Summary
Desenvolvemos um software automatizado de visão computacional para detectar eventos exocióticos marcados por sondas fluorescentes sensíveis ao pH. Aqui, demonstramos o uso de uma interface gráfica de usuário e RStudio para detectar eventos de fusão, analisar e exibir parâmetros espátulais de fusão e classificar eventos em modos de fusão distintos.
Abstract
A microscopia timelapse TIRF de GFP sensível ao pH (pHluorin) anexada às proteínas SNARE vesículas é um método eficaz para visualizar eventos exocióticos vesículas únicos na cultura celular. Para realizar uma identificação e análise imparcial e eficiente de tais eventos, uma abordagem baseada em visão computacional foi desenvolvida e implementada no MATLAB. O pipeline de análise consiste em um algoritmo de segmentação celular e identificação de eventos exocióticos. A abordagem da visão computacional inclui ferramentas para investigar múltiplos parâmetros de eventos únicos, incluindo a meia-vida da decadência da fluorescência e do pico ΔF/F, bem como a análise de células inteiras da frequência da exocitese. Estes e outros parâmetros de fusão são usados em uma abordagem de classificação para distinguir modos de fusão distintos. Aqui uma GUI recém-construída realiza o pipeline de análise do início ao fim. Uma adaptação adicional da função K de Ripley no R Studio é usada para distinguir entre eventos de fusão agrupados, dispersos ou aleatórios no espaço e no tempo.
Introduction
Construções VAMP-pHluorin ou receptor de transferrina (TfR)-pHuji construções são excelentes marcadores de eventos exocióticos, pois estes fluoroforos sensíveis ao pH são extintos dentro do lúmen vesícula ácido e fluoresce imediatamente após a abertura do poro de fusão entre a vesícula e a membrana plasmática1. Após a abertura dos poros de fusão, a fluorescência decai exponencialmente, com alguma heterogeneidade que revela informações sobre o evento de fusão. Aqui, um aplicativo de interface de usuário gráfico (GUI) é descrito que detecta e analisa automaticamente eventos exocióticos. Este aplicativo permite que o usuário detecte automaticamente eventos exocióticos revelados pelos marcadores sensíveis ao pH2 e gere recursos de cada evento que podem ser usados para fins de classificação3 (Figura 1A). Além disso, a análise do agrupamento de eventos exocióticos usando a função K de Ripley é descrita.
A classificação automatizada de eventos exocióticos em diferentes modos exocióticos foi relatada recentemente3. Dois modos de exocistose, fusão de vesícula completa (FVF) e excitose de fusão de beijo e fuga (KNR) foram descritos anteriormente4,5,6,7. Durante a FVF, o poro de fusão dilata, e a vesícula é incorporada na membrana plasmática. Durante o KNR, o poro de fusão abre transitoriamente e depois seeals4,5,8,9,10. Foram identificados quatro modos de exocitose no desenvolvimento de neurônios, dois relacionados à FVF e dois relacionados à KNR. Este trabalho demonstra que tanto fvf quanto KNR podem ser subdivididos em eventos de fusão que procedem imediatamente à decadência de fluorescência (FVFi e KNRi) após abertura de poros de fusão ou eventos exocióticos que exibem um atraso após a abertura do poros de fusão antes da decadência da fluorescência (FVFd e KNRd)(Figura 1B). O classificador identifica o modo de exocitose para cada evento de fusão. Aqui esta análise foi incorporada em uma GUI que pode ser instalada em sistemas operacionais baseados em MATLAB em Windows e Mac. Todos os arquivos de análise podem ser encontrados em https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing ou
https://github.com/GuptonLab.
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Protocol
1. Escolha conjuntos de dados e diretórios
- Para selecionar conjuntos de dados para análise, clique no botão Encontrar Conjuntos de dados (Figura 2A, caixa vermelha 1) para navegar até a pasta onde os dados são depositados (por exemplo, pasta RawData). Os datafiles preencherão automaticamente os Arquivos de Dados como uma lista. Pode haver mais de um conjunto de dados na pasta.
- Clique no botão Escolher Diretório e selecione o diretório (por exemplo, Teste) onde os arquivos analisados serão depositados(Figura 2A, caixa vermelha 2) . Um conjunto de pastas e arquivos de análise acabados, bem como imagens temporárias intermediárias serão criados neste diretório quando o botão Análise for pressionado. Erros serão produzidos se um diretório não for escolhido.
2. Defina o tamanho do pixel e a taxa de quadro
- Preencha a taxa de quadros e o tamanho dos pixels apropriados na caixa apropriada "Framerate" ou "pixel size"(Figura 2A,caixa verde). Se não forem fornecidos valores (eles estão definidos como "0" padrão), o programa procurará os metadados associados ao arquivo para o framerate e o tamanho do pixel. Se esses valores não puderem ser encontrados, o programa será padrão para por pixel para medição e por período para pontos de tempo.
NOTA: No exemplo fornecido, o framerate é de 100, e o tamanho do pixel é de 0,08.
3. Escolha ou faça máscaras
- Use o botão Fabricante de máscaras para criar automaticamente máscaras celulares para os dados na lista de dataset do arquivo(Figura 2A, caixa azul). Ao usar o botão Mask Maker, uma nova pasta no diretório escolhido será criada chamada MaskFiles. O "indicador executar" ficará amarelo durante a corrida e voltará ao verde quando concluído.
NOTA: Uma máscara para cada arquivo na lista arquivos de dados será criada a partir dos primeiros 10 quadros do arquivo de imagem (ou de todos os quadros se menos de 10 estiverem no arquivo de imagem) e depositada na pasta MaskFiles usando o esquema de nomeação adequado (descrito abaixo). - Certifique-se de que os arquivos da máscara presiram automaticamente a lista Arquivos de máscara. O usuário pode proceder diretamente à análise.
NOTA: Verifique sempre os arquivos da máscara e confirme que eles capturam toda a região de interesse. O primeiro quadro do arquivo de dados e o arquivo da máscara são exibidos na interface do usuário quando selecionados. (Figura 2B). O Fabricante de Máscaras pode produzir erros no caso de baixo sinal para ruído, por isso a validação de que os arquivos de máscara são apropriados é fundamental para o controle de qualidade. - Como alternativa ao uso do Mask Maker, se o sinal de ruído de imagens for insuficiente, crie máscaras manualmente no ImageJ.
- Primeiro, abra o arquivo de imagem bruta em ImageJ (Figura 3A).
- Clique no botão Seleção de Polígono e clique para desenhar uma máscara ao redor da célula. Uma vez terminado, clique duas vezes no último ponto para completar o polígono.
- Uma vez terminado, navegue até Editar | | de seleção Criar máscara (Figura 3B). Uma nova máscara invertida será criada com base no desenho do polígono. Salve máscaras em uma pasta designada MaskFiles no diretório escolhido. O esquema de nomeação de arquivos de máscara deve corresponder aos arquivos de dados individuais correspondentes seguidos de "_mask_file". Por exemplo, se um arquivo de dados for chamado de "VAMP2_488_WT_1.tif", o arquivo de máscara correspondente deve ser chamado de "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
- Use o botão Find Maskfiles para navegar até a pasta escolhida de arquivos de máscara personalizados depositados. As máscaras preencherão os Arquivos de Máscaras como uma lista.
NOTA: É importante ter uma máscara para cada arquivo de dados antes de executar a análise.
4. Análise e extração de recursos
- Depois que o diretório for escolhido e a lista de arquivos de dados e a lista de arquivos máscaras forem preenchidas, clique no botão Análise (Figura 4A). Se for necessária a classificação dos eventos exocióticos, passe para a etapa 5.
NOTA: O clique no botão Análise executará uma série de tarefas automatizadas para analisar os dados. Ele criará pastas individuais no diretório escolhido para depositar dados analisados. Durante a execução, o "indicador de execução" mudará de verde para amarelo(Figura 4A, caixa vermelha). Depois que a análise estiver concluída, isso mudará de volta para verde. - Encontre uma pasta DataFiles (Figura 4B) com o conjunto completo de arquivos de análise (bem como arquivos de extração de recursos, a serem usados posteriormente) nomeados de acordo com cada arquivo de dados(Figura 4C).
NOTA: A descrição desses arquivos de análise está incluída abaixo na seção Resultados Representativos.
5. Classificação de eventos exocióticos
- Para realizar a classificação simultânea de eventos exocióticos com detecção automatizada, verifique a caixa de seleção classificação antes de clicar no botão Análise. Para cada evento exociótico, atribua uma pontuação de probabilidade entre 0-1 para cada classe. Um evento exociótico é considerado classificado como uma das quatro classes se a pontuação de probabilidade para essa classe for > 0,5.
NOTA: Uma vez concluída a análise, uma nova pasta de arquivo de dados aparecerá dentro do diretório escolhido. A pasta conterá arquivos de análise correspondentes a cada arquivo de imagem.
6. Análise espococrânica da exocistose utilizando os valores K de Ripley
- Crie um arquivo de máscara "neurite" e "soma" separados. Primeiro, segmentar a soma do neurite. Não há um método imparcial para segmentar a soma dos neurites, de modo que o usuário deve ficar cego ao experimento de condicionamento e usar o melhor julgamento; sugere-se um elipsoide sem extensões neuritas óbvias.
- Imagem AbertaJ/Fiji.
- Arraste e solte o arquivo da máscara ou use o Arquivo | Abra e selecione o arquivo da máscara.
- Use a ferramenta de coleta de cores e clique em qualquer um dos pixels pretos no fundo da máscara para definir a cor para preto.
- Use a ferramenta de seleção de polígonos ou à mão livre para desenhar um contorno em torno da soma, separando-a dos neurites. Isso requer tomadas de decisão manuais.
- Clique em Editar | | de seleção Faça máscara. Uma nova imagem será aberta com a soma circulada segmentada do resto da imagem. Isso criará um arquivo de máscara soma.
- Sem mover a região desenhada, clique no cabeçalho do arquivo de máscara original.
- Clique em Editar | Preencha para preencher a soma circulada para que apenas os neurites permaneçam a máscara.
- Uma vez obtidos arquivos de neurite e máscara separados, salve ambos os arquivos da máscara.
- Abra "neurite_2D_network" em Matlab.
- No MATLAB, navegue até o diretório com todos os dados de análise.
- Altere o caminho "nome da máscara" para o nome da máscara de neurite, ou seja, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
- Altere o "csv_file_name" para onde está localizado fluorescent_traces.csv arquivo, ou seja, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
- Clique em Executar para esqueletoizar o arquivo da máscara de neurite. Isso cria uma versão esqueletoizada do arquivo da máscara de neurite e deposita-o como um arquivo CSV sob a pasta maskfiles.
- Em seguida, gere um arquivo CSV para a soma. Abra "CSV_mask_creator.m" em Matlab.
- Coloque no caminho para o "nome da máscara" para o nome da máscara soma, ou seja, "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- Altere o "writematrix" para csv filename a ser criado, ou seja, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- Clique em Executar. Isso cria o novo arquivo VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
- Repita 6.14 para cada arquivo de máscara.
7. Configuração rstudio
- Abra rstudio e abra ripleys_k_analysis. Arquivo R.
- Instale o pacote "spatstat" no RStudio indo para Ferramentas | Instalar pacotes e digitar em "spatstat" seguido de clique em Instalar.
NOTA: Isso só precisa ser realizado uma vez por instalação de Rstudio. - Execute a biblioteca no início de cada sessão.
- Preste atenção a duas variáveis principais neste caso: "neuron_mask" e "neuron_datapoints". A Máscara de Neurônio aponta para o conjunto de arquivos de máscara para executar, ou seja, arquivos de máscara soma."
NOTA: Execute todos os arquivos de máscara soma juntos, separadamente dos arquivos da máscara de Neurite, e vice-versa. - Leia na .csv dos arquivos da máscara para que cada um dos neurônios seja analisado.
- Execute vários arquivos ao mesmo tempo copiando neuron_mask_n+1 adicionais. Isso permitirá agregar a análise de Ripley, usando o script descrito na seção 8.
- Agora verifique a segunda variável, "neuron_datapoints".
- Leia no." X_fluorescent_traces.csv" arquivo gerado pelo programa de análise (por recursos todos os extracted_R arquivo) com as posições x,y,t dos eventos exocióticos, bem como o arquivo específico de neurite das posições x,y para a rede 2D. Isso vai na posição "neuron_datapoints".
- Em RStudio Select Code | | da Região Run Corra tudo. Isso gera várias tramas, incluindo os valores K agrupados de Ripley, bem como parcelas de densidade.
- Salve parcelas indo para exportar | Salvar imagem como | Selecione o formato e o diretório de imagem apropriados e insira o nome do arquivo apropriado e clique em Salvar.
NOTA: A função de plotagem para os heatmaps é chamada no script usando "plot (densidade (soma_data,0,4)". O número "0.4" aqui representa o quão suavizada deve ser a função de densidade. Ele pode ser alterado para se adequar aos dados do usuário de forma significativa, mas se as comparações forem realizadas entre diferentes mapas de calor, o número deve ser o mesmo entre eles. - Exportar ou Salvar imagem do Rstudio. Se um mapa de calor exigir uma edição mais aprofundada, escolha um tipo de arquivo apropriado (SVG ou EPS).
8. Análise de Ripley
NOTA: O Ripleys_k_analysis. O arquivo R também gerou automaticamente as parcelas de valor k da Ripley. A execução de todo o script executará automaticamente as funções mencionadas abaixo, mas está incluída em detalhes se desejar executar cada parte do script individualmente ou fazer alterações na análise.
- Primeiro, execute a função envelope para cada célula. Esta função simulou aleatoriedade espacial completa (RSE) para testar o valor K do Ripley do padrão de ponto de evento exociótico contra.
Data_envelope_1 = envelope (soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
Data_envelope_2 = envelope (soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) - Em seguida, unindo esses envelopes e criar uma estimativa de RSE para o grupo:
Pool_csr = piscina (Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
Em seguida, execute a função K do Ripley para todos os pontos de dados.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, razão = TRUE)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, razão = TRUE) - Uma vez concluído, misture os valores K do Ripley e bootstrap seus intervalos de confiança com o seguinte comando:
Pool de dados = pool (Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - Bootstrap com o seguinte comando:
Final_Ripleys_K = varblock (fun = Kest, Data_pool) - Trace os dados.
- Se for necessária uma diferença estatística, o Teste de Permutação Studentizada é incluído no pacote spatstat para testar uma diferença entre grupos de padrões de ponto:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grupo, nperm = np).
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Representative Results
Aqui a GUI (Figura 2A) foi utilizada para analisar eventos exocióticos de três neurônios vamp2-pHluorin expressando neurônios a 3 DIV utilizando microscopia DE TIRF (fluorescência de reflexão interna total). Os neurônios corticais E15,5 foram isolados, seguidos de transfecção com VAMP2-pHluorin e chapeamento utilizando os protocolos descritos em Winkle et al., 2016 e Viesselmann et al., 201111,12. A metodologia dos parâmetros de imagem é como descrito em Urbina et al., 20182. Resumidamente, a microscopia TIRF foi usada para imagem da membrana plasmática basal dos neurônios a cada 100 ms por 2 min. Figura 2, Figura 3, Figura 4 mostram um guia passo a passo para analisar eventos exocíticos. A pasta onde as imagens dos neurônios estão localizadas é selecionada e um diretório para depositar os arquivos de dados de análise final(Figura 2A). Utilizando a função MaskMaker, uma máscara é gerada para os neurônios, que é inspecionada na GUI (Figura 2B). Neste caso, a máscara celular é de boa qualidade, e a análise pode prosseguir. Caso uma máscara seja insuficiente, uma máscara pode ser criada em ImageJ(Figura 3). Depois de usar a função MaskMaker ou criar uma máscara no ImageJ e selecionar o diretório onde os arquivos da máscara estão localizados, a análise é realizada(Figura 4A). Os resultados são gerados na pasta DataFiles quando a análise é concluída (o indicador amarelo muda de volta para verde) (Figura 4B).
Os arquivos de dados são gerados automaticamente e nomeados de acordo com os arquivos de dados brutos fornecidos.
Assumindo que o arquivo de dados se chama X:
X_tracking: Este arquivo inclui x,y posição e número de quadro de cada evento, bem como caixas delimitadoras que podem ser usadas para desenhar caixas em torno de cada evento. A idade indica o número de quadros após a detecção inicial, onde um evento é um puncta gaussiano distinto. Se a classificação for verificada, os resultados de classificação aparecerão neste arquivo, o que indica a probabilidade de um evento exocítico pertencente a uma das quatro classes. Se a probabilidade for maior que 0,5, e maior do que outras probabilidades, então uma classe exocítica foi escolhida.
X_fluorescent traços: Este arquivo inclui x,y posição e número de quadro de cada evento. Além disso, inclui medidas de intensidade fluorescente em uma região de interesse em torno de cada evento 2 segundos antes e 10 segundos após o pico ΔF/F para cada evento (indicado pelas colunas Timepoint).
X_cell_statistics: Este arquivo inclui a área da célula, o tempo total da imagem e a frequência calculada automaticamente de eventos exocióticos para cada célula (em eventos/mm2/minute).
Os arquivos de extração de recursos incluem:
X_contrast: Contraste. Uma medida do contraste de intensidade entre um pixel e seu vizinho sobre toda a imagem.
X_correlation: Correlação. Uma medida de quão correlacionado um pixel está com seu vizinho sobre toda a imagem.
X_energy Energia total. Definida como a soma quadrada da intensidade do pixel.
X_homogeneity mede a proximidade da distribuição dos elementos no ROI para o ROI diagonal.
X_ring_fluorescence: a fluorescência média dos pixels fronteiriços.
X_SD: Desvio padrão. Isso é definido como o desvio padrão do ROI.
Exemplos de traços médios de fluorescência ± SEM de cada classe exocítica foram plotados a partir de X_fluorescent arquivo de traços(Figura 5A). Utilizando o arquivo Cell_statistics, a frequência de exocistose para cada classe foi traçada para cada neurônio (Figura 5B). Com a caixa de seleção de classificação clicada, o programa atribui cada evento exocítico a uma classe, plotada na Figura 5C. Após a classificação, o código de análise K do Ripley foi usado para determinar se os eventos exocióticos são aleatórios, agrupados ou dispersos no espaço e no tempo. Foram gerados calores de densidade da localização de eventos exocióticos (Figura 5D). Estes revelam "hotspots" agrupados esperados em regiões distintas do neurônio. Em seguida, a análise K de Ripley foi realizada para a soma, neurite e clustering ao longo do tempo(Figura 5E). O valor K e o SEM do Ripley (linha preta e região sombreada azul, respectivamente) sobem acima da linha de aleatoriedade espacial completa (linha pontilhada vermelha), sugerindo agrupamento estatisticamente significativo.
Figura 1: Representação da análise e classificação exocítica. (A) Esboço do pipeline de análise para a GUI. As células são segmentadas a partir do fundo antes que eventos exocióticos sejam identificados e rastreados. Parâmetros como o pico ΔF/F e t1/2 são calculados a partir de traços fluorescentes de exocitese em um ROI em torno do evento pré e pós-fusão. (B) ilustração dos quatro modos de exocitose e montagem de imagem de exemplo. Após a fusão, os eventos podem prosseguir instantâneos para FVF ou KNR (FVFi e KNRi), ou um atraso pode estar presente antes do início do destino de fusão para FVF ou KNR (FVFd e KNRd). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise passo a passo do exemplo. (A) Primeiro, são escolhidos conjuntos de dados (1., caixa vermelha) e um diretório é escolhido para colocar arquivos de análise (2., caixa vermelha). Em seguida, a taxa de quadros e o tamanho do pixel são especificados (3., caixa verde). Aqui, foram utilizados 0,08 μm de tamanho de pixel e 100 ms framerate. O botão de função MaskMaker é então pressionado (4., caixa azul). Uma pasta intitulada "MaskFiles" é criada automaticamente no diretório escolhido contendo um arquivo de máscara para cada arquivo de imagem no conjunto de dados. (B) Quando os conjuntos de dados estiverem carregados, a seleção de um arquivo de dados e/ou arquivo de máscara exibirá o primeiro quadro das imagens para facilitar a comparação (caixa verde). Os arquivos da máscara podem não estar completamente corretos; este arquivo de máscara pode ser corrigido para erros, ou um novo arquivo de máscara pode ser feito manualmente Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Criar um arquivo de máscara manualmente em ImageJ. (A) Primeiro, abra o arquivo para fazer uma máscara. O botão "Seleções de Polígono" está delineado em vermelho. Clicando ao redor da borda da célula, um contorno do polígono é criado. (B) Como criar uma máscara a partir do contorno do polígono. Selecionando Editar | | de seleção Create Mask, uma máscara em preto e branco será criada a partir do polígono (imagem direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise de eventos exocióticos. (A) Demonstração do botão de análise (caixa laranja) e uma análise em execução. Observe que o indicador de execução fica amarelo enquanto uma análise está sendo realizada. (B) Exemplos de arquivos de análise que são criados no diretório escolhido quando a análise estiver concluída. DataFiles contêm todos os arquivos de análise do evento exociótico. (C) Análise de arquivos gerados na Pasta DataFiles. As caixas coloridas representam os arquivos abertos em imagens subsequentes. (D) Três arquivos abertos, "X_fluorescent_traces.csv" (vermelho) e "X_Cell_statistics"(verde) e "X_tracking"(azul). Traços fluorescentes contêm a posição x,y e o número do quadro de cada evento, bem como a intensidade fluorescente em cada ROI. Cell_statistics contém informações sumárias de estatísticas exocíticas de células inteiras, como a frequência da exocitese. X_tracking contém informações de posição e tempo para cada evento exociótico, bem como a probabilidade de cada classe de exocitose para cada evento, representado como um número entre 0-1 (>0.5 indica que um evento pertence a uma determinada classe). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos. (A) Fluorescência média traça +/- SEM de cada classe exocítica. (B) Frequência de eventos traçados para três neurônios corticais murinas para cada classe exocítica. Esses valores de dados foram plotados a partir de "X_Cell_statistics", utilizando as classes atribuídas em "X_tracking". (C) Distribuição das classes de exocitose para as mesmas três células utilizadas em A). Aqui, a proporção de cada modo é plotada. (D) Gráfico de densidade de onde eventos exocióticos estão ocorrendo como gerado na parte de Análise K do protocolo de Ripley. Isso pode ser interpretado como um "mapa de calor" da probabilidade espacial de onde os eventos estão ocorrendo. (E) Análise K de Ripley de três células utilizadas para A) e B). A linha vermelha indica qual seria o valor de distribuição espacialmente aleatória dos eventos exocióticos. A linha preta indica o valor K agregado de Ripley para as três células neste exemplo, e a região sombreada azul representa o intervalo de confiança. Aqui, a região sombreada notavelmente fica fora da linha de aleatoriedade espacial completa entre ~0,25-1 μm, sugerindo que eventos exocióticos são agrupados a essas distâncias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ao usar o software de detecção e análise exocítico, considere que o programa só aceita compactação sem perdas .tif arquivos como entrada. Os arquivos de imagem .tif podem ser imagens de 8 bits, 16 bits ou 32 bits em escala de cinza (canal único). Outros formatos de imagem devem ser convertidos em um desses tipos antes da entrada. Para referência, exemplos usados aqui são imagens em escala de cinza de 16 bits.
Inerentes ao processo de detecção automatizada, os conjuntos de imagens timelapse são processados para a subtração de fundo automatizada e correção de fotobleaching. Para subtração de fundo, os pixels fora da região mascarada do arquivo da máscara são mediados ao longo do timelapse de toda a imagem, e o valor médio é subtraído do conjunto de imagens. Para correção de fotobleaching, um ajuste de decaimento mono-exponencial é aplicado à fluorescência média de pixels na máscara ao longo do vídeo, com a intensidade corrigida ajustada da seguinte forma:
Intensidade corrigida = (Intensidade no tempo t) ÷ exp-k×t onde k = constante de decaimento
Portanto, não é necessário pré-processamento antes da entrada. Esses processos, no entanto, dependem criticamente da máscara de imagem para separar efetivamente a célula do fundo e, portanto, uma máscara celular adequada é necessária para bons resultados.
O criador automatizado da máscara celular requer um sinal uniforme com uma relação sinal-ruído suficiente (idealmente, pelo menos 2x o desvio padrão do sinal de fundo médio) para ter um bom desempenho. Empiricamente, a caixa CAAX marcada com uma proteína fluorescente, que insere na membrana plasmática após a prenylação, funciona bem. Não há necessidade de que o sinal possa ser mantido durante toda a imagem timelapse da exoccitose, pois uma máscara adequada pode ser criada a partir de um sinal alto nos primeiros 10 quadros da sequência. No entanto, se a morfologia celular mudar significativamente durante o paradigma da imagem, deve-se tomar cuidado.
Ao usar o software de detecção automatizado, inclua o framerate e o tamanho do pixel para saídas temporais e espaciais precisas. Se não for declarado o tamanho do framerate ou do pixel, a saída será por pixel e por quadro. Como regra geral, os diâmetros da vesícula no desenvolvimento de neurônios estão na escala de ~100 nm13, e assim a detecção automatizada de eventos pode funcionar para vesículas semelhantes em tamanho. Do jeito que está, não há limite rígido no tamanho das vesículas que podem ser detectadas (por área de pixel), uma vez que a detecção automatizada depende da intensidade em forma de gaussiana sobre uma grande variedade de larguras gaussianas. A fusão de vesículas menor que a largura de um pixel pode ser detectada com precisão se a intensidade do evento atender aos critérios de sinal para ruído de 2x o desvio padrão do sinal de fundo médio à medida que a difração de fluorescência se expande sobre vários pixels.
Este programa foi desenvolvido para detectar eventos exocióticos no desenvolvimento de neurônios. No entanto, o software tem sido explorado para detectar com sucesso eventos exocióticos em outras linhascelulares 2,indicando que o algoritmo de detecção é robusto. Embora tenhamos usado o software para detectar eventos exocióticos em tipos de células não neuronais, diferenças no modo de evento exocítico entre os tipos de células14 indicam que o algoritmo de classificação pode não ser adequado para outros tipos de células. Os eventos exocióticos no desenvolvimento de neurônios foram originalmente classificados usando três métodos diferentes: agrupamento hierárquico, Dynamic Time Warping e Principal Component Analysis (PCA), revelando quatro classes diferentes3. Aqui todos os três classificadores são empregados na GUI para categorizar eventos exocióticos em uma dessas quatro classes estabelecidas. Para cada evento exociótico, uma pontuação de probabilidade entre 0-1 é atribuída para cada uma das quatro classes possíveis. Qualquer classe com pontuação de probabilidade > 0,5 é considerada dessa classe. Esta classificação só tem sido usada no desenvolvimento de neurônios até o momento. Não se sabe se essas classes existem em outros tipos de células ou em pontos de tempo de desenvolvimento posteriores nos neurônios. Um grande número de eventos com escores de probabilidade de <0,5 para qualquer uma das classes sugere que o procedimento de classificação pode não ser apropriado para os eventos exocióticos atualmente em avaliação. Se os escores de baixa probabilidade forem atribuídos a eventos exocióticos de diferentes tipos de células, isso sugeriria que a classificação de novo é necessária, pois podem existir modos novos ou alternativos de exocitose. Os mesmos métodos de classificação utilizados aqui precisariam ser aplicados aos eventos exocíticos detectados automaticamente.
Para explorar o agrupamento espacial e temporal de eventos exocióticos, a análise K de Ripley15 é explorada. A análise do agrupamento de neurônios envolve três análises separadas: uma para a soma, uma para os neurites e outra para o tempo. A razão para dividir a soma e os neurites é para explicar a morfologia extrema dos neurites, que muitas vezes são finos o suficiente para que eles possam ser tratados como uma rede 2D e aplicar uma variante 2D da análise K de Ripley. Por tempo, uma análise K de Ripley 1D é implementada para agrupamento temporal. A análise K de Ripley é um método robusto para detectar agrupamento de processos de ponto e colocalização. O gráfico do K de Ripley pode ser interpretado como tal: o valor K do Ripley + intervalo de confiança tem uma chance de 5% de cair fora da linha de aleatoriedade espacial completa a qualquer momento, análogo a um valor p de 0,05. Quando o valor cai fora da linha de aleatoriedade espacial completa, os eventos exocióticos são agrupados (acima da RSE) ou são separados em intervalos regulares (abaixo da RSE) nessas distâncias (eixo x).
A criação do arquivo da máscara depende de um alto sinal inicial para ruído da célula. marcadores sensíveis ao pH podem nem sempre funcionar bem na iluminação de uma célula, dependendo de qual proteína a sonda está ligada. Outra opção para fazer arquivos de máscara se o sinal de ruído do marcador exociótico não der destaque suficiente à borda da célula é empregar um segundo canal/imagem fluorescente para a criação da máscara. Se usar um marcador de fluorescência diferente (tagRFP-CAAX, por exemplo) para fazer máscaras, ao escolher um conjunto de dados, primeiro navegue até a pasta com as imagens para fazer máscaras (por exemplo, uma pasta contendo as imagens tagRFP-CAAX). Use o botão Mask Maker aqui. É importante ressaltar que lembre-se de renomear os arquivos de máscara para corresponder ao arquivo de dados exocióticos a ser analisado com o esquema de nomeação acima (seguindo o exemplo acima, os arquivos de máscaras chamados "CAAX_1_mask_file.tif" precisarão ser renomeados para "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" para corresponder ao conjunto de imagens VAMP2 a ser analisado). Uma vez que os arquivos da máscara sejam nomeados adequadamente, retorne ao botão Escolher Conjunto de Dados novamente para navegar até arquivos de conjunto de dados exocíticos para analisar.
A detecção de exocitose é notavelmente sensível, e eventos exocíticos foram detectados com precisão em relações sinal-ruído tão baixas quanto um ΔF/F de 0,01. A sensibilidade da detecção depende parcialmente da variância da fluorescência de fundo, e eventos inferiores a 4 desvios padrão acima do sinal de fundo não serão detectados.
A detecção de eventos exocióticos depende de sua natureza transitória. Como uma característica da análise de eventos transitórios, nosso código de detecção explora uma janela de 20 segundos em torno do evento exocítico. Em alguns tipos de células, a exocistose de beijo e estadia pode "ficar" por uma janela temporal muito mais longa do que no desenvolvimento de neurônios, e a detecção automatizada pode não capturar robustamente esses eventos menos transitórios. Este recurso é uma variável facilmente modificável para aqueles confortáveis com MATLAB. Semelhante à limitação do ROI de 20 segundos, eventos exocióticos que aparecem mas não desaparecem antes do último período de tempo do vídeo podem não ser contados como exocitese verdadeira, o que pode influenciar a frequência, que é calculada com base em toda a duração da série temporal.
O fabricante de máscaras incluído é automatizado por design e executa bem na segmentação de formas complexas a partir do fundo; no entanto, o design totalmente automatizado limita a gama de sinal-ruído e tipo de sinal que podem ser usados para gerar uma máscara automaticamente. Se o usuário não puder incluir um marcador celular fluorescente que seja uniforme e de uma relação sinal-ruído significativa, a máscara celular precisará ser desenhada manualmente.
A análise baseada no usuário da exocistose é um processo demorado e sujeito a viés pessoal, pois os eventos nem sempre são claramente separados de outras fluorescências. O uso de um programa de análise automatizado para identificar e analisar corretamente eventos exocíticos de forma imparcial aumenta a eficiência da análise e melhora a reprodutibilidade e o rigor.
Não só essa detecção de eventos exocióticos funciona para capturar com precisão a fluorescência sensível ao pH no desenvolvimento de neurônios, mas também outros tipos de células (Urbina et al., 2018). Se a classificação funciona para outros tipos de células exigirá determinação. Aplicações futuras dessa técnica podem ser úteis em sinapses, em tipos de células não neuronais, ou com novos marcadores de acoplamento e fusão de vesículas exóciticas, como recentemente descrito pHmScarlet16.
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Disclosures
Os autores não declaram nada para revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Dustin Revell e Reginald Edwards por testarem o código e a GUI. O financiamento foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde apoiados nesta pesquisa: incluindo R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) e F31NS103586 (FLU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
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