Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele simplificado e indiferenciado tridimensional usando uma plataforma microfluida micromaquinda. Uma abordagem de fluxo paralelo permite a deposição in situ de um compartimento dérmico para a semeadura de células epiteliais em cima, todas controladas por bombas de seringa.
Abstract
Este trabalho apresenta uma nova plataforma microfluida, econômica e confiável, com potencial para gerar tecidos multicamadas complexos. Como prova de conceito, foi modelado um compartimento humano simplificado e indiferenciado contendo um compartimento dérmico (estrommal) e um compartimento epidélico (epitelial). Para isso, foi desenvolvido um dispositivo versátil e robusto, à base de vinil, dividido em duas câmaras, superando algumas das desvantagens presentes em dispositivos microfluidos à base de polidimtilsiloxano (PDMS) para aplicações biomédicas, como o uso de equipamentos caros e especializados ou a absorção de pequenas moléculas hidrofóbicas e proteínas. Além disso, foi desenvolvido um novo método baseado no fluxo paralelo, possibilitando a deposição in situ dos compartimentos dérmico e epidérmico. A construção da pele consiste em uma matriz fibrina contendo fibroblastos primários humanos e uma monocamada de queratinócitos imortalizados semeados no topo, que é posteriormente mantido sob condições dinâmicas de cultura. Essa nova plataforma microfluidica abre a possibilidade de modelar doenças de pele humanas e extrapolar o método para gerar outros tecidos complexos.
Introduction
Recentemente, foram feitos avanços no desenvolvimento e produção de modelos in vitro de pele humana para a análise da toxicidade de produtos cosméticos e farmacêuticos1. Pesquisadores de indústrias farmacêuticas e de cuidados com a pele têm usado animais, sendo os camundongos os mais comuns, para testar seus produtos2,3,4,5. No entanto, testar produtos em animais nem sempre é preditivo da resposta em humanos, o que frequentemente leva à falha de drogas ou efeitos adversos em humanos e,consequentemente,a perdas econômicas5,6. O Reino Unido foi o primeiro país que proibiu o uso de animais para testes cosméticos em 1998. Mais tarde, em 2013, a UE proibiu os testes e aprovação de cosméticos em animais (Regulamento de Cosméticos da UE nº 1223/2009)7.
Essa proibição também está sendo considerada por outros países, como no 'The Humane Cosmetics Act' nos EUA8. Além das preocupações éticas, as diferenças anatômicas entre pele animal e humana tornam os testes em animais demorados, caros e muitas vezes ineficazes. Além disso, o tamanho global do mercado de testes toxicológicos in vitro deve atingir US$ 26,98 bilhões até 20259. Por essas razões, é necessário desenvolver novos métodos e alternativas para esses estudos in vitro, como modelos de pele humana bioengenharia, que possibilitam testes para segurança e efeitos tóxicos de cosméticos e drogas sem o uso de animais.
Existem dois tipos diferentes de modelos de pele humana disponíveis comercialmente, in vitro. O primeiro tipo consiste em equivalentes epidérmicos estratificados contendo múltiplas camadas de queratinócitos diferenciadores que são semeados em diferentes materiais. Alguns deles foram aprovados pela Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) e validados pelo (Centro Europeu para validação de Métodos Alternativos (ECVAM) para testes de corrosão e irritação da pele, como EpiDerm ou SkinEthic10,11,12. O segundo tipo são equivalentes de pele cheia com uma camada de diferenciação de queratinócitos humanos semeados em um andaime tridimensional (3D) que contém fibroblastos, como T-Skin e EpiDerm-FT. No entanto, esses modelos são cultivados sob condições estáticas, o que os torna incapazes de representar com precisão as condições fisiológicas humanas.
O interesse recente tem focado na geração de modelos in vitro de pele 3D em formatos de inserção de cultura celular (CCI) com perfusão dinâmica13,14,15,16,17,18,19. No entanto, esses sistemas não podem ser considerados stricto sensu como microfluidic skin-on-chips, conforme sua definição clássica no campo. A definição de Ingber para órgãos-em-um-chip afirma que o órgão deve ser colocado dentro dos canais microfluidos, condição que apenas alguns dispositivos cumprem20,21. A pele sobre chips modelou até agora epithelia simples como camadas de células únicas e/ou camadas de células dérmicas separadas por uma membrana porosa22,23. Embora tenha havido alguns avanços modelando a pele em sistemas microfluidos16,24, atualmente não há literatura mostrando um sistema órgão-em-um-chip que se encaixe na definição de Ingber, capaz de produzir uma pele multicamadas in situ e incluindo componentes epiteliais e estrânicos.
Neste trabalho, uma nova plataforma microfluida baseada em vinil, econômica e robusta para aplicações de pele em um chip, é apresentada. Esta plataforma foi produzida pela micro-usinagem, que proporciona mais simplicidade no processo de fabricação, além de maior flexibilidade e versatilidade no layout do dispositivo, superando algumas das limitações do PDMS25. Também foi projetada uma maneira de introduzir uma construção de pele simplificada através de um fluxo paralelo controlado com bombas de seringa. O fluxo paralelo permite que dois fluidos com viscosidades muito diferentes (um pré-gel tampão e fibrina neste caso) sejam perfundidos através de um canal sem se misturarem. Como prova de conceito, foi introduzido no dispositivo uma construção dermo-epidérmica contendo fibroblastos embutidos em uma matriz fibrina imitando a derme, além da qual uma monocamada de queratinócitos foi carregada para emular a epiderme indiferenciada. A altura do compartimento dérmico pode ser modulada modificando as taxas de fluxo. A principal novidade deste trabalho, em comparação com os modelos descritos anteriormente22,26,27,28,29, é o desenvolvimento de uma construção 3D dentro de uma microcâmara por meio de microfluidos. Embora este artigo apresente uma pele simplificada e indiferenciada, o objetivo a longo prazo é gerar e caracterizar uma construção de pele totalmente diferenciada para demonstrar sua viabilidade e funcionalidade para fins de testes medicamentosos e cosméticos.
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Protocol
1. Projeto de chip e parâmetros de micromaquinção
- Projetar as camadas de chip microfluidos com software de design de código aberto FreeCAD; consulte a Tabela 1 para as dimensões dos canais. Inclua quatro orifícios de 2,54 mm de diâmetro no design para usar um alinhador personalizado para uma superposição de camada correta.
| Comprimento (μm) | Largura (μm) | |
| Câmara inferior | 28,400 | 800 |
| Câmara superior | 31,000 | 800 |
Tabela 1: Dimensões dos canais superior e inferior do dispositivo.
- Corte 95 folhas de vinil transparentes e de 95 μm de espessura, adesivas e transparentes em quadrados de 30 cm x 30 cm para caber corretamente no plotter.
- Use o software Brother CanvasWorkspace para criar um espaço de trabalho de 30 cm x 30 cm e preenchê-lo com os padrões projetados para as diferentes camadas do chip(Figura 1A). Armazená-lo em um arquivo .svg.
- Corte as folhas de vinil de 30 cm x 30 cm com o plotdor de borda(Figura 1B-D).
- Coloque a folha de vinil em um tapete adesivo de aderência baixa e elimine todas as bolhas de ar, se necessário.
- Carregue o arquivo .svg para o plotador e defina os parâmetros de corte: lâmina de corte: nível 3; pressão de corte: nível 0; velocidade de corte: nível 1. Coloque o tapete adesivo com o vinil no plotador e inicie o processo de corte.
- Corte o padrão do canal superior em vinil de fita dupla face de 12 μm de espessura seguindo as etapas anteriores.
Figura 1: Design de chip e processo de micromaquintura. (A) Layout de software mostrando o espaço de trabalho preenchido com os padrões superior e inferior projetados para o chip. (B) Plotter de borda durante o processo de corte; lâmina de corte, folha de vinil inteira e tapete adesivo são mostrados. (C) Vinil padronizado sendo separado da folha de corte. (D) Amostra de uma camada de vinil adesivo padronizada com o design do canal superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Fabricação de camadas PDMS
- Misture o PDMS e o agente de cura em uma proporção de 10:1 (v/v), e coloque a mistura sob vácuo por 15 minutos para remover bolhas de ar. Despeje 55 mL da mistura em um prato de cultura quadrada de 55 cm2 para obter uma camada de 2 mm de espessura. Remova bolhas com uma agulha.
- Cure a mistura (passo 2.1) em forno por 1h a 80 °C. Desenforme o PDMS e corte-o em retângulos com as dimensões do chip. Faça furos para a tubulação com uma agulha de seringa de 18 G.
3. Montagem de chips
NOTA: Para melhor compreensão, consulte a Figura 2.
- Monte todo o dispositivo usando um alinhador para ajustar canais, entradas e tomadas corretamente. Empilhe quatro camadas de vinil (com o micropattern inferior correspondente) para a montagem do canal inferior, mantendo a fita de cobertura da camada inferior para evitar grudar no alinhador.
- Corte e coloque a membrana porosa de policarbonato (PC) na parte superior do canal inferior para separá-la da parte superior. Tenha cuidado para não cobrir as entradas do canal inferior.
- Adicione dez camadas de vinil com o design da câmara superior. Coloque uma camada de vinil de fita dupla face com o padrão do canal superior na parte superior. Remova o chip do alinhador e coloque-o na lâmina de vidro.
- Coloque uma folha PDMS de 2 mm de espessura em cima da camada de vinil de fita dupla face para fornecer ancoragem adequada para a tubulação e para evitar vazamentos. Deixe um peso em cima do chip durante a noite para garantir que o chip esteja completamente impermeável. Esterilize o chip lavando 70% de v/v de etanol por 5 min, e depois lave com H2O destilado.
Figura 2: Montagem de chip microfluido. (A) Esquema geral da montagem do dispositivo. Câmaras inferiores e superiores são compostas de quatro e onze folhas de vinil sobrepostas, respectivamente. (B) Vistas superiores e laterais do chip microfluido. Os canais superior e inferior estão representados em rosa e azul, respectivamente. (C) Imagem do conjunto do chip usando um alinhador personalizado. (D) Imagem do chip após a montagem completa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Conexões de bomba
NOTA: A representação gráfica das conexões das bombas é mostrada na Figura 3.
- Conecte a bomba 1 à entrada da câmara superior 1 (UCi1).
- Conecte a bomba 2 à entrada da câmara superior 2 (UCi2).
- Conecte a bomba 3 à entrada da câmara inferior (LCi).
- Conecte a Saída de Câmara Superior (UCo) e a Saída de Câmara Inferior (LCo) a um tubo de resíduo.
- Conecte as seringas a cada entrada usando tubos de politefluoroetileno (PTFE) e conectores de aço inoxidável de 18 G.
Figura 3: Conexões de bomba e entradas/saídas de localização. (A) Diagrama mostrando a conexão das três bombas diferentes às suas respectivas entradas. As tomadas se conectam a um contêiner de lixo. (B) Imagem do chip com entradas e tomadas rotuladas. Abreviaturas: LCi = entrada de câmara inferior; LCo = saída de câmara inferior; UCi1 = entrada de câmara superior 1; UCi2 = entrada da câmara superior 2; UCo = saída de câmara superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Cultura celular
NOTA: A linha de células HaCaT tem origem comercial. Os fibroblastos primários humanos são provenientes de doadores saudáveis e foram obtidos a partir da coleta de amostras biológicas de origem humana registradas no Registro Nacional de Biobancos para Investigação Biomédica del Instituto de Salud Carlos III".
- Trabalhe em uma capa de cultura celular, previamente esterilizada sob luz ultravioleta e limpa com etanol.
- Descongelar células H2B-GFP-HaCaT (queratinócitos de pele imortalizados humanos, hKCs) e fibroblastos primários GFP-humanos (hFBs) a 37 °C, adicionar 2 mL de cultura média e centrífuga por 7 min a 20 °C a 250 × g.
NOTA: As células H2B-GFP-HaCaT são queratinócitos imortais humanos modificados para expressar uma proteína fluorescente híbrida histone H2B-green (GFP), fornecendo aos seus núcleos fluorescência verde. GFP-hFBs são fibroblastos primários humanos transformados com o vetor pLZRS-IRES-EGFP para expressar fluorescência verde citoplasmática. Essas células foram modificadas após protocolos publicados anteriormente30,31 - Cultura tanto hKCs quanto hFBs em 1x DMEM suplementados com 10% de soro bovino fetal e 1% de solução antibiótico/antimíctico. Pré-aqueça o meio de cultura a 37 °C antes de usar.
- Retire as células lavando-as com 1x salina tamponada com fosfato (PBS), adicionando 2 mL de ácido tetraáctico de trippsina/etilenodiamina (EDTA) e incubando-as por 10 minutos a 37 °C.
- Inativar trippsina adicionando 4 mL de meio de cultura. Resuspend as células, e transferi-las para um tubo de 15 mL. Remova 10 μL para contar células em uma câmara de Neubauer e determine a concentração apropriada.
- Centrifugar o tubo de 15 mL por 7 min a 20 °C a 250 × g. Remova o supernasce e resuspenque as pelotas na concentração desejada: hFBs a 50.000 células/mL e hKCs a 5·× 106 células/mL.
6. Preparação pré-gel de fibrinogen
- Ative a trombina adicionando 1mL de CaCl2 (1% w/v em NaCl) ao frasco.
- Adicione os seguintes componentes para obter 1 mL de um hidrogel fibrina em uma concentração final de fibrina de 3,5 mg/mL: 59 μL de trombina ativada (10 unidades NIH/mL), 59 μL de ácido tranexamico(Tabela de Materiais,100 mg/mL), 764 μL de meio de cultura contendo 50.000 hFBs/mL, 118 μL de fibrinogênio (20 mg/mL em NaCl (0,9% w/v)).
NOTA: O fibrinogênio deve ser adicionado no último momento.
7. Protocolo de fluxo paralelo
- Bombeie 1x PBS com bomba 3 através da LCi a 50 μL/min durante todo o processo.
- Bombear fluido sacrificial (1x PBS) com bomba 2 através do UCi2 a 100 μL/min.
- Carregue a seringa com o pré-gel, coloque-a rapidamente na bomba 1 e execute-a a 200 μL/min(Figura 4A).
- Pare as bombas 1 e 2 quando o pré-gel sair do UCo.
- Deixe o chip sem remover a tubulação a 37 °C por pelo menos 10 minutos para permitir a gelação.
- Meio de cultura da bomba a 50 μL/h com bomba 3 a UCi2 durante a noite.
- Bloqueie uci1 com um boné.
8. hKCs semeadura de monocamadas
- Verifique sob o microscópio que os hFBs estão espalhados 24 h após a geração do compartimento dérmico.
- Introduza os hKCs com bomba 2 a UCi2 a 5 ×·106 células/mL a 40 μL/min por 1 min(Figura 4B).
- Deixe o chip durante a noite a 37 °C em uma incubadora saturada de umidade para fixação celular.
- Bombeie meio de cultura fresca com bomba 3 somente através de LCi a 50 μL/min(Figura 4C).
Figura 4: Protocolo microfluido para a geração da construção transversal dermo-epidérmica. (A) Seção transversal mostrando o processo de fluxo paralelo para gerar o compartimento dérmico. (B) Semeador de monocamadas de cerato 24 h após geração de compartimento dérmico. (C) Manutenção da cultura celular dentro do dispositivo microfluido. (D) Recriação transversal da pele dentro do chip. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
9. Ensaio de viabilidade celular
NOTA: O kit ao vivo/morto mancha células com fluorescência verde ou vermelha, dependendo de seu estado vivo ou morto. Para a adequada diferenciação de viabilidade, devem ser utilizados hKCs não fluorescentes e hFBs nesta etapa. Todas as etapas do procedimento são realizadas através da UCi2 com a bomba 2.
- Lave o canal superior com 1x PBS por 5 min a 50 μL/min para remover o meio de cultura.
- Bombeie ar para remover o PBS 1x a 50 μL/min.
- Prepare a solução Calcein AM/Ethidium homodimer-1 (Live/Dead) seguindo as instruções do fabricante.
- Bombear solução Viva/Morta a 50 μL/min por 2 min.
- Incubar 30 min a 37 °C no escuro.
- Lave o canal superior bombeando 1x PBS a 50 μL/min por 2 min para remover qualquer reagente restante.
- Observe a amostra sob o microscópio confocal. Use um comprimento de onda de excitação de 495/590 nm e um comprimento de onda de emissão de 519/617 nm para células vivas e mortas, respectivamente.
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Representative Results
O chip projetado é composto por duas câmaras fluidas separadas por uma membrana pc de tamanho de poros de 5 μm que permite o crescimento da célula, permitindo a passagem de moléculas promotoras de crescimento da câmara inferior. A câmara superior contém a construção tecidual, neste caso, uma monocamadas de hKCs em um hidrogel fibrina contendo hFBs.
A altura dos canais é determinada pelo número de folhas adesivas adicionadas a cada canal. A câmara inferior é composta por 4 camadas (380 μm) e a superior de 10 camadas de fita unilateral e uma de dois lados (962 μm). As dimensões do chip são 4 cm x 2 cm, o que aumenta sua manipulação. As folhas de vinil adesivo proporcionam aperto de água e transparência para inspeção visual do dispositivo. A camada PDMS foi útil para a ancoragem adequada da tubulação para evitar qualquer vazamento dos orifícios onde os tubos foram fixados.
De acordo com a literatura publicada, a injecibilidade de hidrogéis contendo células em câmaras microfluidas usando bombas de seringa não foi relatada até o momento. Por essa razão, a injeção do pré-gel da fibrina teve que ser avaliada. Observamos que sob um fluxo de 50 μL/min, a seringa foi bloqueada. No entanto, taxas de fluxo superiores a 200 μL/min podem danificar as células. Foram realizados estudos reológicos para testar o comportamento de afinamento da fibrina pré-gel, obtendo viscosidades de 10 a 50 cP dentro da faixa de vazão selecionada (50-200 μL/min). Esses resultados ajudaram a estabelecer as condições de trabalho desse sistema.
Neste trabalho, um método de fluxo paralelo foi desenvolvido com base na geração de dois fluxos laminar sobrepostos sendo o inferior sendo o pré-gel, enquanto o superior era fluido sacrificial (PBS). Resolvendo numericamente as equações de Navier-Stokes e impondo as condições de fronteira apropriadas, descobrimos que havia múltiplas soluções possíveis para obter a altura desejada. Considerando os limites de taxa de cisalhamento estabelecidos anteriormente, para alcançar um hidrogel de aproximadamente 500 μm de altura, as taxas de fluxo foram de 104 e 222 μL/min para o PBS sacrificial e o pré-gel, respectivamente. Na prática, foram utilizadas taxas de microfluxo de 100 e 200 μL/min para a simplicidade. Quando reintroduzidas no modelo, esses valores resultaram em uma altura de gel de 576 μm, muito semelhante aos valores esperados(Figura 5B). Para verificar experimentalmente o funcionamento do método proposto, foi medida a altura do hidrogel ao longo da câmara superior. Observou-se uma altura média de 550 μm(Figura 5A),bastante semelhante à previsão do nosso modelo matemático.
Figura 5: Soluções matemáticas de fluxo paralelo para escolher os fluxos apropriados de fluido pré-gel e sacrifício para obter a altura dérmica desejada. (A) Visão frontal da imagem confocal dos hKCs semeados no topo do gel de fibrina para avaliar sua altura. (B) Solução matemática para diferentes alturas, dependendo das taxas de fluxo pré-gel e PBS. Abreviaturas: hKCs = queratinócitos de pele imortalizados humanos; PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Ao estabelecer o protocolo no início, a PBS não foi lavada pelo canal inferior, levando a discrepâncias entre a altura teórica do gel e a medida. Essa diferença de altura foi de ~40% em relação à estimada (Figura 6). Uma vez que o protocolo foi otimizado e o PBS bombeado através da câmara inferior, essa perda de altura foi resolvida(Figura 5).
Figura 6: Vista confocícal dos hKCs semeados em cima do hidrogel para medir sua altura quando o PBS não foi bombeado através da câmara inferior. Abreviaturas: hKCs = queratinócitos de pele imortalizados humanos; PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 7A mostra uma imagem de visão superior fluorescente da câmara superior contendo um hidrogel fibrin com GFP-hFBs incorporados, demonstrando que 24 horas após o carregamento, as células são uniformemente distribuídas ao longo da câmara e bem espalhadas. A Figura 7B mostra GFP-hKCs confluentes semeados em cima do hidrogel.
Figura 7: Imagens de fluorescência do canal superior mostrando diferentes células semeadas no dispositivo. (A) Visão superior da câmara superior 24 h após protocolo de fluxo paralelo mostrando os hFBs incorporados no gel de fibrina. (B) GFP-hKCs confluentes semeados em cima do hidrogel 24 h após a geração de hidrogel. A linha vermelha tracejada indica paredes do canal. Barras de escala: 400 μm. Abreviaturas: hFBs = fibroblastos primários humanos; GFP-hKCs = queratinócitos de pele imortais humanos queratizados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
É importante manter o sistema fechado durante a noite até que os hKCs sedimentem e se conectem à superfície do hidrogel. Quando a tubulação é removida antes do apego celular, bolhas de ar entram no canal e deslocam células, levando a uma monocamada confluente não uniforme, como mostrado na Figura 8.
Figura 8: Vista superior da superfície do hidrogel ao remover tubos imediatamente após a semeadura dos HKCs. A linha vermelha tracejada indica paredes do canal. Barra de escala: 400 μm. Abreviaturas: hKCs = queratinócitos de pele imortalizados humanos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O teste de viabilidade celular realizado em hFBs incorporados no hidrogel foi realizado 24 horas após o carregamento utilizando o método de fluxo paralelo, mostrando uma viabilidade celular de ~95%. O mesmo teste realizado em células hKCs 24 h após semeá-las no hidrogel de fibrina mostrou resultados semelhantes. O passo seguinte foi gerar um construto dermo-epidérmico e estudar sua estrutura utilizando microscopia confocal após 24 h(Figura 9).
Figura 9: Imagem confocal 3D reconstruída do modelo de pele indiferenciado no chip microfluido. A linha tracejada amarela indica a superfície do hidrogel que separa hKCs (topo) dos hFBs incorporados no gel (inferior). Abreviaturas: hFBs = fibroblastos primários humanos; hKCs = queratinócitos de pele imortalizados humanos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
É crucial encontrar um equilíbrio entre o comportamento de afinamento da cisalhamento do gel fibrinogênico e seu tempo de gelação: se demorar muito para estabelecer o fluxo paralelo, ele coagula e bloqueia o sistema; se o processo de gelação for muito lento, os hFBs no hidrogel serão sedimentos como mostrado na Figura 10. O comportamento deste estado transitório pode ser regulado variando a concentração de trombina.
Figura 10: Imagem confocal de um hidrogel de fibrina mostrando hFBs sedimentados (em vermelho) devido a um tempo lento de gelagem de fibrina. Uma monocamadas hKCs (em azul) é mostrada em cima do gel. Abreviaturas: hFBs = fibroblastos primários humanos; hKCs = queratinócitos de pele imortalizados humanos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Durante a planificação do dispositivo e práticas experimentais posteriores, surgiram algumas complicações que tiveram que ser resolvidas para obter um dispositivo de funcionamento ideal e tecido bem estruturado. Esses problemas são mostrados na Tabela 2,juntamente com as soluções para solução de problemas.
| Problemas | Soluções |
| Introduzindo um hidrogel 3D na câmara superior, deixando espaço livre acima para queratinócitos de sementes no topo após a geração dérmica | Aplique um fluxo paralelo de dois fluidos (PBS e pré-gel) com diferentes viscosidades para criar um compartimento dérmico com altura controlada. |
| Desalinhamento do canal durante o empilhamento de folhas de vinil | Uso de um alinhador personalizado para empilhar todas as folhas no lugar correto |
| Obtenha uma monocamada queratinócito confluente em cima do gel de fibrina para simular a epiderme | Permita o apego celular ao gel antes de remover os tubos do chip, impedindo que bolhas de ar entrem no canal e deslocando as células. |
| Perda de altura de hidrogel ao longo do canal devido ao vazamento pré-gel para o canal inferior durante o protocolo de fluxo paralelo através da membrana porosa. | Bombeie PBS através do canal inferior durante o estabelecimento de fluxo paralelo. |
| Sedimentação do fibroblasto dentro do gel | A concentração de trombina foi ligeiramente aumentada para acelerar a gelação de fibrina |
Tabela 2: Problemas encontrados durante o desenvolvimento do trabalho atual e das soluções aplicadas.
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Discussion
A motivação para desenvolver esse método foi o desejo de modelar doenças de pele e estudar os efeitos de terapias novas e inovadoras em uma plataforma de alto rendimento. Até o momento, este laboratório produz esses equivalentes dermo-epidérmicos, lançando manualmente ou com a ajuda da tecnologia de bioimpressão 3D - o gel fibrin com fibroblastos em uma placa de inserção de cultura celular e semeadura dos queratinócitos em cima dele. Uma vez que os queratinócitos atingem a confluência, a cultura 3D é exposta à interface ar-líquido, que induz a diferenciação de queratinócitos, gerando uma epiderme estratificada e, consequentemente, uma pele humana interfollicular totalmente desenvolvida32,33,34. No entanto, essas culturas 3D, embora muito relevantes clinicamente, são caras, demoradas e não imitam condições fisiológicas.
A tecnologia tissue-on-a-chip fornece uma plataforma para emular condições fisiológicas na cultura celular, possibilitando assim uma melhor compreensão da toxicidade, eficácia e entrega dos candidatos a medicamentos13,14,15,16,17,18,19,35. A maioria dos tecidos modelados em chips microfluidos "clássicos" são compostos por camadas únicas de células, principalmente células epiteliais22,26,42,27,28,36,37,38,39,40,41 . A modelagem de tecidos mais complexos e multicamadas tem sido dificultada pela dificuldade de gerar camadas de tecido homogêneas e sobrepostas.
A principal novidade deste trabalho, em comparação com os dispositivos anteriores22,43, é o desenvolvimento de um método para gerar uma construção de pele indiferenciada e simplificada por meio de microfluidos. Além disso, outra inovação importante em relação a outras tecnologias publicadas44 é o design de um sistema de chip descartável relativamente simples, econômico e fácil de usar feito de folhas de vinil biocompatíveis que permitem a fabricação ad hoc. Este sistema evita o uso de wafers de silício e procedimentos complicados de ligação plasmática necessários com pdms25. Chips baseados neste material requerem a geração de wafers específicos para cada design diferente de chip, o que eleva o preço do processo de prototipagem. Tudo isso torna a tecnologia atual "clássica" cara, complexa e não muito flexível.
Para superar essas limitações, utilizando a pele como modelo de tecido, apresentamos uma plataforma microfluida muito flexível, barata e robusta baseada em camadas de vinil, produzida pela micromaquinção. Também apresentamos uma nova metodologia baseada no fluxo paralelo de fluidos laminar que permite a geração in situ de uma construção de pele bicamada com um compartimento dérmico inferior contendo hFBs e um compartimento epidérmico superior composto por uma monocamada de hKCs. O chip consiste em duas câmaras separadas por uma membrana porosa pc. O canal superior contém a construção da pele e deixa espaço livre para permitir a diferenciação e estratificação do HKC e/ou perfusão de cultura média, ar ou mesmo drogas no futuro. A câmara inferior é continuamente perfundida com meio de cultura para promover o crescimento celular. O uso de uma membrana porosa pode levar à perda de uma parte do pré-gel da câmara superior para a inferior quando submetida a alta pressão devido à força de bombeamento. A introdução de um fluxo de PBS na câmara inferior compensa essa diferença de pressão e evita esse vazamento.
A distribuição de hKCs na superfície do hidrogel é um aspecto importante na geração de um modelo de pele. Quando não estão homogeneamente difundidos, a geração de uma monocamada uniforme e, portanto, a diferenciação epidérmica poderia ser dificultada. Da mesma forma, os hFBs devem ser igualmente distribuídos dentro do hidrogel para se assemelhar à sua localização natural em que são encontrados na pele real. Para evitar sedimentação celular ou bloqueio de tubulação, a composição do hidrogel (especialmente a concentração de trombina) deve ser cuidadosamente estudada para controlar os tempos de gelação e o comportamento de afinamento da tesoura.
Apesar desses achados encorajadores, é necessário um trabalho futuro para demonstrar o funcionamento a longo prazo do sistema necessário para promover a correta proliferação e diferenciação da monocamada hKC para formar uma pele humana bem diferenciada, incluindo um corneum estrato. Além da pele, esse sistema permitiria a geração de outras construções complexas e multicamadas de tecidos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente ao Dr. Javier Rodríguez, à Dra. Agradecemos gentilmente as contribuições de Sergio Férnandez, Pedro Herreros e Lara Stolzenburg para este projeto. Agradecimentos especiais à Dra. Por fim, reconhecemos a excelente assistência técnica de Guillermo Vizcaíno e Angélica Corral. Este trabalho contou com o apoio do "Programa de Atividades de I+D entre Grupos de Investigação de la Comunidad de Madrid", Projeto S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Este trabalho também contou com o apoio do "Programa de excelencia", Projeto EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGAÇÃO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | - | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
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