Summary
يصف هذا البروتوكول مجموعة الصمامات الأبهرية البشرية المستخرجة أثناء إجراءات استبدال الصمام الأبهري الجراحية أو من الأنسجة الجثة ، والعزل اللاحق والتوسع والتوصيف للخلايا البطانية والخلالية للصمام الأولي الخاصة بالمريض. يتم تضمين تفاصيل مهمة تتعلق بالعمليات اللازمة لضمان بقاء الخلية وخصوصية النمط الظاهري.
Abstract
مرض الصمام الأبهري الكلسي (CAVD) موجود في ما يقرب من ثلث السكان المسنين. يؤدي سماكة الصمام الأبهري وتصلبه وتكلسه إلى تضيق الأبهر ويساهم في فشل القلب والسكتة الدماغية. التسبب في المرض متعدد العوامل ، والضغوط مثل الالتهاب ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية ، والتدفق المضطرب ، والإجهاد الميكانيكي والإجهاد تساهم في التمايز العظمي للخلايا البطانية للصمام والخلايا الخلالية للصمام. ومع ذلك ، فإن عوامل البدء الدقيقة التي تدفع الانتقال العظمي للخلية السليمة إلى خلية متكلسة ليست محددة بالكامل. علاوة على ذلك ، فإن العلاج الحالي الوحيد لتضيق الأبهر الناجم عن CAVD هو استبدال الصمام الأبهري ، حيث يتم إزالة الصمام الأصلي (استبدال الصمام الأبهري الجراحي ، SAVR) أو يتم إدخال صمام بديل قابل للطي بالكامل عبر قسطرة (استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة ، TAVR). هذه العمليات الجراحية تأتي بتكلفة عالية ومع مخاطر جسيمة. وبالتالي ، فإن تحديد أهداف علاجية جديدة لاكتشاف الأدوية أمر حتمي. تحقيقا لهذه الغاية ، تطور الدراسة الحالية سير عمل حيث يتم استخدام الأنسجة التي تمت إزالتها جراحيا من المرضى وأنسجة جثث المتبرعين لإنشاء خطوط أولية خاصة بالمريض من الخلايا الصمامية لنمذجة الأمراض في المختبر. يقدم هذا البروتوكول استخدام محلول التخزين البارد ، الذي يشيع استخدامه في زراعة الأعضاء ، لتقليل الضرر الناجم عن وقت الشراء الطويل في كثير من الأحيان بين استئصال الأنسجة والمعالجة المختبرية مع الاستفادة من استقرار خلايا الأنسجة المستأصلة بشكل كبير. توضح نتائج الدراسة الحالية أن خلايا الصمام المعزولة تحتفظ بقدرتها التكاثرية والأنماط الظاهرية البطانية والخلالية في المزرعة حتى عدة أيام بعد إزالة الصمام من المتبرع. يسمح استخدام هذه المواد بجمع خلايا التحكم وخلايا CAVD ، والتي يتم من خلالها إنشاء كل من خطوط خلايا التحكم والمرض.
Introduction
مرض الصمام الأبهري الكلسي (CAVD) هو مرض مزمن يتميز بالالتهاب والتليف والتكلس الكبير لوريقات الصمام الأبهري. يمكن أن تؤدي إعادة البناء التدريجي وتكلس المنشورات (يسمى تصلب الأبهر) إلى إعاقة تدفق الدم (تضيق الأبهر) مما يساهم في السكتة الدماغية ويؤدي إلى قصور القلب. حاليا العلاج الوحيد ل CAVD هو استبدال الصمام الأبهري الجراحي أو عبر القسطرة (SAVR و TAVR ، على التوالي). لا يوجد خيار غير جراحي لوقف أو عكس تطور CAVD ، وبدون استبدال الصمام ، تقترب معدلات الوفيات من 50٪ في غضون 2-3 سنوات1،2،3. إن تحديد الآليات الأساسية التي تقود هذا المرض سيحدد الأساليب العلاجية الجديدة المحتملة.
في البالغين الأصحاء ، يبلغ سمك وريقات الصمام الأبهري حوالي ملليمتر واحد ، وتتمثل وظيفتها الرئيسية في الحفاظ على تدفق الدم أحادي الاتجاه من البطين الأيسر4. تتكون كل وريقة من الوريقات الثلاث من طبقة من الخلايا البطانية الصمامية (VECs) التي تبطن السطح الخارجي للوريقة وتعمل كحاجز. تحافظ VECs على توازن الصمام من خلال تنظيم النفاذية ، والتصاق الخلايا الالتهابية ، وإشارات paracrine5،6،7. تتكون الخلايا الخلالية للصمام (VICs) من غالبية الخلايا داخل نشرة الصمام8. يتم ترتيب VICs في ثلاث طبقات مميزة في النشرة. تعرف هذه الطبقات باسم البطين والإسفنجي والليبروزا9. يواجه البطين البطين الأيسر ويحتوي على ألياف الكولاجين والإيلاستين. تحتوي الطبقة الوسطى ، الإسفنجية ، على نسبة عالية من البروتيوغليكان الذي يوفر مرونة القص أثناء الدورة القلبية. تقع طبقة الفيبروس الخارجية بالقرب من سطح التدفق على الجانب الأبهري وهي غنية بالكولاجين الليفي من النوع الأول والنوع الثالث الذي يوفر القوة للحفاظ على التكيف أثناء الانبساط10،11،12. توجد VICs في حالة هدوء ، ومع ذلك ، فإن عوامل مثل الالتهاب ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والإجهاد الميكانيكي قد تعطل توازن VIC8،9،13،14،15،16. مع فقدان التوازن ، تنشط VICs وتكتسب نمطا ظاهريا شبيها بالخلايا الليفية العضلية قادرا على تكاثر وتقلص وإفراز البروتينات التي تعيد تشكيل ميليو17 خارج الخلية. يمكن أن تنتقل VICs المنشطة إلى خلايا متكلسة تذكرنا بتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) إلى بانيات عظمية 15،17،18،19،20،21،22،23،24،25.
يبدو أن التكلس يبدأ في طبقة الألياف الغنية بالكولاجين من مساهمات كل من VECs و VICs ولكنه يتوسع ويغزو الطبقات الأخرى من النشرة8. وبالتالي ، من الواضح أن كلا من VECs و VICs يستجيبان للمحفزات لتنظيم التعبير عن الجينات العظمية ، ومع ذلك ، فإن الأحداث الدقيقة التي تقود تنشيط الجينات العظمية ، وكذلك التفاعل المعقد بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية للنشرة ، لا تزال غير محددة. نماذج الفئران ليست مصدرا مثاليا لدراسة الدوافع غير الوراثية لمرض CAVD ، حيث أن الفئران لا تطور CAVD de novo26,27 ، وبالتالي فإن استخدام الأنسجة البشرية الأولية وخطوط الخلايا الأولية المعزولة من هذه الأنسجة أمر ضروري. على وجه الخصوص ، الحصول على هذه الخلايا بأعداد كبيرة ونوعية جيدة أمر حتمي ، حيث أن مجال ثقافات الخلايا 3D والنمذجة العضوية يتوسع ومن المرجح أن يصبح بديلا قائما على الإنسان خارج الجسم الحي لنماذج الفئران.
الغرض من الطريقة الحالية هو مشاركة سير العمل الذي هيأ الظروف لعزل وتنمية VECs و VICs التي تم الحصول عليها بكفاءة من الصمامات التي تمت إزالتها جراحيا من المتبرعين البشريين. أظهرت الدراسات السابقة عزلا ناجحا ل VECs و VICs من الخنازير28 وصمامات الفئران29 ، على حد علمنا هذا هو الأول الذي يصف عزل هذه الخلايا في الأنسجة البشرية. ينطبق البروتوكول الموصوف هنا على الصمامات البشرية المستأصلة ويتحايل بشكل كبير ويحسن الضرر الناجم عن وقت الشراء الطويل في كثير من الأحيان بين استئصال الأنسجة والمعالجة المختبرية من خلال إدخال استخدام محلول التخزين البارد ، وهو محلول مخزن يستخدم سريريا في عمليات زرع الأعضاء التي تعمل على استقرار خلايا الأنسجة المستأصلة بشكل كبير. يوضح البروتوكول الموصوف هنا أيضا كيفية تحديد النمط الظاهري للخلية وضمان كفاءة عالية لبقاء الخلية مع الحد الأدنى من التلوث المتبادل للخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم جمع جميع عينات المرضى من الأفراد المسجلين في الدراسات المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بيتسبرغ وفقا لإعلان هلسنكي. تمت الموافقة على الأنسجة الجثة التي تم الحصول عليها عن طريق مركز استعادة الأعضاء والتعليم (CORE) من قبل لجنة جامعة بيتسبرغ للإشراف على البحوث والتدريب السريري الذي يشمل المتوفين (CORID).
1. الموافقة والسلامة
- الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) أو مذكرة إعفاء لأي مجموعة من عينات المرضى أو أنسجة الجثث وفقا لإعلان هلسنكي.
- خذ التدريب المؤسسي المطلوب للعمل مع الأنسجة البشرية مثل التدريب على مسببات الأمراض المنقولة بالدم ، وأبحاث الموضوعات البشرية الطبية الحيوية ، وأمن الخصوصية والمعلومات ، ونقل وشحن المواد البيولوجية.
2. الخدمات اللوجستية والتحضير
- العينات الجراحية
- تأكد من توفر الثلاجة ووجودها بالقرب من غرفة العمليات. احتفظ بأنابيب مخروطية سعة 50 مل ملصقة مسبقا بتسميات غير محددة تحتوي على 40 مل من القسمة المعقمة من محلول التخزين البارد في هذه الثلاجة لاستخدامها من قبل الطاقم الجراحي. هذه الأنابيب مستقرة عند 4 درجات مئوية حتى تاريخ انتهاء الصلاحية على العبوة الأصلية.
- عند الاستخراج ، ضع أنسجة الصمام في هذه الأنابيب. ضع الأنابيب في حاوية ثانوية محكمة الغلق مثل كيس بلاستيكي مانع للتسرب أو حاوية بلاستيكية تحمل ملصق بيولوجي. يتم التقاط الأنسجة ونقلها على الجليد وفقا للبروتوكولات المؤسسية لنقل المخاطر البيولوجية.
- عينات جثة
- غمر الأعضاء المستعادة في محلول التخزين البارد ، ووضعها في وعاء احتواء ثانوي مغلق ، ونقلها على الجليد وفقا للبروتوكولات المؤسسية لنقل المخاطر البيولوجية.
3. إعداد الكواشف
- اصنع صفائح مطلية بالكولاجين في اليوم السابق على الأقل.
- في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، امزج 5 مل من كحول الأيزوبروبيل ، و 8.7 مل من حمض الأسيتيك ، و 0.5 ميكروغرام من مسحوق الكولاجين I. أحضر ما يصل إلى 50 مل بالماء المعقم. امزج وفلتر من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر.
- تحت غطاء زراعة الخلايا المعقمة ، أضف ما يكفي من محلول الكولاجين إلى 6 أطباق بئر وأطباق 10 سم لتغطية القاع بالكامل. غطي الطبق واتركيه لمدة 4-6 ساعات في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المحلول الزائد باستخدام ماصة معقمة ، وضعه في أنبوب مخروطي معقم جديد سعة 50 مل ، واحفظه عند 4 درجات مئوية لعمل ألواح إضافية. يمكن تخزين المحلول عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
- جفف الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل ، ثم قم بتخزينها في كيس قابل لإعادة الإغلاق عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين الأطباق والأطباق المطلية بالكولاجين لعدة أشهر.
- الأوتوكلاف العناصر التالية: ملقط الأنسجة ، مقص الأنسجة ، مسحات القطن ومنصات الشاش.
- وسائط نمو VEC: قم بإعداد واستخدام وسيط نمو الخلايا البطانية وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. يحفظ في الظلام على حرارة 4 درجات مئوية. يسخن إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام مباشرة على الخلايا ، ولا تترك الوسائط في حمام دافئ لفترة أطول من اللازم (10-15 دقيقة كافية). استخدم الوسائط في غضون شهر واحد من التحضير.
- وسائط نمو مركز فيينا الدولي: الوسط الأساسي DMEM المكمل (4.5 جم/لتر من الجلوكوز، مكمل إل-جلوتامين، 110 ملغم/لتر من بيروفات الصوديوم)30 مع 10٪ FBS معطل بالحرارة و100 وحدة دولية/مل بنسلين و100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين. يحفظ في الظلام على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. يسخن إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام مباشرة على الخلايا ، ولا تترك الوسائط في حمام دافئ لفترة أطول من اللازم (10-15 دقيقة كافية).
- اصنع محلول شطف معقم قبل الاستخدام مباشرة. تكملة PBS معقمة مع 2.5 ميكروغرام / مل من مبيدات الفطريات ، 0.05 ملغ / مل جنتاميسين و 5 ميكروغرام / مل مبيد للجراثيم.
- اصنع محلول كولاجيناز معقم قبل الاستخدام مباشرة. أضف 5 ملغ من كولاجيناز II إلى 5 مل من وسط قاعدة DMEM الطازج المعقم. تخلط جيدا وتعقيم الحل عن طريق المرور من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. يحفظ على الثلج حتى الاستخدام.
4. إعداد الأنسجة ومعالجتها
ملاحظة: يجب الحصول على موافقة مؤسسية لاستخدام الأنسجة البشرية قبل بدء العمل. أثناء التعامل مع المناديل ، يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية التالية (PPE): ثوب ملتف حول حاجز سائل يمكن التخلص منه ، أو معطف مختبر أمامي مخصص بأزرار مع حاجز سائل يلتف حول ساحة وبرسيم كم يمكن التخلص منه ؛ درع كامل للوجه ، أو نظارات أمان مع قناع جراحي ؛ قفازات مزدوجة أحذية قريبة من أصابع القدم وملابس لتغطية الساقين. يتم توضيح مخططات سير العمل الشاملة لإعداد الأنسجة لتقييم التكلس (القسم 5) وعزل الخلايا (القسمان 6 و 7) في الشكل 1 أ ، ب على التوالي.
- عند استلام عينة العضو الجثة ، قم باستئصال جذر الأبهر وغمره في أنبوب مخروطي سعة 50 مل من محلول الشطف المعقم. عند استلام العينة الجراحية ، أخرجها من أوعية النقل واغمسها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل من محلول الشطف المعقم. ضع الأنبوب الذي يحتوي على المنديل في دلو الثلج على الروك واخلطه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
ملاحظة: ستؤدي معالجة الأنسجة في أقرب وقت ممكن من وقت الاستخراج إلى أفضل استعادة للخلايا ، ومع ذلك يمكن جمع خلايا قابلة للحياة حتى 61 ساعة بعد الاستئصال ، وتظهر البيانات أن VICs أكثر قوة من VECs مع مرور الوقت. إذا تعذر معالجة الأنسجة على الفور ، عندما يكون ذلك ممكنا ، قم بإزالة الأنسجة ، وقم بتنفيذ الخطوة 4.1 ، ثم أعد المنديل إلى محلول تخزين بارد معقم طازج واحتفظ به عند 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للمتابعة. يمكن تخزين الصمامات التي يتم جمعها أثناء العمليات الجراحية الليلية أو في عطلة نهاية الأسبوع في محلول تخزين بارد سعة 40 مل عند 4 درجات مئوية ولا تزال قادرة على إنتاج خلايا قابلة للحياة بعد أكثر من يومين من الاستخراج. - رش الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول وانتقل إلى غطاء معقم. إزالة الأنسجة واستئصال وريقات صمامي (الشكل 2 أ). ضع وريشة واحدة في قنينة مبردة (أو 2-3 قوارير إذا كانت هناك حاجة إلى عدة قطع أصغر للتحليل في المستقبل) وقم بالتجميد المفاجئ عن طريق إسقاط النيتروجين السائل ثم خزنه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
- إذا كان الصمام ثنائي الشرف ، فقم باستئصال نشرة واحدة فقط. باستخدام المقص ، قم بقص النشرة إلى النصف من العقيدات إلى المفصلة. استخدم نصف النشرة للتجميد المفاجئ والنصف الآخر للخطوة 4.3.
- معالجة النشرة الثانية لتضمين البارافين لتقييم محتوى التكلس عن طريق تقطيعه إلى نصفين من العقيدات إلى المفصلات. ضع كلتا القطعتين في كاسيت مغمور في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) ، ثم ضعهما على كرسي هزاز في RT لمدة لا تقل عن 2 ساعة ولكن ليس أكثر من 4 ساعات.
ملاحظة: أوقات التثبيت الأطول تخلق المزيد من الخلفية مع تلطيخ المناعي. بمجرد تنفيذ الخطوتين 4.2 و 4.3 ، انتقل فورا إلى القسم 6 وعد إلى الخطوة 4.4 بعد الخطوة 6.12. - بعد التثبيت ، اغسل الأنسجة عن طريق الغمر في PBS الطازج لمدة 1 ساعة 3-4 مرات. بعد هذه الغسالات ، يمكن أن تبقى العينات في PBS عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر إذا لزم الأمر. انتقل إلى الخطوة التالية قبل التضمين مباشرة.
- التغيير تدريجيا من PBS إلى 70٪ إيثانول. اغسل 30-60 دقيقة لكل خطوة مع 1: 4 70٪ إيثانول: PBS ؛ 1: 1 70٪ إيثانول: PBS ، 4: 1 70٪ إيثانول: PBS ؛ 70٪ إيثانول.
- قم بتضمين الأنسجة بحيث تكشف الأقسام عن الطبقات الثلاث للنشرة (الشكل 1 أ) وفقا للبروتوكولات المعمول بها31. بدلا من ذلك ، وإذا كان ذلك متاحا ، أحضر الأنسجة إلى قلب علم الأمراض لتضمينها وقطعها.
- بعد التعامل مع المناديل ، تخلص من معدات الوقاية الشخصية أو خزنها حسب الاقتضاء واغسل يديك على الفور. قم بتطهير جميع المعدات والأسطح والنفايات الصلبة والسائلة بتخفيف 1:10 من المبيض أو مطهر المنظفات. اترك 20 دقيقة لإزالة التلوث ، ثم اتبعه بشطف الإيثانول بنسبة 70٪. علاج غطاء زراعة الخلايا مع رذاذ الميكوبلازما وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
5. فون كوسا تلطيخ لمحتوى الكالسيوم
ملاحظة: يمكن القيام بذلك بشكل جيد بعد عزل الخلية وإنشاء الخط ولكن تأكد من ربط مستوى تكلس الأنسجة بالمستندات المتعلقة بخط الخلية الأولية الذي تم إنشاؤه.
- تقطع شرائح البارافين بسمك 5 أو 10 ميكرومتر على شرائح زجاجية وتخبز الشرائح على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، ثم تبرد إلى RT.
- باستخدام حلول جديدة ، قم بإزالة الشرائح عن طريق غمرها على النحو التالي: 100٪ زيلين لمدة 30 دقيقة ، 2x ؛ 100٪ إيثانول لمدة 3 دقائق ، 2x ؛ 90٪ إيثانول لمدة 3 دقائق ؛ 80٪ إيثانول لمدة 3 دقائق ؛ 70٪ إيثانول لمدة 3 دقائق ؛ 50٪ إيثانول لمدة 3 دقائق ؛ ماء عالي النقاء لمدة 3 دقائق ؛ يحفظ في ماء عالي النقاء حتى الخطوات التالية.
ملاحظة: الأوقات المذكورة أعلاه هي الحد الأدنى ، قد تستغرق كل خطوة أطول. - المضي قدما في تلطيخ Von Kossa وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
- قم بتقييم منطقة الصمام بالكامل مجهريا وقم بتعيين نسيج تحكم (لا توجد علامة على التكلس) أو CAVD (أي دليل على التكلس ، الشكل 2 ب).
6. عزل الخلية البطانية للصمام (VEC) وتوسيعها وتأكيدها
- في غطاء زراعة الخلايا المعقمة ، افتح الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على نشرة الصمام المتبقية وضع النشرة في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل مملوء ب PBS بارد الثلج. أنبوب الغطاء وقلبه برفق أو ضعه على الروك لمدة 2 دقيقة في RT.
- قم بإزالة الأنسجة إلى طبق 60 مم مملوء ب 5-7 مل من محلول كولاجيناز البارد. باستخدام ملقط ، اغمس جانبي النشرة في المحلول 3-4 مرات. احتضان الأنسجة لمدة 5-10 دقائق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، مع هز الأنسجة برفق كل 2 دقيقة 3-4 مرات.
- أخرج 2 مل من المحلول من الطبق وضعه في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل. ضع ملقط على العقدة واستخدم قطعة قطن معقمة جافة للتمرير من الملقط إلى المفصلة ، وقم بتدوير المسحة أثناء تحريكها على طول الوريقة. بين كل تمريرة ، امسح المسحة في المحلول في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل لإزالة الخلايا. كرر لمسح سطح الأنسجة بالكامل ، ثم اقلبه وكرر على الجانب الآخر.
- امسك نشرة الصمام بالملقط في يد ، وماصة 1 مل في اليد الأخرى ، اشطف أسطح النشرة بالمحلول الموجود في الطبق. بمجرد شطفه ، انقل كل المحلول الذي يحتوي على VECs في الطبق إلى نفس الأنبوب المخروطي سعة 15 مل مع الخلايا من المسحة وانتقل إلى الخطوة 6.5. ضع نسيج الصمام المتبقي في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل مع 7 مل من محلول كولاجيناز المعقم وانتقل إلى الخطوة 7.1.
- قم بالطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على VECs عند 180 × جم لمدة 5 دقائق لتكوير VECs المعزولة. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليقها في 3 مل من وسائط نمو VEC. الطرد المركزي مرة أخرى وإزالة طاف . أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط النمو وحدد عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم والتريبان الأزرق.
- أعد تعليق حبيبات VEC في 2 مل من وسائط نمو VEC وقم بتقطيع الخلايا في بئر مطلي مسبقا بالكولاجين من صفيحة 6 بئر عند حوالي 5 × 105 خلايا / سم2. دع الخلايا تنمو على الأقل 3-4 أيام ، ثم قم بإزالة الوسائط وتجديدها بوسائط جديدة. كرر تغيير الوسائط كل 4 أيام. سوف تنمو VECs في بقع مرصوفة بالحصى (الشكل 3B ، الألواح اليسرى).
- عندما تغطي بقع VEC >80٪ من اللوحة ، تقسم الخلايا عند حوالي 1.3 × 104 خلايا / سم 2 اعتمادا على مدى سرعة نموها (إذا وصلت إلى 80٪ في أقل من أسبوع واحد مقسمة عند عدد أقل قليلا من الخلايا / سم2).
- للانقسام ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 2 مل DPBS ثم أضف ما يكفي من كاشف التفكك لتغطية سطح الخلايا فقط. احتضن لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وتحقق للتأكد من عدم تحضين الخلايا. توقف عن الهضم عن طريق إضافة حجم متساو من وسائط نمو VEC ونقل السائل إلى أنبوب سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 180 × جم لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة التعليق في الحجم المناسب من الوسائط لعدد الآبار / الألواح المطلوبة.
ملاحظة: بمجرد توسيعها إلى صفيحة 10 سم ، قد تفقد VECs في بعض الأحيان مورفولوجيتها وتغير النمط الظاهري أثناء تكاثرها. يحدث هذا عادة عندما يتم زرع VECs عند التقاء منخفض أثناء إنشاء وتوسيع خط الخلية. - لضمان ثقافة نقية ، ضع في اعتبارك استخدام حبات CD31 + الفائقة المغناطيسية مع كل انقسام.
- ل 1 × 108 خلايا أو أقل (طبق واحد 10 سم أو أقل) ، قم بإعداد 25 ميكرولتر من الخرز المغنطيسي الفائق عن طريق الغسيل وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
ملاحظة: يوصى بإجراء الخطوة 6.10 قبل التربسين من VECs. - افصل الخلايا كما في الخطوة 6.8 ولكن أعد تعليقها في 500 ميكرولتر من PBS بنسبة 0.1٪ BSA ، ودرجة الحموضة 7.4 ، وضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل. أضف 500 ميكرولتر من الخرز المغسول والمعاد تعليقه إلى أنبوب الخلايا سعة 2 مل واحتضانه على دوار لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- ضع الأنابيب على المغناطيس لمدة 2 دقيقة. بينما لا يزال الأنبوب في المغناطيس ، قم بإزالة الطافت بعناية. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس ، وأضف 1 مل من PBS الطازج مع 0.1٪ BSA ، ماصة برفق 2-3 مرات ، ثم ضعه مرة أخرى على المغناطيس لمدة دقيقتين. كرر 2 مرات أكثر. بعد الإزالة النهائية للمخزن المؤقت ، أعد تعليق الخلايا في وسائط النمو بالحجم اللازم لإعادة الطلاء.
ملاحظة: ستظل الخلايا تحتوي على خرز ، لكنها لن تؤثر على النمو وسيتم إزالتها في الممرات اللاحقة. - بمجرد توسيع الخلايا ، بالإضافة إلى التشكل ، قم بتأكيد النمط الظاهري VEC عن طريق التلوين الإيجابي لعلامات الفلورسنت المناعية مثل عامل فون ويلبراند (vWF) أو الكاديرين 5 (CDH5) أو PECAM-1 / CD31 ، والتلوين السلبي لعلامات VIC مثل الكالبونين 1 (CNN) أو أكتين العضلات الملساء ألفا -2 (αSMA ، الشكل 4 ، الألواح اليسرى).
7. عزل الخلية الخلالية للصمام (VIC) وتوسيعها وتخزينها
- كما هو مذكور في الخطوة 6.4 ، بعد إزالة VECs من نسيج الصمام ، يتم وضع النشرة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع محلول كولاجيناز 7 مل. احتضان لمدة 12 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية مع غطاء مفتوح قليلا للسماح بتبادل الغازات. لا يزال من الممكن حدوث عزل ناجح ل VICs مع ما يصل إلى 18 ساعة في محلول كولاجيناز.
- بعد الحضانة ، في غطاء زراعة الخلايا المعقمة ، امزج الأنسجة برفق عن طريق السحب باستخدام ماصة مصلية لضمان إطلاق VICs من أنسجة الوريقة.
- قم بإزالة معلق الخلية ومررها عبر مرشح 0.70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
- أضف 7 مل من وسط نمو VIC إلى أنبوب 50 مل وأجهزة طرد مركزي عند 180 × جم لمدة 5 دقائق. نضح طاف وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من وسائط نمو VIC وتحديد رقم الخلية. ضع VICs في طبق معالج بزراعة الأنسجة 60 مم بمعدل 1.3 × 104 خلايا / سم2.
- دع الخلايا تنمو على الأقل 1-2 أيام قبل استبدال الوسائط. قم بإزالة الوسائط واغسل مرتين DPBS لإزالة الحطام المتبقي واستبداله بوسط نمو جديد. تجديد المتوسطة كل 2-3 أيام. سوف تنمو VICs في شكل الخلايا الليفية (الشكل 3B ، الألواح اليمنى).
- عندما تصل VICs إلى التقاء >90٪ ، اغسل مرتين باستخدام DPBS لإزالة الوسائط الزائدة وفصل الخلايا عن طريق إضافة حجم مناسب من كاشف التفكك قبل التسخين لتغطية اللوحة (أي 2-3 مل لكل طبق 10 سم). احتضان الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية. سوف تنفصل VICs عن الطبق بعد 2-3 دقائق من الحضانة. أضف 4-6 مل من الوسائط التي تم تسخينها مسبقا.
ملاحظة: إذا استغرقت الخلايا أكثر من 3 دقائق لرفع اللوحة ، فقد يكون كاشف التفكك قد فقد فعاليته. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام مكشطة الخلايا لرفع الخلايا برفق. - انقل معلق الخلية إلى أنبوب وطرد مركزي برفق عند 180 × جم لمدة 5 دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في وسائط نمو VIC التي تم تسخينها مسبقا وحدد عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم والأزرق التريبان. بذر الخلايا القابلة للحياة بكثافة 1: 2 من الطبق الأصلي (على سبيل المثال ، ~ 1 × 106 خلايا لكل طبق 10 سم أو 1.3 × 104 خلايا / سم2).
- قم بتقييم النمط الظاهري لمركز فيينا الدولي عن طريق التلوين الإيجابي لعلامات الفلورسنت المناعية مثل αSMA أو CNN أو SM22α والتلوين السلبي لعلامات VEC مثل CD31 أو CDH5 أو vWF (الشكل 4 ، اللوحات اليمنى).
ملاحظة: يختار سير عمل البروتوكول المعروض هنا بشكل غير متحيز نشرة واحدة لعزل VECs و VICs ، بينما يتم استخدام المنشورات المتبقية لتلطيخ Von Kossa (القسم 5) والتجميد المفاجئ.
8. تخزين الخلايا على المدى الطويل
- بمجرد توسيعها ، قم بتجميد الخلايا للتخزين طويل الأجل. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 2-5 مل DPBS ثم أضف ما يكفي من كاشف التفكك لفصل الخلايا كما في الخطوتين 6.8 و 7.6. توقف عن الهضم عن طريق إضافة حجم متساو من وسائط نمو VEC أو VIC ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل.
- أوجد عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم والأزرق المثقب.
- جهاز طرد مركزي عند 180 × جم لمدة 5 دقائق.
- أعد تعليق الخلايا في وسائط نمو مشروطة مبردة إلى كثافة خلية ~ 3 × 106 خلايا / مل.
- برفق مع الدوران ، أضف حجما متساويا من وسط الحفظ بالتبريد 2x المبرد. سيؤدي ذلك إلى رفع تركيز الخلية إلى ~ 1.5 × 106 خلايا / مل.
- القسمة 1 مل في قوارير الحفظ بالتبريد. ضع القوارير في حاوية تجميد الخلايا ، وأغلقها ، واقلبها 5-6 مرات لضمان بقاء الخلايا معلقة. ضع الحاوية عند -80 درجة مئوية لمدة 6-72 ساعة أو وفقا لبروتوكول حاوية التجميد. قم بإزالة القوارير من -80 درجة مئوية وانقلها إلى النيتروجين السائل لتخزينها على المدى الطويل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يحدد البروتوكول أعلاه الخطوات اللازمة للتعامل مع أنسجة الصمامات البشرية وعزل وإنشاء خطوط خلايا قابلة للحياة من هذه الأنسجة. تتم معالجة وريقات الصمام الأبهري لتضمين البارافين ، وتجميدها للتخزين طويل الأجل للتحليل الكيميائي الحيوي أو الجيني وهضمها لعزل VECs و VICs (الشكل 1). في حين أن العينات الجراحية من المحتمل أن يكون لها تشخيص سريري لتضيق الأبهر وقد تظهر عقيدات ثقيلة من التكلس يمكن رؤيتها بالعين المجردة ، فإن تكلس الصمام الأبهري موجود في عدد كبير من الأفراد المسنين (>65 عاما)32 ، وبسبب هذا الانتشار ، تخضع جميع الأنسجة - الجراحية والجثث - لتلطيخ فون كوسا أو إجراء مماثل لتقييم ما إذا كان التكلس موجودا (الشكل 2).
وقد وجد أن استخدام محلول التخزين البارد استقر بشكل كبير في خلايا أنسجة الصمام المستأصلة. يستخدم محلول التخزين البارد في عمليات زرع الأعضاء الحية. يتم مسحه من خلال الأعضاء إما قبل أو بعد إزالته من المتبرع ويترك في الأوعية الدموية لهذا العضو أثناء النقل على الجليد. لوحظ أن خطوط VEC تم إنشاؤها بسهولة أكبر من عينات المانحين من الأنسجة الجراحية ، وكانت خطوط المتبرع أكثر عرضة للاحتفاظ بمورفولوجيا الخلايا البطانية لمزيد من الممرات. كان هذا محيرا ، حيث لم تصل أنسجة المتبرع في كثير من الأحيان إلى المختبر لمدة 12-24 ساعة بعد الوفاة بينما تم الحصول على الأنسجة الجراحية بين 2 و 4 ساعات. عند تعبئة أنابيب العينات الجراحية بمحلول التخزين البارد بدلا من PBS ، زاد استرداد الخلايا بشكل كبير. كما هو موضح في الشكل 3 ، يمكن الحصول على كل من VECs و VICs القابلة للحياة لمدة تزيد عن 61 ساعة بعد استخراج الصمام. في حين يتم الحصول على نسبة أعلى قليلا من VICs الحية من VECs عندما يتم عزل الخلايا لمدة تصل إلى يوم واحد بعد استئصال الصمام ، تظل الخلايا قابلة للحياة بعد 48 ساعة بعد الختان. يتوافق ما يصل إلى 40٪ من إجمالي الخلايا المستعادة مع الخلايا الحية وقد لاحظنا أرقاما متسقة بين التكرارات البيولوجية. علاوة على ذلك ، يؤكد فحص التشكل أيضا هوية الخلية ؛ بينما تظهر VECs كخلايا معبأة وشبيهة بالحصى ومثبطة للنمو ، فإن مورفولوجيا VIC تشبه الخلايا الليفية العضلية ذات شكل المغزل. أكد التلوين المناعي للعينات أن 91.8٪ ± 1.8 (ن = 3) من VECs الموسعة كانت إيجابية لعلامة البطانة vWF بينما 92.0٪ ± 5.0 (ن = 3) من VICs الموسعة كانت إيجابية لعلامة الخلية الخلالية αSMA (الشكل 4). وتتماشى هذه الأرقام مع النتائج المبلغ عنها سابقا33.
الشكل 1: معالجة أنسجة الصمام وعزل الخلايا عن التحكم البشري وصمامات CAVD . (أ) تمثيل تخطيطي لمعالجة الأنسجة لتقييم مستويات تكلس الصمامات. (ب) تمثيل تخطيطي للمسار الزمني وخطوات عزل وتوصيف الخلايا البطانية للصمام البشري (VECs) والخلايا الخلالية للصمام (VICs) من أنسجة التحكم و CAVD. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تقييم التكلس . (أ) صورة تمثيلية لأنسجة صمام التحكم (العلوي) والمتكلسة (السفلية) من متبرعين بشريين. لاحظ أن عقيدات التكلس لأنسجة CAVD يمكن أن تغير بشدة التشكل والقدرة على استئصال المنشورات بشكل نظيف. (ب) تلطيخ الممثل فون كوسا لأنسجة صمام التحكم (يسار) و CAVD (يمين) بعد التثبيت والمعالجة الإضافية لأنسجة الصمام البشري. ملاحظة يتم الكشف عن التكلس من خلال وجود هطول الأمطار المظلمة في أنسجة النشرة. تم التقاط صور الصمام بكاميرا المختبر. تم التقاط صمامات Von Kossa الملطخة بهدف 10x ، شريط مقياس 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم بقاء الخلية (A) منحنيات بقاء VECs و VICs. تم الحصول على ثلاث منشورات من خمس عينات صمام. تمت معالجة النشرة الأولى من كل صمام على الفور (3-12 ساعة بعد الاستخراج) ، وتمت معالجة النشرة الثانية بعد حوالي 24 ساعة (22-35 ساعة) ، وتمت معالجة النشرة الثالثة بعد حوالي 48 ساعة من الحصول على الأنسجة (45-61 ساعة). تم حفظ منشورات الصمامات في محلول التخزين البارد عند 4 درجات مئوية حتى تتم معالجتها. يمثل المحور ص النسبة المئوية للخلايا الحية. (ب) مورفولوجيا الثقافات الصحية ل VECs (الألواح اليسرى) و VICs (الألواح اليمنى). تظهر الرسوم البيانية متوسط نسبة الخلايا الحية ± SD للخلايا المعزولة من أنسجة الصمام n = 5. تم التقاط الصور بهدف 4x و 10x ، وقضبان مقياس 200 ميكرومتر و 100 ميكرومتر ، على التوالي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تلطيخ مناعي تمثيلي على VECs و VICs. VECs إيجابية لعامل العلامة البطانية von Willebrand (vWF ، اللوحات اليسرى) بينما VICs موجبة للعلامة الخلالية αSMA. لاحظ أن بروتوكول العزل الخاص بنا يضمن كفاءة عزل عالية ؛ لم يتم الكشف عن أي تلوث متبادل بين VECs و VICs. تم التقاط الصور بهدف 10x ، شريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد الحصول على أنسجة السيطرة والمرض من البشر أمرا بالغ الأهمية لنمذجة الأمراض في المختبر وخارج الجسم الحي. ومع ذلك ، في حين أن المرء يتحدث في كثير من الأحيان عن تحديات سد الفجوة بين مقاعد البدلاء إلى جانب السرير ، فإن الترتيب العكسي - الانتقال من الجناح الجراحي إلى المقعد - غالبا ما يكون فجوة شاقة. من الضروري للعالم الأساسي الحصول على عينات الأنسجة البشرية الأولية التعاون مع عالم جراح مستثمر لديه فريق من الممرضات والفنيين الجراحيين ومساعدي الأطباء وطلاب الطب والمقيمين ومديري البروتوكول السريري الذين يمكنهم تسجيل المرضى والموافقة عليهم ، والمشاركة والمساعدة في التعامل السليم مع الأنسجة المستأصلة ، وتنسيق الخدمات اللوجستية المطلوبة لالتقاط الأنسجة. بدون بذل أقصى جهد من جميع المعنيين لتقليل الوقت من الاستئصال إلى عزل الخلايا ، سيتم تغيير أو فقدان المواد الخلوية الحيوية والمعلومات التي تحتوي عليها بشكل لا يمكن إصلاحه.
من الأهمية بمكان للحفاظ على صلاحية عينات الأنسجة استخدام محلول التخزين البارد. هذا هو نفس الحل الذي تستخدمه فرق زراعة الأعضاء في UPMC والمراكز الطبية الأخرى لزراعة الأعضاء. تم الحصول على إنتاجية أفضل للخلايا من الأنسجة الجثة التي تم استئصالها من المتبرع قبل ساعات عديدة من الأنسجة التي تم الحصول عليها بسرعة أكبر من غرفة العمليات ولكن تم الاحتفاظ بها في برنامج تلفزيوني بارد. كان هذا الاكتشاف العرضي ضروريا لشراء الخلايا من الأنسجة البشرية. يتراوح وقت الشراء من استئصال الأنسجة إلى التسليم في المختبر من 1-5 ساعات للأنسجة الجراحية وما يزيد عن 24 ساعة للأنسجة الجثثية. وبالمقارنة ، يمكن في كثير من الأحيان شراء ومعالجة الأنسجة الحيوانية في غضون دقائق من القتل الرحيم ، وهو أمر مثالي لبقاء الخلية. في حالة عدم وجود محلول التخزين البارد ، من المحتمل أن يكون أداء الوسيط المناسب لزراعة الخلايا أفضل من PBS ، ولكن لم يتم اختبار هذا الوسيط هنا بسبب نجاح محلول التخزين البارد في زراعة الأعضاء الحية واستلام الأنسجة الجثة في هذا المحلول. الحل مستقر على الرف وهو مثالي للتخزين في غرف العمليات ، ومن المعروف أن مكونات معينة مثل الأدينوزين تعزز الاستجابات المفيدة للضغوط الخلوية مثل نقص التروية / نقص الأكسجة21,34.
خطوة أساسية أخرى للحصول على خلايا قابلة للحياة هي غسل الأنسجة بمبيدات الفطريات والجنتاميسين ومبيد الجراثيم. يساعد هذا الشطف القصير على ضمان بقاء الخلايا غير ملوثة بالبكتيريا والفطريات. بنفس القدر من الأهمية هي خطوات هضم VECs من أنسجة الصمام ، حيث في غضون بضع دقائق فقط ، يتم فصل VECs ثم مسحها من سطح وريقات الصمام. الهضم اللاحق ل VICs الموجودة على المصفوفة الكثيفة خارج الخلية للنشرة لديه مساحة أكبر بكثير للمناورة للمدة والقوة. يسمح علاج الأنسجة غير المتحيز الموصوف في هذا البروتوكول بعزل مجموعتي الخلايا الرئيسيتين الموجودتين في نشرة الصمام ، VECs و VICs. على الرغم من أن تحليل نسخ الخلية الواحدة الأخير قد أظهر تعايش ما لا يقل عن أربعة عشر نوعا فرعيا مختلفا من الخلايا الموجودة في الصمام البشري ، بما في ذلك ست خلايا انسجة غير مشتقة من الصمام في أنسجة CAVD35 ، فقد يمثل هذا التنوع اختلافات بسبب التأثيرات الناتجة عن معالجة وهضم هذه الأنسجة المتصلبة ، أو قد يكون بسبب البيئات الدقيقة المختلفة التي تتعرض لها خلايا الوريقات: تتعرض VECs لتدفقين مختلفين للدم بينما يتم تضمين VICs في ثلاث طبقات مصفوفة مختلفة خارج الخلية 8,9. يضمن بروتوكول العزل والتحليل واسع النطاق الموصوف هنا أن أكثر من 90٪ من VECs و VICs تتوافق مع النمط الظاهري الرئيسي. على الرغم من أنه يمكن العثور على درجة من التغاير ، إلا أنها لا تؤثر على النتائج العامة لدراسة توازن VEC و VIC8،9،13،14،15،16.
من المهم أيضا ملاحظة أن المرضى وأنسجة الصمامات الخاصة بهم ، وبالتالي خطوط الخلايا المشتراة منهم ، ليست متطابقة. قد تؤثر الوراثة ، والأمراض المشتركة ، والتعامل أثناء الجراحة والمعالجة ، ونضارة مكونات محلول الهضم على معدل النمو وربما حتى على السلوك أو النمط الظاهري للخلايا المعزولة. بينما توضح الدراسة الحالية القدرة على إنتاج عدد كاف من الخلايا القابلة للحياة من خلال هذا الإجراء ، قد تكون هناك اختلافات فطرية أو مستحثة في خطوط الخلايا هذه والتي قد تؤثر على التجارب النهائية. غالبا ما يكون من الصعب معرفة الوقت بدقة منذ إزالة الأنسجة من المريض أو المتبرع ، وخاصة في حالة الأخير ، الوقت منذ توقف الدورة الدموية. علاوة على ذلك ، هناك تباين متأصل بين الأنسجة فيما يتعلق بعدد خلايا الصمام القابلة للحياة التي تم الحصول عليها ، والقدرة التكاثرية للخلايا ، والاحتفاظ بالنمط الظاهري للخلية. قد تحتوي خطوط الخلايا على طفرات جينية - إما خلقية أو جسدية - لا يعرفها الطبيب وفريق البحث ، وقد تؤدي إعادة تشكيل الأنسجة ومعالجتها اللاحقة أيضا إلى تعديل النمط الظاهري للخلية أو حتى علم التخلق. على هذا النحو ، بالنسبة لجميع التجارب التي تستخدم فيها هذه الخلايا البشرية الأولية ، من الضروري للغاية استخدام النسخ البيولوجية - أي خطوط الخلايا التي تم الحصول عليها من مرضى مختلفين - على الرغم من الوقت والتكلفة الكبيرة التي تتكبدها. هذا يساعد على ضمان أن أي نتائج ليست بسبب الآثار المربكة من شراء ومعالجة الأنسجة. يمكن تعديل معدل الانتشار المتغير لخطوط الخلايا المختلفة إما عن طريق جمع الخلايا في التجارب في أوقات مختلفة أو زرع الخلايا للتجارب بكثافات مختلفة ؛ لا توجد إجابة واحدة هي الأفضل لجميع التصاميم التجريبية. في حين أن المضاعفات ليست ضئيلة ، فإن استخدام التحكم البشري الأساسي وخطوط الخلايا المشتقة من أنسجة CAVD للنماذج التجريبية في المختبر وخارج الجسم الحي أمر ضروري لتحديد عوامل البدء وعمليات الانتشار التي تدفع التسبب في CAVD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يتلقى IS دعما بحثيا مؤسسيا من Atricure و Medtronic ويعمل كمستشار لشركة Medtronic Vascular. لا يرتبط أي من هذه الصراعات بهذا العمل. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر جيسون دوبينز على المناقشة الثاقبة والقراءة النقدية لهذه المخطوطة. نود أن نعرب عن تقديرنا لمركز استعادة الأعضاء والتعليم لمساعدتهم ودعمهم ونشكر المتبرعين بالأنسجة وعائلاتهم على جعل هذه الدراسة ممكنة. يتم جمع جميع عينات المرضى من الأفراد المسجلين في الدراسات المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بيتسبرغ وفقا لإعلان هلسنكي. تمت الموافقة على الأنسجة الجثة التي تم الحصول عليها عن طريق مركز استعادة الأعضاء والتعليم (CORE) من قبل لجنة جامعة بيتسبرغ للإشراف على البحوث والتدريب السريري الذي يشمل المتوفين (CORID).
بعض الشخصيات التي تم إنشاؤها باستخدام Biorender.com.
يتم دعم CSH من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم K22 HL117917 و R01 HL142932 ، جمعية القلب الأمريكية 20IPA35260111.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
- Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
- Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
- Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
- Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
- Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
- Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
- Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
- Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
- Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
- Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
- Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
- Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
- Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
- Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
- Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
- Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
- Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
- Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
- Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
- Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
- Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
- Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
- Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T.
- Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
- Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
- Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
- St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
- Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).
