשר דומה עם 6% יודיקסנול. בתמיסת יודיקסנול של 6%, BAs צפו למעלה תוך 30-60 דקות (איור 3C). ה-BAs שבודדו עם התמיסה הזו הראו צורת פטל טיפוסית והכילו טיפות שומנים רב-לוקולריות (איור 3D). חלבונים שהופקו מה-BAs המבודדים האלה הופרדו יפה בג'ל SDS-PAGE (איור 3E).
כדי לוודא אם תמיסת 6% יודיקסנול הפרידה ביעילות בין BAs ללא BAs, תייגנו גנטית את ה-BAs עם tdTom ובדקנו את התאים השוכנים בתמיסת היודיקסנול הברורה של 6%. לאחר הפרדת ה-BAs מהלא-BAs (שלב 2.4), תמיסת היודיקסנול של 6% מתחת לשכבת ה-BAs דוללה 6 פעמים עם PBS ולאחר מכן עברה צנטריפוגה ב-600 x g למשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, נוצר כדור קטן של תאים אדומים בתחתית, אשר עשוי להיות תאי שבר כלי דם סטרומליים. כפי שניתן לראות באיור 3, תאים משכבת BAs היו תאים חיוביים tdTom (איור 3F); עם זאת, תאים שהתאוששו מהכדור היו שליליים tdTom (איור 3G). בנוסף, לא נראו טיפות שומנים ברורות בתאים השליליים של tdTom. נתונים אלה מצביעים על כך שהפרוטוקול החדש שלנו יכול להפריד ביעילות את ה-BAs מהתאים שאינם שומנים.
יחד, נתונים אלה מראים כי בידוד BAs עם תמיסת BSA של 3% מפריע למחקרי ביוכימיה עוקבים ומציעים כי תמיסת יודיקסנול של 6% עדיפה על תמיסת BSA של 3% לבידוד BAs.
ניתוח ביטוי גנים וחלבונים עם BAs מבודדים.
כדי לאמת את הליך הבידוד החדש של BAs ברמה המולקולרית, הושווה הביטוי של שלושה גנים בין BAT לבין BAs מבודדים: Ucp1, Pdgfa ו- Pdgfra. ב-BAT, Pdgfra מתבטא בתאי אנדותל ובתאים אינטרסטיציאליים, ותאים חיוביים PDGFRα הם תאי אב פוטטיביים10. רמות ה-mRNA של Ucp1 ו-Pdgfa היו גבוהות יותר באופן משמעותי ב-BAs המבודדים מאשר ב-BAT (איור 4A,B). להיפך, ה-mRNA של Pdgfra זוהה רק ב-BAT (איור 4B).
PPARγ הוא גורם שעתוק השולט על התפתחות רקמת השומן, UCP1 הוא חלבון מיטוכונדריה, ו- PDGFRα הוא חלבון קולטן ממברנה. שלושת החלבונים האלה מייצגים חלבונים המפוזרים בתאים שונים. כתמים מערביים בוצעו כדי לבחון אם חלבון המופק מ- BAs ו- BAT של Trizol-lysed מתאים לניתוח ביטוי חלבונים. UCP1 ו-PPARγ זוהו גם ב-BAs וגם ב-BAT (איור 4C,D), מה שמאשר שהחלבון הכולל שבודד מה-BAs או ה-BAT של טריזול מתאים לכתם המערבי. יתר על כן, בהתאם לתוצאות qRT-PCR, חלבון UCP1 הועשר ב-BAs (איור 4C); ואילו PDGFRα זוהה רק ב-BAT אך לא ב-BAs טהורים (איור 4D). לסיכום, נתונים אלה מראים כי שיטת הבידוד החדשה שלנו של BAs יעילה ומציעים כי BAs מועשרים בשיטה זו יכולים לשמש ישירות למחקרי ביטוי גנים וחלבונים.
איור 1: הכנת iBAT לבידוד אדיפוציטים חומים . (A) זרימת עבודה של הליך בידוד האדיפוציטים החומים. (B) מבט גחוני של הרקמה הבין-סקפולרית המכילה BAT, WAT ושכבות שריר. (C) BAT בין-שפתי (iBAT). שכבות שרירים ו-WAT הסמוכים ל-iBAT הוסרו. (D) תמונה מייצגת של חתיכות iBAT המשמשות לבידוד אדיפוציטים חומים. B-D, סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הפרדת אדיפוציטים חומים מתמיסת עיכול. (A) תמונות של אדיפוציטים חומים מנותקים לפני ואחרי ההפרדה. תמיסת BSA של 3% שימשה להפרדת אדיפוציטים חומים מאדיפוציטים שאינם חומים. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (B) תצוגה סכמטית של תיוג גנטי של אדיפוציטים חומים עם חלבון פלואורסצנטי tdTomato. (C) תמונות של אדיפוציטים חומים מבודדים. DIC, ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מיצוי סך החלבון מאדיפוציטים חומים שוכבים . (A) הפרדת שלב החלבון מהשלב האורגני. (B) צביעת קומאסי של ג'ל SDS-PAGE. סה"כ החלבון הופק מתמיסת BAT או 3% BSA מאדיפוציטים חומים מטוהרים. רצועת חלבון BSA סומנה על ידי חץ. (C) שכבת אדיפוציטים חומה הנוצרת על גבי תמיסת יודיקסנול של 6%. סרגל אבנית = 1 ס"מ. (D) אדיפוציטים חומים מבודדים עם תמיסת יודיקסנול 6%. אדיפוציטים חומים סומנו על ידי חיצים צהובים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (E) צביעת קומאסי של ג'ל SDS-PAGE. סה"כ החלבון הופק מתמיסת BAT או 6% יודיקסנול מועשרת BAs. (F) תמונות של tdTom עם תווית אדיפוציטים חומים. (G) תמונות של תאים שהתאוששו מתמיסת יודיקסנול מתחת לשכבת BAs. F ו- G, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניתוח ביטוי גנים וחלבונים של אדיפוציטים חומים מבודדים. אדיפוציטים חומים שבודדו בשיטת יודיקסנול שימשו במחקרי ביטוי גנים וחלבונים אלה. (A,B) מדידת qRT-PCR של ביטוי גנים. רמות ה-mRNA נורמלו ל-36B4. N=3. מבחן t תלמיד, *, P<0.01; **, עמ' <0.01. (C) כתם מערבי של PPARγ ו-UCP1. (ד) כתם מערבי של PDGFRα. C ו- D, קרום מוכתם S של פונסו שימש כבקרת העמסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה פותחה שיטה חדשה לבידוד BAs לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.
בפרוטוקול בידוד BAs שפורסם, נעשה שימוש בפתרון BSA של 3% להעשרת BAs12. עם זאת, לא ניתן היה להשתמש ישירות ב-BAs המועשר שהושגו על ידי פרוטוקול זה שפורסם לצורך ניתוח ביטוי חלבונים. הסיבה לכך היא שה-BSA המרוכז הקיים בתמיסת ה-BAs מפריע למעקב אחר מיצוי חלבונים. כאשר ה-BAs המועשרים בתמיסת 3% BSA טופלו במגיב Trizol, נוצרו אגרגטים של חלבונים דביקים, שרובם לא היו מסיסים בתהליך מיצוי החלבון GTPC. בנוסף, במוצר מיצוי החלבון GTPC, רוב החלבון היה BSA (איור 3B). בפרוטוקול חדש זה, פתרון הפרדת BSA של 3% הוחלף ב- 6% יודיקסנול לטיהור BAs. תמיסת יודיקסנול של 6% הפרידה ביעילות בין ה-BAs ללא ה-BAs, וה-BAs המבודדים שימרו את המורפולוגיה (איור 3D). תמיסת BSA עדיפה על 3% BSA, תמיסת יודיקסנול של 6% לא הפריעה למיצוי חלבונים, והחלבון שחולץ היה מתאים לניתוח כתמים מערביים (איור 4C,D).
רקמת השומן מכילה כמות גדולה של שומנים, וזיהום שומנים בדגימות חלבון שחולצו מעכב את מדידת ריכוז החלבון. לאחרונה פורסם פרוטוקול להסרת שומנים ממיצוי חלבונים. בפרוטוקול זה נדרשת סדרה של צנטריפוגות בטמפרטורה נמוכה, שהיא מייגעת וזקוקה לכמות גדולה של חומרי מוצא19. במחקר הנוכחי אומצה שיטת GTPCמשופרת 15 לבידוד חלבון מ-BAT. בשונה מפרוטוקול GTPC הקלאסי, פרוטוקול GTPC משופר זה השתמש באתנול, ברומו-כלורופרופאן ומים כדי לחלץ חלבון מהפאזה האורגנית. הנתונים שלנו הראו כי חלבון שבודד בשיטת GTPC משופרת זו תואם למדידת ריכוז חלבון המבוססת על בדיקת חומצה ביסינצ'ונית (BCA).
בפרוטוקול הבידוד הנוכחי של BAs, לפני תחילת תהליך הדיסוציאציה של האנזים, תערובת ה-BAT ותמיסת העיכול הונחו על קרח למשך שעה אחת. מטרת הליך זה היא להפחית את חילוף החומרים בתאים ואת קצב ביטוי הגנים20, כמו גם לאפשר לאנזימי העיכול לחדור ביעילות לרקמת השומן החומה.
המחקר הנוכחי נועד לפתח שיטת straitforward לבידוד אדיופוציטים חומים מ-BAT בין-סקפולרי לצורך מחקר ביטוי גנים; עם זאת, זיהום אדיפוציטים לבנים עשוי להתקיים ב- BAs המבודדים. הסיבה לכך היא כי BAT interscapular מחובר לפעמים על ידי רקמת שומן לבן, אשר לא ניתן להסיר לחלוטין במהלך שלב ההכנה BAT. הפרוטוקול הנוכחי אינו יכול להפריד בין BAs ל- WAs בהתבסס על צפיפות התא. לכן, אם טוהר גבוה מאוד הוא חיוני, יש למיין את ה- BAs המבודדים לפי FACS לפני שהם מנותחים.
ה-BAT הבין-סקפולרי (iBAT) מכיל שפע של BAs קלאסיים שמקורם בשושלת תאי Myf5 במהלך ההתפתחות העוברית21. כאן iBAT שימש כדוגמה לבידוד BAs. בדומה לפרוטוקול12 שפורסם, השיטה שלנו יכולה לשמש גם לבידוד תאי בז' מ-WAT. עם זאת, כדי לרכוש תאי בז' טהורים מ-WAT, תאי הבז' צריכים להיות מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ולהיות מועשרים על ידי FACS. בהמשך לפרוטוקול הנוכחי שלנו, ניתן להשתמש בתאי בז' מועשרים ב-FACS הן לניתוח ביטוי גנים והן לניתוחי חלבונים, מה שישפר מאוד את היעילות של ניצול חומרים ביולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא
Acknowledgments
Z. Lin נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות HL138454-01 וקרנות מכון המחקר הרפואי הבונים החופשיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S.
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
