Summary
A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional generalizada que regula múltiplas vias biológicas. A espectrometria de massas é a melhor tecnologia para traçar globalmente o perfil do R-metil-proteoma, quando acoplada a abordagens bioquímicas para enriquecimento peptídico modificado. O fluxo de trabalho projetado para a identificação de alta confiança da R-metilação global em células humanas é descrito aqui.
Abstract
A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-traducional (PTM) generalizada de proteínas envolvida na regulação de várias vias celulares, incluindo processamento de RNA, transdução de sinal, resposta a danos no DNA, biogênese de miRNA e tradução.
Nos últimos anos, graças aos desenvolvimentos bioquímicos e analíticos, a proteômica baseada em espectrometria de massa (EM) emergiu como a estratégia mais eficaz para caracterizar o metilproteoma celular com resolução de sítio único. No entanto, a identificação e o perfil da R-metilação da proteína in vivo pela EM continuam a ser desafiantes e propensos a erros, principalmente devido à natureza subestequiométrica desta modificação e à presença de várias substituições de aminoácidos e metil-esterificação química de resíduos ácidos que são isobáricos à metilação. Assim, são necessários métodos de enriquecimento para melhorar a identificação de peptídeos-R-metil e estratégias de validação ortogonal para reduzir as Taxas de Falsa Descoberta (FDR) em estudos de metilproteômica.
Aqui, um protocolo projetado especificamente para identificação e quantificação de peptídeos R-metil de alta confiança a partir de amostras celulares é descrito, que combina marcação metabólica de células com metionina codificada em isótopos pesados (hmSILAC) e digestão em solução de protease dupla de extrato de célula inteira, seguida por fracionamento de cromatografia off-line de fase reversa de pH alto (HpH-RP) e enriquecimento de afinidade de peptídeos R-metil usando anticorpos anti-pan-R-metil. Após a análise de MS de alta resolução, os dados brutos são primeiro processados com o pacote de software MaxQuant e os resultados são então analisados pelo hmSEEKER, um software projetado para a pesquisa aprofundada de pares de pico MS correspondentes ao peptídeo metil leve e pesado dentro dos arquivos de saída MaxQuant.
Introduction
A arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional (PTM) que decora cerca de 1% do proteomade mamíferos 1. A proteína arginina metiltransferases (PRMTs) são as enzimas que catalisam a reação de R-metilação pela deposição de um ou dois grupos metil aos átomos de nitrogênio (N) do grupo guanidino da cadeia lateral de R de maneira simétrica ou assimétrica. Em mamíferos, os PRMTs podem ser agrupados em três classes - tipo I, tipo II e tipo III - dependendo de sua capacidade de depositar monometilação (MMA) e dimetilação assimétrica (ADMA), MMA e dimetilação simétrica (SDMA) ou apenas MMA, respectivamente 2,3. Os PRMTs visam principalmente resíduos de R localizados em regiões ricas em glicina e arginina, conhecidos como motivos GAR, mas alguns PRMTs, como PRMT5 e CARM1, podem metilar motivos ricos em prolina-glicina-metionina (PGM)4. A R-metilação emergiu como um modulador de proteínas de vários processos biológicos, como o splicing de RNA 5, o reparo de DNA6, a biogênesede miRNA7 e a tradução2, fomentando a pesquisa sobre esse PTM.
A espectrometria de massa (EM) é reconhecida como a tecnologia mais eficaz para estudar sistematicamente a R-metilação global na resolução de proteínas, peptídeos e locais. No entanto, este PTM requer algumas precauções particulares para a sua identificação de alta confiança pela EM. Primeiro, a R-metilação é subestequiométrica, com a forma não modificada dos peptídeos sendo muito mais abundante do que os modificados, de modo que os espectrômetros de massa que operam no modo de Aquisição Dependente de Dados (DDA) fragmentarão peptídeos não modificados de alta intensidade com mais frequência do que suas contrapartes metiladas de baixa intensidade8. Além disso, a maioria dos fluxos de trabalho baseados em EM para identificação de locais R-metilados sofre de limitações no nível de análise bioinformática. De fato, a identificação computacional de metilpeptídeos é propensa a altas Taxas de Falsa Descoberta (FDR), porque esse PTM é isobárico a várias substituições de aminoácidos (por exemplo, glicina em alanina) e modificações químicas, como metilesterificação de aspartato e glutamato9. Assim, métodos baseados na marcação isotópica de grupos metil, como o Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), têm sido implementados como estratégias ortogonais para a identificação confiante de MS de metilações in vivo , reduzindo significativamente a taxa de anotações falso-positivas10.
Recentemente, vários protocolos de proteoma para estudar proteínas R-metiladas foram otimizados. O desenvolvimento de estratégias baseadas em anticorpos para o enriquecimento por imunoafinidade de peptídeos-R-metil levou à anotação de várias centenas de sítios R-metilados em células humanas11,12. Além disso, muitos estudos 3,13 relataram que o acoplamento do enriquecimento baseado em anticorpos com técnicas de separação peptídica, como o fracionamento por cromatografia HpH-RP, pode aumentar o número total de metilpeptídeos identificados.
Este artigo descreve uma estratégia experimental desenhada para a identificação sistemática e de alta confiança de sítios R-metilados em células humanas, com base em várias etapas bioquímicas e analíticas: extração de proteínas de células marcadas com hmSILAC, digestão enzimática dupla paralela com proteases de tripsina e lisarginase, seguida de fracionamento cromatográfico de peptídeos digeridos por HpH-RP, juntamente com enriquecimento de imuno-afinidade baseado em anticorpos de MMA-, SDMA-, e peptídeos contendo ADMA. Todos os peptídeos enriquecidos com afinidade são então analisados por cromatografia líquida de alta resolução (LC)-MS/MS no modo DDA, e os dados brutos de MS são processados pelo algoritmo MaxQuant para identificação de peptídeos R-metil. Finalmente, os resultados de saída do MaxQuant são processados com o hmSEEKER, uma ferramenta de bioinformática desenvolvida internamente para pesquisar pares de metilpeptídeos pesados e leves. Resumidamente, o hmSEEKER lê e filtra as identificações de metilpeptídeos do arquivo msms, depois combina cada peptídeo de metila com seu pico MS1 correspondente no arquivo allPeptides e, finalmente, procura o pico da contraparte de peptídeo pesado / leve. Para cada suposto par de pesos pesados, os parâmetros Log2 H/L ratio (LogRatio), Retention Time difference (dRT) e Mass Error (ME) são calculados e os doublets localizados dentro de pontos de corte definidos pelo usuário são rotulados como verdadeiros positivos. O fluxo de trabalho do protocolo bioquímico está descrito na Figura 1.
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Protocol
1. Cultura celular e extração de proteínas (tempo: 3 - 4 semanas necessárias)
- Cultivar células HeLa em paralelo em meios fornecidos com metionina leve (L) ou pesada (H), respectivamente (ver Tabela 1 para composição de meios). Após pelo menos oito divisões celulares, coletar uma alíquota de células de cada canal SILAC e realizar o teste de incorporação.
NOTA: Para verificar a eficiência de incorporação, teste por análise LC-MS/MS que a porcentagem de metionina pesada (Met-4) no canal pesado é o mais próximo possível de 100%. Analise uma alíquota de células fortemente marcadas por LC-MS/MS (para configurações, consulte a Tabela 2) e, em seguida, processe os dados do MS com MaxQuant usando os parâmetros indicados na Tabela 3. Para verificar a incorporação do Met-4, um script desenvolvido internamente está disponível em https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. - Considere a incorporação pesada de metionina como completa quando atingir >97%. Quando cada canal atingir um número total de cerca de 60 x 106 de células (correspondendo a cerca de 40 pratos de 15 cm cada um com 85% de confluência para células HeLa, com variações dependendo do tipo de célula) colhe-os. Conte-os cuidadosamente, misture na proporção de 1:1 e o pellet por centrifugação a 335 x g durante 5 min a 4 °C.
NOTA: Para avaliar a mistura adequada de 1:1 L/H, mantenha uma alíquota e execute-a em uma fatia de um gel que é conhecido por conter uma alta abundância e proteína fortemente metilada por R (por exemplo, fibrilarina). Se a marcação tiver sido bem sucedida e a mistura de 1:1 tiver sido alcançada, deve haver uma proporção de 1:1 de versões leves e pesadas dos peptídeos R-metilados presentes na amostra. Alternativamente, mantenha uma alíquota de amostra mista a ser analisada por LC-MS/MS, em seguida, processe os dados de MS com MaxQuant usando os parâmetros indicados na Tabela 3 e plote a distribuição da relação H/L Log2 conforme mostrado na Figura 2C. O protocolo pode ser interrompido aqui congelando o pellet e armazenando-o a -80 °C. - Ressuspeite o pellet celular em quatro volumes de tampão de lise (ver Tabela 1 para a composição do tampão de lise) em relação ao volume do pellet celular. Por exemplo, use 6 mL de tampão de lise para um pellet de 120 x 10 6 células Hela (60 x 10 6 Light + 60 x 106 Heavy) correspondendo a 1,5 mL de volume.
NOTA: A extração de proteínas deve ser realizada à temperatura ambiente (RT) porque o tampão de lise contém o agente caotrópico 9 M de ureia que se precipita à temperatura do gelo; portanto, a adição de um amplo espectro de inibidores da serina e da cisteína protease é importante, bem como o inibidor de fosfatases, para proteger simultaneamente as proteínas contra a degradação proteolítica e a desfosforilação, coquetel de inibidores de protease e fosfatase estão comercialmente disponíveis como pequenos comprimidos, ver Tabela 1 e Tabela de Materiais. - Sonicate a amostra com um sonicator disruptor de células de microponta por pelo menos cinco ciclos de 15 s ON e 30 s OFF, para garantir a quebra eficiente das membranas celulares e liberação de DNA e cisalhamento. Verifique a viscosidade do extrato pipetando a solução para cima e para baixo. Se for muito viscoso devido ao cisalhamento incompleto do DNA e à solubilização da membrana, repita os ciclos de sonicação.
NOTA: Certifique-se de que a amostra não superaquece durante a sonicação, porque a alta temperatura pode danificar as proteínas. No entanto, não é possível colocar a amostra no gelo entre os ciclos de sonicação, devido à presença de ureia 9M; portanto, é aconselhável pausar por 60 s OFF entre diferentes ciclos de sonicação. Além disso, evite a formação de bolhas de ar durante a sonicação, porque eles reduzem a eficácia da sonicação. - Centrifugar o extrato a 3.000 x g por 10 min no RT para peletizar os detritos e transferir o sobrenadante em um novo tubo de 15 mL.
- Medir o teor de proteína do extrato com um ensaio colorimétrico, como Bradford ou ácido bicinchonínico (BCA)14,15. Uma quantidade inicial ideal de extrato de proteína para este protocolo é entre 20-30 mg.
NOTA: Os tampões de lise contendo ureia de alta concentração são compatíveis tanto com o ensaio de quantificação de Bradford quanto com o BCA; outros tipos de tampão de lise, como aqueles que incluem alta concentração de dodecil sulfato de sódio (SDS), não são compatíveis com Bradford.
2.Digestão do lisado (tempo indicativo necessário 2 horas)
- Realizar a redução do grupo tiol (-SH) de proteínas utilizando uma solução-mãe de ditiotreitol (TDT) dissolvida em água ultrapura a uma concentração final de 4,5 mM e deixar a reação ir por 30 min a 55 °C.
NOTA: É possível preparar 1 M de solução de TDT de reserva e armazená-la a -20 °C durante um período máximo de 1 mês, descongelando apenas as alíquotas necessárias para cada experiência. Alternativamente, o redutor de sulfidrila tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP) pode ser usado para realizar a redução de grupos -SH; especialmente para o armazenamento prolongado de proteínas, a TCEP é significativamente mais estável do que a TDT sem quelatos metálicos, como EGTA no tampão, enquanto a TDT é mais estável se os quelatos metálicos estiverem presentes16. - Realizar alquilação do grupo tiol (-SH) de proteínas adicionando iodoacetamida (IAA) a uma concentração de 10 mM e incubar por 15 min no RT no escuro. Realizar a incubação de proteínas extraídas com solução de IAA no escuro porque o IAA é fotossensível.
NOTA: A solução-mãe IAA a 100 mM deve ser preparada fresca antes de cada experiência. Alternativamente, a cloroacetamida poderia ser usada para realizar alquilação de grupos -SH, especialmente se o objetivo do experimento for analisar a conversa cruzada entre metilação e ubiquitinação, pois o artefato induzido por IAA imita a ubiquitinação17. - Antes de prosseguir com a etapa de digestão de proteínas, salve uma alíquota de extrato proteico (1/1.000 de lisado não digerido inicial) para análise subsequente em gel corado com Coomassie SDS-PAGE e comparação com uma quantidade correspondente de amostra após a digestão; este ensaio serve para verificar a eficiência da proteólise (ver ponto 4).
- Diluir o extrato proteico restante com quatro volumes de 20 mM HEPES pH 8,0, para atingir uma concentração final de ureia de 2 M (que é a concentração compatível com a atividade enzimática das proteases). Dividir a amostra em duas partes: na primeira adicionar tripsina modificada de grau de sequenciação e, na segunda, adicionar protease lisarginase (ver Tabela de materiais) na proporção de 1:100 (p/p) em relação ao mg de matéria-prima. Deixar pernoitar a 37 °C numa termómera a 600 rpm, para permitir a digestão enzimática.
NOTA: A tripsina, a enzima de digestão mais comum na proteômica, cliva-se no terminal C de R e lisina (K), gerando peptídeos com uma distribuição de carga que resulta em espectros de fragmentação dominados por íons do tipo y após dissociação induzida por colisão (CID). A lisargiNase cliva-se no N-terminal de R e K, portanto, espelhando a especificidade da clivagem da tripsina e gerando peptídeos que liberam principalmente íons do tipo b após a fragmentação da CID. Essa análise combinada leva a uma cobertura muito maior da sequência peptídica e a uma maior confiança na identificação sítio-específica das R-metilações18.
3. Purificação do peptídeo (tempo indicativo necessário 1 hora)
- Manter uma alíquota de péptidos digeridos de ambas as reacções, recolhendo os mesmos volumes que no ponto 2.3 para a comparação com o gel corado com Coomastie SDS-PAGE para avaliar a eficiência da digestão das proteases (ver ponto 4).
- Parar a digestão acidificando as amostras com a adição de ácido trifluoroacético (TFA) a uma concentração final de 5%. Misture bem e meça o pH das amostras com um papel de tornassol (o pH deve ser em torno de 3). Vórtice brevemente e gire as amostras acidificadas antes de transferi-las para novos tubos de 15 mL.
- Limpar as amostras através de dois cartuchos de vácuo C18 (peso sorvente de 1 g, ver Tabela de Materiais), um para a amostra digerida com tripsina e outro para a amostra digerida com LysargiNase. Prepare o solvente A, o solvente B e o tampão de lavagem (consulte a Tabela 1 para a composição do tampão).
- Usando pipetas de vidro, reidratar cada cartucho com 6 mL de ACN 100% por 3 vezes. Depois disso, equilibre cada cartucho sequencialmente com 3-9-18 mL de Solvente A. Carregue as amostras (as resinas devem ficar amarelas). Lave novamente sequencialmente com 3-9-18 mL de solvente A e, em seguida, adicione 6 mL de tampão de lavagem. Transfira cada coluna para tubos limpos de 15 mL e elua as amostras com 7 mL de Solvente B. Repita a etapa de eluição com 7 mL de Solvente B, para um volume final de 14 mL.
NOTA: Execute todas essas etapas deixando os buffers e a solução passarem pelas colunas por gravidade. Para favorecer o fluxo dos tampões através da coluna, empurre cada solução lentamente com uma seringa, para imitar o vácuo. - Guardar 50 μL de péptidos eluídos, 50 μL de fluxo (FT), 50 μL da lavagem com solvente A e 50 μL da última lavagem para a subsequente avaliação peptídica pela SDS-PAGE (ver ponto 4).
4. Gel SDS-PAGE corado com Coomassie (tempo indicativo necessário 2 horas)
- Execute as alíquotas coletadas em um gel SDS-PAGE de 17,5% e core com coloração Instant-Blu Coomassie (consulte Tabela de Materiais). O resultado esperado está representado na Figura 2A.
5. Liofilização peptídica (tempo indicativo de 2 dias)
- Cubra os tubos de 15 mL contendo os peptídeos eluídos com filme de parafina, que é então perfurado com uma agulha de 20 G para criar 3-5 orifícios. Coloque os tubos em gelo seco por pelo menos 30 min, até que as amostras estejam completamente congeladas.
- Liofilizar as frações congeladas por 48 h, intervalo de tempo tipicamente suficiente para garantir uma liofilização completa das amostras, mesmo que possa ocorrer alguma variabilidade, devido ao desempenho do liofilizador.
NOTA: O experimento pode ser pausado aqui, armazenando as amostras liofilizadas a -80 °C.
6. Fracionamento cromatográfico off-line de peptídeos HpH-RP (tempo indicativo de 4 dias)
- Para fracionar os peptídeos em 60 frações, utilizar cromatografia líquida HpH-RP, utilizando sistema de HPLC equipado por coluna de HPLC C12-RP (250 x 4,6 mm, 4 μm Proteo 90A).
- Antes da execução, prepare o Buffer A e o Buffer B frescos (a composição dos Buffers é descrita na Tabela 1).
- Filtrar toda a solução com um filtro de 0,22 μm e desgaseificá-las num banho sonicator durante, pelo menos, 30 min.
- Dissolva os peptídeos liofilizados em 1 mL de Tampão A. Filtre os peptídeos através de um filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,45 μm, usando uma seringa.
- Definir a taxa de fracionamento em fluxo de 1 mL/min e coletar 1 mL de frações, utilizando o seguinte gradiente cromatográfico: 5% B a 30% B em 60 min; 30% B a 60% em 2 min; 70% B por 3 min.
- Defina a HPLC de modo que, neste ponto, a coleta de frações seja interrompida e o gradiente mantido no Buffer B de 70% por 5 min antes de uma lavagem extensiva da coluna com um gradiente rápido de até 100% Buffer B, seguido por uma lavagem final (100% Buffer B por 10 min).
NOTA: No final de cada execução cromatográfica, equilibre sempre a coluna com 100% de tampão A durante 20 min. - Fracionar ambas as amostras digeridas separadamente com tripsina e lisargiNase por gradientes cromatográficos Off-Line HpH RP, conforme descrito no ponto 6.5.
- Para cada gradiente cromatográfico, recolher todas as fracções numa placa profunda de 96 poços.
- Agrupe as frações coletadas antes do gradiente em uma única fração chamada PRE. Concatenar as 60 frações do gradiente de cromatografia líquida (LC) de HpH-RP, agrupando-as de forma não contígua em 14 frações finais. Para obter essa concatenação não contígua, agrupe as frações HpH-RP de acordo com o esquema a seguir.
- Fração 1 (volume final 5 mL): Pool 1-15-29-43-57
- Fração 2 (volume final 5 mL): Pool 2-16-30-44-58
- Fração 3 (volume final 5 mL): Pool 3-17-31-45-59
- Fração 4 (volume final 5 mL): Pool 4-18-32-46-60
- Fração 5 (volume final 4 mL): Pool 5-19-33-47
- Fração 6 (volume final 4 mL): Pool 6-20-34-48
- Fração 7 (volume final 4 mL): Pool 7-21-35-49
- Fração 8 (volume final 4 mL): Pool 8-22-36-50
- Fração 9 (volume final 4 mL): Pool 9-23-37-51
- Fração 10 (volume final 4 mL): Pool 10-24-38-52
- Fração 11 (volume final 4 mL): Pool 11-25-39-53
- Fração 12 (volume final 4 mL): Pool 12-26-40-54
- Fração 13 (volume final 4 mL): Pool 13-27-41-55
- Fração 14 (volume final 4 mL): Pool 14-28-42-56
NOTA: A concatenação não contígua consiste na combinação de frações de eluição precoce, média e tardia, o que permite aumentar a heterogeneidade na composição peptídica dentro das frações agrupadas. Consequentemente, a mistura peptídica de cada fração agrupada é eficientemente separada, com co-eluição limitada, na cromatografia subsequente de nano-fluxo de baixo pH-RP-LC diretamente acoplada ao espectrômetro de massa.
- Agrupe as frações coletadas após o gradiente em uma fração exclusiva, chamada POST.
NOTA: Incluindo as frações PRE e gradiente POST, obtém-se um total de 16 frações, em tubos de 15 mL (ver Figura 3A). - Cubra os tubos de 15 mL com filme de parafina e perfure-o com uma agulha de 20 G para gerar 3-5 furos. Congele-os incubando os tubos de centrífuga em gelo seco até que cada fração esteja completamente congelada.
- Liofilizar as frações por cerca de 48 h. Certifique-se de que cada amostra está completamente seca antes de parar o liofilizador.
NOTA: O experimento pode ser pausado aqui, armazenando as amostras liofilizadas a -80 °C.
7. Enriquecimento por imuno-afinidade do peptídeo R-metilado (tempo indicativo de 2 dias)
- Realizar o enriquecimento sequencial de imuno-afinidade do peptídeo modificado com anticorpos anti-pan-R-metilação em paralelo, mas separadamente para as duas amostras das digestões de tripsina e lisargiNase, respectivamente. O tampão de purificação de imuno-afinidade (IAP) é fornecido pela empresa que compra os anticorpos anti-pan-R-metil para enriquecimento de afinidade peptídica modificada (os detalhes estão na Tabela Material e Reagentes). O tampão IAP é concentrado 10x e deve ser diluído 10 vezes antes do uso.
NOTA: O buffer IAP 1x pode ser armazenado a -20 °C até 1 ano. - Centrifugar os peptídeos liofilizados a 2.000 x g por 5 min no RT para girar os peptídeos até o fundo do tubo de 15 mL. Ressuspeite os peptídeos liofilizados com 250 μL de 1x tampão IAP por tubo de 15 mL e transfira em um tubo de baixa ligação de 1,5 mL. Verifique usando um papel decisivo se o pH é >6.
- Mantenha uma pequena alíquota (cerca de 5% do volume) de cada fração como entrada para a análise subsequente do MS.
- Dividir cada fração em duas alíquotas, a fim de realizar o imunoenriquecimento de peptídeos assimetricamente di-metilados (ADMA) e simetricamente di-metilados (SDMA) em paralelo.
- Use três frascos para injetáveis dos anticorpos anti-pan-R-metilados selecionados conjugados com esferas de agarose de proteína A por 10 mg do extrato proteico inicial.
- Preparar a quantidade correta de anticorpos conjugados a grânulos de agarose, centrifugando cada frasco para injetáveis a 2.000 x g durante 30 s e removendo o tampão das contas. Lave as contas três vezes com 1 mL de PBS 1x sempre centrifugando-as a 2.000 x g por 30 s.
- Após a última lavagem, ressuspender as esferas em 40 μL 1x PBS para cada frasco para injetáveis; agrupá-los e, finalmente, dividi-los igualmente em 16 frações (de modo que 2,5 μL de contas de anticorpos são adicionados a cada fração).
- Adicionar 250 μL de 1x tampão IAP a cada tubo, misturar invertendo e deixar incubar numa roda rotativa durante 2 h a 4 °C.
NOTA: Misture as amostras invertendo os tubos de 1,5 mL em vez de pipetá-los com micropontas, o que poderia danificar as contas ou resultar em perdê-las. - Após 2 h de incubação, centrifugar os tubos de 1,5 mL contendo peptídeos e grânulos conjugados com pan-R-metil-anticorpo a 2.000 x g por 30 s para pellet as contas; transferir o FT de cada fração para tubos limpos de 1,5 mL de baixa ligação.
- Adicionar as esferas conjugadas a anticorpos contra a R-monometilação (MMA) aos FTs e repetir os passos 7.7 a 7.9.
- Durante a incubação das amostras peptídicas com os grânulos MMA, lavar duas vezes as frações previamente imunoprecipitadas com anti-ADMA e SDMA com tampão IAP de 250 μL (inversão e não pipetagem) e descartar o sobrenadante a cada lavagem.
- Repetir a lavagem com LC-MS grau H2O três vezes.
- Eluir os peptídeos R-di-metilados enriquecidos com afinidade simétrica e assimétrica das esferas de agarose adicionando 50 μL de TFA a 0,15% a cada tubo (condições ácidas fortes, de fato, desnaturam o epítopo levando à liberação dos antígenos dos anticorpos). Deixe esta solução 10 min em RT, invertendo os tubos a cada 2-3 min.
- Transfira a primeira eluição para tubos limpos de 1,5 mL de baixa ligação e repita a eluição com 50 μL de TFA a 0,15%; agrupe as 2 frações em um tubo.
- Repita os passos de 7,11 a 7,14 para os peptídeos R-mono-metilados que foram incubados com as esferas de anticorpos anti-MMA.
8. Dessalinização e concentração de metilpeptídeos enriquecidos com afinidade por microcolunas C18 (tempo indicativo necessário de 30 minutos)
- Equilibrar com metanol as microcolunas C18-RP confeccionadas com cartuchos de extração 3M Solid Phase para dessalinização e concentração de peptídeos antes da análise de MS19.
- Carregar as amostras (correspondentes às fracções enriquecidas com imuno-afinidade separadas e fracções de entrada) nas microcolunas C18 em duas etapas (50 μL + 50 μL em cada microcoluna C18) por centrifugação a 600 x g durante 6 min.
- Lavar as microcolunas com tampão A de 55 μL (ver quadro 1 para a composição do tamponamento), sempre por centrifugação a cerca de 900 x g durante 5 minutos.
NOTA: O experimento pode ser pausado aqui, deixando as microcolunas C18-RP a 4 °C, onde podem ser armazenadas até 2 semanas.
9. Segunda digestão enzimática (tempo indicativo necessário 3 horas)
- Lavar as microcolunas C18-RP com 55 μL de tampão A (ver quadro 1 para a composição do tampão) durante duas vezes, por centrifugação a cerca de 850 x g durante 5 minutos.
- Elimine os péptidos duas vezes com 20 μL de tampão B (ver Tabela 1 para a composição do tampão) e agrupe as duas fracções.
- Secar os péptidos eluídos num concentrador de vácuo (ver Tabela Material e Reagentes para mais pormenores). Entretanto, preparar a solução de digestão que consiste em bicarbonato de amónio 50 mM que é diluído a partir de uma solução-mãe de 1 M acabada de fabrico (ver quadro 1).
- Adicionar tripsina ou lisargiNase às respectivas amostras, até uma concentração final de 25 ng/μL. Incubar cada amostra a 37 °C durante 2 h.
- Adicione 1 μL de 5% de TFA para parar a digestão; vórtice e girar para baixo as amostras.
NOTA: A clivagem enzimática pela tripsina pode ser inibida no terminal C de R e K metilados, causando clivagens perdidas que aumentam o comprimento e a carga do peptídeo, que por sua vez produzem espectros de fragmentação complexos e incompletos, dificultando a identificação de peptídeos e a atribuição sítio-específica de locais de metilação. Demonstrou-se que uma segunda digestão enzimática pode reduzir a frequência dessas clivagens perdidas, com melhor cobertura de sequência e atribuição de sítio20.
10. Dessalinização de peptídeos (tempo indicativo necessário 30 minutos)
- Carregar as soluções peptídicas acidificadas em novas microcolunas de C18-RP previamente equilibradas seguindo os mesmos passos descritos no ponto 8.
- O peptídeo carregado nas microcolunas C18-RP pode ser armazenado a 4 °C até a eluição para análise LC-MS/MS.
11. Cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) análise (tempo indicativo de 5 dias)
- Eluir os peptídeos das microcolunas C18-RP passando 10μL de tampão B, centrifugando a 615 x g por 5min no RT. Repita esta etapa duas vezes e combine os eluatos.
- Reduza o volume dos eluídos em um concentrador a vácuo até que estejam quase secos, evitando a secagem excessiva.
- Ressuspender os peptídeos em 10 μL de tampão A para análise LC-MS/MS.
- Analisar cada fração de peptídeos R-metil por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) em um Espectrômetro de Massa de alta resolução (ver Tabela de Materiais), acoplado a um sistema de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC) de nano-fluxo. Defina os parâmetros do instrumento conforme descrito na Tabela 2.
- Carregar 2 μL de cada amostra numa coluna nanoanalítica (coluna de pulverização fácil com 75 μm de diâmetro interior, 25 cm de comprimento), embalada com resina C18-RP (tamanho de partícula de 2 μm).
- As amostras são passadas através da nanocoluna C18 RP a uma vazão de 300 nL/min, com o seguinte gradiente linear: 3%-30% B por 89 min, 30%-60% B por 5 min, 60%-95% B por 1 min e 95% B por 5 min.
- O espectrômetro de massa opera no modo de aquisição dependente de dados (DDA) para alternar automaticamente entre a verificação completa do MS e a aquisição do MS/MS. Defina o MS de varredura completa de pesquisa a ser analisado no detector espectrômetro com resolução R = 70.000. Os quinze íons peptídicos mais intensos são isolados sequencialmente a um valor-alvo de 3 x 106 e fragmentados por energia de colisão relativa de 28%. Defina os tempos máximos de acumulação de íons permitidos para 20 ms para varreduras completas e 50 ms para MS/MS e fixe o valor alvo para MSMS para 1 x 106. O tempo de exclusão dinâmica é definido como 20 s.
12. Executando a análise de dados MaxQuant e hmSEEKER
- Após a conclusão das execuções LC-MS/MS, importe os dados brutos do MS para um mecanismo de pesquisa de peptídeos para identificar os metilpeptídeos por abordagem baseada em probabilidade em relação ao banco de dados de referência. Neste protocolo, o MaxQuant versão 1.6.2.10 foi utilizado para nossa análise. MaxQuant requer um mínimo de 2 GB de RAM para ser executado, bem como espaço em disco suficiente para armazenar todos os dados brutos e todos os arquivos de saída.
NOTA: Consulte a documentação oficial em https://www.maxquant.org para obter todos os detalhes sobre a instalação e os requisitos de hardware e software. - Duplique cada arquivo de dados brutos. Renomeie os originais acrescentando "_light" ao seu nome e, em seguida, renomeie as cópias acrescentando "_heavy".
NOTA: hmSEEKER, o script para análise a jusante, diferencia maiúsculas de minúsculas. - Inicie a pesquisa MaxQuant/Andromeda para identificação de peptídeos com as configurações indicadas na Tabela 3. Dos vários dados de saída produzidos pelo MaxQuant, apenas os arquivos allPeptides.txt e msms.txt (localizados na subpasta combined/txt) são necessários para a etapa de pós-processamento.
- O pós-processamento dos dados de saída MaxQuant é realizado pelo algoritmo hmSEEKER. Faça o download de hmSEEKER de: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. O script está disponível como um bloco de anotações Jupyter escrito em Python 3.7 e vem com um conjunto de dados de exemplo para fins de teste. Para novos usuários, é aconselhável baixar e instalar a plataforma Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual). A versão mais recente inclui, por padrão, Python 3.8, Jupyter e todos os pacotes necessários para executar o hmSEEKER (por exemplo, Scikit-learn 0.23.1).
- Crie uma pasta e armazene os arquivos allPeptides.txt e msms.txt da saída MaxQuant nela.
- Inicie o Jupyter (a partir da linha de comando ou do navegador Anaconda).
- Navegue até a pasta hmSEEKER e abra hmSEEKER.ipynb.
- Na seção Parâmetros de Entrada do bloco de anotações, indique os caminhos para o banco de dados FASTA e para a(s) pasta(s) que contém os arquivos de texto MaxQuant.
- Execute o código dentro de cada célula selecionando a célula e clicando no botão Reproduzir na parte superior da interface do Jupyter.
- O script produz um arquivo de saída separado por vírgulas para cada conjunto de dados analisado, além de um arquivo combinado. A lista final de dubletos pode ser encontrada no arquivo chamado "[date]-[time]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
(A Tabela 4 inclui uma breve descrição das colunas na tabela de saída).
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Representative Results
O artigo descreve um fluxo de trabalho para a identificação de alta confiança da proteína R-metilação global, que se baseia na combinação da digestão enzimática do extrato proteico com duas proteases distintas em paralelo, seguida pelo fracionamento por cromatografia líquida de peptídeos proteolíticos HpH-RP e enriquecimento por imuno-afinidade de peptídeos R-metil com anticorpos anti-pan-R-metil (Figura 1).
As células foram cultivadas na presença de Metionina, natural (Light, L, Met-0) ou isotopicamente marcada (Heavy, H, Met-4). Após a marcação isotópica completa, que foi testada pela análise de MS em uma pequena alíquota de extrato somente Met-4, as células pesadas e leves foram colhidas e misturadas na proporção de 1:1 L/H, conforme ilustrado na Figura 1A. Após amarcação metabólica de13 CD 3-metionina, os grupos metilo são adicionados à espinha dorsal da proteína do doador de metila S-adenosil-metionina (SAM) e estarão presentes na forma de isótopos leves ou pesados21. A Figura 1B descreve a reação de metilação da arginina realizada pela família Protein Arginine Methyltransferases (PRMTs) que catalisam a transferência de um grupo metilo da S-adenosilmetionina (SAM) para o nitrogênio guanidino da arginina. Se um único grupo metilo é colocado em um dos átomos de nitrogênio terminal de arginina, arginina monometilada (MMA) é obtida. Se dois grupos metil são adicionados no mesmo átomo de nitrogênio do grupo guanidino, a arginina dimetilada assimétrica (ADMA) é gerada, enquanto se dois grupos metil são colocados em dois átomos de nitrogênio diferentes, a arginina dimetilada simétrica (SDMA) é produzida.
Após a mistura em células leves e pesadas na proporção de 1:1, as proteínas foram extraídas e submetidas à digestão por Tripsina e LysargiNase, em paralelo. Conforme apresentado na Figura 2, o gel corado com Coomastie SDS-PAGE foi utilizado para verificar a digestão enzimática eficiente de proteínas totais em peptídeos (compare as faixas I e II). Além disso, avaliou-se a eficiência da etapa de purificação realizada pela coluna C18 Sep-Pak, confirmando a ausência de peptídeos no escoamento da coluna C18 (Figura 2, faixa III) e na primeira e segunda lavagem (Figura 2 via IV e V, respectivamente), com sua presença esperada no eluído (Figura 2, faixa VI). Avaliou-se a incorporação adequada de Met-4 no canal pesado (Figura 2B) e a mistura correta de H/L 1:1 (Figura 2C).
A Figura 3 mostra o cromatograma do fracionamento de peptídeos por cromatografia líquida HpH-RP off-line e a subsequente concatenação não contígua de frações. Os peptídeos foram detectados por 215 nm UV, enquanto as proteínas não digeridas potencialmente remanescentes foram avaliadas por 280 nm UV. Abaixo do cromatograma a estratégia de concatenação de frações é esquematizada, para reduzir as 70 frações iniciais até as 16 finais, incluindo as frações de gradiente PRE e POST.
Anticorpos anti-pan-R-metil foram utilizados para o enriquecimento de peptídeos R-metil. Esses anticorpos reconhecem os três tipos de R-metilação (MMA, SDMA e ADMA) e estão comercialmente disponíveis como diretamente conjugados a contas de agarose (consulte o material da tabela e reagentes para detalhes). A Tabela 1 lista todos os buffers e soluções usados neste protocolo.
Após a aquisição, cada dado bruto de MS foi analisado duas vezes com MaxQuant, para identificar metilações leves e pesadas em diferentes grupos de busca, com a justificativa de que os metilpeptídeos (pesados e leves) só serão identificados em um grupo específico. A pesquisa de metilações pesadas e leves separadamente melhora a análise, reduzindo o número de modificações variáveis introduzidas e reduzindo o risco de peptídeos mistos marcados falsos positivos. Uma vez que o MaxQuant tenha atribuído metil-sites, o hmSEEKER analisa sua tabela de saída para reconstruir possíveis pares de picos de luz pesada13.
As Figuras 4 e 5 ilustram os espectros completos de MS dos peptídeos FELTGIPPAPR(me) (4) e NPPGFAFVEFEDPR(me) (5), que representam uma anotação de peptídeo metil-peptídico True Positive e False Positive, respectivamente. Na Figura 4, as diferenças m/z observadas entre os três picos são consistentes com a presença de um resíduo enzimaticamente metilado (7,0082 Th entre o não modificado e o metilado à luz; 2,0102 Th entre as formas leve e pesada do metilpeptídeo). Os duplicados hmSILAC resultantes têm um ME de 0,40 ppm, um dRT de 0,00 min e um LogRatio de -0,41; esses valores estão abaixo dos limiares padrão empregados pelo hmSEEKER para distinguir duplos verdadeiros e falsos, que anteriormente era estimado da seguinte forma: | ME| < 2 ppm, |dRT| < 0,5 min, e | LogRatio| < 1. No segundo caso ilustrado na Figura 5, a diferença m/z observada entre o peptídeo leve-metilado e sua suposta contraparte pesada se desvia do valor esperado em 0,0312 Th (ME = -37,28 ppm). Além disso, esse dubleto tem um LogRatio de 2,50, que está fora do intervalo de previsão LogRatio padrão (esses valores de corte foram definidos e discutidos em13). De fato, no espectro MS/MS, a sequência do peptídeo NPPGFAFVEFEDPR(me) resultou não totalmente coberta e a R-metilação atribuída poderia ser interpretada também como uma metilesterificação no glutamato ou aspartato próximo a R.
O fluxo de trabalho hmSEEKER é esquematizado na Figura 6, enquanto a Tabela 4 fornece uma descrição da tabela de saída produzida por esta ferramenta, para ajudar na interpretação dos resultados: peptídeos que carregam múltiplas modificações aparecem várias vezes, cada entrada correspondendo a um evento de metilação diferente em um determinado peptídeo; finalmente, os dubletos de pico são divididos em três classes: os dubletos combinados são os mais confiantes, pois o peptídeo foi fragmentado e identificado tanto na forma pesada quanto na leve.
Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho experimental e das reações enzimáticas proteína-R-metilação. (A) Diagrama de fluxo de trabalho do protocolo bioquímico. As células são cultivadas em meio contendo metionina leve (Met-0) e pesada (Met-4) por pelo menos 8 duplicações e os canais leves e pesados são misturados na proporção de 1:1. As proteínas são extraídas e submetidas à digestão com tripsina ou lisargiNase em paralelo e fracionadas por cromatografia líquida off-line HpH-RP através da coleta de 70 frações, finalmente combinadas em 16 frações. Os peptídeos R-metil são enriquecidos por anticorpos anti-pan-R-metil conjugados a contas de agarose, que foram submetidos à segunda digestão enzimática (tripsina ou LysargiNase, respectivamente) e analisados por LC-MS/MS. Os dados brutos de EM são processados pelo algoritmo MaxQuant para identificação de peptídeos e PTM. Os dados de saída MaxQuant são então submetidos para análise pela ferramenta de bioinformática hmSEEKER, desenvolvida internamente para associação de metilpeptídeos pesados e leves. (B) Esquema da reação de R-metilação. O grupo Guanidino de arginina pode ser modificado pela adição de um grupo metilo, produzindo arginina monometilada (MMA) ou pela adição de dois grupos metil, produzindo arginina dimetilada simétrica (SDMA) ou assimétrica (ADMA). A reação é catalisada por enzimas da família das metiltransferases da proteína arginina (PRMTs), que transferem esses grupos metil da S-adenosil-metionina (SAM). Após a transferência do grupo metilo, a SAM é reduzida a S-adenosilhomocisteína (HAS). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Controles de etapas críticas do protocolo. (A) Gel corado com Coomassie, SDS-PAGE para avaliação da eficiência da digestão proteolítica. MW: marcadores de peso molecular. I) 20 μg de extrato proteico H/L total antes da digestão quantificado por BCA; II) peptídeos digeridos carregados na mesma proporção que em I; III) Escoamento do cartucho C18 carregado na mesma proporção da faixa I; IV-V) primeira e segunda lavagem do cartucho C18 com tampão A, carregado na mesma proporção que I; VI) eluídos do cartucho C18, carregados na mesma proporção que a análise da taxa de incorporação I. (B) Met-4. A incorporação do Met-4 no canal pesado é avaliada por script desenvolvido internamente (disponível em https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/); taxa = 1 indica a incorporação total (C) da distribuição gaussiana das relações H/L para a avaliação de mistura de 1:1. Uma distribuição normal da relação H/L Log2 é plotada considerando ±2σ. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esquema de concatenação da fração HpH e avaliação representativa do enriquecimento de peptídeos R-metilados. (A) Cromatograma de fracionamento de fase reversa de pH alto e esquema da concatenação de fração não contígua. O cromatograma representa o perfil de separação HpH-RP dos peptídeos detectados a 215 nm UV (linha azul), enquanto a presença de proteínas não digeridas foi rastreada no canal UV de 280 nm (linha vermelha). A linha verde clara representa a concentração de tampão B ao longo da corrida cromatográfica. O esquema de agrupamento de frações é relatado, descrevendo a estratégia de concatenação não contígua de frações de eluição precoce, média e tardia, de 70 a 16, incluindo frações de gradiente PRE e POST. (B) Tabela representativa resumindo o enriquecimento de peptídeos R-metilados. A tabela recapitula o número total de peptídeos e a porcentagem relativa de enriquecimento de R-metilação comparando cada IP em sua entrada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplo de dubleto hmSILAC verdadeiro. Espectro de massa de um verdadeiro dubleto positivo. Os picos exibidos correspondem ao peptídeo FELTGIPPAPR nas formas não modificada, monometilada leve (CH 3) e monometilada pesada (13CD3), com carga 2+. As diferenças m/z observadas entre os três picos são consistentes com a presença de um resíduo enzimaticamente metilado. A tabela sob o espectro de massa representa a saída hmSEEKER e contém os parâmetros LogRatio, ME e dRT do dubleto. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplo de falso hBNAC doublet. Espectro de massa de uma atribuição negativa in vivo de metilpeptídeo. Os picos de 811,3849 m/z e 818,3927 m/z correspondem às formas monometiladas não modificadas e leves do peptídeo NPPGFAFVEFEDPR, com carga 2+. O terceiro pico poderia ser atribuído como a contraparte pesada-metila do peptídeo metilado leve, mas o deslocamento m/z observado difere do deslocamento esperado em 0,0312 Th, o que exclui essa possibilidade. A tabela sob o espectro de massa representa a saída hmSEEKER e contém os parâmetros LogRatio, ME e dRT do dubleto. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Representação esquemática do fluxo de trabalho de análise de dados. (A) O MaxQuant detecta picos MS1 nos dados brutos. (B) Picos com um espectro MS2 associado são processados pelo mecanismo de pesquisa de banco de dados Andromeda para obter uma identificação peptídica. (C) O hmSEEKER lê identificações de peptídeos MaxQuant e extrai metilpeptídeos com o Escore de Andrômeda > 25, o Escore Delta > 12 e modificações com uma Probabilidade de Localização > 0,75. (D) Para cada metilpeptídeo que passa na filtragem de qualidade, o hmSEEKER encontra seu pico MS1 correspondente na tabela MaxQuant allPeptides e, em seguida, procura sua contraparte na mesma tabela. (E) Um dubleto de picos é definido pela diferença em seu tempo de retenção (RT), sua razão de intensidade (LogRatio) e o desvio entre a massa delta (EM) esperada e observada; esses três parâmetros são utilizados pelo hmSEEKER para distinguir verdadeiros positivos de falsos positivos, conforme discutido13. (F) Finalmente, o hmSEEKER produz listas de duplicatas redundantes e não redundantes; o primeiro inclui previsões para todos os peptídeos de metila, enquanto o segundo é filtrado de modo que, quando um peptídeo é identificado várias vezes, apenas o melhor dubleto de pontuação é relatado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Buffer | Volume | Composição |
| Solução de L-metionina (L) | 10mL | 30mg/mL Light-Metionina em água ultrapura |
| Solução de L-metionina (H) | 10mL | 30mg/mL Metionina pesada em água ultrapura |
| Meio para cultura celular | 500mL | DMEM com glutamina estabilizável e sem metionina, FBS dialisado a 10% (v/v), 1% (v/v) P/S, 1:1000 (v/v) solução de L-metionina |
| Buffer de lise | 50mL | Ureia 9M, 20mM HEPES pH 8,0;1% (v/v) Inibidor de Protease; 1% (v/v) Inibidor da fosfatase em água ultrapura |
| Solução de bicarbonato de amónio (AMBIC) | 50mL | 1M (NH4)2CO3 em água ultrapura |
| Solução TDT | 10mL | 1.25M TDT em água ultrapura |
| Solução IAA | 5mL | 109mM em água ultrapura |
| Solvente A para Sep-Pak C18 | 50mL | 0,1% TFA em água ultrapura |
| Solvente B para Sep-Pak C18 | 50mL | 0,1% TFA + 40% ACN em água ultrapura |
| Solução de lavagem para Sep-Pak C18 | 50mL | 0,1% TFA + 5% ACN em água ultrapura |
| Tampão A para fracionamento de HpH | 500mL | 25 mM NH4OH em água ultrapura |
| Tampão B para fracionamento de HpH | 500mL | 25 mM NH4OH+ 90% ACN em água ultrapura |
| Buffer de ligação IP 1x | 5mL | diluita 1:10 (v/v) em água ultrapura a partir de 10x solução de estoque comercial disponível |
| Buffer de eluição IP | 50mL | 0,15% TFA em água ultrapura |
| Buffer A para dicas de estágio | 50mL | 0,1% TFA em água ultrapura |
| Buffer B para dicas de estágio | 50mL | 0,1% TFA + 40% ACN em água ultrapura |
| Buffer C para dicas de estágio | 50mL | 0,1% TFA + 50% ACN em água ultrapura |
| MS Solvente A | 250mL | 0,1% FA em água ultrapura |
| MS Solvente B | 250mL | 0,1% FA + 80% ACN em água ultrapura |
| Coquetel de inibidores de protease | 5 mL | cOmplete, Comprimidos Inibidores de Protease (ROCHE) sem EDTA dissolvidos em água ultrapura de acordo com as instruções de fabrico |
| Coquetel de inibidores da fosfatase | 5 mL | PhosSTOP Comprimidos (ROCHE) dissolvidos em água ultrapura de acordo com as instruções de fabricação |
Tabela 1: Composição de buffers e soluções. Listas dos buffers e soluções usadas neste protocolo.
| Parâmetros | Valor |
| Carregamento de amostras (uL) | 2 |
| Taxa de fluxo de carregamento (uL/min) | 10 |
| Taxa de fluxo de gradiente (nL/min) | 300 |
| Gradiente linear | 3-30% B para 89min, 30-60% B para 5min, 60-95% B para 1min, 95% B para 5min |
| Resolução de varredura completa | 70,000 |
| Número de íons mais intensos selecionados | 15 |
| Energia relativa de colisão (%) (CID) | 28 |
| Exclusão Dinâmica (s) | 20.0 |
Tabela 2: Configuração de LC-MS/MS. Parâmetros aplicados para a análise LC-MS/MS de peptídeos R-metil em um Espectrômetro de Massa Quadrupole-Orbitrap de alta resolução, acoplado a um sistema de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC) de nanofluxo.
| Configurações de parâmetros MQ (ver 1.6.2.10) | |||
| Ambiente | Ação | ||
| Configuração | |||
| Modificações | Met4 | Adicione novas modificações. Defina Composição como H(-3) Hx(3) Cx C(-1) e escolha M como a especificidade. | |
| Metil4 (KR) | Duplicar "Metil (KR)", renomeá-lo e alterar a composição para Cx H(-1) Hx(3) | ||
| Dimetil4 (KR) | Duplicar "Dimetil (KR)", renomeá-lo e alterar a composição para H(-2) Hx(6) Cx(2) | ||
| Trimetil4 (K) | Duplicar "Trimetil (K)", renomeá-lo e alterar a composição para Cx(3) H(-3) Hx(9) | ||
| OxMet4 | Duplique "Oxidação (M)" e renomeie-a. | ||
| Proteases | Lisarginase | Adicione nova protease. Selecione as colunas 'R' e 'K'. | |
| Ao criar um novo PTM ou protease, clique em "Modificar tabela" para alterar as configurações do MaxQuant e, em seguida, em "Salvar alterações" para confirmar as alterações. Reinicie o MaxQuant e as novas opções ficarão visíveis. | |||
| Guia Arquivos Brutos | |||
| Grupo de parâmetros | Separe os arquivos brutos em 2 grupos (0 e 1) | ||
| Parâmetros específicos do grupo | |||
| Tipo | Tipo | Padrão | |
| Multiplicidade | 1 | ||
| Digestão | Enzima | Tripsina ou Lisarginase | |
| Clivagens Perdidas Máximas | Definir como 3 | ||
| Modificações | Modificações de variáveis | Grupo 0 | Oxidação (M), Metilo (KR), Dimetilo (KR), Trimetilo (K) |
| Grupo 1 | OxMet4, Metil4 (KR), Dimetil4 (KR), Trimetil4 (K) | ||
| Modificações Corrigidas | Grupo 0 | Carbamidometilação | |
| Grupo 1 | Carbamidometilação e Met4 | ||
| Parâmetros globais | |||
| Seqüências | Arquivos Fasta | Carregar arquivo FASTA | |
| Identificação | PSM FDR | Definir como 0,01 | |
| Pontuação mínima para peptídeos modificados | Definir como 1 | ||
| Escore Delta mínimo para peptídeos modificados | Definir como 1 | ||
| Identificação Avançada | Segunda pesquisa peptídica | Ticar | |
| Tabelas | Escrever tabela allPeptides | Verificar | |
| Avançado | Calcular propriedades de pico | Verificar | |
| Se não for especificado, deixe o parâmetro padrão. | |||
| Configurações de parâmetros MQ para teste de incorporação | |||
| Parâmetros específicos do grupo | |||
| Tipo | Tipo | Padrão | |
| Multiplicidade | 2 | ||
| Max rotulado | 5 | ||
| Etiqueta Pesada | Selecione Met4 | ||
| Digestão | Enzima | Tripsina ou Lisarginase | |
| Clivagens Perdidas Máximas | Definir como 3 | ||
| Modificações | Modificações de variáveis | Oxidação (M) | |
| Modificações Corrigidas | Carbamidometilação | ||
| Se não for especificado, deixe o parâmetro padrão. | |||
Tabela 3: Parâmetros de processamento MaxQuant. Parâmetros específicos do grupo e globais ajustados ao experimento específico descrito são listados. Todos os outros parâmetros foram definidos como padrão, dependendo da versão do programa usado.
| Nome da coluna | Descrição |
| Arquivo bruto | Arquivo de dados brutos no qual o dubleto foi identificado |
| H-Scan (Varredura H) | Número de varredura da contraparte Heavy |
| L-Scan | Número de digitalização da contraparte da luz |
| .CLASS | Pode ter 3 valores: |
| Pareados= Peptídeos pesados e leves são identificados com a mesma sequência | |
| Incompatível = Peptídeos pesados e leves têm a mesma sequência aa, mas há uma incompatibilidade na localização do local metilado | |
| Resgatado = Apenas um peptídeo no dubleto é identificado; sua contraparte é um pico não identificado. | |
| PEPTÍDEO | Sequência peptídica |
| PONTUAÇÃO | Peptídeo Andrômeda Score |
| RES | Resíduo modificado |
| PDV | Posição do resíduo modificado |
| MOD | Modificação |
| PROTEÍNA DE CHUMBO | Proteína a que o peptídeo pertence |
| GENE | Nome do gene correspondente à proteína |
| PROBABILITY_TRUE | Probabilidade de o dubleto ser um verdadeiro dubleto hmSILAC, calculado pelo modelo de regressão logística |
| PREDIÇÃO | 1 se o dubleto é putativo verdadeiro, 0 se é falso |
| RELAÇÃO H/L | Log2 da relação Intensidade Pesada/Leve |
| ME | Desvio entre a diferença de massa esperada e observada |
| DRT | Diferença no tempo de retenção |
Tabela 4: Descrição dos resultados de saída do hmSEEKER. Lista das entradas de coluna na tabela de saída hmSEEKER, com uma breve descrição de seu conteúdo.
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Discussion
A identificação de alta confiança da metilação de proteínas/peptídeos in vivo por proteômica global baseada em EM é um desafio, devido ao risco de alta FDR, com várias substituições de aminoácidos e metilesterificação ocorrendo durante o preparo da amostra que são isobáricas à metilação e podem causar atribuições erradas na ausência de estratégias ortogonais de validação da EM. A natureza subestequiométrica desse PTM complica ainda mais a tarefa da metilproteômica global, mas pode ser superada com o enriquecimento seletivo de peptídeos modificados10.
Aqui, um fluxo de trabalho bioquímico e analítico é apresentado, que é projetado para aumentar a eficiência e a confiabilidade da análise global de MS de peptídeos R-metil através da aplicação da estratégia hmSILAC acoplada ao fracionamento peptídico por cromatografia HpH-RP e afinidade-enriquecimento com kits de anticorpos anti-pan-R-metil-peptídeos. A primeira estratégia permite a validação ortogonal de metilpeptídeos e reduz fortemente o FDR de identificação, enquanto o segundo protocolo aumenta sua detectabilidade a partir do contexto de peptídeos não modificados22. No entanto, uma limitação deste protocolo é a exigência de uma quantidade muito grande de extrato proteico inicial (na faixa de 20-40 mg) como entrada para o fracionamento peptídico subsequente e enriquecimento de afinidade, o que limita a aplicação do método a linhagens celulares imortalizadas e de rápido crescimento que podem ser expandidas extensivamente. Em vez disso, a configuração atual não é aplicável a células ou tecidos primários derivados do paciente. Investigações futuras devem ser direcionadas para o aprimoramento do protocolo nessa direção: estratégias adicionais para o enriquecimento bioquímico do peptídeo metilado sobre os não modificados poderiam permitir contornar o uso de anticorpos, possibilitando a redução dos experimentos. Outro desenvolvimento interessante poderia ser representado pela combinação dos métodos atuais com a modificação química de peptídeos proteolíticos com etiquetas de massa isobáricas ou tandem, com duas vantagens potenciais: por um lado, a possibilidade de combinar múltiplas condições em um único experimento, multiplexando assim a quantificação relativa de alterações metilproteômicas sobre diferentes perturbações; por outro lado, agrupar diferentes amostras numa antes do fraccionamento cromatográfico e do enriquecimento por afinidade pode permitir reduzir a escala de experiências individuais.
Este protocolo baseia-se em duas digestão separadas do extrato de toda a célula em paralelo com a tripsina e a lysargiNase. A tripsina cliva a ligação peptídica no lado C-terminal dos resíduos K e R, gerando peptídeos que apresentam um resíduo carregado positivamente no terminal C, além da carga positiva N-terminal da α-amina23. A enzima LysargiNase hidrolisa seletivamente ligações peptidil-K e -R, gerando peptídeos que possuem um K ou R no local N-terminal, que podem incluir formas K-metiladas. O uso de ambas as proteases aumenta a cobertura geral do proteoma na análise de EM em larga escala, levando à identificação de peptídeos eventualmente perdidos após uma única digestão tríptica18. A digestão enzimática dupla, em vez disso, é realizada para reduzir o número de possíveis clivagens enzimáticas perdidas. De fato, a metilação de K e R reduz fortemente a eficiência da clivagem de proteínas pela tripsina. Apesar dessa precaução, ainda é comum que os peptídeos metilados sejam mais longos e contenham clivagens perdidas, o que leva a uma fragmentação pobre do CID.
O uso de outro tipo de fragmentação, como a Dissociação por Transferência de Elétrons (ETD), poderia resolver esse problema. De fato, o ETD geralmente não fragmenta íons peptídicos duplamente carregados de forma eficiente como o CID, mas fornece clivagem bastante uniforme de precursores de peptídeos de estados de carga mais alta (≥3). Isso pode ser uma vantagem no caso da R-metilação, uma vez que ocorre frequentemente em domínios ricos em arginina que contêm resíduos de R múltiplos e vizinhos. No entanto, a ETD tem uma taxa de varredura menor do que a CID, de modo que o número total de identificações peptídicas é reduzido24,25,26.
Recentemente, vários protocolos que envolvem o enriquecimento de peptídeos pós-translacionais modificados foram acoplados a diferentes estratégias de separação por cromatografia que ajudam a reduzir a complexidade da mistura de peptídeos, aumentando assim a eficiência geral da detecção de peptídeos modificados na EM. Aqui, aplica-se o fracionamento cromatográfico HpH-RP associado à concatenação não contígua das frações. O fracionamento peptídico off-line baseado em uma cromatografia de fase invertida de pH alto exibe uma separação de alto poder de resolução que é ortogonal à separação RP de pH baixo on-line realizada a jusante durante a execução LC-MS/MS27. Além disso, a estratégia de concatenação não contígua tem duas vantagens principais: primeiro, aumenta a cobertura proteica agrupando frações de eluição precoce, média e tardia em frações concatenadas individuais, preservando a heterogeneidade da mistura peptídica. Em segundo lugar, a concatenação reduz a análise subsequente do tempo de execução da EM, adquirindo um número menor de frações amostrais28.
Devido à natureza subestequiométrica da R-metilação, uma etapa de enriquecimento é necessária para facilitar a detecção de metilpeptídeos na análise global de MS de proteomas de modificação. Neste protocolo, os metilpeptídeos são enriquecidos por precipitação de imuno-afinidade (IAP) usando os anticorpos anti-SDMA e anti-ADMA em paralelo, enquanto a imuno-precipitação de mono-metil-peptídeos usando anticorpo anti-MMA é realizada nos FTs dos experimentos anteriores de IAP. Esta ordem reflete a eficiência diferente desses anticorpos: anticorpos anti-SDMA e anti-ADMA têm menor eficiência de ligação em comparação com o anticorpo anti-MMA. Digno de nota, essa eficiência diferente também pode causar vieses na representação dos diferentes graus de R-metilações em proteomas de modificação anotados experimentalmente29.
Antes da disponibilidade comercial de anticorpos anti-pan-R-metilação, outras estratégias de separação foram aplicadas para aumentar a detecção de peptídeos R-metilados pela EM, como cromatografia de forte troca catiônica (SCX) e interação hidrofílica (HILIC). Apesar de essas técnicas poderem reduzir a complexidade da mistura peptídica analisada na EM, elas não melhoraram significativamente a identificação dos metilpeptídeos30,31,32,33.
Apesar de todas essas soluções técnicas e analíticas que visam aumentar a separação, detecção, fragmentação e anotação de sequência de metilpeptídeos, a cobertura de metilproteoma ainda é limitada e tendenciosa em relação às proteínas metiladas mais abundantes, como ribonucleoproteína, helicases de ligação ao RNA, enquanto várias proteínas modificadas conhecidas de baixa abundância (por exemplo, TP53BP1, CHTF8, MCM2) só são detectadas por acaso e não de forma confiável em vários experimentos globais34 . O fracionamento subcelular aplicado antes do fluxo de trabalho atual poderia melhorar a detecção de tais proteínas; no entanto, a atual escala experimental necessária não torna esta uma alternativa viável.
Após a EM, os dados brutos são analisados através do algoritmo MaxQuant para identificação de peptídeos e PTM. A análise de dados de experimentos hmSILAC não é, no entanto, simples com algoritmos de pesquisa padrão. Por exemplo, enquanto o MaxQuant pode analisar eficientemente experimentos padrão SILAC com base na marcação metabólica com K e R isotopicamente codificados, ele não funciona de forma eficiente quando a marcação de isótopos é codificada em um PTM variável, como no caso da marcação de metila pesada que leva à metilação pesada. Portanto, a estratégia aqui adotada consiste em primeiro analisar os dados do hmSILAC com o MaxQuant sem usar sua funcionalidade de busca de duplas embutida para que os peptídeos leves e pesados possam ser identificados de forma independente; em seguida, eles são combinados com um software de pós-processamento. Este fluxo de trabalho bioinformático também tem suas próprias armadilhas, pois é preciso especificar metilações em formas pesadas e leves no painel Modificações Variáveis do MaxQuant, terminando com um total de oito modificações variáveis quando a oxidação da metionina (pesada e leve) também está incluída. Pesquisar muitos PTMs com um mecanismo de busca de banco de dados como MaxQuant / Andromeda é impraticável, porque leva a um aumento exponencial dos peptídeos teóricos que o algoritmo tem que testar: nossa solução foi analisar cada MS dados brutos duas vezes, com diferentes conjuntos de PTMs variáveis (através da função de grupos de parâmetros do MaxQuant). Após a pesquisa de peptídeos, a ferramenta desenvolvida internamente hmSEEKER é empregada para apoiar a atribuição de pares de peptídeos leves pesados a partir das tabelas de saída produzidas pela MaxQuant. A primeira versão do algoritmo hmSEEKER foi publicada recentemente13, onde foi demonstrado que o hmSEEKER pode identificar duplicatas hmSILAC com FDR < 1%. Falsos positivos ainda podem surgir de pares de picos que, por acaso, têm um múltiplo de diferença de massa de 4,02 Da, mas isso é muito improvável para os dubletos classificados como Matched ou Mismatched, à luz dos seguintes fatos: para um dubleto Matched ou Mismatched ser falso, Andrômeda tem que determinar incorretamente a sequência da contraparte pesada e da leve. Supondo que o mecanismo de pesquisa tenha sido executado com seus parâmetros padrão, cada identificação tem uma probabilidade de 1% de estar incorreta. Assim, a probabilidade de a contraparte hmSILAC também estar incorreta é de 0,01%.
Uma armadilha do hmSILAC é que os peptídeos contendo metionina em sua espinha dorsal também geram duplos que são indistinguíveis daqueles gerados por metil-peptídeos. No entanto, a partir de nossa experiência, isso não deve representar um grande problema, primeiro porque os peptídeos sem metilações podem ser simplesmente descartados da saída MaxQuant e, segundo, porque o hmSEEKER leva em conta automaticamente qualquer resíduo de metionina em um metilpeptídeo ao calcular a diferença de massa esperada; por último, este risco também é excluído pelo facto de as modificações pesadas e ligeiras serem pesquisadas em grupos de parâmetros separados, de modo a que o motor de busca não possa dividir uma monometilação pesada (+18,03 Da) numa monometilação leve mais uma metionina pesada (14,01 + 4,02 Da).
Uma solução mais formal e experimental para esse problema foi proposta por Oreste Acuto e seus colaboradores, que desenvolveram uma variante do hmSILAC, denominada isometionina metil-SILAC (iMethyl-SILAC)22. Neste protocolo alternativo de marcação metabólica, a metionina de luz natural é substituída por [13 C 4]-Metionina, que tem a mesma massa que [13CD3]-Metionina (Met-4), mas não produz grupos metil isotopicamente codificados estáveis, devido à distribuição diferente dos isótopos pesados dentro da etiqueta molecular. Assim, em experimentos com iMethyl-SILAC, peptídeos contendo metionina não modificados não geram dubletos. No entanto, deve-se notar que, quando Acuto e colegas de trabalho compararam o desempenho do iMethyl-SILAC e do hmSILAC tradicional, os dois métodos ainda apresentaram FDRs muito semelhantes.
Uma possível limitação do hmSEEKER é que ele é projetado para trabalhar diretamente em tabelas de saída MaxQuant para que seu código-fonte não seja compatível com outros mecanismos de pesquisa, cujos arquivos de saída são estruturados de forma diferente; nesse sentido, o MethylQuant35 fornece uma boa ferramenta de bioinformática alternativa que é adaptada ad hoc para a análise direta de dados brutos de MS de experimentos do tipo hmSILAC e é mais flexível em termos dos arquivos de entrada fornecidos. Um modelo de aprendizado de máquina está em desenvolvimento para distinguir duplicatas H/L de peptídeo metil verdadeiro e falso sem depender de limiares definidos pelo usuário.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
MM e EM são estudantes de doutoramento da Escola Europeia de Medicina Molecular (SEMM). O EM é o destinatário de uma bolsa FIRC-AIRC de 3 anos (Código do Projeto: 22506). As análises globais de R-metil-proteomas no grupo TB são apoiadas pelo AIRC IG Grant (Código do Projeto: 21834).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
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