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Biology

ऊतक और मूत्र से मानव गुर्दे ट्यूबुलॉइड की पीढ़ी

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62404
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 2Oncode Institute

Summary

मानव गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों गुर्दे शरीर विज्ञान और रोग का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान इन विट्रो मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। ट्यूबुलॉइड को गुर्दे के ऊतकों (स्वस्थ और रोगग्रस्त) के साथ-साथ मूत्र से स्थापित किया जा सकता है, बाद में अनुसंधान सामग्री के आसानी से प्राप्य और कम आक्रामक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Abstract

वयस्क स्टेम सेल (एएससी) -व्युत्पन्न मानव गुर्दे एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड, या ट्यूबुलॉइड, उच्च दक्षता के साथ स्वस्थ और रोगग्रस्त गुर्दे एपिथेलियम से स्थापित किया जा सकता है। सामान्य गुर्दे ट्यूबुलॉइड मूल के अपने ऊतकों के कई पहलुओं को फिर से रीकैपिटुलेट करते हैं। वे अलग नेफ्रॉन खंडों का प्रतिनिधित्व करते हैं - सबसे विशेष रूप से समीपस्थ ट्यूबल, हेनले के लूप, डिस्टल ट्यूबल, और डक्ट इकट्ठा करने के लिए - और सामान्य गुर्दे के शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, ट्यूबुलाइड तकनीक रोग मॉडलिंग की सुविधा देती है, उदाहरणके लिए, संक्रामक रोगों के साथ-साथ कैंसर के लिए। ट्यूबुलाइड पीढ़ी के लिए गुर्दे की एपिथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करना, हालांकि, बचे हुए सर्जिकल सामग्री (जैसे आंशिक) नेफ्रेक्टॉमी) या सुई बायोप्सी पर निर्भर है। मूत्र से ट्यूबुलाइड विकसित करने की क्षमता स्वस्थ गुर्दे एपिथेलियल कोशिकाओं का एक विकल्प, कम आक्रामक स्रोत प्रदान करेगी। यह पहले दिखाया गया है कि ट्यूबुलाइड संस्कृतियों को ताजा एकत्र मूत्र के केवल कुछ मिलीलीटर से सफलतापूर्वक उत्पन्न किया जा सकता है। यह लेख ऊतक और मूत्र के नमूनों से एएससी-व्युत्पन्न मानव गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों को उत्पन्न करने और प्रचारित करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Introduction

गुर्दे शरीर के तरल पदार्थों के संतुलन को व्यवस्थित रूप से नियंत्रित करने का कार्य करते हैं। उनके शारीरिक कार्य की हानि मधुमेह, उच्च रक्तचाप, और दवा प्रेरित विषाक्तता1सहित विभिन्न कारकों के कारण हो सकती है। सामान्य गुर्दे के शरीर विज्ञान की बेहतर समझ के साथ-साथ गुर्दे की बीमारियों के विकास के लिए, प्रतिनिधि प्रीक्लिनिकल मॉडल का उपयोग महत्वपूर्ण है। हाल के वर्षों में, तथाकथित ऑर्गेनॉइड प्रौद्योगिकी2के आधार पर कई इन विट्रो किडनी मॉडल उत्पन्न किए गए हैं। ऑर्गेनॉइड तीन आयामी, बहुकोशिकीय संरचनाएं हैं जो ऊतक (सामान्य या रोगग्रस्त) के आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान जैसी होती हैं, जिनसे वे उत्पन्न होते हैं। वे pluripotent (PSCs) या वयस्क स्टेम सेल (ASCs) से उत्पन्न किया जा सकता है, प्रत्येक अपनी विशेषताओं और अनुप्रयोगों के साथ ।

पीएससी से व्युत्पन्न किडनी ऑर्गेनॉइड नेफ्रोजेनेसिस3,4,5की नकल करते हैं । उन्हें जबरन डिफरेंटाइजेशन (प्रेरित प्लूपिपेंसी या आईपीएससी) द्वारा रोगी-व्युत्पन्न प्रतिबद्ध कोशिकाओं से भी स्थापित किया जा सकता है। आईपीएससी को बाद में विशिष्ट विकास कारक कॉकटेल के समय पर संपर्क करके नेफ्रॉन के विभिन्न सेल प्रकारों, गुर्दे की कार्यात्मक इकाई में विभेदित किया जा सकता है। एक डिश में एक जगह पूरा मिनी अंग बनाने के दौरान, उनकी स्थापना समय लेने वाली रहती है, और पुनर्प्रोग्रामिंग प्रोटोकॉल के कारण, आईपीएससी अवांछित आनुवंशिक अस्थिरता6के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है। इसके अलावा, आईपीएससी ऑर्गेनॉइड वयस्क गुर्दे की कोशिकाओं में पूरी तरह से परिपक्व होने में सक्षम नहीं हैं, एक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफ़ाइल का खुलासा करते हैं जो प्रारंभिक विकास चरण7में भ्रूण गुर्दे जैसा दिखता है।

एएससी-व्युत्पन्न मानव गुर्दे ट्यूबुलॉइड को वयस्क गुर्दे के एपिथेलियम के नवीकरण को फिर से काटना दिखाया गया है। वे मुख्य रूप से समीपस्थ ट्यूबल, हेनले के लूप, डिस्टल ट्यूबल, और डक्ट इकट्ठा करने का प्रतिनिधित्व करते हैं, जैसा कि विभिन्न ट्रांसपोर्टर प्रोटीन8,9,10की अभिव्यक्ति द्वारा पुष्टि की गई है। ट्यूबुलॉयड संस्कृति प्रोटोकॉल एक स्थिर जीनोम को बनाए रखते हुए रोगी-व्युत्पन्न गुर्दे के ऊतकों के तेजी से विस्तार के लिए अनुमति देता है। शोध अनुप्रयोगों में सामान्य गुर्दे के शरीर विज्ञान, नेफ्रोटॉक्सिकिटी, दवा परीक्षण के साथ-साथ रोग मॉडलिंग8,10, 11,12का अध्ययन करना शामिल है। ट्यूबुलॉइड सहित रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की स्थापना की एक संभावित सीमा, ताजा ऊतक की उपलब्धता है। हालांकि, कई रिपोर्टों से पता चला है कि मूत्र गुर्दे की एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए एक स्रोत के रूप में काम कर सकता है, जिससे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों8,13, 14के लिए रोगी सामग्री प्राप्त करने के लिए एक बहुतसरल,कम आक्रामक रणनीति प्रदान कीजातीहै। दरअसल, हाल ही में यह दिखाया गया है कि ट्यूबुलॉइड मूत्र8से उगाया जा सकता है। यह लेख गुर्दे के ऊतकों और मूत्र से ट्यूबुलाइड संस्कृतियों की स्थापना और रखरखाव का वर्णन करता है।

Protocol

नोट: यहां वर्णित प्रयोगों इरासमस मेडिकल सेंटर (रॉटरडैम, नीदरलैंड) और राजकुमारी Máxima बाल चिकित्सा कैंसर विज्ञान (Utrecht, नीदरलैंड) के लिए चिकित्सा नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. ऊतक से मानव गुर्दे ट्यूबुलॉइड की पीढ़ी

  1. सामग्री
    1. प्रीवार्म मल्टीवेल टिश्यू कल्चर प्लेट्स (6, 12 और 24 कुएं) रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. बेसल मीडियम (एडीडीएफ ++++) को 1x एल-एलेनिन/एल-ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 1% डब्ल्यू/वी 4-(2-हाइड्रोक्सीथिल) जोड़कर तैयार करें-1-पिपराज़ीन एथेनेसुल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस, 10 एमएम), और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक्स को एडवांस डीएमईएम/एफ12 में शामिल करें ।
    3. 1.5% B27 पूरक, 10% आर-स्पॉन्डिन-वातानुकूलित माध्यम जोड़कर संस्कृति माध्यम तैयार करें, एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (50 एनजी/एमएल), फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर-10 (100 एनजी/एमएल), एन-एसिटिलसिस्टीन (1.25 एमएम), रो-किनेस बाधित यार वाई-27632 (10 माइक्रोन), ब्रॉड-स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक्स (0.1 मिलीग्राम/एमएल), और A83-01 (5 माइक्रोन) एडडीएफ ++++ के लिए। उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक aliquot विगलन द्वारा तहखाने झिल्ली निकालने (बीएमई) तैयार करें। प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर बीएमई रखें।
    5. एडीडीएफ ++++ में 1 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए कोलेजनेस को कमजोर करके कोलेजनेस समाधान तैयार करें, जिसमें 10 माइक्रोन वाई-27632 शामिल हैं। 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    6. 10 सेमी पेट्री व्यंजन, स्केलपेल और चिमटी तैयार करें। बर्तनों को 20 मिनट के लिए पराबैंगनी दीपक लगाकर कीटाणुरहित करें, इसके बाद कीटाणुनाशक, डेमी पानी और 70% वी/वी इथेनॉल के साथ धुलाई करें। हवा- बर्तन सुखा लें।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक क्षैतिज शेखर prewarm।
  2. प्रक्रिया
    1. एडीडीएफ +++ माध्यम के 30-40 एमएल से भरी 50 एमएल ट्यूब में किडनी टिश्यू ले लीजिए। ऊतक के टुकड़े को 10 सेमी पेट्री डिश में मध्यम के ~ 1 एमएल में रखें। टिस्केबल(चित्रा 1A)का उपयोग करके ऊतक को ~1 मिमी 3 आकार के टुकड़ों में कीमा बनाएं।
    2. कीमा बनाया हुआ ऊतक को संदंश और स्केलपेल का उपयोग करके 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। एडीडीएफ +++ के 5 एमएल को पेट्री डिश में जोड़ें, धोएं, और 10 एमएल बाँझ पिपेट के साथ माध्यम एकत्र करें। इन सभी सामग्रियों को एक ही ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × जी पर सेंट्रलाइज, और सुपरनेट को हटा दें। 15 एमएल ट्यूब में कोलेजनस सॉल्यूशन का 3-4 एमएल डालें। ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक क्षैतिज शेखर सेट और 250 आरपीएम की गति से ले जाएं।
    4. इनक्यूबेशन के पहले 15 मिनट के बाद, नमूना की जांच करें और ट्यूब को सख्ती से हिलाएं। निलंबन सजातीय होने तक दोहराएं और ऊतक के अधिकांश टुकड़े गायब हो गए हैं, अधिकतम इनक्यूबेशन समय के साथ 45-60 मिनट(चित्रा 1B)।
    5. एडडीएफ + + + के साथ ट्यूब भरें, और ट्यूब 5-10x उलटा करके मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × जी पर सेंट्रलाइज, और सुपरनैंट को हटा दें। यदि गोली लाल है, तो चरण 1.2.6 के साथ आगे बढ़ें। अन्यथा, चरण 1.2.8 पर जाएं।
    6. सेल पेलेट के शीर्ष पर लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर (सामग्री की तालिकादेखें) के 1 एमएल जोड़ें। गोली को फिर से खर्च करने के लिए ट्यूब को धीरे-धीरे टैप करें (पिपेट टिप के साथ पुनर्सुस्ल न करें)। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    7. AdDF ++++ के साथ ट्यूब भरें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × जी पर सेंट्रलाइज, और सुपरनैंट को हटा दें। यदि रक्त कोशिकाएं अभी भी दिखाई दे रही हैं, तो प्रक्रिया को एक बार और दोहराएं, जो चरण 1.2.6 से शुरू होता है। अन्यथा, चरण 1.2.8 के साथ आगे बढ़ें।
    8. यदि प्रोटोकॉल के इस बिंदु पर ऊतक का हिस्सा दिखाई देता है, तो चरण 1.2.8 के साथ आगे बढ़ें। अन्यथा, चरण 1.2.9 में गोली की मात्रा के माप के साथ आगे बढ़ें। ट्यूब में एडीडीएफ +++ का 5 एमएल जोड़ें, और 10 एमएल बाँझ पिपेट के साथ रीसुस्पेंड करें। 50 एमएल ट्यूब पर रखे 100 माइक्रोन नायलॉन सेल छन्नी के माध्यम से निलंबन को फ़िल्टर करें।
    9. फ़िल्टर किए गए निलंबन को एक नई 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × जी पर सेंट्रलाइज, और सुपरनैंट को हटा दें। एक ज्ञात मात्रा के लिए सेट p1000 पिपेट का उपयोग कर सेल गोली की मात्रा को मापें। ध्यान से हवा के बुलबुले बनाने के बिना resuspend करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट। ट्यूब को 1 मिनट के लिए बर्फ में स्थानांतरित करें।
    10. गोली में बीएमई की 70-75% मात्रा जोड़ें। एक p1000 या p200 पिपेट का उपयोग कर Resuspend, और प्लेट 15 माइक्रोन ड्रॉपलेट्स एक प्रीवार्मेड, मल्टीवेल सेल कल्चर प्लेट (6, 12, या 24 कुओं, कुल चढ़ाना मात्रा (<१०० माइक्रोन, 24 कुओं; 100-200 माइक्रोन, 12 कुओं; >२०० L, 6 कुओं) के आधार पर) ।
    11. प्लेट को उल्टा करें, और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 1C)पर 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में आराम करने दें। प्रीवार्मेड कल्चर माध्यम जोड़ें, और संस्कृतियों का निरीक्षण करें(चित्रा 1C,D)।

2. मूत्र से मानव गुर्दे ट्यूबुलॉइड की पीढ़ी

नोट: मूत्र कोशिकाओं के लिए एक शत्रुतापूर्ण वातावरण है। इस प्रोटोकॉल के सफल निष्पादन के लिए यह महत्वपूर्ण है कि मूत्र के नमूनों को जितनी जल्दी हो सके संसाधित किया जाता है, अधिमानतः उत्सर्जन से 4 घंटे के भीतर। इस दौरान यूरिन सैंपल 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर होने चाहिए।

  1. सामग्री
    1. प्रीवार्म मल्टीवेल टिश्यू कल्चर प्लेट्स (6, 12 और 24 कुएं) रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. वाशिंग माध्यम तैयार करें: AdDF +++ व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं (0.1 मिलीग्राम/एमएल) और 10 μM Y-27632 के साथ पूरक।
    3. ऊपर वर्णित संस्कृति माध्यम तैयार करें। उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    4. बीएमई मैट्रिक्स तैयार करें। प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखें।
  2. प्रक्रिया
    1. एक मूत्र नमूना ले लीजिए, और इसे समान रूप से 50 एमएल ट्यूबों(चित्रा 2A-I)में विभाजितकरें। प्रत्येक ट्यूब में वाशिंग माध्यम का 10-20 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 2A-II)पर 5 मिनट के लिए 300 × जी पर सेंट्रलाइज करें, और सुपरनेटेंट को ध्यान से हटा दें।
    2. प्रत्येक ट्यूब में वाशिंग माध्यम के 10 एमएल जोड़ें। 10 एमएल बाँझ पिपेट का उपयोग करके छर्रों को सावधानीपूर्वक फिर से रीसस्ट करें। 4 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 2A-III)पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें, और सुपरनेट को ध्यान से हटा दें।
    3. छर्रों को फिर से खर्च करें, और सभी ट्यूबों की सामग्री को एक 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को वाशिंग मीडियम से भरें। 4 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 2A-IV)पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें, और सुपरनैंट को हटा दें।
    4. एक ज्ञात मात्रा के लिए सेट p1000 पिपेट का उपयोग कर सेल गोली की मात्रा को मापें। ध्यान से हवा के बुलबुले बनाने के बिना resuspend करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट। ट्यूब को 1 मिनट के लिए बर्फ में स्थानांतरित करें।
    5. पेलेट में बीएमई की 70-75% मात्रा जोड़ें। एक p1000 या p200 पिपेट का उपयोग कर Resuspend, और प्लेट 15 माइक्रोन ड्रॉपलेट्स एक प्रीवार्मेड, मल्टीवेल सेल कल्चर प्लेट (6, 12, या 24 कुओं, कुल चढ़ाना मात्रा (<१०० माइक्रोन, 24 कुओं; 100-200 माइक्रोन, 12 कुओं; >२०० L, 6 कुओं) के आधार पर) ।
    6. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में उल्टा करें। प्रीवार्मेड कल्चर मीडियम जोड़ें, और संस्कृतियों(चित्रा 2B)का निरीक्षण करें।

3. ट्यूबुलाइड संस्कृतियों का विस्तार

नोट: ट्यूबुलाइड संस्कृतियों को लगभग हर 1-2 सप्ताह में 1:2-1:3 के विभाजन अनुपात के साथ पारित किया जा सकता है। उन्हें आम तौर पर लाइन-विशिष्ट विविधताओं के साथ लगभग 15 मार्गों के लिए विस्तारित किया जा सकता है।

  1. सामग्री
    1. प्रीवार्म मल्टीवेल टिश्यू कल्चर प्लेट्स (6, 12 और 24 कुएं) रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. बेसल माध्यम (AdDF ++++) तैयार करें, और प्रक्रिया के दौरान इसे बर्फ पर रखें।
    3. संस्कृति माध्यम तैयार के रूप में पहले वर्णित है । उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    4. बीएमई मैट्रिक्स तैयार करें, और प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखें।
    5. 10 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए वाई-27632 के अलावा ट्राइप्सिन रिप्लेसमेंट एजेंट तैयार करें। उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    6. ऑटोक्लेव गैर-फ़िल्टर किए गए पी 10 टिप्स।
    7. सेंट्रलाइज को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  2. प्रक्रिया
    1. कुएं में मौजूद माध्यम का उपयोग करके एक p1000 पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग करके ट्यूबुलाइड युक्त बूंदों को बाधित करें। अच्छी तरह से नीचे परिमार्जन करने के लिए टिप का उपयोग करें, नीचे से जुड़ी सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करना सुनिश्चित करें।
    2. एक 15 एमएल ट्यूब में सामग्री ले लीजिए। एडीडीएफ ++++ का 10 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, और सुपरनेट को हटा दें।
    3. गोली के आकार के आधार पर, 10 माइक्रोन वाई-27632 के साथ पूरक ट्राइप्सिन रिप्लेसमेंट एजेंट जोड़ें। ट्यूबुलाइड युक्त बीएमई बूंदों के 200 माइक्रोन के लिए ट्राइपसिन रिप्लेसमेंट एजेंट के 1 एमसीएल का उपयोग करें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    4. टिप के साथ एक p1000 पिपेट का उपयोग करें, और 1000 माइक्रोन टिप पर एक गैर-फ़िल्टर, बाँझ p10 टिप डालें। ऑर्गेनॉइड को यांत्रिक रूप से बाधित करने के लिए 20-30x के लिए पिपेट ऊपर और नीचे।
    5. माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें कि क्या ट्यूब(चित्र 3 ए)में कई अक्षुण्ण ऑर्गेनॉइड अभी भी मौजूद हैं। यदि इस बिंदु पर 10% से अधिक अक्षुण्ण ऑर्गेनॉइड मौजूद हैं, तो चरण 3.2.3 में 5 मिनट इनक्यूबेशन से दोहराएं जो एक बार फिर चरण 3.2.5 में अक्षुण्ण ऑर्गेनॉइड के लिए सूक्ष्म अवलोकन तक हैं। अन्यथा, चरण 3.2.6 के साथ आगे बढ़ें।
    6. AdDF ++++ के साथ ट्यूब भरें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × जी पर सेंट्रलाइज, और सुपरनैंट को हटा दें। एक ज्ञात मात्रा के लिए सेट p1000 पिपेट का उपयोग कर सेल गोली की मात्रा को मापें। ध्यान से हवा के बुलबुले बनाने के बिना resuspend करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट। ट्यूब को 1 मिनट के लिए बर्फ में स्थानांतरित करें।
    7. गोली में बीएमई की 70-75% मात्रा जोड़ें। एक p1000 या p200 पिपेट का उपयोग कर Resuspend, और प्लेट 15 माइक्रोन ड्रॉपलेट्स एक प्रीवार्मेड, मल्टीवेल सेल कल्चर प्लेट (6, 12, या 24 कुओं, कुल चढ़ाना मात्रा (<१०० माइक्रोन, 24 कुओं; 100-200 माइक्रोन, 12 कुओं; >२०० L, 6 कुओं) के आधार पर) ।
    8. प्लेटों को उल्टा कर दें, और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में आराम करने दें। पूर्व-युद्ध संस्कृति माध्यम जोड़ें, और संस्कृतियों(चित्रा 3B)का निरीक्षण करें।

Representative Results

गुर्दे के ऊतकों के लिए, ट्यूबुलाइड संरचनाएं आमतौर पर स्थापना के 7 दिनों के भीतर दिखाई देतीहैं (चित्रा 1D)। पहले 7 दिनों के भीतर स्पष्ट विकास की कमी प्रोटोकॉल के एक असफल परिणाम को इंगित करता है । आम तौर पर, ट्यूबुलाइड संस्कृतियों को पहले चढ़ाना के बाद 1-2 सप्ताह के भीतर पारित करने की आवश्यकता होती है। मूत्र के लिए, कोशिका विकास स्थापना के लगभग 14-21 दिनों बाद स्पष्ट हो जाता है, कॉम्पैक्ट ट्यूबुलॉयड संरचनाओं की उपस्थिति के साथ और/ संस्कृति स्थापना सबसे अधिक संभावना विफल रहा है अगर कोई विकास चढ़ाना के बाद 4 सप्ताह के भीतर एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के साथ पता लगाया जा सकता है । मूत्र-व्युत्पन्न संस्कृतियों के लिए, पहला पासेजिंग आम तौर पर 3 से 4 सप्ताह के बीच होता है। जबकि पहले मार्ग में किडनी ट्यूबुलाइड संस्कृतियों में मुख्य रूप से कॉम्पैक्ट संरचनाएं शामिल होती हैं, सिस्टिक एपिथेलियल ट्यूबुलॉइड की उपस्थिति मार्ग संख्या(चित्रा 1D और चित्रा 2B) की वृद्धि के साथ बढ़ जाती है। मानव गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों की सफल पीढ़ी का आकलन ट्यूबलर किडनी एपिथेलियम में व्यक्त मार्कर के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला प्रदर्शन करके किया जा सकता है, जैसे कि जोड़ा बॉक्स जीन 8 प्रोटीन (पैक्स8) (चित्रा 4A,बी)।

Figure 1
चित्र 1:ऊतक-व्युत्पन्न गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों। (A)गुर्दे के ऊतकों कीमा बनाने की प्रक्रिया का अवलोकन। ऊतक को स्केलपेल का उपयोग करके ~ 1 मिमी 3 के आकार में कीमा बनायाजाता है। (ख)स्वस्थ गुर्दे के ऊतकों के सही एंजाइमेटिक पाचन का उदाहरण। ऊतक से पहले दिखाया गया है (बाएं) और बाद (दाएं) कोलेजनास के साथ एंजाइमेटिक पाचन के 45 मिनट। ऊतक के कुछ टुकड़े अभी भी ट्यूब के तल पर दिखाई दे रहे हैं, और समाधान बादल हो जाना चाहिए, निलंबन में कोशिकाओं की उपस्थिति का संकेत है । (ग)प्रसंस्कृत गुर्दे के ऊतकों वाली बीएमई बूंदों की चढ़ाना के बाद सेल कल्चर प्लेटों की प्रतिनिधि छवि । बूंदों को चढ़ाना के बाद कल्चर प्लेट्स को उल्टा (बाएं) कर दिया जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखा जाता है। 15-20 मिनट के बाद, प्रीवार्म्ड कल्चर मीडियम को कुएं (दाएं) में जोड़ा जाता है। (घ)ऊतक व्युत्पन्न ट्यूबुलाइड संस्कृतियों के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां । पहली बोने के 2-3 दिन बाद पहली ट्यूबुलाइड संरचनाएं दिखाई देती हैं। बढ़ती मार्ग संख्या के साथ, ट्यूबुलॉइड आमतौर पर आकृति विज्ञान को अधिक सिस्टिक फेनोटाइप में बदल देते हैं। स्केल बार = 300 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: बीएमई = तहखाने झिल्ली निकालने। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:मूत्र-व्युत्पन्न गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों। (A)मूत्र नमूना प्रसंस्करण का अवलोकन। संग्रह(I)के बाद जितनी जल्दी हो सके, मूत्र के नमूनों को 50 एमएल ट्यूबों में विभाजित किया जाता है और धोने के माध्यम(II)में पतला किया जाता है। एक दूसरे धोने के चरण(III)के बाद, ट्यूबों की सामग्री को पूल किया जाता है और चढ़ाना से पहले एक तीसरा और अंतिम वॉश चरण(IV)किया जाता है। (ख)मूत्र व्युत्पन्न ट्यूबुलाइड संस्कृतियों की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां । पहले टबुलाइड संरचनाओं और अनुयायी कोशिकाओं को पहले चढ़ाना के बाद 21 दिनों के भीतर दिखाई देना चाहिए। स्केल बार = 300 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3-गुर्दे की ट्यूबुलाइड संस्कृतियों का पासेजिंग। (एक)एंजाइमेटिक पाचन के बाद गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों की प्रतिनिधि छवि। पाचन पूरा करने के बाद, अक्षुण्ण ट्यूबुलाइड संरचनाओं का 10% से अधिक नहीं रहना चाहिए। स्केल बार = 300μm.(B)चढ़ाना के बाद गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों के प्रतिनिधि छवि। संस्कृतियों का निरीक्षण इस बात की पुष्टि करता है कि अधिकांश ट्यूबुलाइड बाधित हुए हैं । स्केल बार = 300 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4:ट्यूबुलाइड संस्कृतियों का हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन। (ए)स्वस्थ गुर्दे के ऊतकों और ट्यूबुलाइड का एचएंडई धुंधला। स्केल बार = 100 माइक्रोन.(ख)सामान्य गुर्दे के ऊतकों, ट्यूबुलॉइड, एमआरटीके ऊतक और एमआरटीके ऑर्गेनॉइड में पैक्स8 की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। ऑर्गेनॉइड संरचनाओं की पैक्स8 सकारात्मकता उनके गुर्दे की एपिथेलियल उत्पत्ति की पुष्टि करती है। स्वस्थ गुर्दे के ऊतक सकारात्मक (ट्यूबल) और नकारात्मक संरचनाओं (ग्लोमेरुली) दोनों को दिखाता है। एमआरटीके ऊतक और ऑर्गेनॉइड को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन संक्षिप्त: एच एंड ई = हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन; पैक्स8 = जोड़ा बॉक्स जीन 8; MRTK = गुर्दे का घातक rhabdoid ट्यूमर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

ऑर्गेनॉइड को ऊतक के अवतार माना जाता है जिससे वे प्राप्त होते हैं। वे मूल के ऊतकों की जीनोटिक और फेनोटाइपिक विशेषताओं को बनाए रखतेहुएरोगी सामग्री के तेजी से विस्तार की अनुमति देते हैं । ऑर्गेनॉइड तकनीक ने हाल ही में अधिक प्रतिनिधि प्रीक्लिनिकल मॉडल के विकास के लिए दरवाजे खोले हैं, जिनका उपयोग बेंच से बेडसाइड तक निष्कर्षों का अनुवाद करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरणों के रूप में किया जा सकता है। किडनी ट्यूबुलॉइड दवा-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिकिटी के परीक्षण के लिए विट्रो मॉडल में आशाजनक हैं, जो कई कीमोथैरेपी दवाओं2,8,12का एक आम दुष्प्रभाव है। इस प्रकार, रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइडसंस्कृतियों को उपचार16, 17,18के प्रति रोगी प्रतिक्रिया के लिए भविष्य कहनेवाला होने का प्रदर्शन किया गया था। ट्यूबुलॉइड पर एक उच्च थ्रूपुट तरीके से दवाओं का परीक्षण इसलिए संभावित रूप से चिकित्सीय खिड़कियों की बेहतर परिभाषा की अनुमति देता है और रोगियों में दवा-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिकिटी के जोखिम को कम करता है।

आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली एंटीबायोटिक दवाओं को19गुर्दे पर विषाक्त प्रभाव डालने के लिए वर्णित किया गया है । हालांकि व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति संदूषण को रोकने के द्वारा संस्कृतियों की सफल स्थापना के लिए आवश्यक है, यह उनकी संभावित nephrotoxicity पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि ट्यूबुलाइड संस्कृतियों की स्थापना पर एंटीबायोटिक दवाओं का कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं देखा गया है, लेकिन उनके प्रभावों का अच्छी तरह से मूल्यांकन करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है । ट्यूबुलाइड का अध्ययन और मॉडलिंग रोगों के लिए शोषण किया जा सकता है8. सिलिओपैथी (सिलिया की रोगीय शिथिलता) के साथ-साथ गुर्दे को प्रभावित करने वाले अन्य आनुवंशिक सिंड्रोम का अध्ययन या तो प्रभावित विषयों से सीधे ट्यूबुलाइड लाइनें पैदा करके किया जा सकता है, या स्वस्थ संस्कृतियों का उपयोग करके जिसमें रोग-विशिष्ट चालक उत्परिवर्तन CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन20के माध्यम से पेश किया जा सकता है ।

यद्यपि ट्यूबुलॉइड बहुकोशिकीय गुर्दे की संस्कृतियां हैं, लेकिन उनमें कई गुर्दे की कोशिका प्रकारों की कमी है, जिनमें पोडोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाएं8शामिल हैं। इसके अलावा, कुछ अन्य एएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड मॉडल के विपरीत, ट्यूबुलॉइड में सीमित प्रतिकृति क्षमता होती है क्योंकि उन्हें लगभग 15 मार्गों के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है। हालांकि, इस सीमित उम्र को संस्कृति माध्यम21में WNT के अलावा काफी बढ़ाया जा सकता है। अधिक विभेदित कोशिका प्रकारों सहित उन्हें गुर्दे का और भी अधिक प्रतिनिधि बनाने के लिए ट्यूबुलाइड संस्कृति प्रोटोकॉल का और अधिक अनुकूलन आवश्यक है। यद्यपि ऊतक नमूनों से ट्यूबुलाइड स्थापना की दक्षता बहुत अधिक है (>95%), यह दुर्लभ मामलों में विफल हो सकती है। इसमें विभिन्न कारण हो सकते हैं: 1) प्रारंभिक सामग्री की खराब गुणवत्ता(उदाहरण के लिए,दवा उपचार के परिणामस्वरूप परिगलित ऊतक), 2) ऊतक नमूने की अधिक अपच, या 3) प्राथमिक नमूने का संदूषण।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्राप्त ऊतक नमूनों की गुणवत्ता प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त है, सर्जरी पर ऊतक के मूल्यांकन को निष्पादित करने वाले पैथोलॉजी कर्मचारियों के साथ घनिष्ठ संपर्क बनाए रखना महत्वपूर्ण है। यदि पर्याप्त सामग्री उपलब्ध है, तो इसकी व्यवहार्यता की पुष्टि हिस्टोलॉजिकल परीक्षा(जैसे,हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन स्टेनिंग) द्वारा की जानी चाहिए। इसके अलावा, एंजाइमेटिक पाचन के दौरान सेल लाइसिस को रोकने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि इनक्यूबेशन प्रक्रिया अब 1 घंटे से अधिक नहीं है। अंत में, संदूषण को रोकने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीफंगल एजेंटों को धोने और संस्कृति मीडिया में जोड़ा जाना चाहिए ।

मूत्र में एक्सफोलिएटेड एपिथेलियल कोशिकाएं हो सकती हैं जो गुर्दे22से प्राप्त नहीं होती हैं, जो ट्यूबुलाइड संस्कृतियों को दूषित कर सकती हैं। इनमें, उदाहरण के लिए, मूत्र सेतुलियम कोशिकाएं शामिल हैं, जो गुर्दे की ट्यूबलर कोशिकाओं के विपरीत, ट्यूमर प्रोटीन P63 के लिए सकारात्मक और पैक्स88के लिए नकारात्मक हैं। इसलिए अनुवर्ती प्रयोगों(चित्रा 4B)के साथ आगे बढ़ने से पहले स्थापित गुर्दे ट्यूबुलाइड लाइनों की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए पैक्स8 सकारात्मकता के लिए संस्कृतियों का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।

मूत्र उच्च ऑस्मोटिक दबाव और कम पीएच के कारण कोशिकाओं के लिए एक शत्रुतापूर्ण वातावरण का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए प्रोटोकॉल की सफलता के लिए यह महत्वपूर्ण है कि मूत्र संग्रह पर जितनी जल्दी हो सके नमूनों को संसाधित किया जाता है। इस प्रकार, एकत्र किए गए मूत्र को सीडिंग के समय व्यवहार्य कोशिकाओं की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए जितनी जल्दी हो सके बफर समाधान के साथ पतला और बड़े पैमाने पर धोया जाना चाहिए। यदि मूत्र प्रसंस्करण से पहले कई घंटों तक संग्रहीत किया जाता है तो ट्यूबुलाइड प्रतिष्ठान की सफलता दर में काफी कमी आएगी। अंत में, हालांकि बाँझ, मूत्र संग्रह प्रक्रिया के साथ जुड़े संदूषण का एक उच्च जोखिम है । इसलिए एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीफंगल एजेंटों के साथ धोने और विकास माध्यम को पूरक करना महत्वपूर्ण है। उपरोक्त सभी को ध्यान में रखते समय, लगभग 50% की सफलता दर प्राप्त की जा सकती है।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

हम अध्ययन में भाग लेने के लिए सभी रोगियों और उनके परिवारों को धन्यवाद देते हैं । हम नैदानिक टीम है जो हमारे अनुसंधान की सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं । हम यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) अनुदान 850571 (जद), डच कैंसर सोसायटी (KWF)/Alpe डी HuZes बास Mulder पुरस्कार (नंबर १०२१८, जद), Oncode संस्थान, और फाउंडेशन बच्चों के कैंसर मुक्त (KiKa नंबर २९२, सी.C) शुरू के समर्थन के लिए आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A83-01 Tocris 2939/10 Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634010
antiPAX8 antibody LSBio LS-B13466
B27 supplement ThermoFisher Scientific 17504044 Stock of 50x, final concentration of  1x
BME Trevigen 3533-010-02
Collagenase Sigma Aldrich  C9407 Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL
EGF Peprotech AF-100-15 Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL
GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine Gibco 35050061 Stock of 100x, final concentration of 1x
Hepes Gibco 15630106 Stock of 1 M, final concentration of 10 mM
Multiwell tissue culture plates 12 wells CELLSTAR 665180
Multiwell tissue culture plates 24 wells CELLSTAR 662160
Multiwell tissue culture plates 6 wells CELLSTAR 657160
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140163 Stock of 10.000 U/mL, final concentration of  100 U/mL
Primocin - broad-range antibiotics Invivogen ant-pm-1 Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL
Red blood cells lysis buffer Roche 11814389001
RhoKinase inhibitor Y-27632 Abmole Bioscience M1817 Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM
R-spondin conditioned medium Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10%
TrypLe Express/ trypsin replacement agent ThermoFisher Scientific 12605010

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References

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जीव विज्ञान अंक 170
ऊतक और मूत्र से मानव गुर्दे ट्यूबुलॉइड की पीढ़ी
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Calandrini, C., Drost, J. Generation … More

Calandrini, C., Drost, J. Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine. J. Vis. Exp. (170), e62404, doi:10.3791/62404 (2021).

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