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Biology

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62393
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Summary

Il presente studio fornisce protocolli dettagliati di test di ubiquitilazione in vitro per l'analisi dell'attività catalitica dell'ubiquitina ligasi E3. Le proteine ricombinanti sono state espresse utilizzando sistemi procariotici come la coltura di Escherichia coli.

Abstract

L'attaccamento covalente dell'ubiquitina (Ub) ai residui interni di lisina di una proteina substrato, un processo chiamato ubiquitilazione, rappresenta una delle più importanti modificazioni post-traduzionali negli organismi eucariotici. L'ubiquitilazione è mediata da una cascata sequenziale di tre classi enzimatiche tra cui enzimi attivanti l'ubiquitina (enzimi E1), enzimi coniuganti l'ubiquitina (enzimi E2) e ligasi di ubiquitina (enzimi E3) e, a volte, fattori di allungamento della catena dell'ubiquitina (enzimi E4). Qui vengono forniti protocolli in vitro per saggi di ubiquitilazione, che consentono la valutazione dell'attività dell'ubiquitina ligasi E3, la cooperazione tra coppie E2-E3 e la selezione del substrato. Le coppie E2-E3 cooperanti possono essere sottoposte a screening monitorando la generazione di catene libere di poli-ubiquitina e/o l'auto-ubiquitilazione della ligasi E3. L'ubiquitilazione del substrato è definita dal legame selettivo della ligasi E3 e può essere rilevata mediante western blotting della reazione in vitro. Inoltre, viene descritto un saggio di scarica E2~Ub, che è uno strumento utile per la valutazione diretta della cooperazione funzionale E2-E3. Qui, il trasferimento E3-dipendente dell'ubiquitina è seguito dal corrispondente enzima E2 su amminoacidi liberi di lisina (che imitano l'ubiquitilazione del substrato) o lisine interne della stessa ligasi E3 (auto-ubiquitilazione). In conclusione, vengono forniti tre diversi protocolli in vitro che sono veloci e facili da eseguire per affrontare la funzionalità catalitica della ligasi E3.

Introduction

L'ubiquitilazione è il processo mediante il quale Ub è legato covalentemente a una proteina substrato1. La modificazione Ub è catalizzata da successive reazioni enzimatiche che coinvolgono l'azione di tre diverse classi enzimatiche,ovvero enzimi Ub-attivanti (E1s), enzimi Ub-coniuganti (E2s), Ub ligasi (E3s), ed eventualmente fattori di allungamento della catena Ub (E4s)2,3,4,5. Dopo l'attivazione dipendente da adenosina trifosfato (ATP) e magnesio (Mg2+) di Ub da parte di E1, la cisteina del sito attivo di E1 attacca la glicina C-terminale di Ub, formando un complesso tioestere (Ub ~ E1). L'energia prelevata dall'idrolisi dell'ATP fa sì che l'Ub raggiunga uno stato di transizione ad alta energia, che viene mantenuto durante la seguente cascata enzimatica. Successivamente, l'enzima E2 trasferisce l'Ub attivato alla sua cisteina catalitica interna, formando così un legame tioestere transitorio Ub~E2. Successivamente, Ub viene trasferito alla proteina del substrato.

Questo può essere fatto in due modi. O la ligasi E3 può prima legarsi a E2, o la ligasi E3 può legare direttamente Ub. Quest'ultimo modo si traduce nella formazione di un intermedio E3 ~ Ub. In entrambi i casi, Ub è legato alla proteina del substrato dalla formazione di un legame isopeptidetico tra il gruppo carbossilico C-terminale di Ub e il gruppo lisina Ɛ-amminico del substrato6. Il genoma umano codifica due E1, circa 40 E2 e più di 600 presunte ubiquitina ligasi7. Sulla base del meccanismo di trasferimento Ub dell'E3, le Ub ligasi sono divise in tre categorie che coinvolgono il tipo Omologo a E6AP C-Terminus (HECT), il tipo Really Interesting New Gene (RING) / U-box e RING tra le ligasi di tipo RING (RBR)8. In questo studio, l'U-box contenente ligasi, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), viene utilizzato come enzima E3 rappresentativo. A differenza degli enzimi E3 di tipo HECT che formano i tioesteri Ub~E3, il dominio U-box di CHIP lega E2~Ub e promuove il successivo trasferimento Ub/substrato direttamente dall'enzima E28,9. Sulla base dell'importanza della U-box per la funzione enzimatica, un mutante CHIP U-box inattivo, CHIP (H260Q), viene utilizzato come controllo. CHIP (H260Q) non riesce a legarsi ai suoi affini E2, perdendo così la sua attività di legasi E310.

L'ubiquitilazione proteica svolge un ruolo cruciale nella regolazione di una moltitudine di eventi cellulari nelle cellule eucariotiche. La diversità dei risultati cellulari promossi dall'attaccamento reversibile delle molecole Ub alle proteine del substrato può essere attribuita alle caratteristiche molecolari di Ub. Poiché Ub stesso contiene sette residui di lisina (K) per un'ulteriore ubiquitilazione, esiste una ricca varietà di tipi di catene Ub con diverse dimensioni e / o topologie11. Ad esempio, i substrati possono essere modificati da una singola molecola Ub a uno (mono-ubiquitilazione) o lisine multiple (multi mono-ubiquitilazione), e persino da catene Ub (poli-ubiquitilazione)11. Le catene Ub sono formate omo- o eterotipicamente attraverso lo stesso o diversi residui di lisina di Ub, che potrebbero anche provocare catene Ub ramificate9. Pertanto, l'ubiquitilazione proteica porta a diverse disposizioni di molecole Ub che forniscono informazioni specifiche, ad esempioper la degradazione, l'attivazione o la localizzazione delle proteine coniugate12,13. Questi diversi segnali Ub consentono una rapida riprogrammazione delle vie di segnalazione cellulare, che è un requisito importante per la capacità della cellula di rispondere alle mutevoli esigenze ambientali.

Un aspetto centrale dell'ubiquitilazione è legato al controllo della qualità delle proteine. Le proteine mal ripiegate o irreversibilmente danneggiate devono essere degradate e sostituite da proteine di nuova sintesi per mantenere l'omeostasi proteica o la proteostasi14. Il controllo qualità E3 ligasi, CHIP, collabora con chaperoni molecolari nella degradazione Ub-dipendente delle proteine danneggiate9,15,16,17. Oltre a ciò, CHIP regola la stabilità dell'accompagnatore diretto dalla miosina, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), che è strettamente coordinato con la funzione muscolare e le deviazioni dai livelli ottimali portano alla miopatia umana18,19,20,21. La degradazione di UNC-45B da parte del proteasoma 26S è mediata dall'attaccamento di una catena poli-Ub legata a K489. In assenza di proteine del substrato, CHIP esegue l'auto-ubiquitilazione10,22,23,che è caratteristica delle ligasi ubiquitina RING/U-box E324,25 e considerata regolatrice dell'attività della ligasi26. L'applicazione dei metodi di saggio di ubiquitilazione in vitro descritti in questo articolo ha contribuito a identificare sistematicamente gli enzimi E2 che si uniscono a CHIP per promuovere la formazione di catene poli-Ub libere e / o l'auto-ubiquitilazione di CHIP (sezione 2 del protocollo). Inoltre, è stata osservata ubiquitilazione CHIP-dipendente di UNC-45B, che è un substrato noto della ligasi E318,19 (sezione 3 del protocollo). In definitiva, è stato monitorato il trasferimento dipendente da CHIP di Ub attivato dal tioestere Ub~E2 (sezione 4 del protocollo).

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Protocol

1. Preparazione di tamponi e reagenti

NOTA: tamponi e reagenti preparati manualmente in laboratorio sono elencati di seguito. Tutti gli altri tamponi e reagenti utilizzati nei protocolli sono stati acquistati da fonti diverse e utilizzati secondo le istruzioni dei produttori.

  1. Preparare 10x soluzione salina tamponata con fosfato (10x PBS). A tale scopo, mescolare 1,37 M di cloruro di sodio (NaCl), 27 mM di cloruro di potassio (KCl), 80 mM di disodio-idrogeno-fosfato diidrato (Na2HPO4.2H2O) e 20 mM di potassio-diidrogeno fosfato (KH2PO4) in 1 L di H2O a doppia distillazione (ddH2O). Autoclave il PBS 10x e preparare una soluzione PBS 1x in ddH2O.
    1. L'autoclave viene effettuata per 15 minuti a 121 °C e 98,9 kPa.
      NOTA: L'autoclave viene eseguita in queste condizioni per tutti i tamponi e le soluzioni. Se non diversamente indicato, le soluzioni vengono conservate a temperatura ambiente (RT).
  2. Preparare 1 L di soluzione PBS-Tween (PBS-T) aggiungendo lo 0,1% di Tween a 1 L di 1x PBS.
  3. Preparare 10 mL di una soluzione madre di L-lisina da 0,5 M sciogliendo la L-lisina in ddH2O. Aliquota L-lisina in porzioni da 1 mL e conservarle a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
    NOTA: L-lisina può essere congelata e scongelata ripetutamente.
  4. Preparare una soluzione di acido tetra acetico (EDTA) di etilene diammina 0,25 M sciogliendo EDTA in 200 mL di ddH2O.
    1. Regolare il pH a 8,0 con idrossido di sodio (NaOH).
    2. Regolare il volume a 250 mL con ddH2O.
    3. Autoclave la soluzione.
  5. Preparare 10 mL di una soluzione di albumina sierica bovina (BSA) da 20 mg/mL sciogliendo BSA in ddH2O. Conservare a -20 °C in aliquote da 200 μL.
    NOTA: BSA può essere congelato e scongelato ripetutamente.
  6. Preparare 1 L di tampone corrente di acido solfonico 2-(N-morfolino)etano (MES) sciogliendo 50 mM MES, 50 mM di base tris, 3,47 mM di sodio dodecil solfato (SDS) e 1,03 mM di EDTA in 0,9 L di ddH2O. Dopo aver miscelato correttamente, regolare il volume a 1 L.
    1. Il pH del tampone 1x è 7,6. Non regolare il pH con acido o base.
  7. Preparare 200 ml di soluzione bloccante (latte al 5%) sciogliendo 10 g di latte in polvere in 1x PBS-T. Conservare la soluzione bloccante a 4 °C per un massimo di una settimana.
  8. Preparare 1 L di buffer di trasferimento (vedere la tabella dei materiali)secondo le istruzioni del produttore.
  9. Preparare 2x tampone campione SDS sciogliendo 125 mM di base Tris, 4% SDS, 4% glicerolo, 0,03% blu bromofenolo e 50 μL/mL di β-mercaptoetanolo in 50 mL ddH2O. Aliquota in porzioni da 1 mL e conservare a -20 °C fino all'uso.

2. Saggio di auto-ubiquitilazione in vitro

  1. Preparazione ed esecuzione del test
    1. Calcolare il volume di ciascun reagente richiesto per reazione in base alle molarità date delle proteine e alle concentrazioni proteiche delle soluzioni proteiche. Per reazione di auto-ubiquitilazione, utilizzare 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 e 50 μM Ub. Regolare il volume della reazione a 20 μL con ddH2O.
      NOTA: la soluzione di ATP e il buffer di ubiquitilazione sono stati acquistati come soluzioni stock 10x e utilizzati a 1x.
    2. Preparare uno schema di pipettaggio per tutte le reazioni. Testare nove diversi enzimi E2 per la loro capacità di funzionare (I) con CHIP, (II) con un mutante CHIP (H260Q) cataliticamente inattivo e (III) senza CHIP nelle singole reazioni di ubiquitilazione.
    3. Per evitare errori di pipettaggio, preparare una miscela principale su ghiaccio che contenga il volume necessario per tutte le reazioni più una reazione aggiuntiva. Calcola la quantità di miscela principale richiesta per reazione.
      NOTA: i componenti della miscela master sono reagenti che sono ugualmente necessari per ogni reazione, ad esempioE1, E3, Ub, ATP e tampone di ubiquitilazione.
    4. Aggiungere ddH2O e miscela master ai tubi di reazione a catena della polimerasi (PCR). Tenere i tubi sul ghiaccio.
    5. Prima di iniziare le reazioni di ubiquitilazione aggiungendo gli enzimi E2, impostare un termociclatore PCR con il seguente programma: 2 h, 37 °C seguito da 4 °C, all'infinito.
    6. Aggiungere 1 μM degli enzimi E2 nelle rispettive provette e incubare i campioni nel termociclatore PCR per il periodo di tempo indicato.
    7. Dopo 2 ore, aggiungere il buffer del campione SDS a ciascuna reazione e mescolare pipettando su e giù più volte.
      NOTA: il volume richiesto del tampone campione dipende dalla concentrazione di stock del tampone campione. Qui, 20 μL di 2x buffer di campione SDS sono stati aggiunti a ciascuna reazione.
    8. Far bollire immediatamente i campioni a 95 °C per 5 minuti e continuare con l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE). Conservare le proteine denaturate a -20 °C.
  2. Elettroforesi su gel e western blot
    1. Dopo lo scongelamento, girare i campioni per circa 10 s e caricare il gel SDS-PAGE. Utilizzare una scala proteica come riferimento di dimensione.
      NOTA: Qui sono stati utilizzati gel gradienti Bis-Tris al 4-12% e 3 μL di scala proteica. Dividere i volumi del campione e caricare due gel in modo uguale utilizzando 20 μL di ciascun campione.
    2. Eseguire il gel a 160-200 V per circa 30-45 minuti in modo che la parte anteriore del campione raggiunga il fondo del gel.
    3. Trasferire ogni gel in un contenitore di plastica riempito con tampone semidry blotting e incubarlo per 2-5 minuti a RT. Rimuovere il gel impilabile.
    4. Preparare due pezzi di carta assorbente delle dimensioni di un gel e una membrana di nitrocellulosa di dimensioni gel per gel SDS e pre-immergere nel tampone di blotting semidry. Assemblare il sandwich western blot (WB) in una camera WB dal basso verso l'alto nel seguente ordine: carta assorbente, membrana nitrocellulosa, gel SDS-PAGE, carta assorbente.
    5. Rimuovere le bolle d'aria che potrebbero essere state intrappolate tra gli strati sandwich. A tale scopo, utilizzare un rullo per rotolare con cura sul sandwich un paio di volte.
    6. Chiudere la camera e lasciare che il tampone della macchia in eccesso si scarichi.
    7. Posizionare la camera nel rispettivo dispositivo di blotting e utilizzare il seguente programma per il semidry blotting: 25 V, 1.0 A, 30 min.
    8. Trasferire la membrana cancellata in un contenitore di plastica riempito con soluzione bloccante e incubare per 30 minuti a RT.
    9. Preparare la soluzione anticorpale primaria aggiungendo l'anticorpo a 10 ml di PBS-T contenente un reagente bloccante (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: La concentrazione di lavoro dell'anticorpo è specifica dell'anticorpo. In questo caso, un anticorpo monoclonale anti-ubiquitina di topo è stato utilizzato ad una diluizione di 1:5.000. Per il secondo gel, è stato utilizzato un anticorpo anti-CHIP monoclonale di coniglio a 1:5.000 nel reagente PBS-T/bloccante.
    10. Sostituire la soluzione bloccante con la soluzione anticorpale primaria e incubare durante la notte a 4 °C su un bilanciere.
    11. Lavare la membrana tre volte per 10 minuti con PBS-T.
    12. Preparare la soluzione anticorpale secondaria aggiungendo il rispettivo anticorpo a 10 ml di PBS-T.
      NOTA: Qui, gli anticorpi anti-topo di capra e anti-coniglio di topo vengono utilizzati a una diluizione di 1:10.000.
    13. Incubare la membrana con l'anticorpo secondario per 1 ora a RT su un bilanciere.
    14. Lavare la membrana tre volte per 5 minuti con PBS-T.
  3. Analisi dei dati
    1. Aggiungere i reagenti di rilevamento western blot per gli anticorpi coniugati con perossidasi di rafano (HRP) alla membrana lavata secondo le istruzioni del produttore e acquisire il segnale HRP utilizzando pellicole a raggi X o una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica (Figura 1).

3. Saggio di ubiquitilazione del substrato in vitro

  1. Preparazione ed esecuzione del test
    1. Calcolare il volume di ciascun reagente richiesto per reazione, in base alle molarità date delle proteine e alle concentrazioni proteiche delle soluzioni proteiche. Per reazione di ubiquitilazione del substrato, utilizzare 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM substrato e 50 μM Ub. Utilizzare 10x soluzione di ATP e 10x tampone di ubiquitilazione a 1x. Regolare il volume della reazione di ubiquitilazione del substrato a 20 μL con ddH2O.
    2. Preparare uno schema di pipettaggio per tutte le reazioni. Includere reazioni di controllo adeguate verificando che l'ubiquitilazione del substrato sia specifica per E3. Utilizzare la proteina UNC-45B come substrato rappresentativo di CHIP e un mutante CHIP cataliticamente inattivo (H260Q) come controllo. Preparare le seguenti reazioni: E1, E2, Ub mix (incluso Ub, ATP, tampone di ubiquitilazione); E1, E2, Ub mix, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP (H260Q), UNC-45B; e E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.
    3. Per evitare errori di pipettaggio, preparare una miscela principale su ghiaccio che contenga il volume necessario per tutte le reazioni più una reazione aggiuntiva. Calcolare il volume della miscela master richiesta per reazione.
      NOTA: i componenti della miscela principale per questo test includono E1, E2, Ub, ATP e tampone di ubiquitilazione.
    4. Aggiungere componenti di reazione nel seguente ordine: ddH2O, substrato, E3 ligasi.
    5. Prima di iniziare la reazione di ubiquitilazione mediante aggiunta della miscela master, impostare un termociclatore PCR con il seguente programma: 2 h, 37 °C seguito da 4 °C, all'infinito.
    6. Aggiungere la miscela principale a ciascun tubo e incubare i campioni nel termociclatore PCR per il periodo di tempo indicato.
    7. Dopo 2 ore, aggiungere 2x buffer di campionamento SDS a ciascuna reazione e mescolare pipettando su e giù più volte.
    8. Dopo la corsa, far bollire immediatamente i campioni a 95 °C per 5 minuti e continuare con PAGE. In alternativa, conservare le proteine denaturate a -20 °C.
  2. Elettroforesi su gel e western blot
    1. Eseguire l'elettroforesi su gel e il western blot come descritto al paragrafo 2.2. Utilizzare anticorpi specifici per il rilevamento del substrato e della ligasi E3, rispettivamente.
      NOTA: Qui, UNC-45B è fuso con un tag proteico polipeptidico derivato dal prodotto del gene c-myc che consente l'uso di un anticorpo anti-MYC monoclonale di topo. Anti-MYC viene utilizzato a 1:10.000.
  3. Analisi dei dati
    1. Eseguire l'analisi dei dati come descritto nella sezione 2.3 (Figura 2).

4. Saggio di dimissione della lisina

  1. Preparazione ed esecuzione del test
    1. Carica dell'enzima E2 con Ub da E1
      1. Calcolare il volume di ciascun reagente richiesto per reazione in base alle molarità date delle proteine e alle concentrazioni proteiche delle soluzioni proteiche. Per reazione di carica, utilizzare 2 μM E1, 4 μM E2 e 4 μM ubiquitina priva di lisina (Ub K0). Utilizzare 10x ATP e 10x ubiquitylation buffer a 1x. Regolare il volume della reazione di carica a 20 μL con ddH20.
        NOTA: Il mutante Ub K0 privo di lisina viene utilizzato per imporre la produzione esclusiva di E2 mono-ubiquitilato. Può essere utilizzato anche Ub di tipo selvaggio; tuttavia, questo potrebbe portare a diverse modifiche E2 ~ Ub(ad esempio,poli-ubiquitilazione di E2), che sono più difficili da analizzare. Per il primo utilizzo o quando si utilizza un nuovo enzima E2, determinare il livello di carica Ub su E2 che può essere raggiunto da E1. Per determinare la resa della carica, visualizza E2 non caricato rispetto a E2 carico tramite la colorazione Coomassie. Qui, circa la metà di Ub K0 è stata convertita in modo affidabile in UBE2D2 ~ Ub quando si utilizzano rapporti equimolari di UBE2D2 e Ub K0 (Figura supplementare S2A).
      2. Preparare uno schema di pipettaggio per la reazione di carica. Regolare il volume della reazione di carica alle successive reazioni di scarica di scelta, ad esempio,utilizzare CHIP e CHIP (H260Q) nelle singole reazioni di scarica. Pertanto, preparare il doppio del volume di una reazione di carica.
        NOTA: per il primo utilizzo, testare diverse concentrazioni della ligasi E3 di scelta per monitorare le condizioni di scarica ottimali e analizzarle mediante western blotting. In una condizione ideale, lo scarico di Ub da E2 aumenterà nel tempo fino a quando la rispettiva banda proteica E2 ~ Ub scomparirà.
      3. Incubare la reazione di carica per 15 minuti a 37 °C.
    2. Cessazione della reazione di carica
      1. Arrestare la reazione di carica aggiungendo apasi ad una concentrazione finale di 1,8 U/mL. Effettuare l'incubazione con apasi per 5 minuti a RT, seguita dall'aggiunta di EDTA ad una concentrazione finale di 30 mM. Regolare il volume della reazione di carica a 30 μL con ddH2O.
        NOTA: L'apirasi viene utilizzata per convertire le molecole di ATP in molecole di ADP (adenosina difosfato). Poiché l'attività dell'enzima E1 è ATP-dipendente, E1 non può più caricare E2. L'EDTA viene inoltre utilizzato per garantire che E1 sia inibito spegnendo gli ioni Mg2+ che sono co-fattori necessari per E1. Il volume di apirasi necessario per fermare la reazione può variare tra le condizioni del test. Sebbene l'apirasi da sola estenda già le molecole di ATP disponibili, una combinazione di apiasi ed EDTA è stata più efficace nell'arrestare la reazione di carica per la coppia E1-UBE2D2. Poiché l'arresto della reazione è un fattore critico per la riproducibilità del saggio, l'arresto efficiente deve essere testato per le nuove coppie E1-E2. A tale scopo, impostare una reazione di carica, arrestarla e raccogliere campioni in punti temporali specifici, ad esempiodopo 2, 5, 10 e 15 minuti. I livelli non mutevoli di E2~Ub indicano che la reazione si è fermata e che il tioestere era stabile durante quel periodo di tempo (Figura supplementare S2B).
    3. Scarico di E2~Ub da parte di E3
      1. Preparare quattro tubi corrispondenti ai diversi punti temporali (t0, t1, t2, t3); aggiungere un tampone campione non riducente (6,7 μL di 4 tampone al litio dodecil solfato (LDS)) a ciascun tubo.
        Nota : non utilizzare l'agente riducente nel buffer di esempio.
      2. Rimuovere 6 μL dalla reazione di carica interrotta per t0e regolare il volume a 20 μL con ddH2O.
      3. Incubare il campione t0 per 10 minuti a 70 °C.
        NOTA: Non far bollire il campione prolungando il tempo di incubazione poiché i tioesteri sono labili a temperature più elevate.
      4. Calcolare il volume di ciascun reagente richiesto per reazione di scarica. Utilizzare i restanti 24 μL dell'E2 carico e aggiungere 10 mM di L-lisina, 1 mg/ml di BSA e 500 nM della ligasi E3. Utilizzare il buffer di ubiquitilazione a 1x e regolare il volume a 80 μL con ddH2O.
      5. Preparare uno schema di pipettaggio per tutte le reazioni di scarica e utilizzare CHIP (H260Q) come controllo oltre a CHIP (WT).
      6. Impostare le reazioni di scarica sul ghiaccio aggiungendo i componenti richiesti nel seguente ordine: ddH2O, tampone di ubiquitilazione, BSA, lisina, E3 ligasi e E2 caricato per avviare la reazione.
      7. Incubare la reazione di scarica a RT.
      8. Prelevare campioni dopo 5, 30 e 60 minuti trasferendo 20 μL della reazione di scarica nelle rispettive provette.
        NOTA: i punti temporali adatti che consentono un corretto monitoraggio dello scarico possono variare tra le coppie E2-E3.
      9. Vorticare immediatamente il campione e incubarlo a 70 °C per 10 minuti.
      10. Procedere direttamente con PAGE.
        NOTA: I tioesteri E2 ~ Ub possono essere labili anche dopo la denaturazione nel tampone del campione. Pertanto, l'elettroforesi su gel deve essere eseguita direttamente dopo l'esecuzione del test.
  2. Elettroforesi su gel e western blot
    1. Eseguire l'elettroforesi su gel e il western blotting come descritto al paragrafo 2.2. Utilizzare un anticorpo Ub-specifico e, se disponibile, utilizzare anche un anticorpo specifico E3 che è stato allevato in una specie diversa, consentendo il rilevamento simultaneo del segnale Ub ed E3 ligasi.
  3. Analisi dei dati
    1. Eseguire l'analisi dei dati come descritto nella sezione 2.3 (Figura 3).

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Representative Results

Per identificare gli enzimi E2 che cooperano con l'ubiquitina ligasi CHIP, è stato testato un set di candidati E2 in singole reazioni di ubiquitilazione in vitro. Le coppie E2-E3 che hanno collaborato sono state monitorate dalla formazione di prodotti di ubiquitilazione E3-dipendenti, cioèauto-ubiquitilazione della ligasi E3 e formazione di polimeri Ub liberi. I prodotti di ubiquitilazione sono stati analizzati mediante western blotting. L'interpretazione dei dati si basa sul confronto dimensionale delle bande proteiche risultanti con marcatori di peso molecolare. L'ubiquitilazione proteica porta alla formazione di specifici modelli di bande caratterizzati dalla comparsa di bande doppie o più bande iterative con una rispettiva differenza di dimensioni di 8,6 kDa (dimensione di una singola molecola di Ub).

Qui, la capacità di nove E2 di promuovere la formazione di prodotti di ubiquitilazione è stata testata in presenza di CHIP wild-type (Figura 1A), il mutante U-box inattivo CHIP (H260Q) (Figura 1B) o senza CHIP (Figura supplementare S1). I prodotti di ubiquitina E3-indipendenti si sono formati in presenza di CHIP inattivo e in assenza di CHIP (Figura 1B e Figura supplementare S1). Il CHIP inattivo non era auto-ubiquitilato (Figura 1B). Al contrario, il CHIP wild-type è stato auto-ubiquitilato quando combinato con membri della famiglia UBE2D (D1-D3) e membri della famiglia UBE2E (E1, E3), rispettivamente(Figura 1A,corsie 3, 4 e 5). Mentre le catene poly-Ub libere sono state prodotte in collaborazione con UBE2D1-3, questo non è stato rilevato per UBE2E1 o UBE2E3, rispettivamente (Figura 1A, corsie 6 e 7).

La capacità della famiglia UBE2D di promuovere sia la formazione di polimeri Ub liberi che l'auto-ubiquitilazione di CHIP è stata attribuita alla presenza di un sito di legame dell'ubiquitina non covalente sul retro dell'E227,28. Allo stesso modo, la formazione esclusiva di catene Ub libere da parte di UBE2N/V1(Figura 1A,corsia 9) è stata attribuita al legame di Ub da parte di una specifica subunità UBE2V1 (subunità Uev), dirigendo la formazione di catene Ub legate a K6329. Non si sono formati prodotti di ubiquitilazione in presenza di UBE2C1 e UBE2H(Figura 1A,corsie 2 e 8). In conclusione, CHIP può collaborare con diversi enzimi E2 in vitro; tuttavia, la sua auto-ubiquitilazione è specifica dell'enzima E2.

Successivamente, la coppia UBE2D2-CHIP è stata utilizzata per studiare l'ubiquitilazione dell'chaperone diretto alla miosina, UNC-45B, mediante attività della ligasi CHIP (Figura 2). L'ubiquitilazione del substrato è stata analizzata tramite western blotting. UNC-45B non ubiquitilato ha un peso molecolare di 103 kDa (Figura 2, corsia 4). Il mutante U-box inattivo di CHIP non ha eseguito né l'ubiquitilazione di UNC-45B né l'auto-ubiquitilazione(Figura 2,corsia 3). Al contrario, l'ubiquitilazione di UNC-45B e l'auto-ubiquitilazione di CHIP sono state rilevate al momento dell'incubazione con CHIP wild-type(Figura 2,corsia 6). Pertanto, CHIP può ubiquitilare UNC-45B in vitro,suggerendo che UNC-45B è un substrato conservato di CHIP18.

In definitiva, l'attività catalitica di CHIP è stata analizzata in assenza di qualsiasi proteina substrato. A tal fine, è stato eseguito un saggio di scarica di lisina in cui gli amminoacidi liberi di lisina possono servire come accettore Ub in assenza di substrati E3 (Figura 3, Figura supplementare S2C). Il test di scarica consiste in una fase di carica in cui Ub viene caricato sull'E2 da E1, una fase di arresto per impedire un ulteriore caricamento di Ub su E2 e una fase di scarica in cui Ub viene trasferito dal tioestere transitorio Ub ~ E2 su amminoacidi lisina liberi e / o su residui di lisina della ligasi E3. L'analisi Western blot è stata eseguita per visualizzare sia le proteine Ub-modificate che il CHIP della ligasi E3. L'enzima UBE2D2 non caricato ha un peso molecolare di 17 kDa (Figura supplementare S2C).

Quando caricato con una singola molecola di Ub - assicurata dall'uso di Ub (Ub K0) privo di lisina - il peso molecolare di UBE2D2~ Ub si sposta verso l'alto a circa 26 kDa. Il punto temporale zero (t0) rappresenta il rendimento complessivo di E2 caricato (Figura 3). In presenza di CHIP inattivo (35 kDa), è stata rilevata una debole scarica E3 ligasi-indipendente di UBE2D230,31, ma nessuna auto-ubiquitilazione di CHIP. Al contrario, in presenza di CHIP wild-type (35 kDa), è stata rilevata una scarica più rapida di UBE2D2, che ha prodotto una scarica completa entro 60 minuti. Allo stesso tempo, è stata osservata l'auto-ubiquitilazione di CHIP, indicando che CHIP ha promosso il trasferimento di Ub sui propri residui di lisina.

Figure 1
Figura 1: Analisi Western blot per la collaborazione enzimatica E2-E3 in vitro. Le reazioni di auto-ubiquitilazione in vitro con diversi enzimi E2 umani (da sinistra a destra: vuoto, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H e -N/V1) sono state eseguite come indicato utilizzando (A) CHIP wild-type o (B) il mutante inattivo CHIP U-box, CHIP (H260Q), come E3 ubiquitina ligasi. I campioni sono stati divisi equamente, eseguiti su gel di poliacrilammide separati e immunoblottizzati con anticorpi anti-CHIP e anti-Ub per visualizzare i prodotti di reazione. Abbreviazioni: Ub = ubiquitina; CHIP = terminale carbossilico della proteina interagente HSC70; ATP = adenosina trifosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Analisi Western blot monitoraggio ubiquitilazione del substrato. Le reazioni di ubiquitilazione del substrato in vitro sono state eseguite come indicato per rilevare l'ubiquitilazione dell'UNC-45B umano da parte di CHIP wild-type o del mutante inattivo CHIP U-box, CHIP (H260Q). UBE2D2 umano è stato usato come enzima E2. Abbreviazioni: WT = wild-type; Ub = ubiquitina; CHIP = terminale carbossilico della proteina interagente HSC70. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Analisi Western blot che monitora il trasferimento Ub dipendente da CHIP dal tioestere UBE2D2~Ub. La carica di UBE2D2 umano da parte di Ub senza lisina (Ub K0), l'arresto della reazione di carica e la scarica di UBE2D2 ~ Ub sono stati eseguiti come descritto. Per le reazioni di scarica, chip wild-type o il mutante inattivo CHIP U-box, CHIP (H260Q), sono stati utilizzati come ubiquitina ligasi e 10 mM L-lisina è stato fornito come potenziale accettore Ub. I campioni sono stati raccolti dopo i periodi di tempo indicati, eseguiti su un gel di poliacrilammide e immunoblottizzati con una miscela di anticorpi anti-Ub / anti-CHIP. Abbreviazioni: Ub = ubiquitina; CHIP = terminale carbossilico della proteina interagente HSC70; ATP = adenosina trifosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Monitoraggio rappresentativo dell'enzima E2 in assenza di E3. Le reazioni di ubiquitilazione in vitro con diversi enzimi E2 umani (da sinistra a destra: vuoto, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H e -N/V1) sono state eseguite come indicato in assenza di una ligasi E3 per lo screening di prodotti di reazione indipendenti da E3. I campioni sono stati eseguiti su un gel di poliacrilammide e immunoblottizzati con anti-Ub. Abbreviazioni: Ub = ubiquitina; ATP = adenosina trifosfato. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Analisi della resa di carica e della stabilità del tioestere UBE2D2~Ub K0. (A) La resa della carica UBE2D2 ottenuta da E1 è stata testata in varie condizioni. La prima reazione di carica (I) consisteva in 5 μM E1, 5 μM E2 e 50 μM Ub K0. La seconda reazione di carica (II) consisteva in 2 μM E1, 4 μM E2 e 4 μM Ub K0. Le reazioni di carica sono state eseguite come descritto per 30 minuti a 37 °C. I campioni sono stati raccolti dopo 15 e 30 minuti. Le reazioni sono state interrotte con l'aggiunta di 4x tampone campione LDS e incubate a 70 °C per 10 minuti prima dell'elettroforesi su gel e della colorazione di Coomassie. UBE2D2 non caricato è stato utilizzato come controllo. Circa la metà dell'UBE2D2 è stato convertito in UBE2D2~Ub. Nessuna ricarica aggiuntiva è stata rilevata dopo 15 minuti. Inoltre, né l'aumento di E1 né l'aumento dell'ubiquitina libera hanno alterato la resa di carica di UBE2D2 ~ Ub. Pertanto, la ricarica è stata successivamente eseguita per 15 minuti a 37 °C utilizzando 2 μM E1, 4 μM E2 e 4 μM Ub K0. (B) Dopo la carica, la reazione è stata interrotta con l'aggiunta di 1,8 U/mL di apirasi e 30 mM di EDTA e incubata a RT. I campioni sono stati raccolti dopo 2, 5, 8, 10 e 15 minuti (corsie 2-6) e UBE2D2 non caricato è stato utilizzato come controllo (corsia 1). È stato aggiunto 4x tampone campione LDS e i campioni sono stati incubati a 70 °C per 10 minuti prima dell'elettroforesi su gel e della colorazione di Coomassie. L'arresto è stato efficiente misurato dall'intensità a banda costante della proteina UBE2D2 ~Ub, indicando anche che il tioestere era stabile durante il periodo di tempo indicato. (C) La carica di UBE2D2 umano da parte di Ub senza lisina (Ub K0), l'arresto della reazione di carica e la scarica di UBE2D2 ~Ub sono stati eseguiti come descritto. Per le reazioni di scarica, chip wild-type o il mutante inattivo CHIP U-box, CHIP (H260Q) sono stati utilizzati come ligasi di ubiquitina e 10 mM di L-lisina sono stati forniti come potenziale accettore Ub. I campioni sono stati raccolti dopo i periodi di tempo indicati, eseguiti su gel di poliacrilammide separati e colorati con Coomassie. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Questo articolo descrive i metodi di ubiquitilazione di base in vitro per l'analisi della funzione della ligasi E3. Quando si eseguono saggi di ubiquitilazione in vitro, si deve considerare che alcuni enzimi E2 possono eseguire l'auto-ubiquitilazione a causa dell'attacco della loro cisteina attiva sui propri residui di lisina che si trovano in prossimità del sito attivo30. Per aggirare questo problema, si raccomanda l'uso di un mutante E2 in cui il rispettivo residuo di lisina viene scambiato con arginina, il che si traduce in un enzima E2 cataliticamente attivo resistente all'auto-ubiquitilazione32. Ciò è di particolare importanza quando si monitora il trasferimento di Ub tramite saggi di scarico di lisina per garantire la riproducibilità del saggio. Un altro fattore critico è la natura transitoria del legame tioestere E2~Ub. Nel caso in cui la stabilità del tioestere limiti possibili applicazioni in vitro, il residuo di cisteina attivo dell'E2 potrebbe essere scambiato con una serina per generare un ossiestere E2~Ub33più stabile. Per il primo utilizzo o quando si utilizza un nuovo enzima E2, determinare il livello di carica Ub su E2 che può essere raggiunto da E1. L'efficienza di carica può essere influenzata da diversi fattori tra cui l'origine della specie E1, la temperatura della reazione di carica e il rapporto molare tra Ub ed E2. Per determinare la resa della ricarica, visualizzare i valori non caricati rispetto a. caricato E2 tramite la colorazione Coomassie.

Complessivamente, queste potenziali restrizioni evidenziano l'importanza dell'ottimizzazione empirica delle condizioni di analisi in vitro, come la coppia E2-E3, la cinetica di carica e scarica E2, la molarità e l'attività delle proteine ricombinanti, in particolare per il saggio di scarica di lisina, per ottenere risultati riproducibili. Date le diverse funzioni cellulari dell'attaccamento covalente di Ub alle proteine del substrato, l'analisi dell'ubiquitilazione proteica è un campo di ricerca popolare. Tuttavia, l'analisi degli eventi di ubiquitilazione può essere difficile, specialmente in vivo. Questa difficoltà deriva da molteplici fattori tra cui la natura transitoria dell'interazione E3-substrato34, la ridondanza di molte ligasi E3, nonché la promiscuità delle ligasi E3 per diversi substrati35. Inoltre, la caratterizzazione di specifici eventi di ubiquitilazione in vivo è ostacolata dall'esistenza di ulteriori fattori che contribuiscono come i fattori di allungamento della catena dell'ubiquitina e gli enzimi di deubiquitilazione che modulano la topologia della catena dell'ubiquitina36. Questi vincoli sottolineano l'importanza di solide tecniche in vitro che aiutano a caratterizzare le attività enzimatiche delle ligasi di ubiquitina E3 in un sistema ricombinante definito.

Oltre alle applicazioni descritte, i saggi di ubiquitilazione in vitro possono anche essere utilizzati per rilevare il tipo di Ub-linkage utilizzando anticorpi specifici di tipo linkage. Come ulteriore approccio più dettagliato, la rispettiva banda proteica del substrato modificato Ub può essere estratta dal gel di poliacrilammide e analizzata tramite spettrometria di massa. L'identificazione del tipo di linkage supporta la comprensione del ruolo fisiologico dell'interazione E3-substrato, che è di particolare importanza per la caratterizzazione delle vie di degradazione del substrato associate alla malattia37,38. Allo stesso modo, il saggio di scarico della lisina può essere utilizzato come strumento efficace per svelare le differenze catalitiche tra le ligasi di ubiquitina E3 o le famiglie di ligasi E330. In conclusione, i metodi di ubiquitilazione in vitro qui descritti sono strumenti efficaci per analizzare diversi aspetti della funzione della ligasi E3. Oltre all'esecuzione relativamente semplice dei metodi descritti, un grande vantaggio è l'applicabilità generale in quanto le proteine provenienti da tutte le fonti eucariotiche potrebbero essere espresse in modo ricombinante e studiate in vitro senza la necessità di attrezzature speciali.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Ringraziamo i membri del nostro laboratorio per la discussione critica e i consigli utili sul manoscritto. Ci scusiamo per non aver citato contributi preziosi a causa della limitazione delle dimensioni. Questo lavoro è sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 e Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD to TH. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nell'ambito della Strategia di eccellenza della Germania - EXC 2030 - 390661388 e - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 a T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC GE Healthcare 10600000 nitrocellulose membrane
Anti-CHIP Cell Signaling 2080 Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC Roche OP10 Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin Upstate 05-944 Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase Sigma A6535-100UN
ATP (10x) Enzo 12091903
BSA Sigma A6003-10G
EDTA Roth 8043.2
KCl Roth 6781.1
K2HPO4 Roth P749.2
KH2PO4 Roth 3904.1
LDS sample buffer (4x) novex B0007
L-Lysine Sigma L5501-5G
MES Roth 4256.4
MeOH VWR Chemicals 2,08,47,307 100%
Milchpulver Roth T145.3
NaCl Roth P029.3
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x) novex NP0006-1
Page ruler plus Thermo Fisher 26619 Protein ladder
RotiBlock Roth A151.1 Blocking reagent
SDS (20%) Roth 1057.1
S1000 Thermal Cycler Bio Rad 1852196
Trans-Blot Turbo Bio Rad 1704150EDU Transfer system
Tris base Roth 4855.3
Tween 20 Roth 9127.2
UbcH Enzyme Set BostonBiochem K-980B E2 enzymes
Ubiquitin BostonBiochem U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1 Enzo BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x) Enzo BML-KW9885-001
Whatman blotting paper Bio Rad 1703969 Extra thick filter paper

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Biologia Numero 171
<em>In vitro</em> Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi
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Müller, L., Kutzner, C. E.,… More

Müller, L., Kutzner, C. E., Balaji, V., Hoppe, T. In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function. J. Vis. Exp. (171), e62393, doi:10.3791/62393 (2021).

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