Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Индукционная система органоидов сетчатки для получения 3D-тканей сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека

Published: April 12, 2021 doi: 10.3791/62435
Automatic Translation
*1, *1, 1
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China, 510060
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы описываем оптимизированную систему индукции органоидов сетчатки, которая подходит для различных линий плюрипотентных стволовых клеток человека для генерации тканей сетчатки с высокой воспроизводимостью и эффективностью.

Abstract

Дегенеративные заболевания сетчатки являются основными причинами необратимой слепоты без эффективного лечения. Плюрипотентные стволовые клетки, которые могут дифференцироваться во все типы клеток сетчатки, даже мини-ткани сетчатки, имеют огромные перспективы для пациентов с этими заболеваниями и многие возможности в моделировании заболеваний и скрининге лекарств. Однако процесс индукции от hPSCs к клеткам сетчатки сложен и занимает много времени. Здесь мы описываем оптимизированный протокол индукции сетчатки для генерации тканей сетчатки с высокой воспроизводимостью и эффективностью, подходящих для различных плюрипотентных стволовых клеток человека. Этот протокол выполняется без добавления ретиноевой кислоты, которая способствует обогащению колбоковых фоторецепторов. Преимуществом этого протокола является количественная оценка размера EB и плотности покрытия для значительного повышения эффективности и повторяемости индукции сетчатки. При этом методе все основные клетки сетчатки последовательно появляются и повторяют основные этапы развития сетчатки. Это облегчит последующие приложения, такие как моделирование заболеваний и клеточная терапия.

Introduction

Дегенеративные заболевания сетчатки (РД), такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и пигментный ретинит (РП), характеризуются дисфункцией и гибелью фоторецепторных клеток и обычно приводят к необратимой потере зрения без эффективных способовлечения 1. Механизм, лежащий в основе этих заболеваний, в значительной степени неизвестен частично из-за отсутствия моделей заболеваний человека2. За последние десятилетия были достигнуты значительные успехи в регенеративной медицине с помощью технологии стволовых клеток. Многие исследователи, включая нас самих, показали, что плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSCs), включая эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs), могут дифференцироваться во все типы клеток сетчатки, даже мини-ткани сетчатки с помощью различных подходов дифференцировки3,4,5,6,7,8,9,10, 11, обеспечивая огромный потенциал в моделировании заболеваний и клеточной терапии12,13,14.

Однако процесс индукции от hPSCs к клеткам сетчатки очень сложен и трудоемкий с низкой повторяемостью, что требует исследователей с богатым опытом и высокой квалификацией. В ходе сложного и динамического процесса индукции на выход тканей сетчатки будет влиять ряд факторов15,16,17. Кроме того, различные методы индукции часто значительно различаются по срокам и надежной экспрессии маркеров сетчатки, что может сбить с толку сбор образцов и интерпретацию данных3. Поэтому будет востребован простой протокол дифференциации сетчатки от гПСК с пошаговым руководством.

Здесь на основе наших опубликованных исследований18,19,20,21описан оптимизированный протокол индукции сетчатки для генерации органоидов сетчатки (РО) с богатыми конусными фоторецепторами из гПСК, который не требует добавки ретиноевой кислоты (РА). Этот протокол фокусируется на описании многоступенчатого метода генерации нейронной сетчатки и RPE. Образование ЭБ является неотъемлемой частью ранней индукционной стадии. Как размер, так и плотность покрытия ЭБ количественно оптимизированы, что научно повышает выход тканей сетчатки и способствует повторяемости. Во второй части индукции зрительные везикулы (ОВ) самоорганизуются в культуре адгезии и образуютСЯ РО в культуре суспензии; временные курсы и эффективность этой части значительно варьируются в разных линиях hPSC. Созревание и спецификация клеток сетчатки в РО в основном происходят на средней и поздней стадии индукции. Без добавления РА могут быть получены зрелые фоторецепторы как с богатыми колбочками, так и с палочками.

Цель этого протокола состоит в том, чтобы количественно описать и детализировать каждый шаг для неопытных исследователей. Различные линии hPSC были успешно индуцированы в РО этим протоколом с надежным выходом богатых конусами тканей сетчатки и высокой повторяемостью. РО, полученные из ГПСК с этим протоколом, могут резюмировать основные этапы развития сетчатки in vivoи выживать в долгосрочной перспективе, что облегчает последующие приложения, такие как моделирование заболеваний, скрининг лекарств и клеточная терапия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура и расширение хПСК

  1. Культура HPSC
    1. Покрытие двух скважин 6-скважинной пластины внеклеточным матриксом (ECM, hESC-qualified matrix). Приготовьте 50 мл раствора ECM, содержащего 8-12 мкг/мл ECM в модифицированной среде Орла Дульбекко (DMEM). В 49 мл DMEM добавьте 1 мл размороженный раствор ECM (50x). Добавьте 1 мл раствора ECM в каждую скважину 6-скважинной плиты. Инкубируют его в течение 1 ч в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
    2. Подготовьте среду для технического обслуживания hPSC (MM) в соответствии с инструкцией производителя.
    3. Предварительно прогреть ММ при комнатной температуре (RT) в течение 30 мин.
    4. Разморозить криогенный флакон с гПСК (hiPSCs или hESCs) (около 1 x 106)из резервуара с жидким азотом путем инкубации на водяной бане при 37 °C в течение 30 с.
    5. Выньте флакон и тщательно продезинфицируйте его, используя 75% дезинфицирующий спиртовой спрей. Поместите его в шкаф для биобезопасности.
    6. Перенесите клеточную суспензию из флакона в пробирку 15 мл, добавьте 5 мл предварительно нагретого ММ капля за каплей в трубку с помощью пипетки 5 мл. Тем временем осторожно встряхните трубку, чтобы смешать hPSCs.
    7. Центрифугировать трубку при 170 х г в течение 5 мин. Удалите большую часть супернатанта с помощью пипетки 1 мл осторожно и оставьте после себя около 50 мкл супернатанта, чтобы избежать потери клеток.
    8. Добавьте 1 мл ММ в трубку и повторно суспендируйте гранулу, осторожно пипеткой вверх и вниз один или два раза с помощью пипетки 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выживаемость отдельных клеток hPSCs низкая. Мелкоклеточные скопления с 3-5 клетками предпочтительны для поддержания роста гПСК в колониях.
    9. Удалите ECM из предварительно покрытых колодцев (этап 1.1.1), добавьте 1,5 мл ММ в каждую скважину, а затем распределите 0,5 мл клеточной суспензии на скважину.
    10. Осторожно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить гПСК, и поместите пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. Не перемещайте пластину в течение как минимум 24 ч, чтобы способствовать слипанию клеток.
    11. Меняйте ММ через день и проходите через гПСК, когда слияние достигло около 80%.
  2. Пропуск гПСК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание недифференцированного состояния в hPSCs имеет большое значение для дальнейших применений. В условиях адгезии hPSCs растут колониями с четко определенной границей. Клетки должны проходить, когда слияние hPSCs достигает около 80%.
    1. Понаблюдайте за клетками под микроскопом. Пометьте и механически удалите хорошо видимые дифференцированные клетки (<5%) перед прохождением.
    2. Подготовьте пластину с покрытием ECM, как описано на этапе 1.1.1.
    3. Предварительно нагретый MM и 1x фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) без Ca2+ и Mg2+ при RT.
    4. Предварительно нагрейте раствор ЭДТА 0,5 мМ (в 1x PBS) на водяной бане при 37 °C.
    5. Извлеките среду из культурального листа с помощью вакуум-аспирационной системы, добавьте 1 мл 1x PBS в каждую скважину для промывки клеток с помощью пипетки 1 мл и повторите дважды.
    6. Добавляют 1 мл раствора ЭДТА на скважину для диссоциации гПСК в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C и 5% CO2 в течение 5 мин. Не превышать рекомендуемое время инкубации во избежание диссоциации на одиночные клетки.
    7. Вынимаем пластинку и проверяем на отслоение клеток под микроскопом. Сливающиеся hPSCs ослабевают, и можно увидеть каждую границу клетки, но клетки не могут легко оторваться, мягко встряхнув клеточную пластину.
    8. Удалите раствор ЭДТА пипеткой 1 мл и добавьте 1 мл ММ, чтобы остановить диссоциацию. Аккуратно пипетку hPSCs один или два раза с помощью пипетки 1 мл, чтобы повторно суспендировать клетки. Нет необходимости в центрифуге для сбора клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если большинство клеток отрывается от пластины после инкубации с ЭДТА, клетки могут быть собраны центрифугой.
    9. Удалите ECM из предварительно покрытых колодцев (этап 1.2.2) и добавьте 1,5 мл ММ на скважину.
    10. Перенесите 150-200 мкл клеточных комков в каждую скважину. Как правило, hPSCs могут проходить в соотношении 1:6. Например, ячейки из одной скважины 6-скважинной плиты могут быть распределены по шести новым скважинам.
    11. Осторожно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить гПСК, и культивируйте гПСК в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение не менее 24 ч, не касаясь пластины.
    12. Меняйте ММ через день, как описано в шаге 1.1.

2. Дифференциация сетчатки от гПСК

ПРИМЕЧАНИЕ: Когда колонии достигают ~ 80% слияния(рисунок 1B),их можно направлять на дифференциацию в органоиды сетчатки в соответствии с протоколом, схематическим на рисунке 1A. Чтобы гарантировать, что hPSCs имеют высокое качество и хороший выход, регулярно оценивайте плюрипотентность с помощью молекулярных маркеров, таких как OCT4 или NANOG, используя IFC или QPCR. ГПСК следует выбрасывать, если дифференцированные клетки составляют более 5% от общего числа клеток. Проверьте наличие загрязнения микоплазмы с помощью комплекта для обнаружения микоплазмы в соответствии с инструкциями производителя. Используйте только микоплазменные гПСК, так как микоплазма может изменить дифференцированную способность hPSCs.

  1. Подготовка сред и реагентов
    1. Приготовьте нейронную индукционную среду (NIM), смешивая следующее: 500 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium/питательной смеси F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 мл 1% добавки N2, 0,5 мл 0,1% гепарина (2 мг/мл в 1x PBS) и 5 мл 1% MEM non-Essential Amino Acids (NEAA).
    2. Готовят среду дифференцировки сетчатки (RDM), содержащую 300 мл DMEM/F-12, 200 мл основного DMEM, 10 мл 2% добавки B27, 5 мл 1% антимикотика антибиотика и 5 мл 1% MEM NEAA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: И NIM, и RDM не фильтруются, но проводится тест на стерильность. Добавьте 1 мл среды и добавьте ее в посуду 35 мм и процеживайте в течение 3-7 дней в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Носитель может храниться при 4 °C и должен использоваться в течение 2 недель для обеспечения активности компонентов.
    3. Приготовьте 10 мМ Блеббистатина (1000x) в ДМСО. Добавьте 1,710 мкл ДМСО, растворив 5 мг Блеббистатина для получения 10 мМ запасного раствора (1000x), аликвоту при 10 мкл/пробирку и храните при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все среды и реагенты должны быть нагреты на RT в течение 30 минут перед использованием, если не указано иное.
  2. Формирование эмбриоидного тела (EB)
    1. На 0 день (D0) инициируют дифференциацию. Выньте одну скважину гПСК из 6-скважинной плиты, которая выросла до ~80% слияния. Соберите клетки с помощью раствора диссоциации ЭДТА, как описано на этапах 1.2.1-1.2.6.
    2. Удалите раствор ЭДТА, добавьте 1 мл ММ, содержащего 10 мкМ блеббистатина, чтобы остановить диссоциацию клеток, и соберите клетки пипеткой 1 мл. Размер клеточных скоплений является одним из ключевых факторов, влияющих на выход ЭБ. Приблизительно пять ячеек на сгусток предпочтительнее для получения нужного размера ЭБ на D5-D7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это ключевой шаг. Не пипетируйте клетки слишком много раз, так как EB-подобные агрегаты трудно сформировать из отдельных клеток hPSCs.
    3. Переложите клеточную суспензию (около 2х 10 6 ячеек) на 100 мм сверхнизкой насадки Чашки Петри и добавьте в чашку 9 мл ММ, содержащего 10 мкМ Блеббистатина.
    4. Осторожно встряхните блюдо дважды, чтобы равномерно распределить клетки, и поставьте блюдо в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
    5. На D1 после культивирования клеток в течение не менее 24 ч вынимаем посуду и наблюдайте за ней под микроскопом. К этому времени самопроизвольно образуется большое количество мелкоклеточных агрегатов(рисунок 1С).
    6. Приготовьте 12 мл смеси с ММ и НИМ в соотношении 3:1 (9 мл ММ и 3 мл НИМ) в пробирке 15 мл.
    7. Переложите клеточные культуры в центрифужную трубку 15 мл с пипеткой 10 мл перпендикулярно и добавьте в чашку 10 мл предварительно подогретой смеси.
    8. Центрифугируйте трубку при 60 х г в течение 3 мин, чтобы собрать агрегаты, удалите супернатант с помощью пипетки 5 мл и оставьте после себя около 500 мкл, чтобы избежать потери клеток.
    9. Добавить 2 мл смеси в пробирку и переложить суспензию в ту же посуду (этап 2.2.7).
    10. Аккуратно встряхните блюдо, чтобы равномерно распределить клеточные агрегаты, и поставьте блюдо обратно в инкубатор.
    11. На D2 приготовьте 12 мл новой смеси с ММ и НИМ в соотношении 1:1 (6 мл ММ и 6 мл НИМ) в пробирке 15 мл. Замените клеточную среду свежеприготовленной смесью, повторив этапы с 2.2.5 по 2.2.10.
    12. На D3 измените клеточную среду с 15 мл NIM, как описано выше. Культивьять клетки не менее 5 дней в условиях суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время D1 до D3 среда должна меняться каждый день, обеспечивая достаточное питание. Начиная с D3, NIM можно менять через день. Также ЭБ можно разделить на несколько блюд, чтобы обеспечить обильное питание.
  3. Засеять ЭБ
    ПРИМЕЧАНИЕ: На D5-D7 выберите подходящую временную точку для наложения ЭБ на посуду, покрытую ECM, в соответствии с размером ЭБ. ЭБ с приблизительным диаметром 200 мкм подходит для дифференцировки сетчатки. В общем, одна скважина гПСК в 6-скважинной плите может производить от 300 до 1000 ЭБ. Вариация выхода EB варьируется в зависимости от линий hPSC.
    1. На D4 приготовьте посуду с покрытием ECM для культуры приверженности EBs. Добавьте 5 мл ECM в каждую чашку для культивации тканей (обработанную поверхностью) и поместите их в инкубатор на ночь.
    2. На D5 удалите ECM из предварительно покрытой посуды и добавьте 10 мл предварительно разогретого NIM к каждому блюду.
    3. Вынимайте блюдо, содержащее ЭБ. Проверьте качество ЭБ под микроскопом и убедитесь, что они достаточно яркие и круглые по форме. Размер ЭБ составляет приблизительно 200 мкм в диаметре. Соберите все ЭБ в пробирку 15 мл. Переложите ЭБ из посуды в трубку 15 мл с пипеткой 5 мл. Дайте ЭБ успокоиться на 5 минут. Удалите большую часть супернатанта, оставив после себя около 2 мл среды.
    4. Распределите ЭБ по покрытой оболочке посуде, содержащей 10 мл NIM по капле, пипеткой 1 мл. Засеять ЭБ при плотности примерно 2-3 ЭБ насм2. Например, добавьте около 120-180 ЭБ в тарелку 100 мм. Чтобы приблизительно судить о числе EB, поместите одну каплю суспензии EB на крышку и подсчитайте количество EB под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность покрытия ЭБ является одним из ключевых факторов, влияющих на эффективность индукции сетчатки. Плотность также может быть отрегулирована каждой линией hPSC.
    5. Аккуратно встряхните посуду, равномерно распределив ЭБ. Поместите их в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте посуду в течение не менее 24 ч для усиления адгезии КЭБ.
  4. Индукция зрительных везикул (ОВ) и пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) в условиях адгезии
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как ЭБ посеяны на поверхности, покрытой ECM, у hPSCs могут развиваться OV-подобные структуры, которые можно наблюдать уже в D20 после дифференцировки. В этом протоколе специфические факторы роста или сигнальные молекулы не требуются для направления гПСК в судьбу сетчатки, за исключением добавления добавок N2 и B27 в средах.
    1. На D8-D9 снимите посуду и понаблюдайте за ЭБ под микроскопом. Все ЭБ будут прикреплены и разложены на посуде(рисунок 1D). Добавьте 10 мл свежего NIM к каждой 100-миллиметровой тарелке, содержащей 10 мл старой среды. Положите их обратно в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не удаляйте старую среду.
    2. На D12 измените половину среды с помощью NIM с помощью пипетки 10 мл. Храните культуру в инкубаторе.
    3. На D16 удалите все NIM из посуды с помощью вакуум-аспирационной системы. Добавьте 20 мл RDM к каждому блюду. Продолжайте культивировать в RDM и меняйте половину среды через день.
    4. Во время D10-D30 дважды в неделю наблюдают морфологические изменения клеток под микроскопом и оценивают эффективность дифференцировки сетчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с D10, домены глазного поля (EF) самоорганизуются в периферических зонах адгезивных ЭБ. OV-подобные структуры появляются между D20 и D25, постепенно выступают из тарелки и самостоятельно образуют оптическую чашку, которая окружена пигментированной RPE(рисунок 1E). ОВ можно легко распознать с помощью яркого, преломляемого и толстого кольца NR.
  5. Отсоезить и культивировать OVs и RPE в суспензии для получения органоидов сетчатки (РО)
    1. На D28-D35 большинство RV появляются в посуде. Используйте вольфрамовую иглу или иглу со шприцем 1 мл для механического отсоединения морфологически идентифицируемых ОВ вместе с соседним RPE. Культививику их в подвезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внешний вид и выход OVs и RPE сильно различаются в разных линиях hPSC. Таким образом, временная точка отсоединения OV и RPE является гибкой. Очевидные ОВ с соседним RPE могут быть отсоединены, а затем перемещены в чашку с низким уровнем прикрепления, содержащую RDM. Продолжайте культивировать остальные клетки до тех пор, пока все ОВ и RПЕ не будут подняты вверх.
    2. Поместите 50-60 ОВ в каждую 100-миллиметровую чашку для культуры с низким насадкой, содержащую 15 мл RDM для формирования РО(рисунок 1F).
    3. Меняйте RDM каждые 2-3 дня до D42, когда РО хорошо округлой формы.

3. Развитие и созревание сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе сыворотка необходима для поддержания роста и созревания РО для долгосрочной культуры.

  1. Ламинирование сетчатки и спецификация в РО
    1. Приготовьте 10 мл 100 мМ таурина (1000x) в 1x PBS. Взвесите 125 мг таурина и растворите в 10 мл 1x PBS. Отфильтруйте раствор шприцевым фильтром 0,22 мкм. Аликвота при 500 мкл/пробирка и хранение при -20 °C.
    2. Готовят культуральную среду сетчатки 1 (RC1). Смешайте следующие компоненты: 250 мл DMEM/F-12, 175 мл основного DMEM, 50 мл фетальной бычий сыворотки, 10 мл 2% добавки B27, 5 мл 1% антибиотического антимикотика, 5 мл 1% MEM NEAA, 0,5 мл 100 мкМ таурина и 5 мл 2 мМ L-аланил-L-глутамина.
    3. Готовят культуральную среду сетчатки 2 (RC2), содержащую 450 мл DMEM/F-12, 50 мл фетальной бычий сыворотки, 5 мл 1% добавки N2, 5 мл 1% антимикотика антибиотика, 0,5 мл 100 мкМ таурина, 5 мл 1% MEM NEAA и 5 мл 2 мМ Л-алнил-L-глутамина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: RC1 и RC2 не фильтруются, а проходят тест на стерильность. Выньте 1 мл среды, добавьте ее в посуду 35 мм и процедить в течение 3-7 дней в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2,чтобы обеспечить стерильность перед использованием. Среда может храниться при 4 °C и должна использоваться в течение 2 недель для обеспечения активности компонентов. Все среды и реагенты должны быть предварительно прогреты на RT в течение 30 мин перед использованием.
    4. На D42 переключите питательную среду с RDM на RC1.
    5. Наклоните посуду примерно на 30° и дайте РО отстояться на 30 с. Удалите старый RDM с пипеткой 10 мл, оставив после себя около 1 мл среды, чтобы избежать потери РО. Добавьте 15 мл свежего RC1 к каждому блюду.
    6. Аккуратно встряхните посуду, чтобы равномерно распределить РО. Поставьте посуду обратно в инкубатор. После этого меняйте всю среду два раза в неделю.
    7. Во время D50-D90 выбирайте высококачественные РО для долгосрочной культуры, которые имеют круглую форму с толстым и ярким NR. Поместите 30-40 РО в тарелку с низкой насадкой 100 мм с 20 мл RC1 и меняйте всю среду два раза в неделю.
    8. Для долгосрочной культуры суспензии RO, пипетка RO, чтобы избежать повторного крепления RO-RO с использованием пипетки. Перекладывать РО на блюда новой культуры раз в месяц, чтобы избежать прилипания РО к поверхности посуды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В условиях культуры суспензии РО имеют круглую форму, с ярким и толстым кольцом NR, прикрепленным с более или менее RPE с одной стороны. Ламинированная нервная сетчатка развивается, и подтипы клеток сетчатки последовательно появляются с первыми генерируемыми ганглиозными клетками сетчатки, за которыми следуют фоторецепторные клетки, амакриновые клетки и биполярные клетки.
  2. Созревание фоторецепторов человека с обогащением колбочих шишек в РО
    1. После D90 переключите среду с RC1 на RC2, которая подходит для созревания фоторецепторов.
    2. Измените среду, как описано в шагах 3.1.7-3.1.8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При этом условии культивируемости РО могут расти в долгосрочной перспективе(рисунок 1G),вплоть до D300. Клетки сетчатки в РО становятся зрелыми, и все клеточные подтипы нервной сетчатки, включая глиальные клетки Мюллера, палочки и колбочки, также приобретаются. Без какого-либо добавления РА, конусные фоторецепторы также богаты РО.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Процесс индукции сетчатки в этом протоколе имитирует развитие сетчатки плода человека. Чтобы инициировать дифференцировку сетчатки, hPSC были диссоциированы на небольшие сгустки и культивированы в суспензии, чтобы вызвать образование EBs. На D1 образуются однородные ячейки агрегатов или ЭБ(рисунок 1С). Культурная среда постепенно переходила в NIM. На D5 ЭБ были нанесены на посуду с покрытием ECM. Клетки постепенно мигрировали из ЭБ(рисунок 1D). От D10 глазные поля самоорганизуются в периферической зоне адгезивных ЭБ. На D16 индукционная среда была заменена RDM. Впоследствии NR-домены постепенно формировались, выступали из тарелки и самообразовывались OV-подобные структуры, окруженные ячейками RPE(рисунок 1E). Во время D28-D35 ОВ вместе с соседним RPE поднимались вверх острой иглой и культивировались в суспензии. В условиях культуры суспензии РО самообразовывались, включая нервную сетчатку (NR), прикрепленную с большей или меньшей сферой RPE с одной стороны(рисунок 1F),и могли выживать и созревать со временем, пока FBS были добавлены в среду.

По мере прогрессирования дифференцировки и спецификации сетчатки hPSCs последовательно продуцировали все основные подтипы клеток сетчатки. Подтипы нейронной сетчатки постепенно выстраивались в слои, имитируя архитектурные особенности нативной сетчатки человека(Рисунок 2А–G). Ганглиевые клетки сетчатки (RGC) были впервые получены из прародителей сетчатки и накоплены на базальной стороне НДР. Фоторецепторные клетки расположены на апикальной стороне, в то время как амакриновые клетки, горизонтальные клетки, биполярные клетки и глиальные клетки Мюллера расположены в промежуточном слое НДР.

С помощью этого протокола РО превратились в высокозрелые фоторецепторы как со стержнями, так и с колбочками(рисунок 2G-I). Фоторецепторы быстро увеличивались в развивающемся ядерном слое(рисунок 2G)после 8-й недели и постепенно созревались с 17-й недели. С 21 недели все подтипы фоторецепторов, включая палочки, красные / зеленые колбочки и синие колбочки, могут быть обнаружены в РО. Как богатые стержни, так и колбочки могут быть получены в этом протоколе индукции без какого-либо добавления РА на протяжении всего процесса дифференцировки.

Figure 1
Рисунок 1:Индукционные и морфологические особенности органоидов сетчатки из гПСК. (А)Схемы индукции сетчатки из гПСК. (B) Типичная колония hPSCs (10x). (C)ЭБ на D1 (4x). (D)На D7 позолоченные ЭБ были прикреплены и разложены на посуде (4x). (E) На D25 зрительные везикулоподобные структуры (ОВ) образовались и выступали из тарелки (обозначены красным кругом), окруженные пигментированной RPE (4x). (F)Органоиды сетчатки самоформировались после того, как ОВ поднимались вверх и культивировались в условиях суспензии (стрелки указывали на NR и RPE (4x). (G) Органоид сетчатки, включающий NR (красная стрелка) и RPE (черная стрелка) на D180 (4x). Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Подтипы клеток сетчатки последовательно обнаруживались в трехмерных тканях сетчатки. Пример изображений основных типов клеток сетчатки, экспрессировающих специфические маркеры иммунофлуоресцентным окрашиванием. (А-Б) Клетки-прародителя сетчатки экспрессировали Ki67(A)и VSX2(B). (C) Islet1 положительные ганглиоциты сетчатки, расположенные на базальной стороне нервной сетчатки. (D)Амакриновые клетки положительны для AP2α. (E)Глиальные клетки Мюллера положительны для SOX9. (F)PKCα положительные биполярные клетки. (G) Восстановление положительных фоторецепторных клеток. (H)Родопсин положительные палочковые фоторецепторы. (I)L/M-опсин положительные колбочные фоторецепторы. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом многоступенчатом протоколе индукции сетчатки hPSCs руководствовались шаг за шагом, чтобы получить судьбу сетчатки, и самоорганизовывались в органоиды сетчатки, содержащие ламинированные NR и RPE. Во время дифференцировки hPSCs рекапитулировали все основные этапы развития сетчатки человека in vivo,от EF, OV и RPE до ламинирования сетчатки, генерируя все подтипы клеток сетчатки, включая ганглиозные клетки сетчатки, амакриновые клетки, биполярные клетки, палочковые и конусные фоторецепторы и глиальные клетки Мюллера в пространственном и временном порядке. Рекапитуляция развития сетчатки принесет пользу последующим приложениям, таким как моделирование заболеваний сетчатки.

Было установлено несколько протоколов для генерации органоидов сетчатки из hPSCs3,4,5,6,7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,19,20 . В соответствии с условиями культивированности протоколы могут быть классифицированы на 2D, 3D, а комбинации 2D и 3D подходов9,13. 2D подходы6,10,22 означают, что весь процесс индукции происходит в условиях адгезивной культуры, генерируя клетки сетчатки без архитектуры из гПСК. Напротив, 3D-подходы7,11,23 означают, что весь процесс индукции происходит в условиях суспензионной культуры, в результате получается организованные ткани сетчатки. Например, Sasai, Y. et al.7,24 сообщили о методе SFEBq (сывороточная свободно плавающая культура эмбриоидных телеподобных агрегатов с быстрой реагрегацией), чтобы направлять ЭСК для дифференциации в оптические чашки в культуре суспензии. Используя многоступенчатые 3D-подходы8,11,18,20,25, включая этот протокол, hPSCs были индуцированы к судьбам сетчатки и органоидам как в условиях адгезивной, так и в условиях суспензионной культуры.

Чтобы индуцировать hPSCs к судьбе нервной сетчатки, во многих протоколах к среде был добавлен ряд экзогенных факторов. Например, Lamba et al.26 добавили комбинацию ноггина (ингибитор пути BMP) и Dickkopf-1 (dkk1, антагонист сигнального пути Wnt/β-катенина) и инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), чтобы направить ESCs к передней нервной судьбе. Osakada et al.6 добавили DAPT (ингибитор сигнальных путей Notch) и лево-правый фактор определения A (ингибитор сигнальных путей WNT) для получения предшественников палочковых и конусных фоторецепторов. Kuwahara et al.27 и Capowski et al.3 добавили BMP4 для краткого раннего воздействия культуры hPSCs для улучшения производства OV. Напротив, этот оптимизированный протокол индукции сетчатки прост и недорог, не требуя внешних модуляторов сигнализации, за исключением базовой добавки N2 и B27.

Ретиноевая кислота (РА) играет важную роль в развитии сетчатки и определении фоторецепторов28,29,30. Большинство протоколов были разработаны с добавкой РА (0,5-1 мкМ) в определенные периоды. Наши исследования показали, что слишком высокая концентрация РА или слишком длительный период лечения РА приводят к богатым палочками фоторецепторам, но ингибируют дифференцировку конуса8,18. Однако в этом оптимизированном протоколе РА не добавляется в культуральную жиму на протяжении всего процесса дифференцировки18,способствуя производству колбочных фоторецепторов, которые отвечают за дневное зрение и цветовое зрение человека и необходимы для клеточной замены лечения RD. Хотя некоторые исследования показывают, что передача сигналов гормонов щитовидной железы направляет подтипы колбочек у мышей и сетчатки человека31,32,регулятор для конусной приверженности все еще неясен33. В этих исследованиях от Kim et al.34 и Lowe et al.35долгосрочная культура также без какой-либо экзогенной ретиноевой кислоты генерировала богатые конусами органоиды сетчатки, что согласуется с этим оптимизированным протоколом.

Ключевыми моментами этого протокола, которые необходимо понять, являются изготовление высококачественных ЭБ и надлежащее засева ЭБ. Клетки быстро растут во время ранней культуры суспензии EB. Среду следует менять каждый день и быть достаточной, чтобы обеспечить обильное питание. Размер ЭБ, приблизительно 200 мкм в диаметре, подходит для дифференцировки сетчатки. Плотность покрытия ЭБ при 2-3 ЭБ насм2 подходит для большинства линий hPSC. Лучшим преимуществом этого оптимизированного протокола является количественная оценка размера EB и плотности покрытия для значительного повышения эффективности и повторяемости индукции сетчатки. Мы четко описали все этапы в деталях, что во многом помогает неопытным исследователям выучить и повторить индукцию сетчатки.

Кроме того, эффективность индукции сетчатки во многом зависит от качества и дифференциации потенции гПСК36,37. Различные hPSC имеют разную эффективность. Некоторые линии hPSC действительно имеют низкую эффективность, что может быть связано с методами перепрограммирования, соматическими клетками и так далее. Было подтверждено, что этот протокол подходит для различных hPSCs для получения 3D-органоидов сетчатки и RPE, включая различные hESCs и hiPSCs, перепрограммированные из фибробластов, крови и клеток мочи18,20,21. В общем, с помощью этого протокола, описанного выше, одна скважина hPSCs (около 80% слияния) в 6-скважинной плите может генерировать около 1000 ЭБ, давая примерно 200 РО. Таким образом, этот протокол с высокой эффективностью подходит для крупномасштабного производства органоидов сетчатки и приносит пользу последующим применениям, включая базовое и трансляционные исследования.

Таким образом, оптимизированный протокол индукции сетчатки прост и недорог с высокой повторяемостью и эффективностью, предлагает многообещающие персонализированные модели заболеваний сетчатки и обеспечивает обильный источник клеток для клеточной терапии, скрининга лекарств и теста генной терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Сюфэн Чжун является патентным изобретателем, связанным с генерацией клеток сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Фондом научно-технического проекта Гуанчжоу (201803010078), Научно-техническим проектом провинции Гуандун (2017B020230003), Фондом естественных наук (NSF) Китая (81570874, 81970842), программой талантов Сотни Университета Сунь Ятсена (PT1001010) и Фондами фундаментальных исследований Государственной ключевой лаборатории офтальмологии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(−)-Blebbistatin Sigma B0560-5mg ROCK-inhibitor
1 ml tips Kirgen KG1313 1 ml
10 ml pipette Sorfa 3141001 Pipette
100 mm Tissue culture BIOFIL TCD000100 100 mm Petri dish
100 mm Tissue culture Falcon 353003 100 mm Petri dish
15 ml Centrifuge tubes BIOFIL CFT011150 Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishes Falcon 353001 35 mm Petri dish
5 ml pipette Sorfa 313000 Pipette
50 ml Centrifuge tubes BIOFIL CFT011500 Centrifuge tubes
6 wells tissue culture plates Costar 3516 Culture plates
Anti-AP2α Antibody DSHB 3b5 Primary antibody
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X Gibco 15240062 Antibiotic-Antimycotic
Anti-ISL1 Antibody Boster BM4446 Primary antibody
Anti-Ki67 Antibody Abcam ab15580 Primary antibody
Anti-L/M opsin Antibody gift from Dr. jeremy / Primary antibody
Anti-PAX6 Antibody DSHB pax6 Primary antibody
Anti-rabbit 555 Invitrogen A31572 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin Antibody Millipore ab5585 Primary antibody
Anti-Rhodopsin Antibody Abcam ab5417 Primary antibody
Anti-sheep 555 Invitrogen A21436 Donkey anti-Sheep IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 Antibody Abclonal A19710 Primary antibody
Anti-VSX2 Antibody Millipore ab9016 Primary antibody
B-27 supplement W/O VIT A (50X) Gibco 12587010 Supplement
Cryotube vial Thermo scientific-NUNC 375418 1.8 ml
DAPI DOJINDO D532 4',6-Diamidino-2-phenylindole
dihydrochloride; multiple suppliers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max Sigma D2650-100ML Multiple suppliers
DMEM Gibco C11995500BT Medium
DMEM /F12 Gibco C11330500BT Medium
EDTA Invitrogen 15575-020 0.5 M PH 8.0
FBS NATOCOR SFBE Serum
Filter Millipore SLGP033RB 0.22μm, sterile Millex filter
GlutaMax, 100X Gibco 35050061 L-alanyl-L-glutamine
Heparin Sigma H3149 2 mg/ml in PBS to use
Matrigel, 100x Corning 354277 Extracellular matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140050 MEM NEAA
mTeSR1 STEM CELL 85850 hPSCs maintenance medium (MM)
N2 supplement Gibco 17502048 Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer GNM GNM10010 Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
Taurine Sigma T0625 Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment Corning CLS3262-20EA Petri dish

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  2. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  3. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  4. Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
  5. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  6. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
  7. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  8. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
  9. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  10. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
  13. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  14. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  15. Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
  16. Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
  17. Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
  18. Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
  19. Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
  20. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  21. Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
  22. Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
  23. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
  24. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  25. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  26. Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
  28. da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
  29. Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
  30. Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
  31. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  32. Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
  33. Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
  34. Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  35. Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
  36. Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
  37. DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).

Tags

Медицина выпуск 170
Индукционная система органоидов сетчатки для получения 3D-тканей сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guan, Y., Xie, B., Zhong, X. Retinal … More

Guan, Y., Xie, B., Zhong, X. Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (170), e62435, doi:10.3791/62435 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter