Summary
Это исследование описывает новый метод выделения мышиных коричневых адипоцитов для анализа экспрессии генов и белков.
Abstract
Коричневая жировая ткань (BAT) отвечает за недрожащий термогенез у млекопитающих, а коричневые адипоциты (BA) являются функциональными единицами BAT. БА содержат как мультилокулярные липидные капли, так и обильные митохондрии, и они экспрессируют разъединяющий белок 1 (UCP1). БА подразделяются на два подтипа в зависимости от их происхождения: классические БА, полученные из эмбриона (цБА), и БА, полученные из белых адипоцитов. Из-за их относительно низкой плотности БА не могут быть выделены из НИМ традиционным методом центрифугирования. В этом исследовании был разработан новый метод выделения БА от мышей для анализа экспрессии генов и белков. В этом протоколе межлопаточный BAT у взрослых мышей переваривали раствором коллагеназы и диспазы, а диссоциированные БА обогащали 6% раствором йодиксанола. Затем выделенные БА лизировали реагентом тризол для одновременного выделения РНК, ДНК и белка. После выделения РНК органическая фаза лизата использовалась для экстракции белка. Наши данные показали, что 6% раствор йодиксанола эффективно обогащал БА, не вмешиваясь в последующие исследования экспрессии генов и белков. Тромбоцитарный фактор роста (PDGF) является фактором роста, который регулирует рост и пролиферацию мезенхимальных клеток. По сравнению с коричневой жировой тканью, изолированные БА имели значительно более высокую экспрессию Pdgfa. Таким образом, этот новый метод обеспечивает платформу для изучения биологии коричневых адипоцитов на уровне одного клеточного типа.
Introduction
Как мыши, так и люди имеют два типа жировых тканей: белая жировая ткань (WAT) и коричневая жировая ткань (BAT)1. WAT хранит энергию в виде триглицеридов в белых адипоцитах, а коричневые адипоциты (BA) BAT рассеивают химическую энергию в виде тепла2. Основываясь на своем происхождении развития, БА далее классифицируются на классические БА (цБА), которые образовались во время развития эмбриона, и белые адипоциты, полученные из БА (бежевые / бритовые клетки, преобразованные из белых адипоцитов в условиях стресса)3. БА являются многолокулярными и экспрессируют термогенный белок, разъединяющий белок 1 (UCP1)4. Депо межлопастных BAT (iBAT) является одним из основных депо cBA у мелких млекопитающих5, тогда как бежевые клетки диспергированы внутри WAT6.
Из-за своей природы рассеивания энергии, БА получили большое внимание в качестве терапевтической мишени для снижения ожирения7. Чтобы использовать БА для лечения ожирения, важно понимать молекулярные механизмы, которые контролируют функцию, выживание и рекрутирование БА. Жировые ткани, включая BAT и WAT, неоднородны. За исключением адипоцитов, жировые ткани содержат много других типов клеток, таких как эндотелиальные клетки, мезенхимальные стволовые клетки и макрофаги8. Хотя доступны генетические инструменты для конкретного истощения генов-кандидатов у мышей, такие как UCP1: Cre line9, методы очистки БА от BAT или WAT ограничены, что затрудняет изучение БА на уровне одноклеточного типа. Кроме того, без получения чистых БА отношения между БА и не-БА не будут четко очерчены. Например, рецептор фактора роста тромбоцитов альфа (PDGFRα) был использован в качестве маркера для недифференцированных мезенхимальных клеток, и он экспрессируется в эндотелиальных и интерстициальных клетках BAT. При холодном стрессе BAT PDGFRα положительные клетки-предшественники дают начало новым BA10. PDGFRα активируется его лигандом PDGF, фактором роста, который регулирует рост и пролиферацию мезенхимальных клеток11; однако неясно, влияют ли БА на поведение PDGFRα-положительных клеток-предшественников путем секреции PDGF.
Недавно был опубликован протокол изоляции БА, который основан на флуоресцентно-активированной сортировке клеток (FACS)12. В этом протоколе 3% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) использовался для отделения БА от не-БА, а обогащенные БА дополнительно очищались FACS. Применение этого протокола ограничено требованием процесса СУИМ, который опирается как на оборудование, так и на опыт работы СУИМ. В этом исследовании был разработан новый протокол изоляции БА от НИМ. БА, выделенные этим протоколом, могут быть непосредственно использованы для исследований экспрессии генов и белков. Кроме того, данные этого исследования свидетельствуют о том, что БА являются основным ресурсом PDGF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши содержались в условиях, свободных от патогенов, и все процедуры были одобрены Масонским медицинским исследовательским Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC). UCP1::Cre9 и Rosa 26tdTomato мыши линии13 были зарегистрированы ранее. Всех мышей держали при комнатной температуре с циклом 12 ч света/темноты.
1. Приготовление растворов и коричневой жировой ткани (НДТ)
- Приготовьте раствор для пищеварения и разделительный раствор в центрифужных пробирках по 15 мл.
- 10 мл раствора BAT Digestion: До 10 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), добавьте 3,5 мг/ мл диспазы II, 1 мг / мл коллагеназы II и 10 мМ CaCl2 для приготовления раствора для пищеварения BAT.
- 10 мл 12% раствора йодиксанола (разделительный раствор): Смешать 1 мл 10x PBS, 2 мл 60% йодиксанола, 0,01 мл 1 M MgCl2, 0,025 мл 1 M KCl, 0,1 мл 0,2 M этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 6,865 мл ddH2Oдля получения 12% йодиксанола.
- Усыпить одну взрослую мышь с передозировкой CO2 . Вкратце, заполните клетку мыши 100% CO2 со скоростью смещения 10-30% объема клетки в мин. через 5 мин, подтвердите смерть, проверив на отсутствие видимого дыхания.
- Рассекните животное и соберите межлопаточные НДТ. Удалите WAT и мышечные слои под стереомикроскопом.
- Для достаточного переваривания разрежьте каждую долю BAT на ~ 3 мм3 части и поместите их в чистую колбу объемом 50 мл с металлическим перемешивателем и 5 мл раствора для сбраживания. Перед началом пищеварения дайте колбе, содержащей BAT и буфер пищеварения, постоять на льду в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: На следующих этапах около 80 мг BAT использовалось для выделения коричневых адипоцитов.
2. Процедура изоляции БА
- Поместите колбу на магнитную мешалку, которая заключена в инкубатор. Установите скорость перемешивания на уровне 60 об/мин и температуру инкубатора на уровне 35 °C соответственно. Пищеварение будет длиться около 30 минут. Если ломтики BAT образуют сгустки вокруг мешалки во время пищеварения, используйте наконечник пипетки 1 мл, чтобы разрушить агрегированные ткани.
- Поместите фильтр сетчатого фильтра 70 мкм поверх чистой центрифужной трубки объемом 50 мл. Пипетка около 4 мл клеточной суспензии через ситечко. Промыть ситечко 4 мл 12% раствора йодиксанола. Пипетка вверх и вниз для смешивания клеток и раствора йодиксанола. Переложите клеточную смесь в две прозрачные пробирки из полистирола по 5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: В конце пищеварения раствор для пищеварения должен быть мутным, что указывает на достаточное пищеварение. Используйте свежий раствор для пищеварения каждый раз. После приготовления раствор для пищеварения следует использовать в течение 2 ч. - Повторите шаги 2.2 и 2.3 еще раз, если пищеварение недостаточно.
- Оставьте прозрачные полистирольные трубки, содержащие разделительный раствор и БА, на льду на 1 ч. БА образуют слой сверху.
- Выньте 20 мкл изолированных БА для исследования в микроскоп.
3. Выделение РНК и белка из БА
- Пипетка слоя БА на две микроцентрифужные трубки объемом 1,7 мл для выделения РНК и белка. Осторожно удалите избыточный раствор йодиксанола, не нарушая слой БА.
- Добавьте 1 мл тризола для одновременного выделения РНК, ДНК и белка в клеточном растворе. Смешайте достаточно, чтобы щелкнуть клетки.
- Добавьте 200 мкл хлороформа, чтобы разделить фазы.
- Центрифугируйте трубку по 9,981 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- После центрифугирования используют водную фазу для выделения РНК. В этом исследовании общая РНК использовалась для обратной транскрипции, а количественная ОТ-ПЦР проводилась с помощью ПЦР в реальном времени. Последовательности грунтовок перечислены в Таблице материалов.
- Перенесите 300 мкл органической фазы в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл.
- К органической фазе добавляют 2,5 объема 100% этанола и вихрь в течение 10 с.
- Добавьте 200 мкл 1-бром-3-хлорпропана и вихрь в течение 10 с.
- Добавьте 600 мкл двойной дистиллированной воды и вихрь в течение 10 с.
- Дайте смешанному раствору постоять 10 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга при 9,981 х г в течение 10 мин при 4 °C. На этом этапе фазы будут разделены. Белковая фаза локализуется в среднем слое.
- Сверху удалить водный раствор. Добавьте 1 мл 100% этанола в оставшийся раствор.
- Центрифуга в течение 10 мин, 9,981 x g, 4 °C. После центрифугирования образуется белковая гранула. Выбросьте супернатант.
- Промыть гранулу 1 мл 100% этанола.
- Центрифуга в течение 10 мин, 9981 х г, 4 °C. Сохраните гранулу и выбросьте супернатант.
- Высушите гранулы на воздухе в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Измерьте вес мокрой гранулы. Добавьте 1% раствор SDS в соотношении 20 мкл/мг гранулы.
- Растворите гранулу, поместив трубку в нагретый шейкер. Установите температуру на уровне 55 °C, а скорость на 11 x g. Обычно требуется 5-10 минут, чтобы полностью растворить белковую гранулу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация растворенного белка может быть измерена с помощью анализа BCA14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Препарат интеракапулярного НИМ для выделения коричневых адипоцитов
Процесс выделения коричневых адипоцитов (БА) изображен на рисунке 1А. Весь процесс, от приготовления НИМ и растворов для сбраживания/разделения до получения изолированных БА, займет около 4 ч.
У взрослых мышей обильный BAT существует в межлопаточной области. Этот межлопастной BAT (iBAT) покрыт мышечными слоями и WAT (рисунок 1B). Перед началом процедуры пищеварения мышечные слои и WAT должны быть удалены, чтобы получить чистый iBAT (рисунок 1C). В опубликованном протоколе изоляции БА для изоляции БА12 использовался измельченный НИМ. В этом исследовании пищеварение 3 мм3 размера BAT (рисунок 1D) дало больше BA, чем измельченный BAT.
Отделение БА от неБА с помощью 3% раствора BSA
После переваривания iBAT диссоциированные БА смешивали с не-БА в продукте пищеварения. Поскольку БА содержат капли липидов, их плотность ниже, чем у неБА; однако плотность BA недостаточно низкая, чтобы позволить им эффективно плавать к вершине обычного решения PBS. PBS, содержащий 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA), был использован для отделения BA от non-BA12, что было успешно повторено в этом исследовании (рисунок 2A).
Rosa 26tdTomato представляет собой репортерную линию мыши, которая экспрессирует сильный белок флуоресценции tdTomato (tdTom) после cre-опосредованной рекомбинации13. Ucp1::Кре трансгенные мыши экспрессируют Cre рекомбиназу в БА9. Линия мыши Ucp1::Cre была скрещена с мышами Rosa 26tdTomato для генетической маркировки BA с помощью tdTom (рисунок 2B). Для проверки процедуры изоляции БА iBAT от мышей Ucp1::Cre;tdTom/+ был диссоциирован. Большинство клеток, обогащенных в верхнем слое раствора BSA, имели малиновую форму и содержали мультилокулярные липидные капли. Кроме того, большинство из этих клеток малиновой формы были tdTom положительными (рисунок 2C), подтверждая, что они были коричневыми адипоцитами.
Отделение БА от неБА 6% раствором йодиксанола
3% раствор для разделения BSA, обогащенный БА. Было неясно, могут ли эти изолированные БА быть использованы для анализа экспрессии генов и белков. Затем РНК и белок извлекали из обогащенных БА. Экстракция РНК была успешно выполнена в соответствии со стандартной процедурой выделения РНК. Однако стандартный протокол выделения белка тризола, также известный как метод Гуанидиниум тиоцианат-фенол-хлороформ (метод GTPC), не работал хорошо, что было утомительно и имело очень низкий выход белка. Поэтому был принят улучшенный метод выделения белка для извлечения белка из тризол-лизированных БА.
В этом улучшенном протоколе GTPC этанол, бром-хлорпропан и вода использовались для извлечения белка из органической фазы15. После добавления этанола, бромхлорпропана и воды в органическую фазу, а после центрифугирования между водной фазой и органической фазой образуется белковая гранула (рисунок 3А). Затем белковую гранулу промывали 100% этанолом и растворяли в 1% SDS. Этот улучшенный метод GTPC использовался для извлечения белка из bAs, обогащенных раствором iBAT и BSA. Хотя белковая гранула BAT легко растворялась в 1% SDS, большая часть выделенной белковой гранулы BA не была растворимой. Затем растворенный белок исследовали гелем SDS-PAGE. Как показано в синем окрашенном геле SDS-PAGE Coomassie (рисунок 3B), массивная белковая полоса около 60 кДа присутствовала в изолированных БА, но не в образцах BAT. Поскольку молекулярная масса BSA составляет 66 кДа, а в растворе для разделения BA существует обильный BSA, эта доминирующая белковая полоса должна быть BSA. Эти данные свидетельствуют о том, что BSA из раствора разделения BA препятствует экстракции белка.
Йодиксанол представляет собой неионную и изоосмотическую градиентную среду16 , которая широко используется для очистки клеток17 и аденоассоциированного вируса (AAV)18. Чтобы избежать интерференции BSA в исследованиях экспрессии белка, йодиксанол использовался для замены BSA в новом растворе для разделения BA. 3% раствор BSA имеет плотность 1,03, что аналогично 6% йодиксанолу. В 6% растворе йодиксанола БА всплывали к вершине через 30-60 мин (рисунок 3С). БА, выделенные с помощью этого раствора, показали типичную форму малины и содержали мультилокулярные липидные капли (рисунок 3D). Белки, извлеченные из этих изолированных БА, были хорошо разделены в геле SDS-PAGE (рисунок 3E).
Чтобы проверить, эффективно ли 6% раствор йодиксанола отделяет БА от не-БА, мы генетически маркировали БА tdTom и исследовали клетки, находящиеся в прозрачном 6% растворе йодиксанола. После отделения БА от не-БА (стадия 2.4) 6% раствор йодиксанола ниже слоя БА разбавляли 6 раз PBS и затем центрифугировали при 600 х г в течение 5 мин. После центрифугирования на дне образовалась небольшая гранула эритроцитов, которая могла быть стромальной сосудистой фракцией. Как показано на рисунке 3, ячейки из слоя БА были tdTom положительными клетками (рисунок 3F); однако клетки, извлеченные из гранулы, были tdTom отрицательными (рисунок 3G). Кроме того, в отрицательных клетках tdTom не было видно явных липидных капель. Эти данные свидетельствуют о том, что наш новый протокол может эффективно отделять БА от нежировых клеток.
Вместе эти данные демонстрируют, что выделение БА с 3% раствором BSA мешает последующим биохимическим исследованиям и предполагают, что 6% раствор йодиксанола лучше, чем 3% раствор BSA для выделения БА.
Анализ экспрессии генов и белков с изолированными БА.
Для проверки этой новой процедуры выделения БА на молекулярном уровне сравнивали экспрессию трех генов между BAT и изолированными BA: Ucp1, Pdgfa и Pdgfra. В BAT Pdgfra экспрессируется в эндотелиальных клетках и интерстициальных клетках, а PDGFRα-положительные клетки являются предполагаемыми клетками-предшественниками10. Уровни мРНК Ucp1 и Pdgfa были значительно выше в изолированных БА, чем в BAT (рисунок 4A,B). Напротив, мРНК Pdgfra была обнаружена только в BAT (рисунок 4B).
PPARγ является транскрипционным фактором, контролирующим развитие жировой ткани, UCP1 - белком митохондрий, а PDGFRα - белком мембранных рецепторов. Эти три белка представляют собой белки, распределенные в разных клеточных компартментах. Вестерн-блоттинги были проведены, чтобы проверить, подходит ли белок, извлеченный из тризол-лизированных БА и BAT, для анализа экспрессии белка. UCP1 и PPARγ были обнаружены как в БА, так и в НИМ (рисунок 4C,D), подтверждая, что общий белок, выделенный из тризол-лизированных БА или БАТ, подходит для вестерн-блоттинга. Кроме того, в соответствии с результатами qRT-PCR белок UCP1 был обогащен БА (рисунок 4C); в то время как PDGFRα был обнаружен только в BAT, но не в чистых BA (рисунок 4D). Таким образом, эти данные демонстрируют, что наш новый метод выделения БА является эффективным, и предполагают, что БА, обогащенные этим методом, могут быть непосредственно использованы для исследований экспрессии генов и белков.
Рисунок 1: Подготовка iBAT к выделению коричневых адипоцитов. (A) Рабочий процесс процедуры выделения коричневых адипоцитов. (B) Вентральный вид межлопастной ткани, содержащей BAT, WAT и мышечные слои. с) МЕЖЛОПАСТНЫЕ НИМ (иБАТ). Мышечные слои и WAT, прилегающие к iBAT, были удалены. (D) Репрезентативное изображение кусочков iBAT, используемых для выделения коричневых адипоцитов. B-D, Шкала = 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Отделение коричневых адипоцитов от пищеварительного раствора. (А) Изображения диссоциированных коричневых адипоцитов до и после разделения. 3% раствор BSA использовали для отделения коричневых адипоцитов от небурых адипоцитов. Шкала bar = 1 см. (B) Схематическое представление генетической маркировки коричневых адипоцитов флуоресцентным белком tdTomato. (C) Изображения изолированных коричневых адипоцитов. DIC, дифференциальный интерференционный контраст. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Экстракция общего белка из лизированных коричневых адипоцитов. (А) Отделение белковой фазы от органической фазы. (B) Окрашивание Coomassie гелем SDS-PAGE. Общий белок экстрагировали из БАТ или 3% раствора BSA, очищенного коричневыми адипоцитами. Полоса белка BSA была обозначена стрелкой. (C) Коричневый слой адипоцитов образуется поверх 6% раствора йодиксанола. Шкала бара = 1 см. (D) Коричневые адипоциты, выделенные 6% раствором йодиксанола. Коричневые адипоциты обозначались желтыми стрелками. Шкала стержня = 50 мкм. (E) Окрашивание гелем SDS-PAGE. Общий белок экстрагировали из БАТ или 6% раствора йодиксанола, обогащенного БА. (F) Изображения меченых tdTom коричневых адипоцитов. (G) Изображения клеток, извлеченных из раствора йодиксанола ниже слоя БА. F и G, шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ экспрессии генов и белков изолированных коричневых адипоцитов. Коричневые адипоциты, выделенные методом йодиксанола, использовались в этих исследованиях экспрессии генов и белков. (A,B) qRT-PCR измерение экспрессии генов. Уровни мРНК нормализовались до 36В4. N=3. Студенческий t тест, *, P<0.01; **, С<0.01. (C) Вестерн-блоттинг PPARγ и UCP1. (Г) Вестерн-блоттинг PDGFRα. C и D, S-окрашенная мембрана Ponceau использовалась в качестве контроля нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании был разработан новый метод выделения БА для анализа экспрессии генов и белков.
В опубликованном протоколе изоляции БА для обогащения БА12 использовался 3% раствор BSA. Тем не менее, обогащенные БА, достигнутые этим опубликованным протоколом, не могут быть непосредственно использованы для анализа экспрессии белка. Это связано с тем, что концентрированный BSA, существующий в растворе BA, препятствует последующей экстракции белка. Когда БА, обогащенные 3% раствором BSA, обрабатывали реагентом тризола, образовывались липкие белковые агрегаты, большинство из которых не были растворимы в процессе экстракции белка GTPC. Кроме того, в продукте экстракции белка GTPC большая часть белка была BSA (рисунок 3B). В этом новом протоколе 3% раствор для разделения BSA был заменен 6% йодиксанолом для очистки БА. 6% раствор йодиксанола эффективно отделял БА от не-БА, а изолированные БА имели сохраненную морфологию (рисунок 3D). Превосходя 3% раствор BSA, 6% раствор йодиксанола не мешал экстракции белка, и экстрагированный белок был пригоден для анализа вестерн-блоттинга (рисунок 4C,D).
Жировая ткань содержит большое количество липидов, а загрязнение липидами в извлеченных образцах белка препятствует измерению концентрации белка. Недавно был опубликован протокол по удалению липидов из белковых экстракций. В этом протоколе требуется серия низкотемпературных центрифугаций, что утомительно и требует большого количества исходных материалов19. В текущем исследовании был принят улучшенный методGTPC 15 для выделения белка из BAT. В отличие от классического протокола GTPC, этот улучшенный протокол GTPC использовал этанол, бром-хлорпропан и воду для извлечения белка из органической фазы. Наши данные показали, что белок, выделенный с помощью этого улучшенного метода GTPC, был совместим с измерением концентрации белка на основе анализа бицинхониновой кислоты (BCA).
В текущем протоколе выделения БА перед началом процесса диссоциации ферментов смесь НИМ и раствора для пищеварения помещали на лед на один час. Целью этой процедуры является снижение клеточного метаболизма и скорости экспрессии генов20, а также позволить ферментам пищеварения эффективно проникать в коричневую жировую ткань.
Текущее исследование было направлено на разработку прямолинейного метода выделения коричневых адиопоцитов из межлопаточных BAT для изучения экспрессии генов; однако загрязнение белыми адипоцитами может существовать в изолированных БА. Это связано с тем, что межлопастная BAT иногда прикрепляется белой жировой тканью, которая не может быть полностью удалена на этапе подготовки BAT. Текущий протокол не может отделять BA от WA на основе плотности клеток. Поэтому, если очень высокая чистота имеет важное значение, изолированные БА должны быть отсортированы FACS перед анализом.
Межлопастная BAT (iBAT) содержит обильные классические БА, полученные из клеточной линии Myf5 во время эмбрионального развития21. Здесь iBAT был использован в качестве примера для изоляции БА. Подобно опубликованному протоколу12, наш метод также может быть использован для выделения бежевых клеток из WAT. Тем не менее, чтобы получить чистые бежевые клетки из WAT, бежевые клетки должны быть помечены флуоресцентным белком и обогащены FACS. Следуя нашему текущему протоколу, обогащенные FACS бежевые клетки могут быть использованы как для анализа экспрессии генов, так и для белка, что значительно повысит эффективность использования биологических материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой
Acknowledgments
Z. Lin был поддержан фондами Национального института здравоохранения HL138454-01 и Масонского медицинского научно-исследовательского института.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S.
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
