Summary
Este protocolo descreve o procedimento para remover o lobo ventral do fígado em zebrafish adulto para permitir o estudo da regeneração hepática.
Abstract
A insuficiência hepática é uma das principais causas de morte em todo o mundo, e a mortalidade por doença hepática crônica está aumentando acentuadamente nos Estados Unidos. Fígados saudáveis são capazes de se regenerar de danos tóxicos, mas em doença hepática avançada, a capacidade natural do fígado de se regenerar é prejudicada. Os zebrafish emergiram como um poderoso sistema experimental para estudar a regeneração. São um modelo ideal para estudar a regeneração hepática a partir da hepatectomia parcial, procedimento com relevância clínica direta em que parte do fígado é removida cirurgicamente, deixando o resto intacto. Não há protocolo padrão para hepatectomia parcial; estudos anteriores utilizando este modelo têm usado protocolos ligeiramente diferentes e relatado resultados diferentes. Descrito aqui é um protocolo eficiente e reprodutível para a realização de uma hepatectomia parcial em zebrafish adulto. Usamos esta técnica para demonstrar que os zebrafish são capazes de regeneração epimórfica do lobo ressecado. Este protocolo pode ser usado para interrogar ainda mais os mecanismos necessários para a regeneração hepática em zebrafish.
Introduction
Entre os órgãos sólidos em humanos, o fígado é o único órgão capaz de regenerar1. Isso é crítico, pois o fígado é um órgão essencial, responsável pelas principais funções metabólicas, armazenamento de energia, desintoxicação sanguínea, secreção de proteínas plasmáticas e produção de bile2. Hepatócitos perdidos devido a danos tóxicos ou inflamatórios são substituídos principalmente por divisão dos hepatócitos restantes1. Um modelo experimental clássico para estudar a regeneração hepática é a hepatectomia parcial, onde os lobos individuais do fígado são removidos, deixando os lóbulos restantes intactos3. Este procedimento foi inicialmente desenvolvido em ratos, nos quais aproximadamente dois terços da massa hepática é removida. Após hepatectomia parcial em mamíferos, a regeneração compensatória ocorre nos lóbulos restantes até que o fígado recupere sua massa inicial. Notavelmente, o fígado mamífero não substitui os lóbulos perdidos.
O zebrafish (Danio rerio) representa um modelo tratável para estudar a regeneração de órgãosadultos 4. O fígado de zebrafish, embora estruturalmente diferente do fígado mamífero, é composto pelos mesmos tipos de células e serve a mesma função dos mamíferos2. É composto por três lóbulos, com dois lobos dorsais e um único lobo ventral que são achatados ao longo do intestino. A hepatectomia parcial já foi realizada anteriormente em zebrafish, com relatos conflitantes quanto ao modo preciso de regeneração. Normalmente, uma hepatectomia parcial de um terço é realizada pela remoção de todo o lobo ventral. Relatórios iniciais indicaram que, após a remoção do lobo ventral, ele foi totalmente regenerado dentro de uma semana5,6,7, sugerindo que, em contraste com o fígado mamífero, o fígado de zebrafish é capaz de regeneração epimórfica. Estudos subsequentes demonstraram que a remoção do lobo ventral resultou em regeneração compensatória nos lobos dorsais, em vez da regeneração do lobo ventral perdido, e, finalmente, a recuperação da massa hepática dentro de uma semana8,9. O perfil transcriômico dos lobos dorsais após a ressecção do lobo ventral revelou alterações significativas associadas à regeneração compensatória10. Dado que o modo de regeneração hepática pode variar com a extensão da lesão8,especulamos que as discrepâncias nos resultados podem ser devido à variação técnica no protocolo de hepatectomia parcial entre grupos de pesquisa.
Este protocolo descreve um procedimento para a realização de uma hepatectomia parcial de um terço em zebrafish adulto, removendo o lobo ventral. Esta técnica será valiosa para avaliar mecanismos de regeneração hepática.
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Protocol
Os zebrafish foram criados e criados de acordo com os procedimentos padrão. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Brigham e da Mulher (2016N000405). Os zebrafish adultos foram jejuados por 24 horas antes do início do protocolo. A água do sistema refere-se à água em tanques de carcaça de zebrafish na instalação aquática.
1. Preparação e anestesia
- Prepare 0,016% solução tricaine em água do sistema.
ATENÇÃO: Tricaine é um irritante se entrar em contato com os olhos, pele ou trato respiratório. - Prepare uma esponja para segurar zebrafish anestesiado durante o protocolo de dissecção. Corte uma esponja completa em moedas. Usando uma lâmina de barbear, remova uma fina cunha de esponja que corre paralelamente ao longo eixo do quarto da esponja.
- A fenda deve ser longa o suficiente para acomodar um peixe adulto (isso vai variar entre diferentes tamanhos de peixe). Por exemplo, para um peixe adulto com 35 mm de comprimento, o comprimento da fenda deve ser de 20 mm. A cabeça e o corpo são snugly mantidos na esponja, mas a cauda passa pela borda da esponja(Figura 1B).
- Mergulhe a esponja em solução tricaine 0,016%.
- Coloque o zebrafish adulto (masculino ou feminino) em 625 mL de solução tricaine de 0,016%.
- Incubar por 6 minutos ou até que o peixe não responda ao toque.
- Usando fórceps, retire cuidadosamente o peixe do tanque Tricaine e coloque o lado ventral do peixe para cima na ranhura da esponja(Figura 1A - B).
- Coloque a esponja sob um microscópio dissecando com iluminação de cima para baixo.
2. Cirurgia
- Usando fórceps finos, belisque a pele e escamas mediadamente, apenas posterior ao coração(Figura 1B).
- Usando uma tesoura carregada de mola, faça um corte sob as fórceps para criar um buraco na cavidade corporal (Figura 1C - D). Tome cuidado para não ferir o coração ou um vaso sanguíneo importante, pois isso resultará em aumento da mortalidade.
- Utilizando uma tesoura carregada de mola, faça uma incisão de 3-4 mm ao longo do abdômen, processando posteriormente até que a incisão chegue às aletas pélvicas(Figura 1D - E). A essa altura, o lobo ventral do fígado pode ser visível através da incisão.
- Aperte os lados da esponja com uma mão para forçar os órgãos viscerais a saírem da cavidade corporal. O lobo ventral do fígado será visível em cima do intestino (Figuras 1F,2A-B). O fígado aparecerá como uma estrutura rosa ou laranja espalhada sobre o intestino marrom-dourado. Animais designados como controles falsos são recuperados neste momento.
- Aperte os fórceps finos para que as duas latas toquem. Mantendo a pressão sobre a esponja, deslize as latas dos fórceps finos entre o fígado e o intestino(Figura 1G). Tome cuidado para não perfurar o intestino, pois isso resultará em aumento da mortalidade.
- Relaxe lentamente a pressão sobre os fórceps para que as latas se afastem umas das outras(Figura 1H). Esta ação deslizante rompe os numerosos anexos de veia portal entre o lobo ventral e o intestino(Figura 2B),e é necessário remover limpamente o lobo ventral. Repita este processo até que todas as conexões do portal entre o fígado e o intestino tenham sido cortadas.
- Retire o lobo ventral do intestino usando fórceps finos e corte o lobo ventral livre do resto do fígado(Figura 1I).
- Este procedimento resulta em uma hepatectomia parcial de um terço (Figura 1J).
3. Recuperação
- Retire cuidadosamente o peixe da esponja e coloque-o em um tanque de água do sistema.
- Pipeta sistema água sobre as brânquias por alguns minutos até que o peixe está nadando por conta própria(Figura 1K).
- Monitore os peixes por 2-4 horas antes de colocá-los de volta no sistema. Não alimente o peixe por 24 horas após a cirurgia.
- Monitore os peixes diariamente durante a duração do experimento.
- Com o tempo, a incisão na parede do corpo cicatrizará naturalmente sem a necessidade de suturas (Figura 1L,2C).
4. Lóbulo ventral para análise do comprimento do intestino
- Eutanize todos os animais destinados à análise em água gelada por 10 minutos até que todos os movimentos operculares cessem.
- Retire o peixe da água gelada e coloque-o do lado ventral para cima na ranhura de uma esponja.
- Usando uma tesoura carregada de mola, faça uma incisão na parede do corpo ventral na posição anterior-posterior do coração. Em seguida, faça mais duas incisões que correm ao longo do eixo anterior-posterior desde a primeira incisão até as barbatanas pélvicas. (Figura 2A).
- Retire a pele e o músculo para revelar os órgãos viscerais (Figura 2A).
- Adquira imagens de campo brilhante e fluorescentes dos órgãos viscerais usando um microscópio de epifluorescência. Este campo de visão incluirá a área onde o lobo ventral foi ressecado. Como os animais são eutanizados antes da análise, esse tipo de análise impede a imagem a longo prazo do mesmo peixe.
5. Análise da razão de peso do fígado para o corpo
- Eutanize todos os animais destinados à análise em água gelada por 10 minutos até que todos os movimentos operculares cessem.
- Coloque os peixes em um tubo cônico de 50 mL.
- Adicione 25 mL de paraformaldeído em 1x PBS e 0,3% Tween ao tubo.
ATENÇÃO: O formaldeído é tóxico, e as soluções que contenham formaldeído devem ser sempre processadas em uma capa química. - Nutate por 48 h a 4 °C.
- Realizar quatro lavagens de 10 min em 1x PBS e 0,3% Tween.
- Recupere peixes com fórceps, e seque em uma toalha de papel.
- Grave o peso de todo o peixe.
- Usando uma tesoura carregada de mola, faça uma incisão na parede do corpo ventral na posição anterior-posterior do coração. Em seguida, faça mais duas incisões que correm ao longo do eixo anterior-posterior desde a primeira incisão até as aletas pélvicas. (Figura 2A).
- Retire a pele e o músculo para revelar os órgãos viscerais (Figura 2A).
- Adquira imagens de campo brilhante do fígado usando um microscópio de epifluorescência.
- Disseque o fígado, colocando os pedaços de fígado em um barco de pesagem.
- Grave o peso do fígado.
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Representative Results
Para examinar o potencial regenerativo do fígado de zebrafish adulto, realizamos hepatectomia parcial (PHX) em zebrafish adulto. Em geral, foram selecionados adultos grandes (30-40 mm de comprimento), variando de 1,5 a 2,5 anos. Dentro de experimentos individuais, os animais foram selecionados do mesmo tanque, e tinham idade e tamanho compatível. Como controle adequado, utilizamos cirurgias falsas nas quais o animal foi anestesiado e recebeu uma grande incisão na parede do corpo ventral, mas foi recuperado sem remover nenhum tecido. As taxas de sobrevivência para controles falsos variaram de 90%a 100% para zebrafish masculino e fêmea. As taxas de sobrevivência dos animais PHX variaram de 60%a 75% para peixe-zebra macho e 60%-90% para zebrafish fêmea, com todas as mortes ocorrendo nas primeiras 24 horas após a cirurgia.
O padrão-ouro para quantificar a recuperação do fígado após a PHX é a relação peso hepático e corporal, ou LBR. Este ensaio tem sido usado tanto para a medição da recuperação da massa hepática nos modelosmamíferos 11 e zebrafish8. Para quantificar de forma confiável o peso do fígado, fizemos medições de peso em animais fixos, como descrito anteriormente8. Realizamos medições de LBR em tipo selvagem, zebrafish ileso, e descobrimos que, como relatadoanteriormente, ozebrafish fêmea tinha quase o dobro da LBR em comparação com o zebrafish macho (3,3% para zebrafish fêmea e 1,8% para zebrafish macho)(Figura 3A). Realizamos tanto sham quanto PHX em zebrafish adulto de ambos os sexos e analisamos a LBR em 0 e 7 dias após lesão (dpi)(Figura 3B). Em 0 dpi, os animais falsos tinham um lobo ventral claramente visível, enquanto nos animais PHX o lobo ventral estava completamente ausente(Figura 3C). Notavelmente, isso resultou em uma redução significativa da LBR (redução de 30% no peixe macho, redução de 20% no peixe feminino) (Figura 3D). Na coorte de peixes analisada a 7 dpi, constatamos que o lobo ventral não havia se regenerado(Figura 3E),e ainda assim a LBR de PHX e controles falsos eram comparáveis(Figura 3F). Essas medidas indicam que por 7 dpi, o fígado recuperou massa em relação aos controles falsos, presumivelmente por regeneração compensatória nos lobos dorsais, de acordo com os relatórios anteriores8,9.
Decidimos investigar se, com tempo suficiente, o lobo ventral do fígado era capaz de regenerar. Os peixes adultos Tg (fabp10a:CFP-NTR) foram selecionados para experimentação, pois estes peixes expressam CFP em hepatócitos, permitindo a visualização do fígado usando microscopia de fluorescência. Uma coorte de animais foi submetida ao protocolo de hepatectomia parcial de um terço completo. Os animais foram analisados a 1 ou 36 dpi(Figura 4A). Para cada animal, foi medida a razão do comprimento do lobo ventral com o intestino (Figura 4B).
Os animais submetidos a cirurgias falsas apresentaram um lobo ventral proeminente que ocupou 50%-100% do comprimento do intestino, enquanto os animais submetidos à hepatectomia parcial de um terço apresentaram um lobo ventral severamente reduzido. Surpreendentemente, muitos animais parciais de hepatectomia em 36 dpi apresentaram um aumento da relação ventral/intestino em comparação com animais de hepatectomia parcial a 1 dpi(Figura 4C). Não houve aumento no tamanho do lobo ventral em controles falsos; no entanto, observou-se um aumento estatisticamente significativo no tamanho do lobo ventral após a recuperação da hepatectomia parcial (Figura 4D). Notamos que houve uma grande variação na resposta à cirurgia, com alguns animais sem regeneração, e outros claramente regenerando um lobo ventral bem definido(Figura 4E). Esses resultados demonstram que o lobo ventral é capaz de se regenerar a partir da ressecção hepática cirúrgica em zebrafish adulto. Juntos, nosso trabalho indica que o fígado de zebrafish é capaz de regeneração epimórfica e compensatória.
Figura 1: O protocolo parcial de hepatectomia. (A) Diagrama de um zebrafish adulto, com os eixos anterior-posterior e dorsal-ventral observados. (B) Após a anestesia, um animal é embutido em uma esponja (mostrada em azul) de modo que seja ventral lado para cima. Fórceps finos são usados para beliscar a pele apenas posterior ao coração. A esponja não é mostrada nos painéis subsequentes para clareza. (C) As tesouras são usadas para quebrar a pele apenas posterior ao coração. (D-E) A tesoura é usada na ferida agora aberta para fazer uma incisão de 3-4 mm que vai de anterior para posterior, terminando pouco antes das aletas pélvicas. (F) Espremer os lados da esponja faz com que os órgãos viscerais saiam da ferida maior. (G) Fórceps finos com ambos os toques de latas são deslizadas entre o lobo ventral do fígado e o intestino. (H) Os fórceps são relaxados, fazendo com que eles quebrem os laços venosos do portal entre o fígado e o intestino. Este processo é repetido ao longo do comprimento do lobo ventral. (I-J) O lobo ventral é puxado para cima de sua extremidade posterior, enquanto a tesoura é usada para cortar o lobo ventral do resto do fígado. (K) O animal é colocado em uma câmara de recuperação com água do sistema, onde recupera a consciência e os próprios direitos. (L) Com o tempo, as vísceras são puxadas de volta para a cavidade corporal e a ferida cicatriza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Anatomia de zebrafish e recuperação da hepatectomia parcial. (A) Para análise dos órgãos viscerais, os animais são eutanizados e colocados do lado ventral sobre uma esponja. Primeiro, uma incisão é realizada na posição anterior-posterior do coração (linha vermelha). Em seguida, são geradas duas incisões que correm ao longo do eixo anterior-posterior até as aletas pélvicas (linha azul). Em seguida, a pele e os músculos são descascados para trás, revelando os órgãos viscerais. Rotulados estão o intestino, o lobo ventral do fígado, e a veia central nesse lobo. (B) Imagem ao vivo de uma visão ventral de um zebrafish preparado para análise dos órgãos viscerais. O lobo ventral do fígado é delineado com uma linha branca pontilhada. A caixa amarela na imagem 2x indica a localização da imagem 8x. Pontas de flechas brancas indicam conexões de veias entre o intestino e o fígado. (C) Visão ventral da ferida gerada pelo procedimento parcial de hepatectomia nos pontos de tempo indicados. Com o tempo, a incisão cicatriza completamente. Barras de escala, 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A regeneração compensatória após hepatectomia parcial. (A) As razões de peso hepático/corporal (LBR) foram medidas para o tipo selvagem, zebrafish não ferido. Zebrafish fêmeas têm quase o dobro da LBR em comparação com o zebrafish macho. Os animais fêmeas foram comparados com animais machos usando um teste de soma de classificação Wilcoxon, ****p < 0,0001. (B) Esquema indicando que os zebrafish do tipo selvagem foram utilizados para este experimento. Os animais foram submetidos a hepatectomia falsa ou parcial (PHX), e depois fixados em 0 ou 7 dias após lesão (dpi). Os animais fixos foram imageados e submetidos a medições de LBR. (C,E) São mostradas imagens representativas de animais submetidos a sham ou PHX a 0 dpi(C) e 7 dpi(E). Observe a ausência completa dos lóbulos ventral em animais PHX. Para todas as imagens, mostrada é uma visão ventral dos órgãos viscerais. Imagens são imagens de campo brilhante. O lobo ventral do fígado é delineado em branco. Barras de escala, 500 μm. (D,F) Gráficos de barras do fígado para as relações de peso corporal para zebrafish masculino e feminino após cirurgias sham e PHX em 0 dpi(D) e 7 dpi(F). A altura da barra é o valor médio, e as barras de erro representam SEM. Considerando que há uma redução na LBR após hepatectomia parcial em 0 dpi, não há diferença significativa entre PHX e animais falsos em 7 dpi, indicando restauração de LBR. As amostras parciais de hepatectomia foram comparadas aos controles falsos usando um teste de soma de classificação Wilcoxon, ns = não significativo, *p < 0,05, **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O peixe-zebra pode regenerar seus lóbulos ventral após hepatectomia parcial. (A) Esquema indicando que Tg(fabp10a:CFP-NTR) foram usados para este experimento. Cirurgia e análise por imagem foram realizadas nos pontos de tempo indicados. (B) Uma imagem de exemplo para demonstrar como os animais foram analisados. Os animais foram quantificados medindo o comprimento do lobo ventral (em vermelho), o comprimento do intestino (em amarelo) e calculando a porcentagem do intestino que o lobo ventral ocupa (em branco). (C) É mostrada uma imagem representativa de animais submetidos à hepatectomia falsa ou parcial (PHX) aos 1 e 36 dias de lesão pós(dpi). (D) Parcelas de violino da razão do comprimento do lobo ventral ao comprimento do intestino para animais submetidos a hepatectomia falsa ou parcial a 1 e 36 dpi. Cada ponto representa o valor de um único peixe. Os valores para os peixes machos são em azul, peixe feminino em vermelho. As amostras parciais de hepatectomia foram comparadas aos controles falsos usando um teste de soma de classificação Wilcoxon, ns = não significativo, *p < 0,05. (E) São mostrados dois exemplos de animais de hepatectomia parcial em 36 dpi que não se regeneraram, e dois exemplos que se regeneraram. Para todas as imagens, mostrada é uma visão ventral dos órgãos viscerais. As imagens são uma fusão de uma imagem de fluorescência CFP e uma imagem de campo brilhante. A fluorescência cfp só está presente no fígado. O lobo ventral do fígado está delineado em vermelho. A porcentagem do intestino que o lobo ventral ocupa é em branco. Barras de escala, 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As diferenças anatômicas entre zebrafish e modelos mamíferos para regeneração hepática apresentam desafios únicos à ressecção hepática. O fígado em zebrafish está próximo do coração e do intestino; inadvertidamente danificar qualquer órgão resulta em aumento da mortalidade. O fígado de zebrafish não é encapsulado, tornando mais difícil separar-se do intestino. O fígado recebe sangue rico em nutrientes do intestino através de veias portal. Nos mamíferos, veias que saem do intestino convergem em uma veia portal primária que então se divide à medida que entra no fígado12. Em contraste, o fígado de zebrafish recebe circulação portal de uma série de pequenos vasos que se movem diretamente do intestino para o fígado(Figura 2B). Assim, cada lóbulo do fígado, achatado sobre o intestino, é seguramente preso ao intestino por esses vasos. Tentar remover o lobo ventral sem antes cortar as veias do portal pode muitas vezes resultar em ressecção incompleta (dados não mostrados). Alguns dos protocolos iniciais descrevem puxar o lobo ventral através de uma incisão relativamente menor, o que não permite cortar esses anexos do portal5,6.
O protocolo descrito aqui foi projetado para enfrentar esses desafios para permitir uma remoção consistente do lobo ventral. Zebrafish anestesiados são colocados no sulco da esponja para manter suas brânquias molhadas e seus corpos imóveis durante a duração do procedimento. Beliscar a pele apenas posterior ao coração torna possível colocar uma incisão na pele sem danificar nenhum dos órgãos internos. Abrir uma incisão grande (3-4 mm) faz com que a remoção do fígado e a avaliação do grau de remoção simples(Figura 2C). É importante ressaltar que os zebrafish podem se recuperar e, finalmente, curar uma ferida deste tamanho sem qualquer fechamento de ferida primária. Apertando a esponja e comprimindo a parede do corpo, os órgãos viscerais tornam-se mais acessíveis e é possível deslizar as latas de um fórceps entre o fígado e o intestino. Os fórceps podem então ser usados para cortar as conexões do portal entre o fígado e o intestino. Uma vez alcançado isso, fórceps finos podem ser usados para descascar o lobo ventral para que possa ser separado do resto do fígado.
Medimos as relações de peso hepático/corporal (LBR) de animais submetidos a cirurgias sham e PHX. Descobrimos que por 7 dpi, a LBR de animais PHX era comparável aos controles(Figura 3F). Dado que o lobo ventral não havia se regenerado neste momento (Figura 3E), inferimos que a regeneração ocorreu por meio de compensação nos lobos dorsais. Para abordar a questão de saber se o lobo ventral pode finalmente se regenerar em zebrafish, realizamos PHX e examinamos o reescimento hepático. Em média, a razão do comprimento do lobo ventral para o intestino foi maior em 36 dpi do que em 1 dpi, indicando regeneração do lobo ventral(Figura 4C-D). Há uma grande variação na resposta animal às lesões, com alguns animais experimentando muito pouco crescimento e outros experimentando recuperação substancial do lobo ventral(Figura 4E). Concluímos que o fígado pode se regenerar com uma mistura de regeneração epimórfica do lobo ventral e regeneração compensatória nos lobos dorsais, embora em escalas de tempo diferentes. Como estudos anteriores têm usado hepatectomias parciais para avaliar o papel dos genes individuais5,7,9 e caminhos de sinalização6,8,10 após a ressecção, prevemos que este protocolo avançará nossa compreensão dos mecanismos moleculares e celulares da regeneração hepática em um vertebrado adulto.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
I.M.O. é apoiado pela NIAAA (F32AA027135). W.G. é suportado por R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 e pelo Programa Claudia Adams Barr de Excelência em Pesquisa do Câncer. W.G. é um estudioso de Ciências Biomédicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
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