Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62393
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Summary

המחקר הנוכחי מספק פרוטוקולים מפורטים במבחנה בכל מקום לבדיקת אנליזה לניתוח של E3 אוביקוויטין פעילות קטליטית ligase. חלבונים רקומביננטיים באו לידי ביטוי במערכות פרוקריוטיות כגון תרבות קולי Escherichia.

Abstract

החיבור הקוולנטי של אוביקוויטין (Ub) לשאריות ליזינה פנימיות של חלבון מצע, תהליך המכונה בכל מקום, מייצג את אחד השינויים הפוסט-תרגומיים החשובים ביותר באורגניזמים אאוקריוטים. Ubiquitylation מתווך על ידי מפל רציף של שלושה מחלקות אנזימים כולל אנזימים מפעילי אוביקוויטין (אנזימי E1), אנזימים ההולכים אוביקוויטין (אנזימי E2) ורצועות אוביקוויטין (אנזימי E3), ולפעמים, גורמי התארכות בשרשרת אוביקוויטין (אנזימי E4). כאן, בפרוטוקולים במבחנה לבדיקות בכל מקום מסופקים, המאפשרים הערכה של E3 אוביקוויטין פעילות ligase, שיתוף הפעולה בין זוגות E2-E3, ובחירת מצע. זוגות E2-E3 שיתופיים יכולים להיות מוקרנים על ידי ניטור הדור של רשתות פולי-אוביקוויטין בחינם ו / או כל מקום אוטומטי של ligase E3. מצע בכל העולם מוגדר על ידי כריכה סלקטיבית של ligase E3 והוא יכול להיות מזוהה על ידי סופג מערבי של התגובה במבחנה. יתר על כן, E2 ~ Ub פריקה בדיקה מתוארת, המהווה כלי שימושי להערכה ישירה של שיתוף פעולה פונקציונלי E2-E3. כאן, העברה תלויה E3 של אוביקוויטין מתבצעת מן האנזים E2 המתאים על חומצות אמינו ליצין חינם (חיקוי מצע בכל מקום) או ליזינים פנימיים של E3 ligase עצמו (auto-בכל מקום). לסיכום, שלושה פרוטוקולי במבחנה שונים מסופקים כי הם מהירים וקלים לביצוע כדי לטפל בפונקציונליות קטליטית E3 ligase.

Introduction

בכל מקום הוא התהליך שבו Ub מקושר באופן קוולנטי לחלבוןמצע 1. שינוי Ub מזורז על ידי תגובות אנזימטיות רצופות המערבות פעולה של שלושה מחלקות אנזימים שונות, כלומר., אנזימים מפעילי Ub (E1s), אנזימים ההולכים ub (E2s), ליגסות Ub (E3s) ואולי גורמי התארכות שרשרת Ub (E4s)2,3,4,5. לאחר אדנוסין טריפוספט (ATP)- ומגנזיום (Mg2 +) הפעלה תלויה של Ub על ידי E1, האתר הפעיל ציסטאין של E1 תוקף את גליצין C-מסוף של Ub, ויוצר קומפלקס thioester (Ub ~ E1). האנרגיה שנשאבת מהידרוליזה ATP גורמת ל- Ub להגיע למצב מעבר באנרגיה גבוהה, אשר נשמר לאורך מפל האנזים הבא. לאחר מכן, האנזים E2 מעביר את Ub מופעל לציסטאין הקטליטי הפנימי שלו, ובכך יוצר קשר Ub ~ E2 תיאסטר חולף. לאחר מכן, Ub מועבר לחלבון המצע.

זה יכול להיעשות בשתי דרכים. ייתכן שהליגאז E3 ייקשר תחילה ל- E2, או שליגאז E3 יכול לאגד ישירות את Ub. הדרך האחרונה גורמת להיווצרות של E3 ~ Ub ביניים. בכל מקרה, Ub מקושר לחלבון המצע על ידי היווצרות קשר איזופפטיד בין קבוצת קרבוקסיל C-terminal של Ub לבין קבוצת האמינו ליסין Ɛ של המצע6. הגנום האנושי מקודד שני E1s, כ 40 E2s, ויותר מ 600 פוטטיבי בכל מקום רצועות7. בהתבסס על מנגנון העברת Ub של E3, רצועות Ub מחולקות לשלוש קטגוריות המערבות הומולוגית לסוג E6AP C-Terminus (HECT), גן חדש מעניין באמת (RING)/U-box- type, וטבעת בין רצועות מסוג RING (RBR)8. במחקר זה, U-box המכיל ליגאז, טרמינל קרבוקסיל של חלבון אינטראקציה HSC70 (CHIP), משמש כאנזים E3 מייצג. בניגוד לאנזימי E3 מסוג HECT היוצרים Ub ~ E3 thioesters, תחום U-box של CHIP קושר E2 ~ Ub ומקדם את העברת Ub / מצע הבאים ישירות מן האנזים E28,9. בהתבסס על החשיבות של תיבת U עבור פונקציה אנזימטית, מוטציה U-box שבב לא פעיל, CHIP(H260Q), משמש כפקד. CHIP(H260Q) אינו מצליח להיקשר ל- E2s הקוגנייט שלו, ובכך מאבד את פעילות ה- E3 ligase10.

בכל מקום חלבון ממלא תפקיד מכריע בוויסות שפע של אירועים תאיים בתאים אאוקריוטים. ניתן לייחס את מגוון התוצאות התאיות המקודמות על ידי צירוף הפיך של מולקולות Ub לחלבונים מצעיים למאפיינים המולקולריים של Ub. כמו Ub עצמו מכיל שבעה שאריות ליסן (K) עבור כל כולה נוספת, יש מגוון עשיר של סוגי שרשרת Ub עם גדלים שונים ו / או טופולוגיות11. לדוגמה, מצעים יכולים להשתנות על ידי מולקולת Ub אחת באחת (מונו-נביקולציה) או ליזינים מרובים (multi-mono-ubiquitylation), ואפילו על ידי שרשראות Ub (פולי-ubiquitylation)11. שרשראות Ub נוצרות הומו או הטרוטיפיות באמצעות שאריות ליצין זהות או שונות של Ub, מה שעלול אף לגרום לרשתות Ub מסועפות9. לכן, כל החלבון מוביל לסידורים מגוונים של מולקולות Ub המספקות מידע ספציפי, למשל., עבור השפלה, הפעלה או לוקליזציה של חלבונים מצומדים12,13. אותות Ub שונים אלה מאפשרים תכנות מחדש מהיר של מסלולי איתות תאיים, המהווה דרישה חשובה ליכולתו של התא להגיב לצרכים הסביבתיים המשתנים.

היבט מרכזי של בכל מקום קשור לבקרת איכות חלבון. חלבונים תותומים או פגומים באופן בלתי הפיך חייבים להיות מושפלים ומוחלפים בחלבונים מסונתזים חדשים כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון או פרוטאוסטזיס14. בקרת האיכות E3 ligase, CHIP, משתפת פעולה עם מלווים מולקולריים בהשפלה תלוית Ub של חלבונים פגומים9,15,16,17. חוץ מזה, CHIP מווסת את היציבות של המלווה מכוון מיוסין, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), אשר מתואם היטב עם תפקוד שרירים וחריגות מהרמות האופטימליות להוביל מיופתיה אנושית18,19,20,21. השפלה של UNC-45B על ידי פרוטאסום 26S הוא בתיווך על ידי התקשרות של שרשרת פולי-Ub הקשורה K489. בהיעדר חלבוני מצע, CHIP מבצעת10,22,23,המאפיין את רינג / U-box E3 רצועות אוביקוויטין24,25 ונחשב לווסת פעילות ligase26. יישום שיטות בדיקת ההחמצה המופרכות המתוארות במאמר זה סייע לזהות באופן שיטתי אנזימי E2 המשתלבים עם CHIP כדי לקדם היווצרות של שרשראות פולי-Ub בחינם ו/או כל-כל אוטומטי של CHIP (פרוטוקול סעיף 2). יתר על כן, כל מקום תלוי שבב של UNC-45B נצפתה, שהוא מצע ידוע של E3 ligase18,19 (פרוטוקול סעיף 3). בסופו של דבר, העברה תלוית שבב של Ub מופעל מן Ub ~ E2 thioester היה במעקב (פרוטוקול סעיף 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חוצצים וריאגנטים

הערה: מאגרים ותרוממים שהוכנו ידנית במעבדה מפורטים להלן. כל המאגרים ושאר הריאגנטים המשמשים בפרוטוקולים נרכשו ממקורות שונים ושימשו בהתאם להוראות היצרנים.

  1. הכן תמיסת מלח 10x חוצץ פוספט (10x PBS). לשם כך, יש לערבב 1.37 M נתרן כלורי (NaCl), 27 mM אשלגן כלורי (KCl), 80 מ"מ של דיסודיום-מימן-פוספט דיהידראט (Na2HPO4.2H2O), ו-20 מ"ר של אשלגן-דיהידרוגן פוספט (KH2PO4)ב-1 ליטר של H2O מזוקק כפול (ddH2O). יש לאפס את ה-PBS 10x ולהכין פתרון PBS 1x ב-ddH2O.
    1. Autoclaving מתבצע במשך 15 דקות ב 121 °C (70 °F) ו 98.9 kPa.
      הערה: השעבוד האוטומטי מתבצע בתנאים אלה עבור כל המאגרים והפתרונות. אם לא צוין אחרת, פתרונות מאוחסנים בטמפרטורת החדר (RT).
  2. הכן 1 ליטר של פתרון PBS-Tween (PBS-T) על-ידי הוספת 0.1% Tween ל- 1 ליטר של PBS 1x.
  3. הכן 10 מ"ל של 0.5 M L-ליסין פתרון מלאי על ידי המסת L-ליסין ב ddH2O. Aliquot L-ליסין ב 1 מ"ל מנות, ולאחסן אותם ב -20 °C עד לשימוש נוסף.
    הערה: L-ליסין ניתן להקפיא ולהפשיר שוב ושוב.
  4. הכן פתרון 0.25 M אתילן דיאמין טטרה חומצה אצטית (EDTA) על ידי המסת EDTA ב 200 מ"ל של ddH2O.
    1. התאימו את ה-pH ל-8.0 עם נתרן הידרוקסיד (NaOH).
    2. כוונן את עוצמת הקול ל- 250 מ"ל עם ddH2O.
    3. תבודד את הפתרון באופן אוטומטי.
  5. הכן 10 מ"ל של 20 מ"ג / מ"ל פתרון אלבומין סרום בקר (BSA) על ידי המסת BSA ב ddH2O. חנות ב -20 °C ב 200 aliquots μL.
    הערה: ניתן להקפיא ולהפשיר את BSA שוב ושוב.
  6. הכן 1 ליטר של 2-(N-morpholino)אתאן חומצה גופרתית (MES) חוצץ פועל על ידי המסת 50 mM MES, בסיס 50 מ"מ טריס, 3.47 מ"מ נתרן דודציל סולפט (SDS), ו 1.03 מ"מ EDTA ב 0.9 L של ddH2O. לאחר ערבוב נכון, כוונן את עוצמת הקול ל- 1 ליטר.
    1. רמת ה-pH של מאגר 1x היא 7.6. אין להתאים את ה-pH עם חומצה או בסיס.
  7. הכן 200 מ"ל של פתרון חסימה (5% חלב) על ידי המסת 10 גרם אבקת חלב ב 1x PBS-T. יש לאחסן את פתרון החסימה ב- 4 °C (75°F) למשך עד שבוע.
  8. הכן 1 ליטר של מאגר העברה (ראה טבלת החומרים) בהתאם להוראת היצרנים.
  9. הכן 2x SDS מאגר מדגם על ידי המסת בסיס טריס 125 mM, 4% SDS, 4% גליצל, 0.03% ברומופנול כחול, ו 50 μL / mL של β-mercaptoethanol ב 50 מ"ל ddH2O. Aliquot ב 1 mL מנות, ולאחסן ב -20 °C עד לשימוש.

2. במבחנה אוטומטית בכל תוקף

  1. הכנה וביצוע של אסאי
    1. חשב את הנפח של כל ריאגנט הנדרש לכל תגובה בהתבסס על הטוחנות הנתונות של החלבונים וריכוז החלבון של פתרונות החלבון. לפי תגובת כל-סיביות אוטומטית, השתמש ב- 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 ו- 50 μM Ub. כוונן את עוצמת התגובה ל- 20 μL עם ddH2O.
      הערה: פתרון ATP ומאגר בכל עת נרכשו כפתרונות מלאי 10x ושימשו ב- 1x.
    2. הכן ערכת צנרת לכל התגובות. בדוק תשעה אנזימי E2 שונים ליכולתם לתפקד (I) עם CHIP, (II) עם מוטציה CHIP(H260Q) לא פעילה קטליטית, ו- (III) ללא CHIP בתגובות בודדות בכל מקום.
    3. כדי להימנע משגיאות צנרת, הכינו תערובת אב על קרח המכילה את הנפח הנדרש לכל התגובות בתוספת תגובה נוספת אחת. חשב את כמות תערובת האב הנדרשת לכל תגובה.
      הערה: רכיבי מיקס ראשיים הם ריאגנטים הנדרשים באותה מידה עבור כל תגובה, כלומר., E1, E3, Ub, ATP ומאגר בכל עת.
    4. הוסף ddH2O ותערובת מאסטר לצינורות תגובת שרשרת פולימראז (PCR). שמור את הצינורות על קרח.
    5. לפני תחילת תגובות בכל מקום על ידי הוספת אנזימי E2, להגדיר רוכב אופניים תרמי PCR עם התוכנית הבאה: 2 שעות, 37 °C (50 °F) ואחריו 4 °C (50 °F), לאין שיעור.
    6. הוסף 1 μM של אנזימי E2 בצינורות המתאימים, ודגר את הדגימות ב- PCR תרמי מחזור עבור פרק הזמן שצוין.
    7. לאחר 2 שעות, הוסף מאגר דגימת SDS לכל תגובה, וערבב על-ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים.
      הערה: אמצעי האחסון הנדרש של מאגר המדגם תלוי בריכוז המלאי של מאגר הדגימה. כאן, 20 μL של 2x SDS מאגר מדגם נוספו לכל תגובה.
    8. מרתיחים את הדגימות מיד ב 95 °C במשך 5 דקות, ולהמשיך עם אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide (PAGE). יש לאחסן את החלבונים המושקעים ב-20 °C (70 °F).
  2. אלקטרופורזה ג'ל וכתם מערבי
    1. לאחר ההפשרה, לסובב את הדגימות במשך כ 10 s ולטעון את ג'ל SDS-PAGE. השתמש בסולם חלבונים כהתייחסות לגודל.
      הערה: כאן, 4-12% ג'לים הדרגתיים Bis-Tris ו 3 μL של סולם חלבון שימשו. חלק את אמצעי האחסון לדוגמה וטען שני ג'לים באופן שווה באמצעות 20 μL של כל מדגם.
    2. הפעל את הג'ל ב 160-200 V במשך כ 30-45 דקות, כך הקדמי מדגם מגיע לתחתית הג'ל.
    3. מעבירים כל ג'ל למיכל פלסטיק מלא במאגר סופג למחצה, ודגר אותו במשך 2-5 דקות ב- RT. הסר את ג'ל הערימה.
    4. הכן שתי חתיכות של נייר סופג בגודל ג'ל וקרום ניטרוצלולוז בגודל ג'ל לכל ג'ל SDS וספוג מראש במאגר סופג למחצה. להרכיב את כריך כתם מערבי (WB) בתא WB מלמטה למעלה בסדר הבא: נייר סופג, קרום חנקן, ג'ל SDS-PAGE, נייר סופג.
    5. הסר בועות אוויר שאולי נלכדו בין שכבות הכריך. לשם כך, להשתמש רולר לגלגל בזהירות על הכריך כמה פעמים.
    6. סגור את התא, ואפשר למאגר כתם עודף להתנקז.
    7. מקם את התא בהתקן הכתמים המתאים, והשתמש בתוכנית הבאה לכתמים למחצה: 25 V, 1.0 A, 30 דקות.
    8. מעבירים את הממברנה הכתומה למיכל פלסטיק מלא בתמיסת חסימה, ודגר במשך 30 דקות ב- RT.
    9. הכן את פתרון הנוגדנים העיקרי על ידי הוספת הנוגדן ל- 10 מ"ל של PBS-T המכיל ריאגנט חסימה (ראה טבלת החומרים).
      הערה: ריכוז העבודה של הנוגדן הוא ספציפי לנוגדנים. במקרה זה, נוגדן נגד אוביקוויטין של עכבר חד-שבטי שימש בדילול של 1:5,000. עבור הג'ל השני, נוגדן ארנב חד שבטי נגד שבב שימש בשעה 1:5,000 ב PBS-T / חסימת ריאגנט.
    10. החלף את פתרון החסימה בתמיסת הנוגדנים העיקרית, ודגר למשך הלילה ב 4 °C (70 °F) על רוקר.
    11. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS-T.
    12. הכן את פתרון הנוגדנים המשני על ידי הוספת הנוגדן המתאים ל-10 מ"ל של PBS-T.
      הערה: כאן, נוגדנים נגד עכבר ועכבר נגד ארנב משמשים בדילול של 1:10,000.
    13. לדגור את הממברנה עם הנוגדן המשני במשך 1 שעות ב RT על רוקר.
    14. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 5 דקות עם PBS-T.
  3. ניתוח נתונים
    1. הוסיפו ריאגנטים לגילוי כתמים מערביים לנוגדנים מצומדים של פרוקסידאז חזרת (HRP) לממברנה השטופה בהתאם להוראות היצרן, ולכוד את אות ה-HRP באמצעות סרטי רנטגן או מצלמת התקן מצמידה טעינה(איור 1).

3. במבחנה מצע בכל

  1. הכנה וביצוע של אסאי
    1. חשב את הנפח של כל ריאגנט הנדרש לכל תגובה, בהתבסס על הטחינה הנתונה של החלבונים וריכוז החלבון של פתרונות החלבון. לפי תגובת מצע בכל זמן, השתמש ב- 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 מצע μM ו- 50 μM Ub. השתמש בפתרון ATP 10x ובמאגר 10x בכל עת ב- 1x. כוונן את עוצמת הקול של תגובת המצע בכל זמן ל- 20 μL עם ddH2O.
    2. הכן ערכת צנרת לכל התגובות. כלול תגובות בקרה מתאימות המוודאות שכל המצע הוא ספציפי ל- E3. השתמש בחלבון UNC-45B כמצע מייצג של CHIP ומוטנט שבב לא פעיל קטליטית (H260Q) כפקד. הכן את התגובות הבאות: E1, E2, תערובת Ub (כולל Ub, ATP, מאגר בכל עת); E1, E2, תערובת Ub, UNC-45B; E1, E2, תערובת Ub, CHIP(H260Q), UNC-45B; ו- E1, E2, תערובת Ub, CHIP, UNC-45B.
    3. כדי להימנע משגיאות צנרת, הכינו תערובת אב על קרח המכילה את הנפח הנדרש לכל התגובות בתוספת תגובה נוספת אחת. חשב את עוצמת הקול של תמהיל האב הנדרש לכל תגובה.
      הערה: רכיבי מיקס ראשיים לבדיקה זו כוללים E1, E2, Ub, ATP ומאגר בכל עת.
    4. הוסף רכיבי תגובה בסדר הבא: ddH2O, מצע, ligase E3.
    5. לפני תחילת התגובה בכל מקום על ידי תוספת של תערובת מאסטר, להגדיר רוכב אופניים תרמי PCR עם התוכנית הבאה: 2 שעות, 37 °C (50 °F) ואחריו 4 °C (50 °F), לאין שיעור.
    6. הוסף את תערובת האב לכל צינור, ודגר את הדגימות ב- PCR תרמי מחזור עבור פרק הזמן שצוין.
    7. לאחר 2 שעות, הוסף 2x מאגר מדגם SDS לכל תגובה, וערבב על-ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים.
    8. לאחר הריצה, להרתיח את הדגימות מיד ב 95 °C (5 דקות), ולהמשיך עם דף. לחלופין, לאחסן את החלבונים denatured ב -20 °C (70 °F).
  2. אלקטרופורזה ג'ל וכתם מערבי
    1. בצע אלקטרופורזה ג'ל כתם מערבי כמתואר בסעיף 2.2. השתמש בנוגדנים ספציפיים לזיהוי המצע והליגאז E3, בהתאמה.
      הערה: כאן, UNC-45B מותך לתג חלבון פוליפפטיד המופק ממוצר הגן c-myc המאפשר שימוש בנוגדן נוגדן עכבר חד שבטי נגד MYC. אנטי-MYC משמש בשעה 1:10,000.
  3. ניתוח נתונים
    1. בצע ניתוח נתונים כמתואר בסעיף 2.3 (איור 2).

4. ליסין פריקה אסייד

  1. הכנה וביצוע של אסאי
    1. טעינת האנזים E2 עם Ub על ידי E1
      1. חשב את הנפח של כל ריאגנט הנדרש לכל תגובה בהתבסס על הטוחנות הנתונות של החלבונים וריכוז החלבון של פתרונות החלבון. לפי תגובת טעינה, השתמש ב-2 מיקרומטר E1, 4 מיקרומטר E2 ו-4 סיביקוויטין נטול ליצין (Ub K0). השתמש במאגר ATP 10x וב- 10x בכל עת ב- 1x. כוונן את עוצמת התגובה לטעינה ל- 20 μL עם ddH20.
        הערה: מוטציית Ub K0 נטולת ליזינה משמשת לאכיפת הייצור הבלעדי של E2 מונו-בכל. ניתן להשתמש גם ב-Ub מסוג פראי; עם זאת, זה עלול להוביל שינויים מגוונים E2 ~ Ub (למשל.,פולי-בכל מקום של E2), אשר קשה יותר לנתח. לשימוש ראשון או בעת שימוש באנזים E2 חדש, לקבוע את רמת טעינת Ub על E2 שניתן להשיג על ידי E1. כדי לקבוע את התשואה של טעינה, לדמיין E2 לא טעון לעומת טעון באמצעות כתמי קומאסי. כאן, כמחצית Ub K0 הומר באופן אמין UBE2D2 ~ Ub בעת שימוש ביחסים שווימולריים של UBE2D2 ו Ub K0(איור משלים S2A).
      2. הכן ערכת צנרת לתגובת הטעינה. כוונן את עוצמת תגובת הטעינה לתגובות הפריקה הבאות לפי בחירה, למשל., השתמש ב- CHIP וב- CHIP(H260Q) בתגובות פריקה בודדות. לכן, להכין כפול את הנפח של תגובת טעינה אחת.
        הערה: בפעם הראשונה, לבדוק ריכוזים שונים של ligase E3 של בחירה כדי לפקח על תנאי פריקה אופטימליים, ולנתח אותם על ידי סופג מערבי. במצב אידיאלי, הפריקה של Ub מ- E2 תגדל עם הזמן עד שרצועת החלבון E2 ~ Ub בהתאמה תיעלם.
      3. לדגור על תגובת הטעינה במשך 15 דקות ב 37 °C (50 °F).
    2. סיום תגובת הטעינה
      1. עצור את תגובת הטעינה על ידי הוספת apyrase בריכוז סופי של 1.8 U / mL. בצע את הדגירה עם apyrase במשך 5 דקות ב RT, ואחריו תוספת של EDTA בריכוז הסופי של 30 מ "ר. כוונן את עוצמת התגובה לטעינה ל- 30 μL עם ddH2O.
        הערה: Apyrase משמש להמרת מולקולות ATP למולקולות ADP (אדנוסין דיפוספט). מכיוון שהפעילות של האנזים E1 תלויה ב-ATP, E1 כבר לא יכול לטעון E2. EDTA משמש גם כדי להבטיח כי E1 מעוכב על ידי מרווה Mg2 + יונים כי הם גורמים משותפים הדרושים עבור E1. נפח האפיראז הנדרש כדי לעצור את התגובה יכול להשתנות בין תנאי ההסמכה. למרות apyrase לבד כבר quenches מולקולות ATP זמין, שילוב של apyrase ו EDTA היה יעיל יותר לעצור את תגובת הטעינה עבור זוג E1-UBE2D2. כמו עצירת התגובה היא גורם קריטי עבור שחזור בדיקה, עצירה יעילה צריך להיבדק עבור זוגות E1-E2 חדשים. למטרה זו, הגדר תגובת טעינה, עצור אותה ואסוף דגימות בנקודות זמן ספציפיות, לדוגמה,לאחר 2, 5, 10 ו- 15 דקות. רמות שאינן משתנות של E2 ~ Ub מצביעות על כך שהתגובה נעצרה, וכי התיאסטר היה יציב בתקופה זו של זמן (איור משלים S2B).
    3. פריקת E2 ~ Ub על ידי E3
      1. הכן ארבע צינורות המתאימים לנקודות הזמן השונות (t0, t1, t2, t3); להוסיף חיץ מדגם ללא צמצום (6.7 μL של 4x ליתיום דודסיל סולפט (LDS) חוצץ) לכל צינור.
        הערה: אל תשתמש בסוכן הפחתת במאגר לדוגמה.
      2. הסר 6 μL מתגובת הטעינה שהופסקה עבור t0, וכוון את עוצמת הקול ל- 20 μL עם ddH2O.
      3. לדגור על מדגם t0 במשך 10 דקות ב 70 °C (70 °F).
        הערה: אין להרתיח את המדגם על ידי הארכת זמן הדגירה כמו thioesters הם מעבדה בטמפרטורות גבוהות יותר.
      4. חשב את הנפח של כל ריאגנט הנדרש לכל תגובת פריקה. השתמש 24 μL הנותרים של E2 טעון, ולהוסיף 10 mM L-ליסין, 1 מ"ג / מיליליטר BSA, ו 500 ננומטר של ליגאז E3. השתמש במאגר בכל עת ב- 1x, וכוון את עוצמת הקול ל- 80 μL עם ddH2O.
      5. הכן ערכת צנרת עבור כל תגובות הפריקה והשתמש ב- CHIP(H260Q) כפקד בנוסף ל- CHIP(WT).
      6. הגדר תגובות פריקה על קרח על-ידי הוספת הרכיבים הנדרשים בסדר הבא: ddH2O, מאגר בכל העולם, BSA, ליסין, ligase E3, ואת E2 טעון כדי להתחיל את התגובה.
      7. לדגור על תגובת הפריקה ב-RT.
      8. קח דגימות לאחר 5, 30, ו 60 דקות על ידי העברת 20 μL של תגובת הפריקה לתוך צינורות מדגם בהתאמה.
        הערה: נקודות זמן מתאימות המאפשרות ניטור נכון של הפריקה יכולות להשתנות בין זוגות E2-E3.
      9. מערבולת המדגם מיד, ודגרה אותו ב 70 °C (70 °F) במשך 10 דקות.
      10. המשך ישירות עם PAGE.
        הערה: E2 ~ Ub thioesters יכול להיות מעבדה גם לאחר denaturing במאגר מדגם. לכן, אלקטרופורזה ג'ל צריך להתבצע ישירות לאחר ביצוע בדיקות.
  2. אלקטרופורזה ג'ל וכתם מערבי
    1. בצע את אלקטרופורזה ג'ל ואת הכתם המערבי כמתואר בסעיף 2.2. השתמש בנוגדן ספציפי Ub, ואם זמין, גם להשתמש בנוגדן ספציפי E3 שגדל במין אחר, המאפשר זיהוי בו זמנית של אות Ub ו- E3 ligase.
  3. ניתוח נתונים
    1. בצע ניתוח נתונים כמתואר בסעיף 2.3 (איור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לזהות אנזימי E2 שמשתפים פעולה עם שבב ligase ubiquitin, קבוצה של מועמדים E2 נבדק בתגובות הפרט במבחנה בכל מקום. זוגות E2-E3 שיתופיים היו במעקב על ידי היווצרות של E3 תלויי כלוב מוצרים, כלומר., auto-בכל מוצרי ההנעה בכל טוב נותחו על ידי סופג מערבי. פרשנות הנתונים מבוססת על השוואת הגודל של רצועות החלבון המתקבלות עם סמני משקל מולקולריים. כל מקום חלבון מוביל להיווצרות של דפוסי פס ספציפיים המאופיינים בהופעת רצועות כפולות או להקות איטרטיביות מרובות עם הפרש גודל בהתאמה של 8.6 kDa (גודל של מולקולת Ub אחת).

כאן נבדקה היכולת של תשעה E2s לקדם היווצרות של מוצרי ubiquitylation בנוכחות שבב מסוג בר(איור 1A),שבב מוטציה U-box לא פעיל (H260Q) (איור 1B),או ללא CHIP (איור משלים S1). מוצרי אוביקוויטין עצמאיים E3 נוצרו בנוכחות שבב לא פעיל ובהיעדר שבב (איור 1B ו איור משלים S1). שבב לא פעיל לא היה בכל זמן אוטומטי(איור 1B). לעומת זאת, שבב מסוג בר היה אוטומטי בכל זמן בשילוב עם בני משפחת UBE2D (D1-D3) ובני משפחת UBE2E (E1, E3), בהתאמה(איור 1A,נתיבים 3, 4 ו-5). בעוד שרשתות פולי-אוב חינמיות יוצרו בשיתוף עם UBE2D1-3, זה לא זוהה עבור UBE2E1 או UBE2E3, בהתאמה(איור 1A,נתיבים 6 ו-7).

היכולת של משפחת UBE2D לקדם הן את היווצרותם של פולימרים Ub חינם ואת auto-בכל מקום של CHIP יוחסה לנוכחות של אתר כריכה אוביקוויטין שאינו קוולנטי על החלק האחורי של E227,28. באופן דומה, ההיווצרות הבלעדית של שרשראות Ub חינם על ידי UBE2N / V1 (איור 1A,נתיב 9) יוחסה לקשירה של Ub על ידי subunit UBE2V1 ספציפי (UEV subunit), מכוון את היווצרות של K63 מקושר Ub רשתות29. לא נוצרו מוצרים בכל העולם בנוכחות UBE2C1 ו- UBE2H(איור 1A,נתיבים 2 ו-8). לסיכום, CHIP יכול לשתף פעולה עם מספר אנזימי E2 במבחנה; עם זאת, כל-אוביקוויטלציה אוטומטית שלה היא E2 ספציפית לאנזים.

לאחר מכן, נעשה שימוש בצמד UBE2D2-CHIP כדי לחקור את ההווה של המלווה בהכוונת המיוסין, UNC-45B, על ידי פעילות ליגאז שבב(איור 2). מצע בכל תוקף נותח באמצעות סופג מערבי. ל-UNC-45B שאינו בכל מקום משקל מולקולרי של 103 kDa(איור 2,נתיב 4). מוטציית U-Box הלא פעילה של CHIP לא ביצעה שימוש ב-UNC-45B ולא בכל אי-שוויון אוטומטי(איור 2,נתיב 3). לעומת זאת, בכל תוקף של UNC-45B ו- auto-ubiququitylation של CHIP זוהה עם דגירה עם שבב מסוג בר(איור 2,נתיב 6). לכן, CHIP יכול בכל מקום UNC-45B במבחנה, דבר המצביע על כך UNC-45B הוא מצע שמור של CHIP18.

בסופו של דבר, הפעילות הקטליטית של CHIP נותחה בהיעדר חלבון מצע כלשהו. עד כה בוצעה בדיקת פריקה של ליסין שבה חומצות אמינו ליצין חופשיות יכולות לשמש כאובר בהיעדר מצעים E3 (איור 3, איור משלים S2C). בדיקת הפריקה מורכבת מצעד טעינה שבו Ub נטען על E2 על ידי E1, צעד עצירה למניעת טעינה נוספת של Ub על E2, וצעד פריקה שבו Ub מועבר מן Ub ~ E2 tioester חולף על חומצות אמינו ליסין חינם ו / או על שאריות ליסין של ligase E3. ניתוח כתם מערבי בוצע כדי לדמיין הן את החלבונים שעברו שינוי Ub והן את שבב ה- E3 ligase. לאנזים UBE2D2 לא טעון משקל מולקולרי של 17 kDa (איור משלים S2C).

כאשר הוא מואשם במולקולת Ub אחת המובטחת על ידי שימוש ב-Ub (Ub K0) ללא ליסין - המשקל המולקולרי של UBE2D2~Ub נע כלפי מעלה לכ-26 kDa. נקודת הזמן אפס (t0) מייצגת את התשואה הכוללת של E2 הטעון (איור 3). בנוכחות שבב לא פעיל (35 kDa), פריקה E3 קלוש ligase עצמאי של UBE2D230,31, אבל לא כל ubiquitylation אוטומטי של CHIP, זוהה. לעומת זאת, בנוכחות שבב מסוג בר (35 kDa), זוהתה פריקה מהירה יותר של UBE2D2, שהניבה פריקה מלאה תוך 60 דקות. במקביל, נצפתה תצפית אוטומטית של CHIP, מה שמצביע על כך שצ'יפ קידם את העברת Ub לשאריות ליצין משלו.

Figure 1
איור 1: ניתוח כתם מערבי לשיתוף פעולה של אנזימי E2-E3 במבחנה. אין ויטרו תגובות auto-ubiquitylation עם אנזימי E2 אנושיים שונים (משמאל לימין: ריק, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H, ו -N/V1) בוצעו כאמור באמצעות (A)שבב מסוג בר או (B) מוטציית U-box CHIP לא פעילה, CHIP(H260Q), כמו E3 ubiquitin ligase. הדגימות חולקו באופן שווה, רצו על ג'לים פוליאקרילמיד נפרדים, וחיסון עם נוגדנים נגד שבב ואנטי Ub כדי לדמיין מוצרי תגובה. קיצורים: Ub = אוביקוויטין; CHIP = מסוף קרבוקסיל של חלבון אינטראקציה HSC70; ATP = אדנוסין טריפוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח כתם מערבי המנטר את המצע בכל טוב. אין ויטרו מצע תגובות בכל זמן בוצעו כפי שצוין כדי לזהות בכל זמן של UNC-45B אנושי על ידי סוג בר CHIP או מוטציה U-box שבב לא פעיל, CHIP(H260Q). UBE2D2 אנושי שימש כאנזים E2. קיצורים: WT = סוג פראי; Ub = אוביקוויטין; CHIP = מסוף קרבוקסיל של חלבון אינטראקציה HSC70. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח כתם מערבי המנטר את העברת ה-Ub התלויה בשב"כי מ-UBE2D2~Ub thioester. טעינה של UBE2D2 אנושי על ידי Ub ללא ליסין (Ub K0), עצירת תגובת הטעינה, ופירוק UBE2D2 ~ Ub בוצע כמתואר. עבור תגובות הפריקה, שבב מסוג פראי או מוטציית U-box שבב לא פעיל, CHIP(H260Q), שימשו רצועות בכל מקום ו 10 mM L-ליצין סופק כמו Ub acceptor הפוטנציאלי. דגימות נאספו לאחר פרקי הזמן שצוינו, רצו על ג'ל פוליאקרילמיד, ואימונובלו עם תערובת נוגדנים נגד Ub/ANTI-CHIP. קיצורים: Ub = אוביקוויטין; CHIP = מסוף קרבוקסיל של חלבון אינטראקציה HSC70; ATP = אדנוסין טריפוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: ייצוגי של פעילות אנזימי E2 לניטור כתם מערבי בהיעדר E3. אין ויטרו תגובות ubiquitylation עם אנזימי E2 אנושיים שונים (משמאל לימין: ריק, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H, ו -N/V1) בוצעו כפי שצוין בהיעדר ligase E3 כדי לסנן מוצרי תגובה E3-עצמאיים. הדגימות היו לרוץ על ג'ל polyacrylamide וחיסון עם אנטי Ub. קיצורים: Ub = אוביקוויטין; ATP = אדנוסין טריפוספט. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: ניתוח תשואת הטעינה והיציבות של UBE2D2~Ub K0 thioester. (A)התשואה של טעינת UBE2D2 שהושגה על ידי E1 נבדקה בתנאים שונים. תגובת הטעינה הראשונה (I) כללה 5 מיקרומטר E1, 5 מיקרומטר E2 ו 50 מיקרומטר Ub K0. תגובת הטעינה השנייה (II) כללה 2 מיקרומטר E1, 4 מיקרומטר E2 ו-4 מיקרומטר Ub K0. תגובות הטעינה בוצעו כמתואר במשך 30 דקות בשעה 37 מעלות צלזיוס. דגימות נאספו לאחר 15 ו 30 דקות. התגובות נעצרו על ידי תוספת של 4x LDS חוצץ מדגם ודגרה ב 70 °C במשך 10 דקות לפני אלקטרופורזה ג'ל וכתם Coomassie. UBE2D2 לא טעון שימש כפקד. כמחצית UBE2D2 הומר UBE2D2 ~ Ub. לאחר השעה 15 דקות לא זוהתה טעינה נוספת. יתר על כן, לא הגידול ב- E1 ולא הגידול בכלוביקוויטין בחינם שינו את תפוקת הטעינה של UBE2D2 ~ Ub. לכן, טעינה בוצעה לאחר מכן במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F) באמצעות 2 μM E1, 4 μM E2, ו 4 μM Ub K0. (B)לאחר טעינה, התגובה נעצרה על ידי תוספת של 1.8 U / mL apyrase ו 30 mM EDTA ודגר ב RT. דגימות נאספו לאחר 2, 5, 8, 10, ו 15 דקות (נתיבים 2-6), ו UBE2D2 לא טעון שימש בקרה (נתיב 1). 4x חוצץ מדגם LDS נוספה, ודגימות היו דגירה ב 70 °C (70 °F) במשך 10 דקות לפני אלקטרופורזה ג'ל וכתמים Coomassie. העצירה הייתה יעילה כפי שנמדדה על ידי עוצמת הרצועה הקבועה של חלבון UBE2D2 ~ Ub, מה שמצביע גם על כך שהתיואסטר היה יציב במהלך פרק הזמן שצוין. (C)טעינה של UBE2D2 אנושי על ידי Ub ללא ליסין (Ub K0), עצירת תגובת הטעינה, ופירוק UBE2D2 ~ Ub בוצע כמתואר. עבור תגובות הפריקה, שבב מסוג פראי או מוטציית U-Box CHIP לא פעילה, CHIP(H260Q) שימשו כרצועות בכל מקום, ו- 10 מ"מ L-ליצין סופקו כקבל Ub הפוטנציאלי. דגימות נאספו לאחר פרקי הזמן שצוינו, לרוץ על ג'לים polyacrylamide נפרדים, ו Coomassie מוכתם. אנא לחץ כאן הורד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר שיטות בסיסיות במבחנה בכל העולם לניתוח של פונקציית ligase E3. בעת ביצוע במבחנה בכל מקום בדיקות, יש לקחת בחשבון כי כמה אנזימי E2 יכולים לבצע auto-בכל מקום בשל ההתקפה של ציסטאין הפעיל שלהם על שאריות ליצין שלהם הממוקמים בסמיכות לאתר הפעיל30. כדי לעקוף בעיה זו, השימוש במוטנט E2 מומלץ שבו שאריות ליצין בהתאמה מוחלפות עבור ארגינין, אשר גורם אנזים E2 פעיל קטליטית כי הוא עמיד אוטומטית בכל מקום32. זה בעל חשיבות מיוחדת בעת ניטור העברת Ub באמצעות בדיקת פריקה ליסין כדי להבטיח רבייה של בדיקת. גורם קריטי נוסף הוא האופי החולף של קשר E2 ~ Ub thioester. במקרה יציבות thioester מגבילה אפשרי ביישומי במבחנה, שאריות ציסטאין הפעילות של E2 ניתן להחליף סרין כדי ליצור E2 ~ Ub אוקסיאסטר יציב יותר33. לשימוש ראשון או בעת שימוש באנזים E2 חדש, לקבוע את רמת טעינת Ub על E2 שניתן להשיג על ידי E1. יעילות הטעינה יכולה להיות מושפעת ממספר גורמים כולל מקור המינים של E1, טמפרטורת תגובת הטעינה ויחס הטוחנת של Ub ל- E2. כדי לקבוע את התשואה של טעינה, הצג הצגה חזותית לא ממופה לעומת. טעון E2 באמצעות כתמי קומאסי.

בסך הכל, הגבלות פוטנציאליות אלה מדגישות את החשיבות של אופטימיזציה אמפירית של תנאי בדיקה במבחנה, כגון זוג E2-E3, טעינה E2 ופריקה קינטיקה, טוחנת ופעילות של חלבונים רקומביננטיים, במיוחד עבור בדיקה פריקה ליזין, כדי להשיג תוצאות לשחזור. בהתחשב בתפקודים התאיים המגוונים של החיבור הקוולנטי של Ub למצע חלבונים, הניתוח של חלבון בכל מקום הוא תחום מחקר פופולרי. עם זאת, ניתוח של אירועי בכל מקום יכול להיות קשה, במיוחד ב vivo. קושי זה נובע מגורמים מרובים כולל האופי החולף של אינטראקצייתE3-מצע 34, יתירות של רצועות E3 רבות, כמו גם הפקרות של רצועות E3 עבור מספרמצעים 35. יתר על כן, האפיון של אירועי כל מקום ספציפיים ב vivo מעוכב על ידי קיומם של גורמים תורמים נוספים כגון גורמי התארכות שרשרת אוביקוויטין ואנזימי deubiquitylation המווסתים טופולוגיית שרשרת אוביקוויטין36. אילוצים אלה מדגישים את החשיבות של טכניקות במבחנה חזקות המסייעות לאפיין פעילויות אנזימטיות של רצועות E3 בכל מקום במערכת רקומביננטית מוגדרת.

מלבד היישומים המתוארים, במבחנה בכל ביסות יכול לשמש גם כדי לזהות את סוג הצמדת Ub באמצעות נוגדנים ספציפיים מסוג הצמדה. כגישה מפורטת יותר, ניתן לחלץ את רצועת החלבון המתאימה של המצע המותאם ל-Ub מג'ל הפוליקרימיד ולנתח אותה באמצעות ספקטרומטריית מסה. זיהוי סוג ההצמדה תומך בהבנת התפקיד הפיזיולוגי של האינטראקציה E3-מצע, שהוא בעל חשיבות מיוחדת לאפיון מסלולי השפלת מצע הקשורים למחלה37,38. באופן דומה, בדיקת פריקה ליזין יכול לשמש ככלי יעיל כדי לפענח הבדלים קטליטיים בין E3 בכל מקום רצועות או E3 ligase משפחות30. לסיכום, שיטות ההפריה המופרכות המתוארות כאן הן כלים יעילים לניתוח היבטים שונים של פונקציית ligase E3. מלבד הביצוע הפשוט יחסית של השיטות המתוארות, יתרון מרכזי הוא הישימות הכללית שכן חלבונים מכל המקורות האוקריוטים יכולים להתבטא מחדש ולמד במבחנה ללא צורך בציוד מיוחד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על דיון ביקורתי ועצות מועילות על כתב היד. אנו מתנצלים על כך שלא ציינו תרומות יקרות ערך בשל מגבלת גודל. עבודה זו נתמכת על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 ואשכול מצוינות EXC 229 / CECAD ל- TH. עבודה זו מומנה על ידי דויטשה פורשונגסגמיינסכאפט (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה - EXC 2030 - 390661388 ו - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 a T.H. gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC GE Healthcare 10600000 nitrocellulose membrane
Anti-CHIP Cell Signaling 2080 Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC Roche OP10 Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin Upstate 05-944 Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase Sigma A6535-100UN
ATP (10x) Enzo 12091903
BSA Sigma A6003-10G
EDTA Roth 8043.2
KCl Roth 6781.1
K2HPO4 Roth P749.2
KH2PO4 Roth 3904.1
LDS sample buffer (4x) novex B0007
L-Lysine Sigma L5501-5G
MES Roth 4256.4
MeOH VWR Chemicals 2,08,47,307 100%
Milchpulver Roth T145.3
NaCl Roth P029.3
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x) novex NP0006-1
Page ruler plus Thermo Fisher 26619 Protein ladder
RotiBlock Roth A151.1 Blocking reagent
SDS (20%) Roth 1057.1
S1000 Thermal Cycler Bio Rad 1852196
Trans-Blot Turbo Bio Rad 1704150EDU Transfer system
Tris base Roth 4855.3
Tween 20 Roth 9127.2
UbcH Enzyme Set BostonBiochem K-980B E2 enzymes
Ubiquitin BostonBiochem U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1 Enzo BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x) Enzo BML-KW9885-001
Whatman blotting paper Bio Rad 1703969 Extra thick filter paper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

Tags

ביולוגיה גיליון 171
<em>במבחנה</em> ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, L., Kutzner, C. E.,… More

Müller, L., Kutzner, C. E., Balaji, V., Hoppe, T. In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function. J. Vis. Exp. (171), e62393, doi:10.3791/62393 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter