Summary
स्वचालित ऊतक विच्छेदन के साथ डिजिटल एनोटेशन कम ट्यूमर सामग्री के मामलों में ट्यूमर को समृद्ध करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण प्रदान करता है और पैराफिन और जमे हुए ऊतक प्रकार दोनों के लिए अनुकूल है। वर्णित वर्कफ़्लो सटीकता, प्रजनन क्षमता और थ्रूपुट में सुधार करता है और इसे अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग्स दोनों पर लागू किया जा सकता है।
Abstract
कम ट्यूमर सामग्री ऊतकों में ट्यूमर संवर्धन, विधि के आधार पर 20% ट्यूमर सामग्री से नीचे, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण जैसे कई डाउनस्ट्रीम परखों के साथ गुणवत्ता डेटा उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है। स्वचालित ऊतक विच्छेदन एक नई पद्धति है जो पारंपरिक मैक्रो-विच्छेदन और लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के समय, लागत और विशेषज्ञता सीमाओं के उपयोगकर्ता-निर्भर अशुद्धता को कम करके इन सामान्य, कम ट्यूमर सामग्री ऊतकों में ट्यूमर संवर्धन को स्वचालित और सुधारती है। यहां, डिजिटल हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) एनोटेशन का उपयोग ब्लेड का उपयोग करके छोटे ट्यूमर क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए किया जाता है जो न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और पूरे एक्सोम अनुक्रमण (डब्ल्यूईएस) से पहले स्वचालित ट्यूमर संवर्धन के लिए मोटाई में 20 μm तक बिना दाग वाले फॉर्मलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) या ताजा जमे हुए वर्गों में 250 μm 2 व्यास है। स्वचालित विच्छेदन न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए एकल या कई वर्गों से कम ट्यूमर सामग्री ऊतकों में एनोटेट क्षेत्रों की कटाई कर सकते हैं। यह सटीकता, प्रजनन क्षमता में सुधार करते हुए और कम स्लाइड के उपयोग के साथ थ्रूपुट में वृद्धि करते हुए व्यापक पूर्व और बाद के फसल संग्रह मैट्रिक्स पर कब्जा करने की भी अनुमति देता है। वर्णित प्रोटोकॉल पशु और / या मानव एफएफपीई या कम ट्यूमर सामग्री के साथ ताजा जमे हुए ऊतकों पर स्वचालित विच्छेदन के साथ डिजिटल एनोटेशन को सक्षम बनाता है और नैदानिक या अनुसंधान वर्कफ़्लो में डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्तता को बढ़ावा देने के लिए ब्याज संवर्धन के किसी भी क्षेत्र के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) का उपयोग रोगी देखभाल और कैंसर अनुसंधान दोनों के लिए तेजी से किया जाता है ताकि उपचार का मार्गदर्शन करने और वैज्ञानिक खोज को सुविधाजनक बनाने में मदद मिल सके। ऊतक अक्सर सीमित होता है और चर ट्यूमर सामग्री वाले छोटे नमूने नियमित रूप से उपयोग किए जाते हैं। ट्यूमर पर्याप्तता और अखंडता, इसलिए, सार्थक डेटा प्राप्त करने के लिए एक बाधा बनी हुई है। कम ट्यूमर प्रतिशत वाले नमूने अनुक्रमण कलाकृतियों से सच्चे वेरिएंट को अलग करने में कठिनाई पैदा कर सकते हैं और अक्सर एनजीएस1 के लिए अयोग्य होते हैं। कम ट्यूमर सामग्री के मामलों के ट्यूमर संवर्धन, 20% से नीचे, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अनुक्रमण डेटा उत्पन्न करने और यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त सामग्री उपज में मदद करने के लिए दिखाया गया है कि कम आवृत्ति वेरिएंट 2,3 से चूक न जाएं। हालांकि, उपयोग किए गए प्लेटफार्मों और उत्पन्न डेटा के नियोजित उपयोग के आधार पर सीमाएं अलग-अलग होंगी।
परंपरागत रूप से, निष्कर्षण के लिए ट्यूमर क्षेत्रों का संवर्धन फॉर्मलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) स्लाइड के मैनुअल मैक्रोडिसेक्शन या लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) द्वारा किया जाता है। मैनुअल मैक्रोडिसेक्शन, या स्लाइड से निर्दिष्ट ऊतक क्षेत्रों को स्क्रैप करना, ट्यूमर क्षेत्रों को अपेक्षाकृत कम लागत के साथ डाउनस्ट्रीम परख में उपयोग के लिए हटाने की अनुमति देता है, लेकिन कम सटीकता और कम परिशुद्धता 2,4 के साथ। न्यूनतम तकनीकी सटीकता उच्च ट्यूमर सामग्री के मामलों के साथ बहुत प्रभावी हो सकती है जहां ट्यूमर के बड़े स्वैथ मौजूद हैं और / या न्यूनतम ऊतक हानि परिणामों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करती है, लेकिन कम ट्यूमर सामग्री के मामलों या अधिक बिखरे हुए ट्यूमर वाले मामलों में वृद्धि की सटीकता की आवश्यकता होती है। इसलिए एलसीएम का आविष्कार 1990 के दशक में किया गया था और फॉर्मलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) स्लाइड 5,6,7,8 से ऊतकके छोटे, परिभाषित, सूक्ष्म क्षेत्रों को ठीक से हटाने का एक मूल्यवान तरीका बन गया। एलसीएम का उपयोग एकल सेल आबादी एकत्र करने के लिए किया जा सकता है जब नमूने की जटिल विषमता मौजूद होती है9 सेल आबादी को अलग करने के लिए पहले मुश्किल के संग्रह की अनुमति देता है। हालांकि, एलसीएम को महंगी मशीनरी की आवश्यकता होती है जिसके लिए व्यापक तकनीकी विशेषज्ञता और हाथों पर 10,11,12,13,14 की आवश्यकता होती है।
स्वचालित ऊतक विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण में एलसीएम (~ 10 μm) और मैक्रोडिसेक्शन (~ 1 मिमी) 15 के बीच परिशुद्धता होती है। इसके अतिरिक्त, यह मैक्रोडिसेक्शन और एलसीएम के बीच लागत और तकनीकी विशेषज्ञता आवश्यकताओं दोनों को प्रदर्शित करता है और पिछले तरीकों के नुकसान को कम करने के लिए अनुक्रमिक एफएफपीई स्लाइड से तेजी से ऊतक संवर्धन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है15. इस फैशन में स्वचालित विच्छेदन डिजिटल एनोटेशन या ऑन-स्टेज स्लाइड संदर्भ छवि ओवरले का उपयोग करता है जो ब्याज के विदारक और समृद्ध क्षेत्रों के लिए क्रमिक रूप से खंडित बिना दाग वाले ऊतक स्लाइड पर होता है। उपकरण प्लास्टिक कताई ब्लेड मिलिंग युक्तियों, 1.5 एमएल संग्रह ट्यूबों का उपयोग करता है और न्यूक्लिक निष्कर्षण और अनुक्रमण सहित डाउनस्ट्रीम परख के लिए ब्याज के क्षेत्रों को इकट्ठा करने के लिए विच्छेदन के लिए विभिन्न तरल पदार्थों की एक संख्या के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। कताई प्लास्टिक मिलिंग टिप आंतरिक और बाहरी सिरिंज बैरल जलाशयों और बफर इकट्ठा करने के लिए एक सवार का उपयोग करता है, फिर मिलों और ऊतक16 एकत्र करता है। चर मिलिंग टिप आकार व्यास (250 μm, 525 μm, 725 μm) तुलना के लिए अलग ऊतक क्षेत्रों के विच्छेदन के लिए अनुमति दे सकते हैं, मल्टीफोकल क्षेत्रों है कि पूल या एकल या एकाधिक एफएफपीई स्लाइड से अलग छोटे क्षेत्रों. फसल के लिए उपयोग की जाने वाली अनुभाग मोटाई को व्यक्तिगत प्रयोग आवश्यकताओं के आधार पर समायोजित किया जा सकता है और उपयोगकर्ता यह सुनिश्चित कर सकते हैं कि फसल के लिए उपयोग किए जाने वाले अंतिम खंड के तुरंत बाद एक धारावाहिक अनुभाग पर एक अतिरिक्त एच एंड ई प्रदर्शन करके ब्याज के क्षेत्रों को समाप्त नहीं किया गया है।
स्वचालित विच्छेदन को कम ट्यूमर सामग्री के मामलों में ट्यूमर सामग्री को समृद्ध करने के तरीके के रूप में पहचाना गया था और हमने एक स्वचालित ऊतक विच्छेदन उपकरण की इच्छित कार्यक्षमता का परीक्षण और विस्तार किया, जिसे वर्तमान में मोटाई में 10 μm तक एफएफपीई नैदानिक नमूनों पर उपयोग के लिए विपणन किया जाता है। काम से पता चलता है कि स्वचालित विच्छेदन अनुसंधान प्रयोजनों के लिए मोटाई में 20 μm तक एफएफपीई और ताजा जमे हुए मानव या पशु ऊतक वर्गों दोनों पर लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल कम ट्यूमर सामग्री वाले ऊतकों में ट्यूमर संवर्धन के लिए डिजिटल रूप से एनोटेट और स्वचालित विच्छेदन के लिए एक दृष्टिकोण भी प्रदर्शित करता है और / या नेस्टेड, बिखरे हुए ट्यूमर के साथ मामलों में जहां सार्थक मैक्रोडिसेक्शन चुनौतीपूर्ण है या संभव नहीं है और एनजीएस के लिए पर्याप्त न्यूक्लिक एसिड की गुणवत्ता और उपज दोनों दिखाता है। स्वचालित विच्छेदन इसलिए ट्यूमर संवर्धन के लिए मध्य-स्तरीय परिशुद्धता और बढ़े हुए थ्रूपुट प्रदान कर सकता है और ब्याज के अन्य क्षेत्रों को समृद्ध करने या अनुसंधान या नैदानिक प्रश्नों के उत्तर देने के लिए अन्य प्लेटफार्मों के साथ संयुक्त करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।
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Protocol
दीक्षा से पहले, संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) प्रोटोकॉल के अनुसार उपयुक्त ऊतक नमूने प्राप्त करें। यहां वर्णित सभी तरीकों को जेनेंटेक, इंक की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. ऊतक और स्लाइड तैयारी
- एफएफपीई या ताजा जमे हुए ऊतक ब्लॉक का चयन करें और नीचे इसी प्रसंस्करण विधि का उपयोग करें।
- वांछित मोटाई पर सकारात्मक चार्ज ग्लास स्लाइड पर ऊतक ब्लॉक वर्गों में कटौती करें। एच एंड ई धुंधला (यानी, 4 μm) के लिए उपयुक्त मोटाई पर कटौती के साथ रिबन में एफएफपीई ऊतक को क्रमिक रूप से अनुभाग करें, इसके बाद आवश्यकता और ऊतक उपलब्धता के आधार पर 4-20 μm से लेकर मोटाई पर 1-4 अनुभाग। सकारात्मक चार्ज ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ऊतक वर्गों ले लीजिए।
नोट: ताजा जमे हुए संदर्भ ऊतक वर्गों को जमे हुए वर्गों के लिए नियमित प्रोटोकॉल का उपयोग करके हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ तुरंत दाग दिया जाना चाहिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित बिना दाग वाले जमे हुए वर्गों को फसल के लिए आवश्यक नहीं किया जाता है। - सभी एफएफपीई वर्गों को रात भर कमरे के तापमान पर सूखने दें।
- 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एफएफपीई संदर्भ स्लाइड सेंकना और फिर नियमित प्रोटोकॉल का उपयोग करके एच एंड ई के साथ दाग।
- 20x आवर्धन या उससे अधिक पर एक पूरे स्लाइड इमेजर पर एच एंड ई दाग स्लाइड स्कैन करें।
- एक विक्रेता प्रदान की देखने के मंच या ओपन सोर्स दर्शक का उपयोग ब्याज के ट्यूमर क्षेत्रों के लिए स्कैन की गई स्लाइड छवियों को एनोटेट करें। इन एनोटेशन को या तो कम-आवर्धन स्क्रीनशॉट के रूप में निर्यात करें या उन्हें बहुभुज कोने के अनुरूप एक्स-वाई पिक्सेल निर्देशांक युक्त मेटाडेटा फ़ाइल के रूप में सहेजें।
नोट: पूर्व के साथ काम करने के लिए कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, लेकिन उत्तरार्द्ध प्रक्रिया स्वचालन में फायदे प्रदान करता है। - उपयोग किए गए दृष्टिकोण के अनुरूप रुचि के एनोटेट किए गए क्षेत्रों के डिजिटल मास्क बनाएं और मैनुअल एनोटेशन निर्यात करें।
नोट: यदि एनोटेशन के स्क्रीनशॉट/छवि का उपयोग किया जाता है, तो सरल छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर का उपयोग किसी क्षेत्र का चयन करने और पूरे चयन को भरने के लिए किया जा सकता है। प्रत्येक आरओआई के लिए एक्स-वाई निर्देशांक का उपयोग करने के लिए ब्याज के क्षेत्रों में भरे हुए कम-मैग छवि बनाने के लिए छवि डेटा और बहुभुज निर्देशांक दोनों को पढ़ने के लिए प्रोग्रामिंग भाषा के उपयोग की आवश्यकता होती है। उपयोगकर्ता को अपने व्यक्तिगत सॉफ़्टवेयर उपलब्धता और आवश्यकताओं के आधार पर एक प्रक्रिया स्थापित करने के लिए स्वचालित विच्छेदन साधन विक्रेता के साथ काम करना चाहिए। यदि स्कैनिंग, डिजिटल स्लाइड एनोटेशन और / या डिजिटल मास्क निर्माण अनुपलब्ध है, तो मार्कर का उपयोग करके सावधानीपूर्वक ऑन-स्लाइड एनोटेशन किया जा सकता है और संदर्भ छवि के रूप में डिजिटल मास्क के स्थान पर उपयोग किया जा सकता है। अनुपूरक फाइल 1 में डिजिटल मास्क निर्माण के लिए स्यूडोकोड प्रदान किया गया है।
2. स्वचालित ऊतक विच्छेदन
- डिजिटल स्लाइड संदर्भ का उपयोग करते समय चौथी स्लाइड पदों के माध्यम से पहले में मंच पर बिना दाग नमूना ऊतक स्लाइड रखें। डिजिटल विकल्प के बजाय ऑन-स्लाइड एनोटेशन का उपयोग करते समय, पहली स्थिति में एक संदर्भ स्लाइड के साथ चौथी स्लाइड पदों के माध्यम से दूसरे में मंच पर बिना दाग वाले नमूना ऊतक स्लाइड रखें।
- स्वचालित ऊतक विच्छेदन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मिलिंग जॉब बनाएं: जॉब सिलेक्शन > नई जॉब > केस आईडी बनाएं > मिलिंग जॉब का नाम दें; ऊपर या नीचे तीर टैब का उपयोग करके मोटाई > अनुभाग मोटाई पर जाएं; फिर पैराफिनाइज्ड या डेपाराफिनाइज्ड, संदर्भ छवि > > फ़ाइल से > आयात छवि > फ़ाइल से ऊतक तैयारी पर जाएं, यदि लागू हो तो ड्रॉपडाउन से डिजिटल संदर्भ के रूप में आयात करने के लिए। ऑन स्टेज स्लाइड संदर्भ के लिए स्टेज से चुनें। जब फ़ील्ड पूर्ण हो जाते हैं, तो चौथे स्थान के माध्यम से पहले प्रत्येक नमूना ऊतक स्लाइड को कैप्चर करने के लिए नीचे-दाएं कोने में स्कैन स्टेज बटन का चयन करके चरण को स्कैन करें।
- छवि पर कब्जा करने के लिए ऊतक क्षेत्र का चयन करें।
- यदि ऑन-स्टेज संदर्भ का उपयोग कर रहे हैं, तो ऊतक पर आयताकार क्षेत्र बनाने के लिए बॉक्स को एक कोने से विपरीत तक खींचें। चरण संदर्भ छवि को कैप्चर करने के लिए आयताकार क्षेत्र के तहत परिपत्र बुलबुले का चयन करें। यदि डिजिटल संदर्भ छवि का उपयोग कर रहे हैं, तो चयनित आयताकार क्षेत्र पर छवि को ओवरले करें। नमूना ऊतक पर आकार और स्थिति से सबसे अच्छा मेल खाने के लिए पाठ्यक्रम ज़ूम में डिजिटल संदर्भ का आकार बदलें और संरेखित करें।
- संदर्भ छवि के ऊपरी-दाएं कोने में प्रतिलिपि विकल्प का चयन करके चौथे स्लाइड पदों के माध्यम से दूसरे में शेष नमूना ऊतक स्लाइड पर इस आयत क्षेत्र की प्रतिलिपि बनाएँ। आवश्यकतानुसार संरेखित करें और आकार बदलें।
नोट: डिजिटल मास्क के बजाय ऑन-स्लाइड संदर्भ छवि का उपयोग करते समय, चुनें कि मंच पर कौन सी स्लाइड का उपयोग संदर्भ के रूप में किया जाना चाहिए।
- संदर्भ और नमूना स्लाइड्स संरेखित करें
- जब संदर्भ छवि सभी स्लाइड स्थितियों में ऊतक नमूना स्लाइड पर पूरी तरह से संरेखित होती है, तो ठीक समायोजन चरण में जाने के लिए स्क्रीन के निचले-दाएं कोने में स्कैन स्टेज बटन का चयन करें। नमूना स्लाइड ओवरले से सर्वोत्तम मिलान करने के लिए संदर्भ के ठीक संरेखण और ज़ूम समायोजन करने के लिए पहले चरण की स्थिति और ट्रांसफ़ॉर्म टूल आइकन (दाएं हाथ के टूलबार में तीसरा आइकन नीचे) का चयन करें। प्रत्येक स्लाइड स्थिति के संरेखण को समायोजित करने और प्राप्त करने के लिए ज़ूम इन और ज़ूम आउट सुविधा के साथ संदर्भ छवि और नमूना छवि के बीच टॉगलिंग स्क्रीन के निचले भाग में नमूना स्लाइडिंग बार के संदर्भ का उपयोग करें। चौथे नमूना स्लाइड पदों के माध्यम से दूसरे में इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
- ब्याज के क्षेत्र के मिलिंग क्षेत्र का चयन करें
- एक बार चार स्लाइड पदों में से प्रत्येक का इष्टतम नमूना ओवरले प्राप्त हो जाने के बाद, नकाबपोश संदर्भ छवि के रंगीन हिस्से पर कलर पिकर टूल आइकन (दाहिने हाथ के टूलबार में दसवां आइकन) का उपयोग करके मिलिंग पथ पदनाम खींचें। यदि विच्छेदन के लिए एकाधिक स्लाइड्स या क्षेत्रों को एनोटेट किया जाता है, तो समान तक विस्तृत करें बॉक्स का चयन करें और फिर नमूना स्लाइड्स पर मिलिंग पथ आरेखित करने के लिए निचले दाईं ओर एनोटेशन प्राप्त करें बटन का चयन करें.
- पहली स्लाइड स्थिति में मिलिंग पथ का चयन करें।
नोट: जब मिलिंग पथ पहली स्लाइड स्थिति में चुना जाता है, तो इसे शेष स्लाइड स्थितियों पर कॉपी किया जाएगा और मिलिंग टिप उपयोग की गणना की जाएगी। ऊपरी-बाएं कोने में मिलिंग टिप उपयोग की गणना कवर किए गए क्षेत्र और चयनित टिप आकार के आधार पर की जाती है। यदि चार से अधिक युक्तियों की गणना की जाती है, तो एनोटेट किए गए आरओआई को कैप्चर करने के लिए एक बड़ा टिप आकार चुना जा सकता है। मिलिंग टिप तीर के तहत स्क्रीन के बाईं ओर टिप आकार का चयन या परिवर्तन किया जा सकता है और टिप उपयोग की पुनर्गणना की जाएगी। - जब मिलिंग पथ की गणना की जाती है, तो चार या उससे कम मिलिंग युक्तियों के साथ एनोटेट किए गए आरओआई एकत्र करें। मंच पर उनके उचित पदनाम में रखा संग्रह ट्यूबों से मिलिंग युक्तियों के लोडिंग संकेत करने के लिए स्क्रीन के निचले दाईं ओर सेटअप स्टेज बटन का चयन करें।
- ऊतक प्रकार (एफएफपीई या ताजा जमे हुए) और डाउनस्ट्रीम न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किट की जरूरतों के लिए सबसे उपयुक्त विच्छेदन बफर के 3.0 मिलीलीटर के साथ जलाशय भरें और स्क्रीन के निचले-दाएं कोने में विच्छेदन बटन का चयन करें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किट से आणविक ग्रेड खनिज तेल या एक उपयुक्त बफर का उपयोग करें।
नोट: स्लाइड और ब्याज के चयनित क्षेत्रों के स्वचालित विच्छेदन तो शुरू होता है और नमूने साधन द्वारा एकत्र कर रहे हैं। यूनिट हेड मंच के पीछे से मिलिंग युक्तियों को उठाएगा और जलाशय से विच्छेदन तरल पदार्थ से भर जाएगा। युक्तियाँ तो पूरा या पूर्ण होने तक स्लाइड से नमूना ऊतक आकांक्षा मिलिंग पथ के साथ स्पिन. विच्छेदन तरल पदार्थ के साथ एकत्र किए गए नमूने को तब मंच के पीछे स्थित संग्रह ट्यूबों में वितरित किया जाता है। - जब स्वचालित विच्छेदन पूरा हो जाता है, तो संग्रह ट्यूबों और विच्छेदित नमूना स्लाइड को मंच से हटा दें और उन्हें क्रमशः ट्यूब रैक और स्लाइड रैक में रखें।
नोट: ताजा जमे हुए फसल निर्माता के निर्देशों के अनुसार न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण में सीधे लिया जाना चाहिए और विच्छेदन के बाद ताजा जमे हुए वर्गों को जमे हुए वर्गों के लिए नियमित प्रोटोकॉल का उपयोग करके तुरंत एच एंड ई दाग दिया जाना चाहिए। - 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पोस्ट विच्छेदित ऊतक स्लाइड सेंकना और फिर नियमित प्रोटोकॉल का उपयोग कर एच एंड ई के साथ दाग।
- 20x आवर्धन और / या संग्रह पर एक पूरे स्लाइड इमेजर पर पोस्ट विच्छेदित एच एंड ई दाग स्लाइड स्कैन करें कि कौन सा ऊतक एकत्र नहीं किया गया था और स्लाइड पर रहता है।
नोट: वैकल्पिक स्कैनिंग विकल्पों के लिए ऊपर चरण 1.5 देखें।
3. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण
- पूल और गोली ऊतक। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण करें।
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Representative Results
ज़ेनोग्राफ्ट में मेटास्टैटिक कोलोरेक्टल कैंसर वाले एफएफपीई और एफएफ माउस यकृत वर्गों का चयन किया गया था। अनुभाग एच एंड ई दाग (चित्रा 1 ए, ई, आई) थे और 20 एक्स आवर्धन पर एक पूरे स्लाइड इमेजर पर स्कैन किए गए थे। एक रोगविज्ञानी डिजिटल रूप से ब्याज के ट्यूमर क्षेत्रों को एनोटेट करता है और एक मुखौटा वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था और डिजिटल पीएनजी संदर्भ छवि (चित्रा 1 बी, एफ, जे) के रूप में स्वरूपित किया गया था। सीरियल 10 μm और 20 μm मोटी बिना दाग नमूना स्लाइड मंच पर रखा गया था और स्वचालित विच्छेदन के रूप में ऊपर वर्णित प्रदर्शन किया गया था। ताजा जमे हुए ऊतकों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट से एक लाइसिस बफर में एकत्र किया गया था और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सीधे न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण में ले जाया गया था। एफएफपीई नमूने आणविक ग्रेड खनिज तेल का उपयोग करके एकत्र किए गए थे और विच्छेदित नमूनों को एक साथ पूल किया गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 25,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया था और आवश्यक न्यूनतम खनिज तेल का उपयोग प्रत्येक नमूने के लिए एक एकल संग्रह ट्यूब में विच्छेदित ऊतक को फिर से निलंबित करने, स्थानांतरित करने और इकट्ठा करने के लिए किया गया था। निर्माता के निर्देशों के बाद न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, आरएनए और डीएनए आकार, मात्रा, अखंडता और शुद्धता निर्धारण के लिए एक विक्रेता को कमरे के तापमान पर नमूने भेजे गए थे। अनुक्रमण पुस्तकालयों का निर्माण किया गया था और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए वाणिज्यिक विकल्पों के साथ संकरण और कैप्चर के लिए उपयोग किया गया था। पोस्ट विच्छेदित नमूना स्लाइड 10 μm (चित्रा 1C, G, K) और 20 μm (चित्रा 1 डी, एच, एल) स्लाइड और विच्छेदन मैट्रिक्स (पूरक तालिका 1) में विच्छेदन क्षेत्रों की पुष्टि करने के लिए नियमित धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग कर एच एंड ई दाग रहे थे। एक्सोम अनुक्रमण ने लगभग 75 मिलियन 100 बीपी युग्मित-अंत पढ़ता है, जिससे प्रति नमूना 150x की कवरेज (डुप्लिकेट रीड्स को हटाने से पहले) की औसत गहराई प्राप्त होती है, जिसमें 99.9% गठबंधन और 78% ऑन-टारगेट दर होती है। आरएनए अनुक्रमण मैट्रिक्स ने 55 मिलियन बीपी युग्मित-अंत पढ़ता है, 98% संरेखण दर और 77% सामंजस्य पढ़ने के साथ 19.4% दोहराव दर का प्रदर्शन किया।
चित्र 1; ताजा जमे हुए और एफएफपीई ऊतक से ट्यूमर घोंसले का सफल विच्छेदन। कोलोरेक्टल कैंसर मेटास्टेसिस के साथ एच एंड ई सना हुआ माउस ताजा जमे हुए (ए-डी) और एफएफपीई (ई-एल) यकृत ऊतक। डिजिटल एनोटेशन (ए, ई, आई) के लिए उपयोग की जाने वाली 4 μm संदर्भ स्लाइडकुल ऊतक क्षेत्र (आई) और वितरित ट्यूमर घोंसले (ई) के लिए कम ट्यूमर प्रतिशत के साथ उदाहरण प्रदर्शित करती हैं जो शास्त्रीय रूप से ट्यूमर संवर्धन के लिए चुनौतियां पेश करती हैं। एनोटेट और डिजिटल रूप से नकाबपोश एच एंड ई संदर्भ स्लाइड (बी, एफ, जे) उत्पन्न किए गए थे और पोस्ट-विच्छेदन 10 μm (C, G, K) और 20 μm (D, H, L) H &E दाग स्लाइड चयनित क्षेत्रों की सफल फसल का प्रदर्शन करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक फ़ाइल 1: स्वचालित विच्छेदन में उपयोग करने के लिए एनोटेशन से डिजिटल मास्क बनाने के लिए स्यूडोकोड का उपयोग किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक तालिका 1: उदाहरण स्वचालित विच्छेदन और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण से मैट्रिक्स पर कब्जा कर लिया। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यहां प्रस्तुत कम ट्यूमर सामग्री एफएफपीई या ट्यूमर संवर्धन और डब्ल्यूईएस में उपयोग के लिए ताजा जमे हुए ऊतकों से ट्यूमर क्षेत्रों को विच्छेदन करने के लिए डिजिटल एनोटेशन और स्वचालित विच्छेदन के आवेदन के लिए एक प्रोटोकॉल है। स्वचालित विच्छेदन के साथ डिजिटल एनोटेशन और मुखौटा निर्माण का संयोजन मैनुअल मैक्रोडिसेक्शन और एलसीएम सहित ट्यूमर संवर्धन के शास्त्रीय तरीकों के लिए आवश्यक हाथों पर समय और विशेषज्ञता को काफी कम कर देता है। प्रोटोकॉल एक संभावित महत्वपूर्ण मध्य-श्रेणी ट्यूमर संवर्धन विकल्प प्रदर्शित करता है जो न केवल कम ट्यूमर सामग्री संवर्धन के लिए अनुमति देता है, बल्कि उन मामलों में भी संवर्धन करता है जहां उच्च थ्रूपुट और परिशुद्धता के मध्यम स्तर के साथ सार्थक ट्यूमर संवर्धन के लिए ट्यूमर आसन्न सामान्य ऊतक से दूर वितरित ट्यूमर घोंसले को विच्छेदित करना चुनौतीपूर्ण है। जबकि कम ट्यूमर सामग्री ज़ेनोग्राफ्ट ऊतकों के लिए हमारे वर्कफ़्लो का उपयोग यहां प्रदर्शित किया गया है, यह भी पाया गया कि यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार के सामान्य ऊतकों और कैंसर के संकेतों के लिए मानव, म्यूरिन और ज़ेनोग्राफ्ट ऊतकों सहित ऊतक प्रकारों में काम करता है।
इसलिए, यह अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला पर भी लागू हो सकता है जहां पृष्ठभूमि ऊतक के महत्वपूर्ण संदूषण के बिना ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए समृद्ध करना फायदेमंद होगा (यानी, एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र के लिए समृद्ध करने के लिए) या यहां तक कि शास्त्रीय मैक्रोडिसेक्शन का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण से पहले ऊतक के क्षेत्रों को हटाने के लिए भी।
स्लाइड स्कैनिंग और डिजिटल एनोटेशन के लिए बाजार में कई प्लेटफ़ॉर्म मौजूद हैं। इसलिए यह जानना महत्वपूर्ण है कि प्लेटफ़ॉर्म संगतता सीमाओं को प्रस्तुत कर सकती है और किसी भी प्रोटोकॉल के भीतर निर्दिष्ट प्लेटफ़ॉर्म सभी प्रयोगशालाओं में मोटे तौर पर उपलब्ध नहीं हो सकते हैं। इसलिए, वर्णित प्रोटोकॉल के भीतर वैकल्पिक विकल्प प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास किए गए थे जो उपयोगकर्ताओं को उनके उपलब्ध संसाधनों के आधार पर कोई आवश्यक संशोधन करने में मार्गदर्शन करेंगे। सावधानीपूर्वक मैनुअल ऑन-स्लाइड एनोटेशन की अनुमति देने के लिए डिजिटल एनोटेशन घटक को हटाने का एक विकल्प भी नोट किया गया है। संशोधनों के लिए प्रदान किए गए विकल्प उपयोगकर्ताओं की एक विकल्प खोजने की क्षमता को अधिकतम करेंगे जो उनके वर्तमान प्लेटफ़ॉर्म और सॉफ़्टवेयर उपलब्धता के साथ काम करता है।
जबकि डिजिटल एनोटेशन और स्वचालित विच्छेदन को मोटे तौर पर एफएफपीई और ताजा जमे हुए ऊतक दोनों पर लागू करने के लिए प्रदर्शित किया गया है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि स्वचालित ऊतक विच्छेदन उपकरण की सीमाओं को एफएफपीई नमूनों के साथ इसके इच्छित उपयोग से परे धकेल दिया गया है और प्रोटोकॉल केवल अनुसंधान उपयोग के लिए है। यहां, सफल ट्यूमर संवर्धन कम ट्यूमर सामग्री एफएफपीई के स्वचालित ट्यूमर विच्छेदन के साथ-साथ न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, डब्ल्यूईएस और आरएनए अनुक्रमण के लिए ताजा जमे हुए ऊतकों के माध्यम से प्रदर्शित किया गया था। प्रोटोकॉल से पता चलता है कि ब्याज के ज़ेनोग्राफ्ट और मानव ऊतक क्षेत्रों को बुनियादी और अनुवादसंबंधी अनुसंधान सेटिंग्स में डब्ल्यूईएस और आरएनए अनुक्रमण से पहले समृद्ध किया जा सकता है और यह भी ध्यान दें कि दोनों ऊतक प्रकारों से पीसीआर सहित अन्य डाउनस्ट्रीम आणविक अनुप्रयोग संभव होंगे। प्रोटोकॉल एफएफपीई स्वचालित विच्छेदन विकल्पों का विस्तार करता है और ताजा जमे हुए ऊतक स्वचालित विच्छेदन के लिए आधार तैयार करता है जिसे नैदानिक सेटिंग्स में उपयोग के लिए विकसित और मान्य किया जा सकता है।
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Disclosures
चार्ल्स ए हवनर, ओलिवर ज़िल, जेफ ईस्टम, जेफरी हंग, जेनिफर गिल्टनेन, निकोलस लॉन्सबरी, डैनियल ओरेपर, सरजेन सैटर्नियो और एमी ए लो जेनेंटेक और रोश के कर्मचारी और स्टॉकहोल्डर हैं और माना जावे और इमैनुएल नौरी रोश के कर्मचारी और स्टॉकहोल्डर हैं।
Acknowledgments
लेखक स्वचालित विच्छेदन विकास में उनके समर्थन के साथ-साथ जेनेंटेक पैथोलॉजी कोर प्रयोगशाला कर्मचारियों के लिए कार्मिना एस्पिरिटू और रॉबिन ई टेलर को धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने इस काम का समर्थन किया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
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