Здесь мы описываем оптимизированную систему индукции органоидов сетчатки, которая подходит для различных линий плюрипотентных стволовых клеток человека для генерации тканей сетчатки с высокой воспроизводимостью и эффективностью.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Индукционная система органоидов сетчатки для получения 3D-тканей сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Дегенеративные заболевания сетчатки являются основными причинами необратимой слепоты без эффективного лечения. Плюрипотентные стволовые клетки, которые могут дифференцироваться во все типы клеток сетчатки, даже мини-ткани сетчатки, имеют огромные перспективы для пациентов с этими заболеваниями и многие возможности в моделировании заболеваний и скрининге лекарств. Однако процесс индукции от hPSCs к клеткам сетчатки сложен и занимает много времени. Здесь мы описываем оптимизированный протокол индукции сетчатки для генерации тканей сетчатки с высокой воспроизводимостью и эффективностью, подходящих для различных плюрипотентных стволовых клеток человека. Этот протокол выполняется без добавления ретиноевой кислоты, которая способствует обогащению колбоковых фоторецепторов. Преимуществом этого протокола является количественная оценка размера EB и плотности покрытия для значительного повышения эффективности и повторяемости индукции сетчатки. При этом методе все основные клетки сетчатки последовательно появляются и повторяют основные этапы развития сетчатки. Это облегчит последующие приложения, такие как моделирование заболеваний и клеточная терапия.
Введение
Дегенеративные заболевания сетчатки (РД), такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и пигментный ретинит (РП), характеризуются дисфункцией и гибелью фоторецепторных клеток и обычно приводят к необратимой потере зрения без эффективных способовлечения 1. Механизм, лежащий в основе этих заболеваний, в значительной степени неизвестен частично из-за отсутствия моделей заболеваний человека2. За последние десятилетия были достигнуты значительные успехи в регенеративной медицине с помощью технологии стволовых клеток. Многие исследователи, включая нас самих, показали, что плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSCs), ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура и расширение хПСК
- Культура HPSC
- Покрытие двух скважин 6-скважинной пластины внеклеточным матриксом (ECM, hESC-qualified matrix). Приготовьте 50 мл раствора ECM, содержащего 8-12 мкг/мл ECM в модифицированной среде Орла Дульбекко (DMEM). В 49 мл DMEM добавьте 1 мл размороженный раствор ECM (50x). Добавьте 1 мл раствора ECM в каждую скважину 6-скважинной плиты. Инкубируют его в течение 1 ч в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
- Подготовьте среду для технического обслуживания hPSC (MM) в соответствии с инструкцией производителя.
- Предварительно прогреть ММ при комнатной температуре (RT) в течение ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Процесс индукции сетчатки в этом протоколе имитирует развитие сетчатки плода человека. Чтобы инициировать дифференцировку сетчатки, hPSC были диссоциированы на небольшие сгустки и культивированы в суспензии, чтобы вызвать образование EBs. На D1 образуются однородные ячейки агрегатов или ЭБ(рисунок 1С). Культурная среда постепенно переходила в NIM. На D5 ЭБ были нанесены на посуду с покрытием ECM. Клетки постепенно мигрировали из ЭБ(рисунок 1D). От D10 глазные по.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом многоступенчатом протоколе индукции сетчатки hPSCs руководствовались шаг за шагом, чтобы получить судьбу сетчатки, и самоорганизовывались в органоиды сетчатки, содержащие ламинированные NR и RPE. Во время дифференцировки hPSCs рекапитулировали все основные этапы развития сетчатки человека in vivo,от EF, OV и RPE до ламинирования сетчатки, генерируя все подтипы клеток сетчатки, включая ганглиозные клетки сетчатки, амакриновые клетки, биполярные клетки, палочковые и конусные фоторецепторы и глиальные клетки.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Сюфэн Чжун является патентным изобретателем, связанным с генерацией клеток сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Фондом научно-технического проекта Гуанчжоу (201803010078), Научно-техническим проектом провинции Гуандун (2017B020230003), Фондом естественных наук (NSF) Китая (81570874, 81970842), программой талантов Сотни Университета Сунь Ятсена (PT1001010) и Фондами фундаментальных исследований Государственной ключевой лаборатории офтальмологии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| (&минус;)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-ингибитор |
| 1 мл наконечники | Kirgen | KG1313 | 1 мл |
| 10 мл пипетка | Sorfa | 3141001 | пипетка |
| 100 мм Тканевая культура | BIOFIL | TCD000100 | 100 мм Чашка Петри 100 |
| мм Тканевая культура | Falcon | 353003 | 100 мм Чашка Петри |
| 15 мл Центрифуга | BIOFIL | CFT011150 | Центрифужные пробирки |
| 35 мм Чашки для тканевых культур | Falcon | 353001 | 35 мм Чашка Петри |
| 5 мл Пипетка | Sorfa | 313000 | Пипетка |
| 50 мл Центрифужные пробирки | BIOFIL | CFT011500 | Центрифужные пробирки |
| 6 лунок для тканевых культуральных планшетов | Costar | 3516 | Культуральные планшеты |
| Anti-AP2α Антитела | DSHB | 3b5 | Первичные антитело |
| АНТИБИОТИК АНТИМИКОТИК 100X | Gibco | 15240062 | Антибиотик-антимикотик |
| Anti-ISL1 антитело | Boster | BM4446 | Первичный антитело |
| Anti-Ki67 Антитело | Abcam | ab15580 | Первичный антитела |
| Anti-L/M опсин Антитела | подарок от доктора Джереми | / | Первичный антитело |
| Anti-PAX6 Антитело | DSHB | pax6 | Primary антитело |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Вторичное антитело, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Антитело | Millipore | ab5585 | Primary антитела |
| Антитела к родопсину | Abcam | ab5417 | Первичный антитело |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) вторичное антитело, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 антитело | Abclonal | A19710 | Primary антитело |
| Anti-VSX2 | Millipore | ab9016 | Primary добавка антитела |
| B-27 без вит а (50X) | Gibco | 12587010 | Добавка |
| Криопробирка флакон | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1,8 мл |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид; множественные поставщики |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Множественные поставщики |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0,5 М PH 8,0 |
| FBS | Natocor | SFBE | |
| Фильтр | сыворотки Millipore | SLGP033RB | 0,22μ m, стерильный фильтр Millex |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-аланил-L-глутамин |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 мг/мл в PBS для использования |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | внеклеточный матрикс (ECM) |
| MEM раствор заменимых аминокислот (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | СТВОЛОВАЯ КЛЕТКА | 85850 | hPSCs поддерживающая среда (MM) |
| N2 добавка | Gibco | 17502048 | добавка |
| фосфатно-солевой буфер (PBS) | GNM | GNM10010 | без Ca+,Mg+,PH7.2± 0,1 0,1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Добавка |
| Чашки для культуры со сверхнизкой нагрузкой 100 мм чашка Петри, чашка Петри с низкой нагрузкой | Corning | CLS3262-20EA |
Ссылки
- Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
