Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Efficiënte fragmentscreening bereiken in de XChem-faciliteit bij Diamond Light Source

Published: May 29, 2021 doi: 10.3791/62414
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2, 1,2,3, 3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,3, 3,5, 1, 1,2,3,4,6
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus, 3Structural Genomics Consortium, University of Oxford, 4Centre for Medicines Discovery, University of Oxford, 5Oxford Protein Informatics Group, Department of Statistics, Oxford University, 6Department of Biochemistry, University of Johannesburg
* These authors contributed equally

Summary

Dit artikel beschrijft het volledige XChem-proces voor het screenen van fragmenten op basis van kristallen, vanaf het aanvragen van toegang en alle daaropvolgende stappen tot het verspreiden van gegevens.

Abstract

Bij de ontdekking van geneesmiddelen op basis van fragmenten worden honderden of vaak duizenden verbindingen kleiner dan ~300 Da getest tegen het eiwit van belang om chemische entiteiten te identificeren die kunnen worden ontwikkeld tot krachtige kandidaat-geneesmiddelen. Omdat de verbindingen klein zijn, zijn de interacties zwak en moet de screeningsmethode daarom zeer gevoelig zijn; Bovendien is structurele informatie vaak cruciaal voor het uitwerken van deze treffers tot loodachtige verbindingen. Daarom is eiwitkristallografie altijd een gouden standaardtechniek geweest, maar historisch gezien te uitdagend om wijdverbreid te worden gebruikt als primair scherm.

De eerste XChem-experimenten werden in 2014 gedemonstreerd en vervolgens uitgeprobeerd met academische en industriële medewerkers om het proces te valideren. Sindsdien hebben een grote onderzoeksinspanning en een aanzienlijke bundeltijd de monstervoorbereiding gestroomlijnd, een fragmentenbibliotheek ontwikkeld met snelle follow-upmogelijkheden, de capaciteit van I04-1 bundellijn voor onbeheerde gegevensverzameling geautomatiseerd en verbeterd, en nieuwe tools geïmplementeerd voor gegevensbeheer, analyse en hitidentificatie.

XChem is nu een faciliteit voor grootschalige kristallografische fragmentscreening, die het hele kristal-tot-depositieproces ondersteunt en toegankelijk is voor academische en industriële gebruikers over de hele wereld. Het peer-reviewed academische gebruikersprogramma wordt sinds 2016 actief ontwikkeld om projecten met een zo breed mogelijke wetenschappelijke reikwijdte te huisvesten, zowel goed gevalideerde als verkennende projecten. Academische toegang wordt toegewezen via tweejaarlijkse oproepen voor collegiaal getoetste voorstellen, en eigen werk wordt geregeld door de Industrial Liaison-groep van Diamond. Deze workflow is al routinematig toegepast op meer dan honderd doelen uit verschillende therapeutische gebieden, en identificeert effectief zwakke bindmiddelen (1%-30% hitrate), die beide dienen als hoogwaardige uitgangspunten voor het ontwerp van verbindingen en uitgebreide structurele informatie bieden over bindingsplaatsen. De veerkracht van het proces werd aangetoond door de voortdurende screening van SARS-CoV-2-doelen tijdens de COVID-19-pandemie, inclusief een doorlooptijd van 3 weken voor de belangrijkste protease.

Introduction

Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) is een veelgebruikte strategie voor het ontdekken van leads, en sinds de opkomst 25 jaar geleden heeft het vier geneesmiddelen voor klinisch gebruik opgeleverd en zijn meer dan 40 moleculen gevorderd tot klinische proeven 1,2,3. Fragmenten zijn kleine chemische entiteiten, meestal met een molecuulgewicht van 300 Da of minder. Ze zijn geselecteerd vanwege hun lage chemische complexiteit, die goede aanknopingspunten bieden voor de ontwikkeling van zeer ligandefficiënte remmers met uitstekende fysisch-chemische eigenschappen. Hun grootte betekent dat ze het bindingslandschap van eiwitten grondiger bemonsteren dan bibliotheken van grotere geneesmiddel- of loodachtige verbindingen, en dus ook hotspots en vermeende allosterische sites onthullen. In combinatie met structurele informatie bieden fragmenten een gedetailleerde kaart van de potentiële moleculaire interacties tussen eiwit en ligand. Niettemin vereist het betrouwbaar detecteren en valideren van die entiteiten, die de neiging hebben om zwak aan het doeleiwit te binden, een reeks robuuste en gevoelige biofysische screeningsmethoden, zoals Surface Plasmon Resonance (SPR), Nuclear Magnetic Resonance (NMR) of Isothermal Titration Calorimetry (ITC)4,5.

Röntgenkristallografie is een essentieel onderdeel van de FBDD-toolkit: het is gevoelig genoeg om zwakke bindmiddelen te identificeren en levert direct structurele informatie op over de interacties op moleculair niveau. Het is een aanvulling op andere biofysische schermen en meestal essentieel voor het vorderen van fragmenttreffers naar loodverbindingen; het vereist kristalsystemen van hoge kwaliteit, wat betekent dat kristallisatie zeer reproduceerbaar is en kristallen idealiter diffracteren tot een resolutie van meer dan 2,8 Å.

Historisch gezien is het erg moeilijk geweest om kristallografie te gebruiken als primair fragmentscherm 6,7,8, zowel in de academische wereld als in de industrie. Synchrotrons daarentegen bereikten orde-van-grootte-verbeteringen in robotica, automatisering 9,10,11 en detectortechnologie 12,13, en in combinatie met even versnelde rekenkracht en algoritmen voor gegevensverwerking 14,15,16, kunnen complete diffractiedatasets in seconden worden gemeten en grote aantallen daarvan volledig onbeheerd, zoals gepionierd bij LillyCAT7 en later MASSIF17,18 (European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)). Dit leidde ertoe dat synchrotrons zeer gestroomlijnde platforms ontwikkelden om op kristallen gebaseerde fragmentscreening als primair scherm toegankelijk te maken voor een brede gebruikersgemeenschap (XChem at Diamond; CrystalDirect bij EMBL/ESRF19; BESSY in het Helmholtz-Zentrum Berlin20; FragMax bij MaxIV21).

Dit artikel documenteert de protocollen die het XChem-platform vormen voor fragmentscreening door middel van röntgenkristallografie, van monstervoorbereiding tot de uiteindelijke structurele resultaten van 3D-gemodelleerde treffers. De pijplijn (figuur 1) vereiste de ontwikkeling van nieuwe benaderingen voor kristalidentificatie 22, weken 23 en oogsten24, evenals software voor gegevensbeheer25 en een algoritmische benadering voor het identificeren van fragmenten 26 die nu veel wordt gebruikt in de gemeenschap. De technologie voor het oogsten van kristallen wordt nu verkocht door een leverancier (zie Tabel met materialen), en de open beschikbaarheid van de gereedschappen heeft andere synchrotrons in staat gesteld ze aan te passen om gelijkwaardige platforms op te zetten21. Lopende projecten hebben betrekking op gegevensanalyse, modelvoltooiing en gegevensverspreiding via het Fragalysis-platform27. Het monstervoorbereidingslaboratorium grenst aan bundellijn I04-1, wat de logistiek van het overbrengen van honderden bevroren monsters naar de bundellijn vereenvoudigt en speciale straaltijd op I04-1 maakt snelle röntgenfeedback mogelijk om de campagne te begeleiden.

XChem is een integraal onderdeel van het gebruikersprogramma van Diamond, met twee oproepen per jaar (begin april en oktober). Het peer-reviewproces is verfijnd in overleg met experts op het gebied van geneesmiddelenontdekking uit de academische wereld en de industrie. Naast een sterke wetenschappelijke casus vereist het voorstelproces28 dat aanvragers niet alleen zelf de gereedheid van het kristalsysteem beoordelen, maar ook hun expertise in biochemische en orthogonale biofysische methoden en het vermogen om screeninghits te bevorderen door middel van follow-upchemie. De toegangswijzen zijn ook geëvolueerd om tegemoet te komen aan de multidisciplinaire gebruikersgemeenschap:

Niveau 1 (één project ) is voor projecten in de verkennende fase en er hoeven geen instrumenten voor de validatie van treffers (biofysische of biochemische instrumenten) en follow-upstrategieën te zijn. Als het project wordt geaccepteerd, krijgt het een verminderd aantal bundeltijdverschuivingen, genoeg voor een proof of concept.

Niveau 2 (één project) is voor goed gevalideerde projecten en vereist downstream-instrumenten en follow-upstrategieën. Als het project wordt geaccepteerd, krijgt het voldoende zendtijd toegewezen voor een volledige fragmentscreeningcampagne. Afzonderlijke projecten (Tier 1 of Tier 2) moeten binnen de 6 maanden van de toewijzingsperiode (april tot september of oktober tot maart) worden voltooid.

Block Allocation Group (BAG) is voor een consortia van groepen en projecten, waar binnen de BAG een robuust proces voor doelselectie en prioritering aanwezig is, samen met een duidelijke follow-uppijplijn. BAG's moeten ten minste één volledig XChem-opgeleide expert (superuser) hebben, die hun activiteiten coördineert met Diamond-personeel en de BAG-leden traint. Het toegewezen aantal bundeltijddiensten wordt bepaald door het aantal wetenschappelijk sterke projecten in de BAG en wordt per toewijzingsperiode opnieuw geëvalueerd op basis van het rapport van de BAG. De toegang is beschikbaar voor 2 jaar.

Het XChem-experiment is verdeeld in drie fasen, met voor elk van hen een beslissingspunt: oplosmiddeltolerantietest, voorscherm en hoofdscherm (Figuur 2). De oplosmiddeltolerantietest helpt bij het bepalen van de inweekparameters, de hoeveelheid oplosmiddel (DMSO, ethyleenglycol of andere cryoprotectanten indien nodig) die het kristalsysteem kan verdragen en voor hoe lang. Oplosmiddelconcentraties variëren doorgaans van 5%-30% over ten minste twee tijdstippen. Diffractiegegevens worden verzameld en vergeleken met de basisdiffractie van het kristalsysteem; Dit bepaalt de inweekparameters voor de volgende fase. Voor de pre-screening worden 100-150 verbindingen gedrenkt onder de omstandigheden die zijn bepaald in de oplosmiddeltest, en het doel is om te bevestigen dat de kristallen de verbindingen onder die omstandigheden kunnen verdragen. Indien nodig wordt de cryoprotectant vervolgens toegevoegd aan de druppels die de fragmenten al bevatten. De succescriteria zijn dat 80% of meer van de kristallen goed genoeg overleven om diffractiegegevens van goede en constante kwaliteit op te leveren; Als dit niet lukt, worden de inweekomstandigheden meestal herzien door de inweektijd of de concentratie van het oplosmiddel te wijzigen. Na een succesvolle pre-screening kunnen de rest van de verbindingen die voor het experiment zijn gekozen, worden ingesteld met behulp van de definitieve parameters.

De DSI-gebalanceerde bibliotheek (zie Tabel met materialen) is met opzet ontworpen om snelle follow-upprogressie mogelijk te maken met behulp van evenwichtige chemie29 en is het werkpaard van de faciliteit geweest. Het is beschikbaar voor gebruikers met een concentratie van 500 mM in DMSO. Academische gebruikers hebben ook toegang tot andere bibliotheken die door medewerkers worden aangeboden (meer dan 2.000 verbindingen in totaal) met concentraties van 100-500 mM in DMSO (een volledige lijst is te vinden op de website28). Een groot deel van de totale collectie is ook verkrijgbaar in ethyleenglycol, voor kristalsystemen die DMSO niet verdragen. Gebruikers kunnen ook hun eigen bibliotheken meenemen, op voorwaarde dat ze platen hebben die compatibel zijn met het akoestische vloeistofbehandelingssysteem (zie Materiaaltabel).

Voor alle drie de stappen van het experiment (karakterisering van het oplosmiddel, voorscreening of volledig scherm) zijn de volgende procedures voor de voorbereiding van het monster identiek (figuur 3): selectie van de locatie van de dosering van de verbinding door middel van beeldvorming en het richten van kristallisatiedruppels met TeXRank22; dosering in druppels met behulp van het akoestische vloeistofdoseersysteem voor zowel oplosmiddelen als verbindingen23; efficiënt oogsten van de kristallen met behulp van de Crystal shifter24; en het uploaden van voorbeeldinformatie in de beamline-database (ISPyB). De huidige interface voor het ontwerpen en uitvoeren van experimenten is een op Excel gebaseerde applicatie (SoakDB), die de benodigde invoerbestanden genereert voor de verschillende apparatuur van het platform, en alle resultaten bijhoudt en registreert in een SQLite-database. Barcodescanners worden in verschillende stadia van het proces gebruikt om monsters te volgen en deze gegevens worden aan de database toegevoegd.

Diffractiegegevens worden verzameld in onbemande modus met behulp van speciale bundeltijd op bundellijn I04-1. Er zijn twee centreermodi beschikbaar, namelijk optisch en op röntgenstraling gebaseerd17. Voor naald- en staafvormige kristallen wordt röntgencentrering geadviseerd, terwijl dikkere kristallen over het algemeen de optische modus ondersteunen, die sneller is en daarom meer monsters kan verzamelen in de toegewezen bundeltijd. Afhankelijk van de resolutie van de kristallen (vastgesteld voordat ze het platform betreden) kan de gegevensverzameling een totale blootstelling van 60 s of 15 s bedragen. Het verzamelen van gegevens tijdens de testfase van het oplosmiddel geeft meestal aan welke combinatie het beste werkt met de prestaties van bundellijn I04-1.

De grote hoeveelheid gegevensanalyse wordt beheerd via XChemExplorer (XCE)25, die ook kan worden gebruikt om de hitidentificatiestap te starten met behulp van PanDDA26. XCE is een tool voor gegevensbeheer en workflow die grootschalige analyse van eiwit-ligandstructuren ondersteunt (Figuur 4); het leest alle automatische verwerkingsresultaten van gegevens die zijn verzameld bij Diamond Light Source (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 en STARANISO31) en selecteert automatisch een van de resultaten op basis van gegevenskwaliteit en gelijkenis met een referentiemodel. Het is belangrijk dat het model representatief is voor het kristalsysteem dat wordt gebruikt voor XChem-screening en alle wateren of andere oplosmiddelmoleculen moet bevatten, evenals alle co-factoren, liganden en alternatieve conformaties die zichtbaar zijn in kristallen die alleen met oplosmiddel zijn gedrenkt. De kwaliteit van dit referentiemodel heeft een directe invloed op de hoeveelheid werk die nodig is tijdens de modelbouw- en veredelingsfase. PanDDA wordt gebruikt om alle gegevens te analyseren en bindingsplaatsen te identificeren. Het lijnt structuren af op een referentiestructuur, berekent de statistische kaarten, identificeert gebeurtenissen en berekent gebeurteniskaarten26,32. In het PanDDA-paradigma is het niet nodig en ook niet wenselijk om het volledige kristallografische model te bouwen; Wat gemodelleerd moet worden is alleen de weergave van het eiwit waar een fragment is gebonden (het bound-state model), dus de focus hoeft alleen te liggen op het bouwen van het ligand en de omringende residuen/oplosmiddelmoleculen volgens de Event Map32.

Protocol

1. Indiening van het projectvoorstel

  1. Inhoud van het voorstel: aangezien het XChem-programma overtekend is, is grondige en volledige informatie in het voorstel van cruciaal belang voor het doorstaan van peer-review.
    1. Maak de zaak! Presenteer het belang van het doel en plaats het in de bredere context.
      1. Formuleer de strategie na de fragmentscreeningscampagne: de orthogonale methoden die zijn om de treffers te valideren en hoe ze te vorderen. Zet de samenwerkingen op een rij, indien nodig.
      2. Vanwege het intensieve laboratorium- en data-analysegedeelte is het ten zeerste aan te raden om vooraf een ervaren kristallograaf toe te wijzen.
      3. Een robuust kristalsysteem is de sleutel tot het elimineren van technische variatie en gebruikers moeten die essentiële punten aanpakken.
        1. Zorg ervoor dat de kristallisatieomstandigheden reproduceerbare druppels opleveren met kristallen van vergelijkbare difractkwaliteit in platen die geschikt zijn voor gebruik op het platform met een reservoirvolume van 30 μL (of minder) en een druppelgrootte tussen 200-500 nL. Idealiter heeft meer dan 50% van de druppels in een plaat kristallen van ten minste 35 μm maat33.
        2. Zorg voor een consistente diffractiekwaliteit van kristallen (2,6 Å of beter).
        3. Controleer de geschiktheid van het kristalsysteem voor fragmentscreening, inclusief kristalverpakking en toegankelijkheid van bekende locaties. Eerder bewijs van een molecuul dat op die plaatsen is gebonden, is vaak geruststellend.

2. Voorbereiding van het bezoek

  1. Overdracht van kristallisatieprotocollen voor kristallisatie ter plaatse.
    1. Zorg voor 2 x 50 ml reservoiroplossing, klaar voor gebruik.
    2. Zorg voor de eiwitoplossing in de benodigde concentratie voor kristallisatie, klaar voor gebruik in aliquots van 30-50 μL.
    3. Geef 10 ml van de eiwitbufferoplossing.
    4. Zorg voor zaadmateriaal (zelfs als het niet nodig is in het kristallisatieprotocol).
      OPMERKING: Zaaien bevordert de reproduceerbaarheid van kristallisatie en versnelt de nucleatietijd33.
    5. Vul het kristallisatie-informatieformulier in dat beschikbaar is op de XChem-website28.
    6. Geef de opslaginformatie op in het verzendformulier dat beschikbaar is op de XChem-website28.
  2. Installeer NoMachine en stel een remote desktop in op Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html).
  3. Genereer en draag een goed referentiemodel over, in overleg met een deskundige kristallograaf of XChem ondersteunend personeel.

3. Experiment met fragmentenscreening

  1. Definiëren van de locatie van de samengestelde afgifte.
    1. Beeldvorming van kristallisatieplaten.
      1. Beeld alle kristalplaten (zie Tabel met materialen) die nodig zijn voor het experiment in de kristalplaatimagers (zie Tabel met materialen). Genereer met behulp van de imager-software plaatnamen in de juiste map voor het plaattype in het volgende formaat Voorstel Number_Plate nummer.
      2. Druk de barcodes af (klik met de rechtermuisknop op de naam van de plaat en selecteer in het menu), plaats ze aan de andere kant van de plaat dan de rijletters, plaats de plaat(en) in de laadpoort met de barcode van de gebruiker af gericht.
      3. Gebruik de imager-besturingssoftware, scan de laadpoort, klik met de rechtermuisknop op platen en selecteer vervolgens Image Plates.
      4. Zodra de beeldvorming is voltooid, verwijdert u de platen uit de imager.
    2. Kristallen kiezen en de locatie van de samenstelling
      OPMERKING: De afbeeldingen van de kristallisatiedruppels worden verwerkt in de Luigi-pijplijn met behulp van TexRank's op textons gebaseerde algoritme Ranker om de druppels te rangschikken op basis van de waarschijnlijke aanwezigheid van kristallen22. Dit duurt ongeveer 10 minuten en de beelden zijn dan beschikbaar in TexRank.
      1. Open TeXRank vanaf een pc en selecteer de kristallade in de lijst rechtsonder of door de streepjescode in het vak linksboven te typen.
      2. Selecteer het juiste imager-formaat en de weergave van één put. Beweeg door de druppelafbeeldingen en als er een kristal is dat geschikt is om in een experiment te gebruiken, klik je met de rechtermuisknop weg van het kristal, maar in de druppel - het doel is om te richten op waar in de druppel oplosmiddel / verbindingen moeten worden toegevoegd, dus wil niet direct het kristalraken 23.
      3. Ga door de hele plaat en als u klaar bent, selecteert u de Echo 1 Target-knop ; Opslaan in de Crystal Targets-directory onder het betreffende bezoek. Wijzig de bestandsnaam niet.
      4. Herhaal dit voor eventuele extra platen.
  2. Samengestelde dosering
    1. Bestanden genereren voor samengestelde dosering
      1. Voer in SoakDB bibliotheekselectie of oplosmiddelinformatie in de bibliotheek/oplosmiddeltabel in.
      2. Voer het druppelvolume in en laad het in de lijst met beoogde kristallen.
      3. Genereer de benodigde batches.
      4. Voer de weekparameters in. Klik op Berekenen en vervolgens op de knop Exporteren in behandeling . Voeg voor oplosmiddel de verschillende concentraties toe aan de tabel. Dit genereert de vijlen voor gebruik in de akoestische dispenser.
      5. Als u cryoprotectant gebruikt, voert u de concentratie in en maakt u de bestanden op dezelfde manier aan.
    2. Doseeroplossingen met behulp van de akoestische dispenser (zie Materiaaltabel)
      1. Neem de bronplaat (verbindingen of oplosmiddel/cryoprotectant) en draai de plaat 2 minuten in de centrifuge op 1.000 x g.
      2. Als u oplosmiddel of cryoprotectant doseert, pipetteer dan 30 μL in het betreffende putje op een plaat van 384PP; Dek af met een microsealfolie en centrifugeer zoals hierboven.
      3. Open de software; selecteer Nieuw en kies de juiste bronbronputplaat (384PP, 384LDV of 1536LDV) en de vloeistofklasse (DMSO, CP, BP of GP). Zorg ervoor dat het juiste plaattype is geselecteerd als bestemmingsplaat. Vink vervolgens het vakje Aangepast aan en ga verder.
      4. Selecteer Importeren en kies het relevante batchbestand. Voltooi de importstappen zoals gevraagd door de software.
      5. Gebruik de plaatkaarten om de te doseren oplossing en de bestemmingslocaties te controleren.
      6. Voer het protocol uit en volg de aanwijzingen zodra ze verschijnen. De oplossing(en) van de bronplaat wordt gedoseerd in de gekozen kristaldruppels.
      7. Bewaar de plaat gedurende de gewenste tijd in de couveuse.
        OPMERKING: Deze parameters worden bepaald in de karakteriseringsstap van het oplosmiddel, de temperatuur zal 4 °C of 20 °C zijn, afhankelijk van de kristalgroeitemperatuur en de tijden liggen meestal tussen 1 uur en 3 uur.
  3. Kristallen oogsten met behulp van de semi-automatische kristaloogstinrichting (zie Tabel met materialen).
    OPMERKING: Als cryoprotectie vereist is, herhaal dan stap 3.2.2 voor de toevoeging van cryoprotectieve oplossingen aan de kristaldruppels voordat de monsters worden geoogst.
    1. Voorbereiding voor de oogst
      1. Bereid de bestanden voor die nodig zijn voor het oogsten in SoakDB. Bevestig desgevraagd of het weken klaar is en de batches zijn voltooid.
      2. Scan het aantal pucks dat nodig is voor het experiment onder het juiste voorstelnummer.
      3. Kies een lade met de juiste maat lussen voor de kristallen (35 μm, 75 μm of 150 μm). Belangrijk is dat u een lusgrootte kiest die zo goed mogelijk overeenkomt met de grootte van het kristal om de automatische centrering op de bundellijn nauwkeuriger te maken, de gegevenskwaliteit te verbeteren door de achtergrond te verminderen en de noodzaak van cryoprotectant te elimineren.
      4. Open de betreffende software en open het tabblad workflow.
      5. Scan de pucks in de software en scrol terug naar de bovenkant van de lijst, waarbij de eerste puck wordt gemarkeerd.
      6. Plaats de pucks in een schuimrubberen dewar en koel ze af met vloeibare stikstof.
      7. Kies Bestand importeren uit SoakDB en selecteer de batch die u wilt oogsten; Controleer of de batch is toegewezen aan de linkerhouder. Er verschijnt een werklijst.
      8. Neem de kristallen plaat, verwijder de verzegeling en plaats deze in de linkerhouder; Verplaats de plaat naar de parkeerstand.
    2. Kristallen oogsten
      1. Maak het u gemakkelijk en druk op de knop Workflow starten (het scherm is een aanraakscherm) om naar de eerste geselecteerde putpositie te gaan.
      2. Als het kristal het heeft overleefd, monteer je het kristal in de lus en duik je in de vloeibare stikstof en plaats je het op positie 1 in de eerste puck in de lijst.
      3. Selecteer de juiste beschrijving voor het kristal in de interface (normaal, gesmolten, gebarsten, gelei of gekleurd).
      4. Als de druppel een samengestelde indrijving is, noteer dan de beschrijving van de samengestelde toestand (helder, kristallijn, neergeslagen, slechte dosering of fasescheiding).
      5. Als het kristal met succes is gemonteerd, selecteert u Gemonteerd en selecteert u anders Fail.
      6. De plaat gaat naar het volgende geselecteerde putje. Vul alle puckposities achter elkaar op (laat geen opening als een kristal is uitgevallen). Ga door tot het einde van de workflow.
      7. Laad aan het einde van de workflow eventuele extra batches en ga verder met het vullen van de pucks op volgorde. Het is niet nodig om een nieuwe puck te starten voor een nieuwe batch.
    3. Barcode-tracking van de oogstresultaten
      1. Zodra alle kristallen zijn geoogst, breng je de pucks naar de barcodescanner, plaats je ze een voor een in de houder om de puck en pin barcodes te scannen.
      2. Wanneer dit is voltooid, plaatst u de deksels op de pucks en bewaart u ze in een opslagdewar met vloeibare stikstof.
      3. Laad het uitvoerbestand in de SoakDB-interface.
    4. Voorbeeldinformatie opnemen in ISPyB34,35,36
      1. Voorbeeldgegevens uploaden naar ISPyB
        1. Werk in SoakDB de beamline bij, bezoek Update voor ISPyB en klik op Exporteren om het bestand te maken dat u naar ISPyB wilt uploaden.
        2. Open stopverf. Log in en blader naar de volgende directory: dls/labxchem/data/year/lbXXXX-1/processing/lab36/ispyb.
        3. Voer het script csv2ispyb uit (csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv)
          OPMERKING: De samples worden nu in ISPyB geladen.
      2. Leg de pucklocatie en de strategie voor het verzamelen van gegevens vast.
        1. Noteer de details en de locatie van de pucks
          OPMERKING: Het is belangrijk om de details en locatie van de pucks vast te leggen, zodat ze kunnen worden gelokaliseerd en op de beamline kunnen worden geladen.
          1. Open in SoakDB het tweede tabblad met het label Pucks.
          2. Vul de gegevens in de vakjes bovenaan in. In het bijzonder de locatie van de pucks (opslagdewar en stokken), parameters voor gegevensverzameling, inclusief de verwachte resolutie en het aantal voorstellen.
          3. Klik op de knop Opslaan en er verschijnt een lijst met alle pucks in de tabel. Kopieer de recent gevulde pucks.
          4. Open de XChem-wachtrijspreadsheet (snelkoppeling op het bureaublad) en plak de informatie. Vul eventuele aanvullende relevante informatie in.

4. Verzamelen van gegevens

OPMERKING: Gegevens worden verzameld in een onbeheerde modus en beheerd door het XChem/beamline-team.

  1. Verkeerd gecentreerde monsters verzamelen.
    OPMERKING: Deze zijn vereist wanneer er problemen zijn opgetreden met de gegevensverzameling voor bepaalde monsters, hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt doordat de pinnen niet correct zijn gecentreerd.
    1. Bekijk de weergave van de samplewisselaar in ISPyB, selecteer Rangschikken op AP om de samples te beoordelen op automatisch verwerkte resolutie in een kleurgradatie van groen naar rood.
    2. Klik op de monsters om te controleren op rode of gele monsters.
      OPMERKING: Hiermee wordt de gegevensverzameling geopend.
    3. Controleer de kristalsnapshots om te zien of het kristal gecentreerd is.
    4. Noteer al degenen die niet gecentreerd zijn en stuur deze naar de lokale contactpersoon die de ontbrekende monsters zal ophalen.

5. Data-analyse

  1. Het ophalen en analyseren van de automatische verwerkingsresultaten van Diamond via XChemExplorer (XCE)25.
    1. Ga in een terminal naar de submap Verwerking: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing of voor XChem BAGs: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing/project/processing/.
    2. Gebruik de alias xce om XChemExplorer te openen.
    3. Selecteer de knop Tabellen bijwerken vanuit gegevensbron .
    4. Onder het tabblad Overzicht vindt u een samenvatting van de experimentele gegevens. Voeg extra categorieën toe met de optie Weer te geven kolommen selecteren in het menu Gegevensbron .
    5. Selecteer op het tabblad Instellingen de map voor gegevensverzameling (/dls/i04-1/data/year/visit/).
    6. Open het tabblad Gegevenssets, kies het doel in het vervolgkeuzemenu Doel selecteren, selecteer Get Nieuwe resultaten van Automatische verwerking in het vervolgkeuzemenu Gegevenssets en klik op Uitvoeren.
      OPMERKING: XCE zal nu het bezoek voor gegevensverzameling parseren voor automatische verwerkingsresultaten. Dit kan enige tijd duren wanneer het voor het eerst wordt uitgevoerd, afhankelijk van het aantal gegevenssets/mappen dat wordt geparseerd.
    7. Controleer de consistentie en kwaliteit van gegevens door de resolutie, spatiegroep en Samenvoegen te controleren. Sluit gegevens met een resolutie lager dan 2,8 Å uit.
      OPMERKING: Standaard is de selectie van de gegevensset gebaseerd op een score die is berekend op basis van I/sigI, volledigheid en aantal unieke reflecties, maar andere verwerkingsresultaten kunnen worden geselecteerd voor gebruik25.
    8. Om een ander verwerkingsresultaat voor afzonderlijke datasets te selecteren, klikt u desgewenst op Voorbeeld-ID en kiest u het gewenste programma/de gewenste uitvoering. Als u de verwerkingspijplijn voor alle gegevenssets wilt wijzigen, selecteert u Voorkeuren bewerken in het menu Voorkeuren en wijzigt u het selectiemechanisme voor gegevenssets.
    9. Verwerk de gegevens indien nodig opnieuw via ISPyB37.
    10. Als er geen verwerkte gegevens voor een monster acceptabel zijn, labelt u het label als Kan niet worden uitgesloten van verdere analyse.
    11. Als u klaar bent, klikt u op Tabellen bijwerken uit gegevensbron om gegevens toe te voegen aan volgende tabellen.
  2. Initiële kaarten berekenen met behulp van DIMPLE38.
    1. Open het tabblad Kaarten , kies het referentiemodel in het vervolgkeuzemenu en selecteer de gewenste gegevenssets, gevolgd door DIMPLE uitvoeren op geselecteerde MTZ-bestanden.
    2. XCE voert meerdere DIMPLE-taken tegelijkertijd uit op het cluster bij Diamond. Zoek de status van deze taken in de kolom Dimple Status en vernieuw ze met behulp van de knop Tabellen bijwerken vanuit gegevensbron of met behulp van de opdracht qstat in Linux.
    3. Controleer na voltooiing of de waarden Dimple Rcryst, Dimple Rfree en Space Group acceptabel zijn. Wijzig indien nodig (hoge Rfree/verkeerde spatiegroep/groot verschil in eenheidscelvolume) de resultaten van de automatische verwerking zoals eerder beschreven en herhaal het genereren van kaarten voor deze gegevenssets.
  3. Genereren van ligandbeperkingen met behulp van Grade39, AceDRG40 of phenix.eLBOW41.
    1. Selecteer het gewenste programma (Voorkeuren, Voorkeuren bewerken, Programma voor het genereren van beperkingen) en selecteer vervolgens gegevenssets op het tabblad Kaarten, gevolgd door het uitvoeren van het CIF/PDB/PNG-bestand van GESELECTEERDE verbindingen maken in de vervolgkeuzelijst Kaarten en beperkingen.
    2. Vernieuw de status van deze taken in de kolom Samengestelde status met behulp van de knop Tabellen bijwerken vanuit gegevensbron .
  4. Het grondtoestandsmodel bouwen (Pre-run)
    OPMERKING: De term grondtoestandsmodel vertegenwoordigt de structuur van het eiwit in zijn ligandvrije vorm, zoals waargenomen in 100 datasets (dit aantal is willekeurig gekozen). Aangezien het grondtoestandsmodel wordt gebruikt als referentie voor het opbouwen van ligandgebonden toestand, is het van cruciaal belang om een nauwkeurig grondtoestandsmodel op te bouwen, inclusief alle oplosmiddel- en watermoleculen, voorafgaand aan de analyse van de gehele fragmentscreeningcampagne. In deze stap worden de honderdste datasets met de hoogste resolutie die door PanDDA zijn gemarkeerd als niet interessant (en dus waarschijnlijk ligandvrij) gebruikt om de gemiddelde kaart van de grondtoestand te genereren, terwijl de dataset met de laagsteR-vrij wordt geselecteerd voor de verfijning. De grondtoestandsgemiddelde kaart is geen kristallografische kaart, maar het is belangrijk om deze kaart alleen te gebruiken voor het bouwen van het grondtoestandsmodel.
    1. Open het tabblad PanDDA's en werk indien nodig tabellen bij vanuit de gegevensbron.
    2. Definieer de uitvoermap (/dls/labxchem/data/year/visit/processing/analysis/panddas).
    3. Selecteer Pre-run voor Ground State Model en klik op Uitvoeren.
      OPMERKING: Gegevenssets met hoge Rfree en onverwachte ruimtegroepen moeten automatisch worden uitgesloten van de analyse.
    4. Als u gegevenssets met hoge Rfree en onverwachte ruimtegroepen handmatig wilt uitsluiten, selecteert u Volledig negeren.
    5. Controleer de status van de pre-run taak met behulp van qstat in een terminalvenster.
    6. Als u klaar bent, selecteert u Grondstatusmodel bouwen en klikt u op Uitvoeren.
      OPMERKING: Dit opent Meerkoet met de PanDDA-gemiddelde kaart en een referentiemodel/2Fo-Fc/Fo-Fc-kaarten van de beste kwaliteit dataset voor hermodellering en verfijning met behulp van Coot. Het is van het grootste belang dat alleen de PanDDA-gemiddelde kaart wordt gebruikt voor modellering.
  5. Treffers identificeren met PanDDA26
    1. PanDDA-analyse
      OPMERKING: Het kan enige tijd duren om op het cluster te worden uitgevoerd als er veel gegevenssets zijn, de eenheidscel groot is en er meerdere kopieën van het eiwit in de asymmetrische eenheid zijn.
      1. Herhaal de eerder beschreven stappen voor Analyseer DLS-resultaten voor automatische verwerking en Initiële kaartberekening. Gebruik voor de kaartberekening het grondtoestandsmodel als referentie: Vernieuw de lijst met referentiebestanden > stel een nieuwe referentie in en genereer indien nodig ligandbeperkingen voor de nieuwe gegevens (stappen 6.1-6.3).
      2. Zorg ervoor dat op het tabblad PanDDA's de uitvoermap is ingesteld zoals voorheen en voer pandda.analyse uit vanuit het vervolgkeuzemenu Hitidentificatie .
      3. Controleer de status van de taak in de Linux-terminal met behulp van de opdracht qstat.
    2. PanDDA inspecteren - controleren/bouwen van bindingsgebeurtenissen
      1. Voer onder het tabblad PanDDA's in XCE pandda.inspect uit vanuit het vervolgkeuzemenu Hitidentificatie om Meerkoet42 te openen met het PanDDA-configuratiescherm.
        OPMERKING: Het configuratiescherm pandda.inspect biedt een samenvatting van PanDDA-statistieken en stelt gebruikers in staat om door bindende gebeurtenissen/sites te navigeren. Er wordt ook een samenvattend HTML-bestand van de resultaten gegenereerd dat tijdens de inspectie kan worden bijgewerkt door HTML bijwerken te selecteren.
      2. Als u een ligand wilt modelleren, klikt u op Ligand samenvoegen met model en Model opslaan voordat u naar een andere gebeurtenis navigeert om te voorkomen dat wijzigingen in het bound-state-model verloren gaan.
        OPMERKING: Alleen modellen die zijn bijgewerkt en opgeslagen, worden geëxporteerd voor verfijning in een later stadium.
      3. Gebruik het veld Gebeurtenisopmerking om aantekeningen te maken bij de bindingsgebeurtenis en de Record Site Information om aantekeningen te maken bij bindingssites.
      4. Laad gemiddelde en 2mFo-DFc-kaarten (van DIMPLE) voor vergelijking met de gebeurteniskaart en het model.
        1. Zodra alle levensvatbare liganden zijn gemodelleerd, samengevoegd en opgeslagen op basis van de gebeurteniskaart, sluit u pandda.inspect.
    3. PanDDA-export en -verfijning
      OPMERKING: Na PanDDA worden inspectiemodellen terug geëxporteerd naar de projectdirectory en wordt een eerste verfijningsronde gestart. Er zijn momenteel twee beschikbare pijplijnen om dit te doen onder het tabblad PANDDA's in XCE.
      1. Export NEW/ALL/SELECTED PANDDA-modellen genereert een ensemble van de gebonden en niet-gebonden modellen voor verfijning en genereert parameters voor bezettingsbeperking voor Refmac43.
        OPMERKING: Het ensemblemodel zal worden gebruikt voor verfijning, maar alleen het bound-state model zal worden bijgewerkt in Meerkoet en gedeponeerd in het VOB. Deze pijplijn kan het best worden gebruikt voor datasets met fragmenten met een lage bezetting en significante veranderingen in het eiwitmodel.
      2. Verfijn NIEUW/ALLE bound-state modellen met BUSTER verfijnt de bound-state alleen met Buster44.
        OPMERKING: Dit kan het beste worden gebruikt met liganden/datasets met een hoge bezettingsgraad met minimale veranderingen in het eiwitmodel.
  6. Het verfijnen van de treffers (alle gegevenssets die zijn geselecteerd voor verfijning zijn nu zichtbaar op het tabblad Verfijning). Selecteer Open COOT - BUSTER Refinement of Open COOT - REFMAC Refinement in het vervolgkeuzemenu Refinement om Coot te openen met het XCE Refinement-configuratiescherm.
    1. Selecteer de status van de te verfijnen samples in de Select Samples drop down (meestal 3 - in verfijning) en klik op GO.
      OPMERKING: Het XCE-configuratiescherm biedt een overzicht van het aantal gegevenssets voor die categorie en maakt navigatie tussen gegevenssets mogelijk, terwijl het een samenvatting geeft van verfijningsstatistieken.
    2. Annoteer de ligandbetrouwbaarheid in het XCE-configuratiescherm: 0 - geen ligand aanwezig - Fragment is niet gebonden; 1 - Laag vertrouwen - Fragment is mogelijk gebonden, maar is niet bijzonder overtuigend; 2 - Correcte ligand, zwakke dichtheid - De gebruiker is ervan overtuigd dat het fragment is gebonden, maar het is een lage bezetting/er zijn enkele problemen met de kaarten; 3 - Duidelijke dichtheid, onverwachte ligand- Kaarten geven duidelijk ligandbinding aan die niet correleert met de opgegeven chemische structuur; 4 - Hoog vertrouwen - Ligand is ondubbelzinnig gebonden.
    3. Breng in dit stadium de nodige wijzigingen aan in het model en start verdere verfijning met behulp van de knop Verfijnen .
    4. Gebruik de knop MolProbity To-Do List weergeven om toegang te krijgen tot MolProbity45-analyse die wordt uitgevoerd op alle verfijningscycli.
    5. Voeg indien nodig verfijningsparameters toe, bijv. voor anisotrope temperatuurfactoren, gekoppelde gegevens of verfijning van de bezetting door de knop Verfijningsparameters te selecteren.
      OPMERKING: Statistieken over gegevensverwerking worden ook geleverd in XCE onder het tabblad Verfijning en als verfijning wordt uitgevoerd met de Buster-pijplijn, worden Buster-rapporten, inclusief MOGUL-analyse46, verstrekt.
    6. Wijzig de status van een gegevensset terwijl deze vordert door verfijning in zowel het hoofdvenster XCE onder het tabblad Verfijning als in het configuratiescherm van Coot XCE . Als u er zeker van bent dat het model nauwkeurig is rond de ligand en geschikt is om te worden gedeeld voor verdere analyse, wijzigt u de status in CompChem Ready. Wanneer de verfijning is voltooid en het model klaar is om te worden geüpload naar het VOB, wijzigt u de status in Gereed voor afzetting.

6. Deponeren van de gegevens

OPMERKING: Alle datasets van een fragmentenscherm en het grondtoestandsmodel dat wordt gebruikt om de PanDDA-gebeurteniskaarten te genereren, kunnen in het VOB worden gedeponeerd met behulp van groepsafzettingen.

  1. Converteer alle PanDDA-gebeurteniskaarten naar MTZ-indeling door Event Map ->SF uit te voeren vanuit het menu Hitidentificatie .
  2. Geef aanvullende metagegevens op, zoals auteurs en methoden, door Depositie > Bewerken van informatie te selecteren. Vul alle vereiste items in en klik op Opslaan in database en sla deze informatie vervolgens op voor depositie van het grondtoestandsmodel. Doe dit nadat de modelstatus is gewijzigd in Gereed voor afzetting.
  3. Selecteer op het tabblad Afzetting de knop MMCIF voorbereiden om mmcif-structuurfactor-mmcif-bestanden te genereren voor alle gegevenssets die gereed zijn voor afzetting . Het volgende bericht verschijnt in het terminalvenster wanneer dit is voltooid: Klaar met het voorbereiden van mmcif-bestanden voor wwPDB-depositie.
  4. Selecteer de knop Kopieer mmcif om al deze bestanden te kopiëren naar een enkel gezipt tar-archief in de Group Deposition Directory van het bezoek.
  5. Ga naar https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; Log in met gebruikersnaam: grouptester en wachtwoord: !2016rcsbpdb. Maak een sessie en upload het ligand-bound.tar.bz2-bestand vanuit de map voor groepsafzetting.
  6. Na het succesvol indienen van de ligandgebonden structuren wordt een e-mail verstuurd met de PDB-codes. Selecteer DB bijwerken met PDB-codes in het menu Deposition ; kopieer en plak de informatie uit deze e-mail in het pop-upvenster en klik op Database bijwerken om PDB-ID's toe te voegen.
  7. Om het grondtoestandsmodel dat door PanDDA wordt gebruikt te deponeren, selecteert u de relevante PanDDA-map in XCE en voert u apo->mmcif uit vanuit het menu Hitidentificatie .
    OPMERKING: XCE selecteert willekeurig een structuur met hoge resolutie en een lage Rfree als model voor de depositiebundel en compileert vervolgens alle mmcif-bestanden met structuurfactor in één bestand.
  8. Selecteer op het tabblad Afzetting de knop Toevoegen aan database onder de sectie Groepsafzetting van grondtoestandsmodel .
  9. Voer de metagegevens voor het grondtoestandsmodel in (opnieuw door Deposition > Edit Information te selecteren), laad het vorige bestand en sla op in database.
  10. Bereid het mmcif-bestand met de grondtoestand voor door mmcif voorbereiden uit te voeren vanuit de sectie Groepsafzetting van grondtoestandmodel en kopieer de mmcif naar de map Groepsafzetting door de knop mmcif kopiëren in dezelfde sectie te selecteren.
  11. Ga net als voorheen naar https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; Log in met gebruikersnaam: grouptester en wachtwoord: !2016rcsbpdb. Maak een sessie en upload het bestand ground_state_structures.tar.bz2 vanuit de map voor groepsafzetting.

Representative Results

De XChem-pijplijn voor het screenen van fragmenten door middel van röntgenkristallografie is uitgebreid gestroomlijnd, waardoor het door de wetenschappelijke gemeenschap kan worden overgenomen (figuur 5). Dit proces is gevalideerd op meer dan 150 screeningcampagnes met een hitpercentage variërend tussen 1% en 30%47,48,49,50,51,52 en door veel terugkerende gebruikers. Kristalsystemen die niet geschikt zijn (lage resolutie, inconsistent in kristallisatie of in diffractiekwaliteit) of die DMSO of ethyleenglycol niet kunnen verdragen, worden vroeg in het proces geëlimineerd, wat tijd, moeite en middelen bespaart. Succesvolle campagnes bieden een driedimensionale kaart van potentiële interactieplaatsen op het doeleiwit; een typische uitkomst is de XChem-screening van de belangrijkste protease van SARS-CoV-2 (Figuur 6). Fragmenttreffers worden doorgaans aangetroffen in: (a) bekende interessante plaatsen, zoals enzymactieve plaatsen en subzakken48; b) vermeende allosterische plaatsen, bijvoorbeeld bij eiwit-eiwitinteracties53; c) kristalverpakkingsinterfaces, die over het algemeen als vals-positieven worden beschouwd (figuur 6). Deze structurele gegevens bieden over het algemeen een basis voor het samenvoegen, koppelen of laten groeien van fragmenttreffers tot loodachtige kleine moleculen 1,3.

Figure 1
Figuur 1: De XChem-pijplijn. Het platform wordt schematisch weergegeven vanaf het projectvoorstel tot en met de voorbereiding van monsters, het verzamelen van gegevens en het identificeren van treffers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Screeningsstrategie. De workflow geeft het doel van elke mijlpaal, de vereisten van het experiment en de beslissingspunten aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Workflow voor monstervoorbereiding. Kritieke stappen voor de monstervoorbereiding worden weergegeven met informatie van elke stap die wordt vastgelegd in een SQLite-database. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Data-analyse met behulp van XCE. Kritische stappen in de data-analyse worden weergegeven door een workflowdiagram met de relevante softwarepakketten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Evolutie van het XChem-gebruikersprogramma: De grafiek toont de acceptatie en consolidatie van het gebruikersprogramma van 2015 tot en met 2019 met de oprichting van BAG's in 2019 en de veerkracht van het platform tijdens de COVID-19-pandemie in 2020. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Representatieve resultaten van het XChem-fragmentscherm. SARS-CoV2-hoofdprotease (Mpro)-dimeer wordt weergegeven in het oppervlak met actieve site-hits weergegeven in geel, vermeende allosterische hits weergegeven in magenta en oppervlakte-/kristalverpakkingsartefacten weergegeven in groen. De figuur is gemaakt met behulp van Chimera en Mpro PDB-vermeldingen van groepsafzetting G_1002156. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het proces dat in dit artikel wordt beschreven, is uitgebreid getest door de gebruikersgemeenschap en het aanpassingsvermogen van de hier beschreven protocollen is essentieel voor het afhandelen van de grote verscheidenheid aan projecten die doorgaans op het platform worden aangetroffen. Er zijn echter een paar voorwaarden voor het kristalsysteem nodig.

Voor elke fragmentscreeningcampagne die wordt uitgevoerd met behulp van röntgenkristallografie, is een reproduceerbaar en robuust kristalsysteem van cruciaal belang. Aangezien het standaard XChem-protocol inhoudt dat het fragment rechtstreeks aan de kristaldruppel wordt toegevoegd, moet de optimalisatie zich richten op het aantal druppels dat kristallen van hoge kwaliteit bevat in plaats van op het totale aantal kristallen. Als druppels meerdere kristallen bevatten, zijn ze in feite overbodig, hoewel ze het oogstproces kunnen verlichten. Bovendien kan het een uitdaging zijn om het kristallisatieprotocol over te brengen van het thuisinstituut naar de faciliteiten ter plaatse. Dit wordt over het algemeen het best bereikt met behulp van kristalzaaien om reproduceerbare nucleatie te bevorderen54, en daarom is het een goede gewoonte voor gebruikers om zaadvoorraden samen met hun eiwit- en kristallisatieoplossingen te leveren.

Om een goede oplosbaarheid en ondersteuning van de verbinding te garanderen, worden de hoge inweekconcentraties die bedoeld zijn om de binding van zwakke fragmenten te stimuleren, fragmentbibliotheken geleverd in organische oplosmiddelen, met name DMSO en ethyleenglycol. Het aanbieden van twee verschillende oplosmiddelen biedt gebruikers een alternatief voor kristallen die DMSO helemaal niet verdragen, of waar het de binding van fragmenten op een interessante plaats verhindert. Gebruikers kunnen alternatieve bibliotheken in waterige buffer aanleveren: verbindingen zullen goed doseren op voorwaarde dat ze volledig zijn opgelost en geformatteerd in platen die compatibel zijn met de vloeistofdoseerrobot.

Voor projecten waarbij het niet mogelijk is een geschikt organisch oplosmiddel te vinden dat zowel de bibliotheek oplost als door het kristalsysteem wordt getolereerd, is een alternatieve procedure het gebruik van gedroogde verbindingen zoals vastgesteld in BESSY55.

In de gemeenschap is er een al lang bestaande vraag over het kunnen weken van verbindingen in kristallen die zijn gekweekt in kristallisatieomstandigheden met hoge zoutconcentraties. In de praktijk wordt meer neerslag van de verbindingen en snelle vorming van zoutkristallen waargenomen in de oogstfase, die wordt verminderd door een vochtige omgeving rond het oogstgebied aan te brengen. Over het algemeen geven screeningcampagnes in kristalsystemen van hoge zoutkristallisatieomstandigheden een vergelijkbaar trefferpercentage als omstandigheden met een laag zoutgehalte.

De eerste fasen van het XChem-proces (testen van de tolerantie van oplosmiddelen en pre-screen) zijn relatief kleinschalige en snelle experimenten, maar maken een duidelijke go/no go-beslissing voor het project mogelijk. Het meest pijnlijk is dat er alternatieve kristalsystemen moeten worden gevonden als geen van beide oplosmiddelen wordt getolereerd, of als de pre-screen resulteert in een zeer lage hitrate. Als ze daarentegen succesvol zijn, informeren de resultaten rechtstreeks de inweekconditie die moet worden gebruikt voor het screeningsexperiment en de beste strategie voor het verzamelen van gegevens. Aangezien de kwaliteit van de gegevens, met name de resolutie, van invloed zal zijn op de kwaliteit van de elektronendichtheid voor de identificatie en analyse van treffers, is het doel om te weken met de hoogst mogelijke concentratie van de verbinding die geen schadelijk effect heeft op de diffractiekwaliteit (waarbij de meeste datasets (~80%) diffracten tot een resolutie van 2,8 Å of beter).

Het data-analyseproces is gestroomlijnd binnen XChemExplorer, dat vertrouwt op de PanDDA-software voor de detectie van zwakke bindmiddelen en gebruikers in staat stelt om de resultaten van de screeningcampagne snel te visualiseren en te bekijken. XChemExplorer importeert gegevensverwerkingsresultaten van de pakketten die beschikbaar zijn bij Diamond (DIALS16, autoPROC 30, STARANISO31 en Xia214) met resolutielimieten die worden bepaald door de standaardmethode voor elk pakket (d.w.z.CC1/2 = 0,3). Standaard is de selectie van de gegevensset gebaseerd op een score die wordt berekend op basis van I/sigI, volledigheid en een aantal unieke reflecties, maar specifieke verwerkingsresultaten kunnen worden geselecteerd voor gebruik in het algemeen of voor individuele steekproeven25. Gegevens worden ook uitgesloten van analyse door PanDDA op basis van criteria zoals resolutie,R-vrij en verschil in eenheidscelvolume tussen referentie- en doelgegevens (standaardwaarden zijn respectievelijk 3,5 Å, 0,4 en 12%), zodat slecht diffracerende, verkeerd gecentreerde of verkeerd geïndexeerde kristallen de analyse niet beïnvloeden.

Het PanDDA-algoritme maakt gebruik van het aanzienlijke aantal datasets dat tijdens een fragmentcampagne is verzameld om liganden met gedeeltelijke bezetting te detecteren die niet zichtbaar zijn in standaard kristallografische kaarten. In eerste instantie gebruikt PanDDA gegevens die zijn verzameld tijdens de oplosmiddeltolerantietests en pre-screenstappen om een gemiddelde dichtheidskaart op te stellen die vervolgens wordt gebruikt om een grondtoestandsmodel te maken. Aangezien dit model zal worden gebruikt voor alle volgende analysestappen, is het van vitaal belang dat het het niet-geligandeerde eiwit nauwkeurig weergeeft onder de omstandigheden die worden gebruikt voor het fragmentscherm. PanDDA gebruikt vervolgens een statistische analyse om gebonden liganden te identificeren en genereert een gebeurteniskaart voor de gebonden toestand van het kristal. Een gebeurteniskaart wordt gegenereerd door de ongebonden fractie van het kristal af te trekken van de dataset voor gedeeltelijke bezetting en laat zien wat zou worden waargenomen als het ligand bij volledige bezetting zou worden gebonden. Zelfs fragmenten die duidelijk lijken in conventionele 2mFo-DF c-kaarten kunnen verkeerd worden gemodelleerd als de gebeurteniskaarten niet worden geraadpleegd32. Hoewel PanDDA een krachtige methode is voor het identificeren van datasets die afwijken van de gemiddelde kaarten (wat meestal een indicatie is van fragmentbinding) en statistieken zoals RSCC, RSZD, B-factorratio en RMSD tijdens verfijning worden verstrekt ten behoeve van de gebruiker, is de gebruiker uiteindelijk verantwoordelijk voor de beslissing of de waargenomen dichtheid nauwkeurig de verwachte ligand en de meest geschikte conformatie weergeeft.

Na data-analyse en verfijning is het voor alle gebruikers mogelijk om meerdere structuren tegelijkertijd in de Protein Data Bank (PDB) te deponeren met behulp van XChemExplorer. Voor elk fragmentscherm worden twee groepsdeposities gemaakt. De eerste afzetting bevat alle fragmentgebonden modellen, met coëfficiënten voor het berekenen van PanDDA-gebeurteniskaarten die zijn opgenomen in MMCIF-bestanden. De tweede afzetting levert het bijbehorende grondtoestandsmodel op, langs de gemeten structuurfactoren van alle datasets van het experiment: deze gegevens kunnen worden gebruikt om de PanDDA-analyse te reproduceren, en voor het ontwikkelen van toekomstige algoritmen. Wat betreft de structuren van de treffers, wanneer de fragmentbezetting laag is, gedraagt verfijning zich beter als de modellen een samenstelling zijn van de ligandgebonden en verstorende grondtoestandsstructuren32; Niettemin is het de gewoonte om alleen de breuken in gebonden toestand te deponeren, aangezien de volledige samengestelde modellen over het algemeen complex en moeilijk te interpreteren zijn. Als gevolg hiervan zijn sommige door het VOB herberekende kwaliteitsindicatoren (met name R/Rfree) soms iets verhoogd. Het is ook mogelijk om alle ruwe data aan te leveren met behulp van platforms zoals Zenodo56, hoewel dit momenteel niet wordt ondersteund door de XChem-pijplijn.

Over het algemeen konden sinds de werking ervan in 2016 fragmentliganden worden geïdentificeerd in meer dan 95% van de doelen met behulp van deze procedure. De ervaring van de vele projecten die XChem heeft ondersteund, werd gedistilleerd tot best practice voor kristalpreparatie33, terwijl een fragmentbibliotheek werd ontwikkeld die het evenwichtige concept implementeerde om de voortgang van fragmenten te ondersteunen29, en ook hielp bij het vestigen van de praktijk van het openbaar maken van bibliotheekcompositie. Het platform heeft het belang aangetoond van een goed onderhouden infrastructuur en gedocumenteerde processen, die hier worden beschreven, en heeft het mogelijk gemaakt om andere fragmentbibliotheken te evalueren57,58, bibliotheken te vergelijken48 en het ontwerp van de collaboratieve EUOpenscreen-DRIVE-bibliotheek 59,60 te informeren.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Acknowledgments

Dit werk vertegenwoordigt een grote gezamenlijke inspanning van de Diamond Light Source en het Structure Genomic Consortium. De auteurs willen de verschillende steungroepen en MX-groep van Diamond bedanken voor hun bijdrage aan de automatisering van de i04-1 beamline en voor het leveren van gestroomlijnde dataverzameling en automatische verwerkingspijplijnen, die gewoonlijk over alle MX-beamlines worden uitgevoerd. Ze willen ook de SGC PX-groep bedanken voor hun veerkracht als eerste gebruikers die de opstelling hebben getest en Evotec als de eerste serieuze industriële gebruiker. Dit werk werd ondersteund door iNEXT-Discovery (Grant 871037) gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Commissie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSI-poised library Enamine DSI-896 fragment library
Echo 550 and 650 series Beckman-Coulter acoustic dispensing system
Echo microplates Beckman-Coulter 001-12380; 001-8768; 001-6025 1536-well and 384-well microplates
Shifter Oxford Lab Technology harvesting device
Microplate centrifuge with a swing-out rotor Sigma model 11121 microplate centrifuge
3-drops crystallisation plates Swissci 3W96T-UVP Crystallisation plates
Formulatrix plate imager and Rockmaker software Formulatrix Crystallisation plates imaging device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: The impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
  2. Jacquemard, C., Kellenberger, E. A bright future for fragment-based drug discovery: what does it hold. Expert Opinion on Drug Discovery. 14 (5), 413-416 (2019).
  3. Jahnke, W., et al. Fragment-to-lead medicinal chemistry publications in 2019. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (24), 15494-15507 (2019).
  4. Li, Q. Application of fragment-based drug discovery to versatile targets. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 180 (2020).
  5. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (23), Basel, Switzerland. 4309 (2019).
  6. Patel, D., Bauman, J. D., Arnold, E. Advantages of crystallographic fragment screening: functional and mechanistic insights from a powerful platform for efficient drug discovery. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 92-100 (2014).
  7. Wasserman, S., et al. Automated synchrotron crystallography for drug discovery: the LRL-CAT beamline at the APS. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 67 (1), 46-47 (2011).
  8. Hartshorn, M. J. Fragment-based lead discovery using X-ray crystallography. Journal of Medicinal Chemistry. 48 (2), 403-413 (2005).
  9. Arzt, S., et al. Automation of macromolecular crystallography beamlines. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 89 (2), 124-152 (2005).
  10. Beteva, A. High-throughput sample handling and data collection at synchrotrons: Embedding the ESRF into the high-throughput gene-to-structure pipeline. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 62, Pt 10 1162-1169 (2006).
  11. Papp, G., et al. FlexED8: The first member of a fast and flexible sample-changer family for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 10 841-851 (2017).
  12. Casanas, A., et al. EIGER detector: Application in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 72, Pt 9 1036-1048 (2016).
  13. Henrich, B., et al. PILATUS: A single photon counting pixel detector for X-ray applications. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 607 (1), 247-249 (2009).
  14. Winter, G., Lobley, C. M. C., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 69, Pt 7 1260-1273 (2013).
  15. Winter, G., McAuley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
  16. Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 74, Pt 2 85-97 (2018).
  17. Bowler, M. W. MASSIF-1: A beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  18. Von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) - A beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27, Pt 3 844-851 (2020).
  19. Cipriani, F., et al. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68, Pt 10 1393-1399 (2012).
  20. Helmholtz Zentrum Berlin. , Available from: https://www.helmholtzberlin.de/forschung/oe/np/gmx/fragment-screening/index_en.html (2021).
  21. Lima, G. M. A., et al. FragMAX: the fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 76 (8), 771-777 (2020).
  22. Ng, J. T., Dekker, C., Kroemer, M., Osborne, M., Von Delft, F. Using textons to rank crystallization droplets by the likely presence of crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 70, Pt 10 2702-2718 (2014).
  23. Collins, P. M., et al. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 246-255 (2017).
  24. Wright, N. D., et al. The low-cost Shifter microscope stage transforms the speed and robustness of protein crystal harvesting. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 77, Pt 1 62-74 (2021).
  25. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 267-278 (2017).
  26. Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
  27. Fragalysis. , Available from: https://fragalysis.diamond.ac.uk (2021).
  28. Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Fragment-Screening.html (2021).
  29. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
  30. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, Pt 4 293-302 (2011).
  31. Vonrhein, C., et al. Advances in automated data analysis and processing within autoPROC , combined with improved characterisation, mitigation and visualisation of the anisotropy of diffraction limits using STARANISO. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 74 (1), 360 (2018).
  32. Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 265-266 (2017).
  33. Collins, P. M., et al. Achieving a good crystal system for crystallographic x-ray fragment screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
  34. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  35. Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., McAuley, K. E. SynchWeb: a modern interface for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 48, Pt 3 927-932 (2015).
  36. Ginn, H. M., et al. SynchLink: an iOS app for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 47, Pt 5 1781-1783 (2014).
  37. Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Data-Analysis/Reprocessing-in-ISPyB.html (2021).
  38. Wojdyr, M., Keegan, R., Winter, G., Ashton, A. DIMPLE - a pipeline for the rapid generation of difference maps from protein crystals with putatively bound ligands. Acta Crystallographica. Section A, Foundations of Crystallography. 69, 299 (2013).
  39. Global Phasing Limited. , Available from: http://www.globalphasing.com (2021).
  40. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 112-122 (2017).
  41. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 65, Pt 10 1074-1080 (2009).
  42. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  43. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 53, Pt 3 240-255 (1997).
  44. Bricogne, G., et al. Buster version 2.10.3. Global Phasing Ltd. , Cambridge, United Kingdom. (2017).
  45. Chen, V. B., et al. MolProbity: All-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 1 12-21 (2010).
  46. Bruno, I. J., et al. Retrieval of crystallographically-derived molecular geometry information. Journal of Chemical Information and Computer Sciences. 44 (6), 2133-2144 (2004).
  47. Delbart, F., et al. An allosteric binding site of the α7 nicotinic acetylcholine receptor revealed in a humanized acetylcholine-binding protein. TheJournal of Biological Chemistry. 293, 2534-2545 (2018).
  48. Douangamath, A., et al. Crystallographic and electrophilic fragment screening of the SARS-CoV-2 main protease. Nature Communications. 11 (1), 5047 (2020).
  49. Guo, J., et al. In crystallo-screening for discovery of human norovirus 3C-like protease inhibitors. Journal of Structural Biology: X. 4, 100031 (2020).
  50. Keedy, D. A., et al. An expanded allosteric network in PTP1B by multitemperature crystallography, fragment screening, and covalent tethering. eLife. 7, 36307 (2018).
  51. McIntyre, P. J., et al. Characterization of three druggable hot-spots in the aurora-a/tpx2 interaction using biochemical, biophysical, and fragment-based approaches. ACS Chemical Biology. 12 (11), 2906-2914 (2017).
  52. Thomas, S. E., et al. Structure-guided fragmentbased drug discovery at the synchrotron: Screening binding sites and correlations with hotspot mapping. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 377 (2147), 20180422 (2019).
  53. Nichols, C., et al. Mining the PDB for tractable cases where x-ray crystallography combined with fragment screens can be used to systematically design protein-protein inhibitors: Two test cases illustrated by IL1β-IL1R and p38α-TAB1 complexes. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (14), 7559-7568 (2020).
  54. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).
  55. Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally diverse compound libraries for crystallographic fragment screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
  56. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org (2021).
  57. Foley, D. J., et al. Synthesis and demonstration of the biological relevance of sp(3) -rich scaffolds distantly related to natural product frameworks. Chemistry. 23 (60), Weinheim an der Bergstrasse. Germany. 15227-15232 (2017).
  58. Kidd, S. L., et al. Demonstration of the utility of DOS-derived fragment libraries for rapid hit derivatisation in a multidirectional fashion. Chemical Science. 11 (39), 10792-10801 (2020).
  59. EU-openscreen ERIC. , Available from: https://www.eu-openscreen.eu/ (2021).
  60. Schuller, M., et al. Fragment binding to the Nsp3 macrodomain of SARS-CoV-2 identified through crystallographic screening and computational docking. bioRxiv. 393405, (2020).

Tags

Efficiënte fragmentscreening XChem-faciliteit diamantlichtbron op fragmenten gebaseerde ontdekking van geneesmiddelen eiwitkristallografie primaire screening initiële XChem-experimenten monstervoorbereiding fragmentbibliotheek I04-1 Beamline gegevensverzameling gegevensbeheer hitidentificatie grootschalige kristallografische fragmentscreening academische en industriële gebruikers peer-reviewed academisch gebruikersprogramma
Efficiënte fragmentscreening bereiken in de XChem-faciliteit bij Diamond Light Source
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Douangamath, A., Powell, A., Fearon, … More

Douangamath, A., Powell, A., Fearon, D., Collins, P. M., Talon, R., Krojer, T., Skyner, R., Brandao-Neto, J., Dunnett, L., Dias, A., Aimon, A., Pearce, N. M., Wild, C., Gorrie-Stone, T., von Delft, F. Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (171), e62414, doi:10.3791/62414 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter