Summary
Este protocolo descreve a coleta de valvas aórticas humanas extraídas durante procedimentos cirúrgicos de substituição valvar aórtica ou de tecido cadavérico e o subsequente isolamento, expansão e caracterização de células endoteliais e intersticiais valvares primárias específicas do paciente. Estão incluídos detalhes importantes sobre os processos necessários para garantir a viabilidade celular e a especificidade do fenótipo.
Abstract
A valvopatia aórtica calcifica (CAVD) está presente em quase um terço da população idosa. O espessamento, o enrijecimento e a calcificação da válvula aórtica causam estenose aórtica e contribuem para a insuficiência cardíaca e o acidente vascular cerebral. A patogênese da doença é multifatorial, e estresses como inflamação, remodelamento da matriz extracelular, fluxo turbulento e estresse mecânico e deformação contribuem para a diferenciação osteogênica das células endoteliais e intersticiais valvares. No entanto, os fatores iniciais precisos que impulsionam a transição osteogênica de uma célula saudável para uma célula calcificante não estão totalmente definidos. Além disso, a única terapia atual para estenose aórtica induzida por CAVD é a substituição da válvula aórtica, pela qual a válvula nativa é removida (substituição cirúrgica da válvula aórtica, SAVR) ou uma válvula de substituição totalmente dobrável é inserida através de um cateter (substituição da válvula aórtica transcateter, TAVR). Esses procedimentos cirúrgicos têm um alto custo e com sérios riscos; portanto, a identificação de novos alvos terapêuticos para a descoberta de medicamentos é imperativa. Para esse fim, o presente estudo desenvolve um fluxo de trabalho em que tecidos removidos cirurgicamente de pacientes e tecidos de cadáveres de doadores são usados para criar linhas primárias específicas do paciente de células valvares para modelagem de doenças in vitro. Este protocolo introduz a utilização de uma solução de armazenamento a frio, comumente utilizada no transplante de órgãos, para reduzir os danos causados pelo tempo de captação muitas vezes longo entre a excisão do tecido e o processamento laboratorial, com o benefício de estabilizar grandemente as células do tecido excisado. Os resultados do presente estudo demonstram que as células valvares isoladas retêm sua capacidade proliferativa e fenótipos endoteliais e intersticiais em cultura mais de vários dias após a retirada valvar do doador. O uso desses materiais permite a coleta de células de controle e CARD, a partir das quais as linhagens celulares de controle e doença são estabelecidas.
Introduction
A valvopatia aórtica calcifica (CAVD) é uma patologia crônica caracterizada por inflamação, fibrose e macrocalcificação dos folhetos valvares aórticos. O remodelamento progressivo e a calcificação dos folhetos (denominada esclerose aórtica) podem levar à obstrução do fluxo sanguíneo (estenose aórtica), o que contribui para o acidente vascular cerebral e leva à insuficiência cardíaca. Atualmente, o único tratamento para CAVD é a substituição cirúrgica ou transcateter da valva aórtica (SAVR e TAVR, respectivamente). Não há opção não cirúrgica para interromper ou reverter a progressão da DAV, e sem a troca valvar, as taxas de mortalidade se aproximam de 50% dentro de 2-3 anos 1,2,3. Definir os mecanismos subjacentes que impulsionam esta patologia identificará potenciais novas abordagens terapêuticas.
Em um adulto saudável, os folhetos valvares aórticos têm aproximadamente um milímetro de espessura, e sua principal função é manter o fluxo unidirecional de sangue para fora do ventrículo esquerdo4. Cada um dos três folhetos é composto por uma camada de células endoteliais da válvula (VECs) que reveste a superfície externa do folheto e funciona como uma barreira. Os VECs mantêm a homeostase valvar regulando a permeabilidade, a adesão das células inflamatórias e a sinalização parácrina 5,6,7. As células intersticiais valvares (VICs) compreendem a maioria das células dentro do folheto valvar8. Os VICs estão dispostos em três camadas distintas no folheto. Essas camadas são conhecidas como ventricular, espongiosa e fibrosa9. O ventricular está voltado para o ventrículo esquerdo e contém fibras de colágeno e elastina. A camada intermediária, a espongiosa, contém alto teor de proteoglicanos que proporciona flexibilidade de cisalhamento durante o ciclo cardíaco. A camada externa de fibrosa está localizada próxima à superfície de saída no lado aórtico e é rica em colágeno fibrilar Tipo I e Tipo III, que fornecem força para manter a coaptação durante a diástole10,11,12. As VICs residem em estado quiescente, no entanto, fatores como inflamação, remodelamento da matriz extracelular (MEC) e estresse mecânico podem interromper a homeostase da CIV 8,9,13,14,15,16. Com a perda da homeostase, os VICs ativam e adquirem um fenótipo semelhante ao miofibroblasto capaz de proliferação, contração e secreção de proteínas que remodelam o milieu extracelular17. VICs ativadas podem fazer a transição para células calcificantes que lembram a diferenciação de uma célula-tronco mesenquimal (CTM) em um osteoblasto 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
A calcificação parece iniciar-se na camada fibrosa rica em colágeno a partir de contribuições de VECs e VICs, mas se expande e invade as demais camadas do folheto8. Assim, fica claro que tanto os VECs quanto os VICs respondem a estímulos para regular positivamente a expressão de genes osteogênicos, no entanto, os eventos precisos que impulsionam a ativação de genes osteogênicos, bem como a complexa interação entre as células e a matriz extracelular do folheto, permanecem mal definidos. Os modelos murinos não são uma fonte ideal para estudar os fatores não genéticos da patogênese da DACD, pois camundongos não desenvolvem CAVD de novo26,27, portanto, o uso de tecidos humanos primários e das linhagens celulares primárias isoladas desses tecidos é necessário. Em particular, a obtenção dessas células em grande número e boa qualidade é imperativa, pois o campo das culturas de células 3D e modelagem organoide está se expandindo e provavelmente se tornará uma alternativa humana ex vivo aos modelos murinos.
O objetivo do presente método é compartilhar um fluxo de trabalho que estabeleceu as condições para isolar e cultivar de forma eficiente VECs e VICs obtidos de válvulas removidas cirurgicamente de doadores humanos. Estudos anteriores mostraram o isolamento bem-sucedido de VECs e VICs de válvulas suínas28 e murinas29, até onde sabemos, este é o primeiro a descrever o isolamento dessas células em tecidos humanos. O protocolo descrito aqui é aplicável a válvulas excisadas humanas e contorna e melhora grandemente os danos causados pelo tempo de colheita muitas vezes longo entre a excisão do tecido e o processamento laboratorial, introduzindo a utilização de uma solução de armazenamento a frio, uma solução tamponada clinicamente utilizada em transplantes de órgãos que estabiliza grandemente as células do tecido excisado. O protocolo aqui descrito também mostra como determinar o fenótipo celular e garantir alta eficiência da sobrevivência celular com o mínimo de contaminação cruzada celular.
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Protocol
Todas as amostras de pacientes são coletadas de indivíduos inscritos em estudos aprovados pelo conselho de revisão institucional da Universidade de Pittsburgh, de acordo com a Declaração de Helsinque. Os tecidos cadavéricos obtidos através do Centro de Recuperação e Educação de Órgãos (CORE) foram aprovados pelo Comitê de Supervisão de Pesquisa e Treinamento Clínico Envolvendo Decedentes da Universidade de Pittsburgh (CORID).
1. Homologação e segurança
- Obter a aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB) ou um memorando isento para qualquer coleta de amostras de pacientes ou tecidos cadavéricos de acordo com a Declaração de Helsinque.
- Faça o treinamento institucional necessário para trabalhar com tecidos humanos, como Treinamento de Patógenos Transmitidos pelo Sangue, Pesquisa de Sujeitos Humanos Biomédicos, Privacidade e Segurança da Informação e Transporte e Transporte de Materiais Biológicos.
2. Logística e preparação
- Amostras Cirúrgicas
- Certifique-se de que um refrigerador esteja disponível e localizado perto da sala de cirurgia. Mantenha 50 mL de tubos cônicos pré-rotulados com nomenclatura desidentificada contendo 40 mL de alíquotas estéreis de solução de armazenamento a frio neste refrigerador para uso pela equipe cirúrgica. Estes tubos mantêm-se estáveis a 4 °C até à data de validade na embalagem original.
- Após a extração, coloque o tecido da válvula nesses tubos. Coloque os tubos em um recipiente secundário selado, como um saco plástico à prova de vazamentos ou um recipiente de plástico rotulado com um rótulo de risco biológico. Os tecidos são captados e transportados no gelo de acordo com os protocolos institucionais para o transporte de riscos biológicos.
- Amostras cadavéricas
- Submergir órgãos recuperados em solução de armazenamento a frio, colocar em um recipiente de contenção secundário selado e transportá-los no gelo de acordo com protocolos institucionais para o transporte de riscos biológicos.
3. Preparação de reagentes
- Faça placas revestidas de colágeno pelo menos no dia anterior.
- Em um tubo cônico de 50 mL, misture 5 mL de álcool isopropílico, 8,7 mL de ácido acético e 0,5 μg de colágeno I em pó. Traga até 50 mL com água estéril. Misture e filtre através de um filtro de 0,45 μm.
- Sob um exaustor de cultura de células estéreis, adicione solução de colágeno suficiente a 6 pratos de poço e pratos de 10 cm para cobrir todo o fundo. Cubra a placa e deixe descansar por 4-6 h à temperatura ambiente. Remova o excesso de solução com uma pipeta estéril, coloque num novo tubo cónico estéril de 50 ml e guarde a 4 °C para fazer placas adicionais. A solução pode ser conservada a 4 °C durante vários meses.
- Secar as placas numa incubadora a 37 °C durante a noite e, subsequentemente, armazená-las num saco resselável a 4 °C. Pratos e pratos revestidos de colágeno podem ser armazenados por vários meses.
- Autoclave os seguintes itens: pinça de tecido, tesoura de tecido, cotonetes e compressas de gaze.
- Meios de crescimento VEC: Preparar e usar meio de crescimento de células endoteliais de acordo com os protocolos do fabricante. Conservar no escuro a 4 °C. Aqueça a 37 °C imediatamente antes do uso nas células, não deixe o meio em banho de aquecimento por mais tempo do que o necessário (10-15 min é suficiente). Use a mídia dentro de um mês após a preparação.
- Meios de crescimento VIC: Meio base DMEM suplementar (glicose de 4,5 g/L, suplemento de L-glutamina, piruvato de sódio 110 mg/L)30 com FBS inativado pelo calor a 10 % e 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Conservar no escuro a 4 °C durante um período máximo de 3 meses. Aqueça a 37 °C imediatamente antes do uso nas células, não deixe o meio em banho de aquecimento por mais tempo do que o necessário (10-15 min é suficiente).
- Faça a solução de enxágue estéril imediatamente antes do uso. Suplementar PBS estéril com fungicida de 2,5 μg/mL, gentamicina de 0,05 mg/mL e bactericida de 5 μg/mL.
- Faça uma solução estéril de colagenase pouco antes do uso. Adicione 5 mg de colagenase II a 5 mL de meio de base DMEM fresco estéril. Misture bem e esterilize a solução passando por um filtro de 0,45 μm. Mantenha no gelo até o uso.
4. Preparação e processamento de tecidos
NOTA: A aprovação institucional para a utilização de tecidos de origem humana deve ser obtida antes do início dos trabalhos. Durante o manuseamento de tecidos, devem ser utilizados os seguintes equipamentos de proteção individual (EPI): um vestido de barreira de líquido descartável ou um jaleco frontal de botão dedicado com um envoltório de barreira de líquido em torno do avental e trevos de manga descartáveis; um escudo facial completo, ou óculos de segurança com uma máscara cirúrgica; luvas duplas; sapatos fechados; e roupas para cobrir as pernas. Diagramas de fluxo de trabalho abrangentes da preparação tecidual para avaliação da calcificação (secção 5) e isolamento celular (secções 6 e 7) são ilustrados na Figura 1A,B, respectivamente.
- Após o recebimento do espécime de órgão cadavérico, extirpar a raiz aórtica e submergir em um tubo cônico de 50 mL de solução de enxágue estéril. Após o recebimento da peça cirúrgica, retirar dos vasos de transporte e submergir em um tubo cônico de 50 mL de solução de enxágue estéril. Coloque o tubo contendo o tecido no balde de gelo no balancim e misture por 10 min à temperatura ambiente (RT).
NOTA: O processamento de tecidos o mais próximo possível do momento da extração produzirá a melhor recuperação celular, no entanto, células viáveis podem ser coletadas acima de 61 h após a excisão, e os dados mostram que os VICs são mais robustos que os VECs à medida que o tempo aumenta. Se o tecido não puder ser processado imediatamente, sempre que possível, remova o tecido, execute o passo 4.1 e, em seguida, volte a colocar o tecido em solução fresca de armazenamento a frio estéril e mantenha-o a 4 °C até estar pronto para prosseguir. As válvulas coletadas durante cirurgias noturnas ou de fim de semana podem ser armazenadas em solução de armazenamento a frio de 40 mL a 4 °C e ainda são capazes de produzir células viáveis mais de 2 dias após a extração. - Pulverize os tubos com etanol a 70% e mova-se para um exaustor estéril. Remover o tecido e extirpar dois folhetos valvares (Figura 2A). Coloque um folheto num frasco para injetáveis criogénico (ou 2-3 frascos para injetáveis se forem necessárias várias peças mais pequenas para análises futuras) e congele por gota de azoto líquido e, em seguida, conservar a -80 °C.
- Se a válvula for bicúspide, excique apenas um folheto. Usando uma tesoura, corte o folheto ao meio do nódulo até a dobradiça. Use uma metade do folheto para congelamento instantâneo e a outra metade para a etapa 4.3.
- Processe o segundo folheto para incorporação de parafina para avaliar o teor de calcificação, cortando-o ao meio do nódulo para a dobradiça. Coloque ambas as peças em uma fita que esteja submersa em paraformaldeído a 4% (PFA) e, em seguida, coloque em um balancim no RT por um período mínimo de 2 h, mas não mais de 4 h.
NOTA: Tempos de fixação mais longos criam mais fundo com coloração imunofluorescente. Depois que as etapas 4.2 e 4.3 forem executadas, mova imediatamente para a Seção 6 e volte para a etapa 4.4 após a etapa 6.12. - Após a fixação, lave os tecidos submergindo em PBS fresco por 1 h 3-4 vezes. Após essas lavagens, as amostras podem permanecer em PBS a 4 °C por vários meses, se necessário. Prossiga para a próxima etapa antes da incorporação.
- Mudança gradual de PBS para etanol a 70%. Lave 30-60 min cada passo com 1:4 70% de etanol: PBS; 1:1 70% etanol: PBS, 4:1 70% etanol: PBS; 70% etanol.
- Incorpore o tecido de modo que as seções revelem as três camadas do folheto (Figura 1A) de acordo com os protocolos estabelecidos31. Alternativamente, e se disponível, traga o tecido para um núcleo de patologia para incorporação e corte.
- Depois de manusear os tecidos, descarte ou armazene os EPIs conforme apropriado e lave as mãos imediatamente. Descontaminar todos os equipamentos, superfícies e resíduos sólidos e líquidos com uma diluição 1:10 de água sanitária ou detergente desinfetante. Aguarde 20 minutos para a descontaminação, em seguida, siga com um enxágue de etanol a 70%. Trate o exaustor de cultura celular com spray de micoplasma de acordo com as instruções do fabricante.
5. Coloração de Von Kossa para o teor de cálcio
NOTA: Isso pode ser feito bem após o isolamento celular e o estabelecimento da linhagem, mas certifique-se de vincular o nível de calcificação do tecido a documentos relativos à linhagem celular primária estabelecida.
- Cortar fatias de parafina de 5 ou 10 μm de espessura em lâminas de vidro e assar as lâminas a 65 °C durante 1 h, arrefecer depois para RT.
- Usando soluções frescas, desparafinizar lâminas submergindo da seguinte forma: 100% xileno por 30 min, 2x; 100% etanol por 3 min, 2x; etanol a 90% por 3 min; 80% de etanol por 3 min; etanol a 70% por 3 min; 50% de etanol por 3 min; água ultrapura por 3 min; manter em água ultrapura até os próximos passos.
NOTA: Os tempos acima são mínimos, cada etapa pode ser mais longa. - Prossiga com a coloração de Von Kossa de acordo com os protocolos do fabricante.
- Avaliar microscopicamente a área valvar completa e atribuir um tecido controle (sem sinal de calcificação) ou CAVD (qualquer evidência de calcificação, Figura 2B).
6. Isolamento, expansão e confirmação da célula endotelial da válvula (VEC)
- Em um exaustor de cultura de células estéreis, abra o tubo cônico contendo o folheto valvar restante e coloque-o em um novo tubo cônico de 50 mL preenchido com PBS gelado. Tampa do tubo e inverta suavemente ou coloque em um balancim por 2 min no RT.
- Remova o tecido para um prato de 60 mm preenchido com 5-7 mL de solução fria de colagenase. Usando fórceps, mergulhe ambos os lados do folheto na solução 3-4 vezes. Incubar o tecido por 5-10 min na incubadora de cultura de células a 37 °C, balançando o tecido suavemente a cada 2 min 3-4 vezes.
- Retire 2 mL da solução do prato e coloque em um tubo cônico estéril de 15 mL. Coloque a pinça no nódulo e use um cotonete seco estéril para deslizar da pinça para a dobradiça, girando o cotonete enquanto o move ao longo do folheto. Entre cada deslize, agite o cotonete na solução no tubo cônico de 15 mL para remover as células. Repita para esfregar completamente a superfície do tecido, depois vire e repita do outro lado.
- Segurando o folheto da válvula com pinça em uma mão e uma pipeta de 1 mL na outra, lave as superfícies do folheto com a solução no prato. Uma vez enxaguado, transfira toda a solução contendo os VECs no prato para o mesmo tubo cônico de 15 mL com as células do cotonete e prossiga para a Etapa 6.5. Coloque o tecido valvar restante em um novo tubo cônico de 15 mL com 7 mL de solução estéril de colagenase e prossiga para a Etapa 7.1.
- Centrifugar o tubo que contém os VECs a 180 x g durante 5 min para peletizar os VECs isolados. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 3 mL de meio de crescimento VEC. Centrifugar mais uma vez e remover o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de meio de crescimento e determine o número de células usando um hemocitômetro e azul de tripano.
- Ressuspeite o pellet VEC em 2 mL de meio de crescimento VEC e pratique as células em um poço pré-revestido de colágeno de uma placa de 6 poços em aproximadamente 5 x 105 células/cm2. Deixe as células crescerem pelo menos 3-4 dias, depois remova a mídia e reabasteça com mídias frescas. Repita a mudança de mídia a cada 4 dias. Os VECs crescerão em manchas em forma de paralelepípedos (Figura 3B, painéis à esquerda).
- Quando os adesivos VEC cobrem >80% da placa, as células divididas em cerca de 1,3 x 104 células/cm 2, dependendo da rapidez com que crescem (se atingirem 80% em menos de 1 semana, dividindo-se a um número ligeiramente menor de células/cm2).
- Para dividir, lave as células duas vezes com 2 mL de DPBS e, em seguida, adicione reagente de dissociação suficiente para cobrir apenas a superfície das células. Incubar durante 2-3 min a 37 °C, verificando se as células não estão excessivamente incubadas. Pare a digestão adicionando volume igual de meios de crescimento VEC e transfira o líquido para um tubo de 15 mL. Centrifugar a 180 x g por 5 min, remover o sobrenadante e ressuspender em volume apropriado de meio para o número de poços/placas necessários.
NOTA: Uma vez expandidos em uma placa de 10 cm, os VECs podem, às vezes, perder sua morfologia e alterar o fenótipo à medida que proliferam. Isso tende a ocorrer quando os VECs são semeados em uma baixa confluência durante o estabelecimento e expansão da linhagem celular. - Para garantir uma cultura pura, considere a utilização de contas superparamagnéticas CD31 + a cada divisão.
- Para 1 x 108 ou menos células (uma prato de 10 cm ou menos), prepare 25 μL de contas superparamagnéticas lavando de acordo com os protocolos do fabricante.
NOTA: Recomenda-se que a etapa 6.10 seja executada antes da tripsinização dos VECs. - Desprenda as células como na etapa 6.8, mas ressuspenda em 500 μL de PBS com BSA a 0,1%, pH 7,4 e coloque em um tubo de centrífuga de 2 mL. Adicionar 500 μL de grânulos lavados e ressuspensos ao tubo de 2 ml de células e incubar num rotador durante 20 minutos a 4 °C.
- Coloque os tubos no ímã por 2 min. Enquanto o tubo ainda estiver no ímã, remova cuidadosamente o sobrenadante. Remova o tubo do ímã, adicione 1 mL de PBS fresco com 0,1% BSA, pipeta suavemente 2-3 vezes, em seguida, coloque de volta no ímã por 2 min. Repita mais 2 vezes. Após a remoção final do tampão, ressuspender as células no meio de crescimento em volume necessário para o replating.
NOTA: As células ainda terão contas, mas estas não afetarão o crescimento e serão removidas nas passagens subsequentes. - Uma vez expandidas as células, além da morfologia, confirme o fenótipo VEC por coloração positiva para marcadores imunofluorescentes como fator de von Willebrand (FvW), caderina 5 (CDH5) ou PECAM-1/CD31, e coloração negativa para marcadores VIC como calponina 1 (CNN) ou alfa-2 actina do músculo liso (αSMA, Figura 4, painéis esquerdos).
7. Isolamento, expansão e armazenamento de células intersticiais valvares (VIC)
- Como indicado na etapa 6.4, após a remoção dos VECs do tecido valvar, o folheto é colocado em um tubo cônico de 15 mL com 7 mL de solução de colagenase. Incubar por 12 h na incubadora de cultura celular com a tampa ligeiramente aberta para permitir a troca gasosa. O isolamento bem-sucedido de VICs ainda pode ocorrer com até 18 h em solução de colagenase.
- Após a incubação, em um exaustor de cultura de células estéreis, misture o tecido suavemente pipetando com uma pipeta sorológica para garantir a liberação de VICs do tecido do folheto.
- Remova a suspensão da célula e passe através de um filtro de 0,70 μm para um tubo cônico de 50 mL.
- Adicionar 7 mL de meio de crescimento VIC ao tubo de 50 mL e centrifugar a 180 x g por 5 min. Aspirar sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de meio de crescimento VIC e determinar o número de células. Chapear os VICs em um prato tratado com cultura de tecidos de 60 mm a 1,3 x 104 células/cm2.
- Deixe as células crescerem pelo menos 1-2 dias antes de substituir a mídia. Remova o meio e lave duas vezes o DPBS para remover os detritos residuais e substitua por um meio de crescimento fresco. Reabasteça o meio a cada 2-3 dias. Os VICs crescerão em forma de fibroblastos (Figura 3B, painéis à direita).
- Quando os VICs atingirem uma confluência de >90%, lave duas vezes com DPBS para remover o excesso de meio e desprenda as células adicionando volume apropriado de reagente de dissociação pré-aquecido para cobrir a placa (ou seja, 2-3 mL por prato de 10 cm). Incubar o prato numa incubadora a 37 °C. VICs se desprenderão do prato após 2-3 min de incubação. Adicione 4-6 mL de meio pré-aquecido.
NOTA: Se as células demorarem mais de 3 minutos a levantar da placa, o reagente de dissociação pode ter perdido potência. Se necessário, um raspador de células pode ser usado para levantar suavemente as células. - Transfira a suspensão da célula para um tubo e centrifugar suavemente a 180 x g por 5 min. Depois de remover o sobrenadante, ressuscite suavemente o pellet celular em meios de crescimento VIC pré-aquecidos e determine o número de células viáveis usando um hemocitômetro e azul de tripano. Semeia as células viáveis a uma densidade de 1:2 do prato original (ou seja, ~ 1 × 106 células por prato de 10 cm ou 1,3 x 104 células / cm2).
- Avalie o fenótipo VIC por coloração positiva para marcadores imunofluorescentes como αSMA, CNN ou SM22α e coloração negativa para marcadores VEC como CD31, CDH5 ou vWF (Figura 4, painéis direitos).
NOTA: O fluxo de trabalho do protocolo apresentado aqui seleciona imparcialmente um folheto para isolamento de VECs e VICs, enquanto os folhetos restantes são utilizados para coloração de Von Kossa (Seção 5) e congelamento instantâneo.
8. Armazenamento celular a longo prazo
- Uma vez expandida, congele as células para armazenamento a longo prazo. Lave as células duas vezes com 2-5 mL de DPBS e, em seguida, adicione reagente de dissociação suficiente para desanexar as células, como nas etapas 6.8 e 7.6. Pare a digestão adicionando volume igual de meios de crescimento VEC ou VIC e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL.
- Determine o número de células viáveis usando um hemocitômetro e azul de tripano.
- Centrífuga a 180 x g durante 5 min.
- Ressuspeite as células em meios de crescimento condicionados resfriados para uma densidade celular de ~ 3 × 106 células/mL.
- Suavemente com o redemoinho, adicione um volume igual de meio de criopreservação refrigerado 2x. Isso levará a concentração celular a ~ 1,5 × 106 células / mL.
- Aliquot 1 mL em frascos de criopreservação. Coloque os frascos para injetáveis num recipiente de congelamento celular, feche e inverta 5-6 vezes para garantir que as células permaneçam suspensas. Coloque o recipiente a -80 °C por 6-72 h ou de acordo com o protocolo do recipiente de congelamento. Remova os frascos para injetáveis de -80 °C e transfira para azoto líquido para armazenamento a longo prazo.
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Representative Results
O protocolo acima descreve as etapas necessárias para o manuseio de tecidos valvares humanos e o isolamento e estabelecimento de linhagens celulares viáveis a partir desses tecidos. Os folhetos da valva aórtica são processados para incorporação de parafina, congelados para armazenamento a longo prazo para análise bioquímica ou genética e digeridos para o isolamento de VECs e VICs (Figura 1). Enquanto os espécimes cirúrgicos provavelmente terão diagnóstico clínico de estenose aórtica e podem apresentar nódulos pesados de calcificação que podem ser visíveis a olho nu, a calcificação valvar aórtica está presente em um número significativo de idosos (>65 anos)32, e por causa dessa prevalência todos os tecidos - cirúrgicos e cadavéricos - são submetidos à coloração de Von Kossa ou procedimento semelhante para avaliar se a calcificação está presente (Figura 2).
Verificou-se que o uso de solução de armazenamento a frio estabilizou grandemente as células do tecido valvar excisado. A solução de armazenamento a frio é usada em transplantes de órgãos vivos. É lavado através dos órgãos antes ou depois da remoção do doador e deixado na vasculatura desse órgão durante o transporte no gelo. Observou-se que as linhagens de VEC foram mais prontamente estabelecidas a partir de espécimes de doadores do que de tecidos cirúrgicos, e as linhagens doadoras foram mais propensas a reter sua morfologia de células endoteliais por mais passagens. Isso era desconcertante, pois os tecidos do doador muitas vezes não chegavam ao laboratório por 12-24 horas post-mortem, enquanto o tecido cirúrgico era obtido entre 2 e 4 horas. Ao embalar os tubos da amostra cirúrgica com solução de armazenamento a frio em vez de PBS, a recuperação celular aumentou muito. Como visto na Figura 3, tanto os VECs viáveis quanto os VICs podem ser obtidos acima de 61 horas após a extração valvar. Embora uma porcentagem ligeiramente maior de VICs vivos seja obtida do que os VECs quando as células são isoladas até um dia após a excisão da válvula, as células permanecem viáveis após 48 horas após a excisão. Até 40% do total de células recuperadas correspondem a células vivas e observamos números consistentes entre as replicações biológicas. Além disso, a inspeção morfológica também confirma a identidade celular; enquanto os VECs aparecem como células embaladas, semelhantes a paralelepípedos e inibidas pelo contato de crescimento, a morfologia do VIC é semelhante aos miofibroblastos com uma forma fusiforme. A imunocoloração dos espécimes confirmou que 91,8% ± 1,8 (n = 3) de VECs expandidas foram positivas para o marcador endotelial FvW, enquanto 92,0% ± 5,0 (n = 3) de VICs expandidas foram positivas para o marcador de células intersticiais αSMA (Figura 4). Estes valores estão em linha com os resultados anteriormente comunicados33.
Figura 1: Processamento de tecido valvar e isolamento celular de válvulas de controle humano e CAVD . (A) Representação esquemática do processamento tecidual para avaliação dos níveis de calcificação das válvulas. (B) Representação esquemática do curso do tempo e das etapas para o isolamento e caracterização de células endoteliais valvares humanas (VECs) e células intersticiais valvares (VICs) de tecidos controle e DACD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação da Calcificação . (A) Imagem representativa dos tecidos valvares de controle (superior) e calcificados (inferior) de doadores humanos. Observe que os nódulos de calcificação do tecido CAVD podem alterar severamente a morfologia e a capacidade de extirpar os folhetos de forma limpa. (B) Coloração representativa de Von Kossa do tecido valvar de controle (esquerda) e CAVD (direita) após fixação e processamento adicional do tecido valvar humano. Nota-se que a calcificação é revelada pela presença de precipitação escura no tecido do folheto. As imagens das válvulas foram capturadas com uma câmera de laboratório. As válvulas coradas de Von Kossa foram capturadas com uma objetiva de 10x, barra de escala de 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação das curvas de sobrevida de VECs e VICs de sobrevivência de Cell Survival (A). Três folhetos foram obtidos de cinco espécimes valvares. O primeiro folheto de cada válvula foi processado imediatamente (3-12 h após a extração), o segundo folheto foi processado aproximadamente 24 h depois (22-35 h) e o terceiro folheto foi processado aproximadamente 48 h após a obtenção do tecido (45-61 h). Os folhetos valvares foram mantidos em solução frigorífica a 4 °C até serem processados. O eixo y representa a porcentagem de células vivas. (B) Morfologia de culturas saudáveis de VECs (painéis esquerdos) e VICs (painéis direitos). Os gráficos mostram a proporção média de células vivas ± DP de células isoladas de n = 5 tecidos valvares. As imagens foram capturadas com objetiva 4x e 10x, barras de escala de 200 μm e 100 μm, respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coloração imunofluorescente representativa em VECs e VICs. As VECs são positivas para o marcador endotelial Fator de von Willebrand (FvW, painéis esquerdos), enquanto as VICs são positivas para o marcador intersticial αSMA. Observe que nosso protocolo de isolamento garante uma alta eficiência de isolamento; não é detectada qualquer contaminação cruzada entre VECs e VICs. As imagens foram capturadas com uma objetiva de 10x, barra de escala de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A obtenção de tecidos de controle e doenças de seres humanos é fundamental para a modelagem de doenças in vitro e ex vivo; no entanto, enquanto muitas vezes se fala sobre os desafios de preencher a lacuna entre o banco à beira do leito, a ordem inversa - indo da suíte cirúrgica para o banco - é muitas vezes tão assustadora quanto uma lacuna. Essencial para um cientista básico obter espécimes de tecido humano primário é uma colaboração com um cientista cirurgião investido que tem uma equipe de enfermeiros, técnicos cirúrgicos, assistentes médicos, estudantes de medicina e residentes e gerentes de protocolo clínico que podem inscrever e consentir pacientes, participar e auxiliar no manuseio adequado de tecidos excisados e coordenar a logística necessária para a coleta de tecidos. Sem o maior esforço de todos os envolvidos para reduzir o tempo desde a excisão até o isolamento celular, o material celular vital e as informações que ele contém serão irreparavelmente alterados ou perdidos.
Crítico para manter a viabilidade dos espécimes de tecido é o uso de solução de armazenamento a frio. Esta é a mesma solução usada pelas equipes de transplante de órgãos da UPMC e outros centros médicos de transplante. Melhor rendimento celular foi obtido a partir de tecidos cadavéricos que haviam sido extirpados do doador muitas horas antes do que de tecidos obtidos mais rapidamente da sala de cirurgia, mas mantidos em PBS frio. Esta descoberta acidental tem sido essencial para a aquisição de células de tecidos humanos. O tempo de captação desde a excisão do tecido até a entrega no laboratório varia de 1-5 horas para o tecido cirúrgico e mais de 24 horas para o tecido cadavérico. Em comparação, a colheita e o processamento de tecidos animais muitas vezes podem ser feitos em poucos minutos após a eutanásia, o que é ideal para a viabilidade celular. Na ausência de solução de armazenamento a frio, é provável que um meio adequado para a cultura de células também possa ter um desempenho melhor do que o PBS, no entanto, este meio não foi testado aqui devido ao sucesso da solução de armazenamento a frio no transplante de órgãos vivos e ao recebimento de tecidos cadavéricos nesta solução. A solução é estável na prateleira, ideal para armazenamento em salas cirúrgicas, e ingredientes específicos, como a adenosina, são conhecidos por promover respostas benéficas a estresses celulares, como isquemia/hipóxia21,34.
Outro passo essencial para a obtenção de células viáveis é lavar os tecidos com fungicida, gentamicina e bactericida. Este enxágue curto ajuda a garantir que as células permaneçam não contaminadas por bactérias e fungos. Igualmente críticos são os passos para digerir os VECs para fora do tecido valvar, onde, no espaço de apenas alguns minutos, os VECs são destacados e, em seguida, esfregados da superfície dos folhetos valvares. A digestão subsequente dos VICs que residem na densa matriz extracelular do folheto tem muito mais espaço de manobra para duração e força. O tratamento tecidual imparcial descrito neste protocolo permite o isolamento das duas principais populações celulares presentes no folheto valvar, VECs e VICs. Embora uma recente análise de transcriptoma de célula única tenha mostrado a coexistência de pelo menos quatorze subtipos celulares diferentes que residem na válvula humana, incluindo seis células estromais derivadas não valvares no tecido CAVD35, essa diversidade pode representar variações devido aos efeitos do processamento e digestão desses tecidos endurecidos, ou pode ser devido a diferentes microambientes aos quais as células folhetas estão expostas: Os VECs são expostos a dois fluxos sanguíneos diferentes, enquanto os VICs são incorporados em três diferentes estratos de matriz extracelular 8,9. O protocolo e a análise de isolamento em larga escala aqui descritos garantem que mais de 90% dos VECs e VICs correspondam ao seu fenótipo principal. Embora um grau de heterogenicidade possa ser encontrado, ele não afeta os desfechos gerais do estudo da homeostase da EVIC 8,9,13,14,15,16.
Também é importante notar que os pacientes e seus tecidos valvares e, portanto, as linhagens celulares obtidas a partir deles, não são idênticos. Genética, comorbidades, manuseio durante a cirurgia e processamento, e frescura dos ingredientes da solução de digestão podem afetar a taxa de crescimento e até mesmo talvez o comportamento ou fenótipo das células isoladas. Embora o presente estudo demonstre a capacidade de produzir um número suficiente de células viáveis com este procedimento, pode haver diferenças inatas ou induzidas nessas linhagens celulares que podem afetar a experimentação a jusante. Muitas vezes é difícil saber com precisão o tempo desde que o tecido foi removido do paciente ou doador e, particularmente no caso deste último, o tempo desde que a circulação parou. Além disso, há uma variabilidade inerente entre os tecidos em relação ao número de células valvares viáveis obtidas, à capacidade proliferativa das células e à retenção do fenótipo celular. As linhagens celulares podem abrigar mutações genéticas - congênitas ou somáticas - das quais o médico e a equipe de pesquisa desconhecem, e a remodelação e o subsequente manuseio dos tecidos também podem modificar o fenótipo celular ou mesmo a epigenética. Como tal, para todos os experimentos em que essas células humanas primárias são usadas, é absolutamente essencial que as replicações biológicas - ou seja, linhagens celulares obtidas de diferentes pacientes - sejam usadas, apesar do tempo e custo substanciais em que incorrem. Isso ajuda a garantir que quaisquer resultados não sejam devidos a efeitos de confusão da aquisição e processamento do tecido. A taxa de proliferação variável de diferentes linhagens celulares pode ser ajustada pela coleta de células em experimentos em diferentes momentos ou semeadura de células para experimentos em diferentes densidades; nenhuma resposta é a melhor para todos os desenhos experimentais. Embora as complicações não sejam insignificantes, o uso de controle humano primário e linhagens celulares derivadas de tecido CAVD para modelos experimentais in vitro e ex vivo é essencial para definir os fatores iniciadores e os processos de propagação que impulsionam a patogênese da DACD.
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Disclosures
O IS recebe apoio institucional de pesquisa da Atricure e da Medtronic e atua como consultor da Medtronic Vascular. Nenhum desses conflitos está relacionado a este trabalho. Todos os outros autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Jason Dobbins pela discussão perspicaz e leitura crítica deste manuscrito. Gostaríamos de agradecer ao Centro de Recuperação e Educação de Órgãos por sua ajuda e apoio e agradecer aos doadores de tecidos e suas famílias por tornar este estudo possível. Todas as amostras de pacientes são coletadas de indivíduos inscritos em estudos aprovados pelo conselho de revisão institucional da Universidade de Pittsburgh, de acordo com a Declaração de Helsinque. Os tecidos cadavéricos obtidos através do Centro de Recuperação e Educação de Órgãos (CORE) foram aprovados pelo Comitê de Supervisão de Pesquisa e Treinamento Clínico Envolvendo Decedentes da Universidade de Pittsburgh (CORID).
Algumas figuras criadas com Biorender.com.
O CSH é apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 e R01 HL142932, pela American Heart Association 20IPA35260111.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
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