Summary
Questo protocollo descrive la raccolta di valvole aortiche umane estratte durante le procedure chirurgiche di sostituzione della valvola aortica o dal tessuto cadaverico e il successivo isolamento, espansione e caratterizzazione delle cellule endoteliali e interstiziali della valvola primaria specifiche del paziente. Sono inclusi importanti dettagli riguardanti i processi necessari per garantire la vitalità cellulare e la specificità fenotipica.
Abstract
La malattia della valvola aortica calcifica (CAVD) è presente in quasi un terzo della popolazione anziana. L'ispessimento, l'irrigidimento e la calcificazione della valvola aortica provocano stenosi aortica e contribuiscono all'insufficienza cardiaca e all'ictus. La patogenesi della malattia è multifattoriale e stress come l'infiammazione, il rimodellamento della matrice extracellulare, il flusso turbolento e lo stress meccanico e la tensione contribuiscono alla differenziazione osteogenica delle cellule endoteliali e interstiziali valvolari. Tuttavia, i precisi fattori iniziali che guidano la transizione osteogenica di una cellula sana in una cellula calcificante non sono completamente definiti. Inoltre, l'unica terapia attuale per la stenosi aortica indotta da CAVD è la sostituzione della valvola aortica, in cui viene rimossa la valvola nativa (sostituzione chirurgica della valvola aortica, SAVR) o una valvola sostitutiva completamente pieghevole viene inserita tramite un catetere (sostituzione della valvola aortica transcatetere, TAVR). Queste procedure chirurgiche hanno un costo elevato e comportano gravi rischi; Pertanto, l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici per la scoperta di farmaci è imperativa. A tal fine, il presente studio sviluppa un flusso di lavoro in cui i tessuti rimossi chirurgicamente dai pazienti e i tessuti dei cadaveri dei donatori vengono utilizzati per creare linee primarie specifiche del paziente di cellule valvolari per la modellazione della malattia in vitro. Questo protocollo introduce l'utilizzo di una soluzione di conservazione a freddo, comunemente utilizzata nel trapianto di organi, per ridurre i danni causati dal tempo di approvvigionamento spesso lungo tra l'escissione tissutale e la lavorazione di laboratorio con il vantaggio di stabilizzare notevolmente le cellule del tessuto asportato. I risultati del presente studio dimostrano che le cellule valvolari isolate mantengono la loro capacità proliferativa e i fenotipi endoteliali e interstiziali in coltura fino a diversi giorni dopo la rimozione della valvola dal donatore. L'utilizzo di questi materiali consente la raccolta di cellule di controllo e CAVD, da cui vengono stabilite sia le linee cellulari di controllo che quelle di malattia.
Introduction
La malattia della valvola aortica calcifica (CAVD) è una patologia cronica caratterizzata da infiammazione, fibrosi e macrocalcificazione dei lembi della valvola aortica. Il rimodellamento progressivo e la calcificazione dei foglietti (definita sclerosi aortica) possono portare all'ostruzione del flusso sanguigno (stenosi aortica) che contribuisce all'ictus e porta all'insufficienza cardiaca. Attualmente l'unico trattamento per CAVD è la sostituzione chirurgica o transcatetere della valvola aortica (SAVR e TAVR, rispettivamente). Non esiste un'opzione non chirurgica per arrestare o invertire la progressione della CAVD e, senza sostituzione valvolare, i tassi di mortalità si avvicinano al 50% entro 2-3 anni 1,2,3. La definizione dei meccanismi alla base di questa patologia identificherà potenziali nuovi approcci terapeutici.
In un adulto sano, i lembi della valvola aortica hanno uno spessore di circa un millimetro e la loro funzione principale è quella di mantenere il flusso unidirezionale di sangue dal ventricolo sinistro4. Ciascuno dei tre lembi è composto da uno strato di cellule endoteliali valvolari (VEC) che riveste la superficie esterna del foglietto e funziona come una barriera. I VEC mantengono l'omeostasi valvolare regolando la permeabilità, l'adesione delle cellule infiammatorie e la segnalazione paracrina 5,6,7. Le cellule interstiziali valvolari (VIC) comprendono la maggior parte delle cellule all'interno del foglietto valvolare8. I VIC sono disposti in tre strati distinti nel volantino. Questi strati sono noti come ventricolari, spongiosa e fibrosa9. Il ventricolo è rivolto verso il ventricolo sinistro e contiene fibre di collagene ed elastina. Lo strato intermedio, la spongiosa, contiene un alto contenuto di proteoglicano che fornisce flessibilità di taglio durante il ciclo cardiaco. Lo strato esterno di fibrosa si trova vicino alla superficie di deflusso sul lato aortico ed è ricco di collagene fibrillare di tipo I e di tipo III che fornisce forza per mantenere la coaptazione durante la diastole10,11,12. I VIC risiedono in uno stato quiescente, tuttavia, fattori come l'infiammazione, il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e lo stress meccanico possono interrompere l'omeostasi VIC 8,9,13,14,15,16. Con la perdita dell'omeostasi, le VIC attivano e acquisiscono un fenotipo simile ai miofibroblasti in grado di proliferare, contrazione e secrezione di proteine che rimodellano il millieu17 extracellulare. I VIC attivati possono trasformarsi in cellule calcificanti che ricordano la differenziazione di una cellula staminale mesenchimale (MSC) in un osteoblasto 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
La calcificazione sembra iniziare nello strato di fibrosa ricco di collagene dai contributi di entrambi i VEC e VIC, ma si espande e invade gli altri strati del foglietto8. Pertanto, è chiaro che sia i VEC che i VIC rispondono agli stimoli per sovraregolare l'espressione dei geni osteogenici, tuttavia, gli eventi precisi che guidano l'attivazione dei geni osteogenici, così come la complessa interazione tra le cellule e la matrice extracellulare del foglietto, rimangono mal definiti. I modelli murini non sono una fonte ideale per studiare i driver non genetici della patogenesi della CAVD, poiché i topi non sviluppano CAVD de novo26,27, quindi è necessario l'uso di tessuti umani primari e delle linee cellulari primarie isolate da questi tessuti. In particolare, ottenere queste cellule in numero elevato e di buona qualità è imperativo, poiché il campo delle colture cellulari 3D e della modellazione organoide si sta espandendo ed è probabile che diventi un'alternativa ex vivo basata sull'uomo ai modelli murini.
Lo scopo del presente metodo è quello di condividere un flusso di lavoro che ha stabilito le condizioni per isolare e far crescere in modo efficiente VEC e VIC ottenuti da valvole rimosse chirurgicamente da donatori umani. Studi precedenti hanno dimostrato il successo dell'isolamento di VEC e VIC da valvole suine28 e murine29, a nostra conoscenza questo è il primo a descrivere l'isolamento di queste cellule nei tessuti umani. Il protocollo qui descritto è applicabile alle valvole asportate umane e aggira e migliora notevolmente il danno causato dal tempo di approvvigionamento spesso lungo tra l'escissione dei tessuti e la lavorazione di laboratorio introducendo l'utilizzo di una soluzione di conservazione a freddo, una soluzione tamponata clinicamente utilizzata nei trapianti di organi che stabilizza notevolmente le cellule del tessuto asportato. Il protocollo qui descritto mostra anche come determinare il fenotipo cellulare e garantire un'elevata efficienza della sopravvivenza cellulare con una minima contaminazione crociata cellulare.
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Protocol
Tutti i campioni di pazienti sono raccolti da individui iscritti a studi approvati dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Pittsburgh in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. I tessuti cadaverici ottenuti tramite il Center for Organ Recovery and Education (CORE) sono stati approvati dal Comitato per la supervisione della ricerca e della formazione clinica che coinvolge i decedenti (CORID).
1. Omologazione e sicurezza
- Ottenere l'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB) o una nota esente per qualsiasi raccolta di campioni di pazienti o tessuti cadaverici in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.
- Seguire la formazione istituzionale richiesta per lavorare con tessuti umani come la formazione sui patogeni trasmessi dal sangue, la ricerca sui soggetti umani biomedici, la privacy e la sicurezza delle informazioni e il trasporto e la spedizione di materiali biologici.
2. Logistica e preparazione
- Campioni chirurgici
- Assicurarsi che un frigorifero sia disponibile e situato vicino alla sala operatoria. Conservare in questo frigorifero provette coniche da 50 mL pre-etichettate con nomenclatura deidentificata contenenti 40 ml di aliquote sterili di soluzione frigorifera per l'uso da parte del personale chirurgico. Questi tubi sono stabili a 4 °C fino alla data di scadenza sulla confezione originale.
- Al momento dell'estrazione, posizionare il tessuto valvolare in questi tubi. Posizionare i tubi in un contenitore secondario sigillato come un sacchetto di plastica a prova di perdite o un contenitore di plastica etichettato con un'etichetta di rischio biologico. I tessuti vengono prelevati e trasportati sul ghiaccio secondo protocolli istituzionali per il trasporto dei rischi biologici.
- Campioni cadaverici
- Immergere gli organi recuperati in una soluzione di conservazione a freddo, collocarli in un recipiente di contenimento secondario sigillato e trasportarli su ghiaccio secondo protocolli istituzionali per il trasporto di rischi biologici.
3. Preparazione dei reagenti
- Fai piatti rivestiti di collagene almeno il giorno prima.
- In un tubo conico da 50 ml, mescolare 5 ml di alcool isopropilico, 8,7 ml di acido acetico e 0,5 μg di collagene I in polvere. Portare fino a 50 ml con acqua sterile. Miscelare e filtrare attraverso un filtro da 0,45 μm.
- Sotto un cappuccio di coltura cellulare sterile, aggiungere una soluzione di collagene sufficiente a 6 piastre e piatti da 10 cm per coprire l'intero fondo. Coprire il piatto e lasciare riposare per 4-6 ore a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione in eccesso con una pipetta sterile, porla in un nuovo tubo conico sterile da 50 mL e risparmiare a 4 °C per ottenere piastre aggiuntive. La soluzione può essere conservata a 4 °C per diversi mesi.
- Asciugare le piastre in un'incubatrice a 37 °C durante la notte e successivamente conservarle in un sacchetto richiudibile a 4 °C. Piatti e piatti rivestiti di collagene possono essere conservati per diversi mesi.
- Autoclave i seguenti articoli: pinze per tessuti, forbici per tessuti, cotton fioc e garze.
- Terreni di crescita VEC: preparare e utilizzare il terreno di coltura delle cellule endoteliali secondo i protocolli del produttore. Conservare al buio a 4 °C. Riscaldare a 37 °C appena prima dell'uso sulle celle, non lasciare i mezzi nel bagno di riscaldamento più a lungo del necessario (10-15 minuti sono sufficienti). Utilizzare il supporto entro un mese dalla preparazione.
- Terreno di coltura VIC: Integratore DMEM terreno base (4,5 g/L di glucosio, integratore di L-glutammina, 110 mg/L di piruvato di sodio)30 con 10% di FBS inattivato dal calore e 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina. Conservare al buio a 4 °C per un massimo di 3 mesi. Riscaldare a 37 °C appena prima dell'uso sulle celle, non lasciare i mezzi nel bagno di riscaldamento più a lungo del necessario (10-15 minuti sono sufficienti).
- Preparare la soluzione di risciacquo sterile appena prima dell'uso. Integrare PBS sterile con fungicida da 2,5 μg/ml, 0,05 mg/ml di gentamicina e 5 μg/mL di battericida.
- Rendere la soluzione sterile di collagenasi appena prima dell'uso. Aggiungere 5 mg di collagenasi II a 5 ml di terreno base DMEM fresco sterile. Mescolare bene e sterilizzare la soluzione passando attraverso un filtro da 0,45 μm. Conservare in ghiaccio fino all'uso.
4. Preparazione e lavorazione dei tessuti
NOTA: L'approvazione istituzionale per l'uso di tessuti umani deve essere ottenuta prima di iniziare il lavoro. Durante la manipolazione dei fazzoletti, devono essere indossati i seguenti dispositivi di protezione individuale (DPI): un camice avvolgente a barriera liquida monouso o un camice da laboratorio frontale dedicato con bottone con grembiule avvolgente e rifogli monouso per maniche; una visiera facciale completa o occhiali di sicurezza con una maschera chirurgica; doppi guanti; scarpe strette; e indumenti per coprire le gambe. I diagrammi completi del flusso di lavoro della preparazione tissutale per la valutazione della calcificazione (Sezione 5) e l'isolamento cellulare (Sezioni 6 e 7) sono illustrati rispettivamente nella Figura 1A,B.
- Al ricevimento del campione di organo cadaverico, asportare la radice aortica e immergerla in un tubo conico da 50 ml di soluzione di risciacquo sterile. Al ricevimento del campione chirurgico, rimuovere dai recipienti di trasporto e immergere in un tubo conico da 50 ml di soluzione di risciacquo sterile. Posizionare il tubo contenente il tessuto nel secchiello del ghiaccio sul bilanciere e mescolare per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
NOTA: L'elaborazione dei tessuti il più vicino possibile al momento dell'estrazione produrrà il miglior recupero cellulare, tuttavia le cellule vitali possono essere raccolte fino a 61 ore dopo l'escissione e i dati mostrano che i VIC sono più robusti dei VEC con l'aumentare del tempo. Se il tessuto non può essere trattato immediatamente, quando possibile, rimuovere il tessuto, eseguire il punto 4.1, quindi riporlo in una soluzione fresca di conservazione sterile e conservarlo a 4 °C fino al momento di procedere. Le valvole raccolte durante gli interventi chirurgici notturni o del fine settimana possono essere conservate in una soluzione di conservazione a 4 °C da 40 ml e sono ancora in grado di produrre cellule vitali più di 2 giorni dopo l'estrazione. - Spruzzare i tubi con etanolo al 70% e passare a una cappa sterile. Rimuovere il tessuto e asportare due lembi valvolari (figura 2A). Introdurre un foglio illustrativo in un flaconcino criogenico (o 2-3 flaconcini se sono necessari diversi pezzi più piccoli per analisi future) e congelare a scatto facendo cadere azoto liquido, quindi conservare a -80 °C.
- Se la valvola è bicuspide, asportare un solo foglio. Usando le forbici, tagliare il foglietto a metà dal nodulo alla cerniera. Usi metà del foglio illustrativo per il congelamento a scatto e l'altra metà per il punto 4.3.
- Elaborare il secondo foglietto illustrativo per l'incorporazione della paraffina per valutare il contenuto di calcificazione tagliandolo a metà dal nodulo alla cerniera. Posizionare entrambi i pezzi in una cassetta immersa in paraformaldeide (PFA) al 4%, quindi posizionarli su un bilanciere a RT per un minimo di 2 ore ma non più di 4 ore.
NOTA: tempi di fissazione più lunghi creano più sfondo con colorazione immunofluorescente. Una volta eseguiti i punti 4.2 e 4.3, passare immediatamente alla sezione 6 e tornare al punto 4.4 dopo il punto 6.12. - Dopo la fissazione, lavare i tessuti immergendoli in PBS fresco per 1 ora 3-4 volte. Dopo questi lavaggi, i campioni possono rimanere in PBS a 4 °C per diversi mesi, se necessario. Procedere al passaggio successivo appena prima dell'incorporamento.
- Passare gradualmente da PBS a etanolo al 70%. Lavare 30-60 minuti ogni passaggio con etanolo 1:4 al 70%:PBS; 1:1 70% etanolo:PBS, 4:1 70% etanolo:PBS; 70% di etanolo.
- Incorporare il tessuto in modo tale che le sezioni rivelino i tre strati del foglietto illustrativo (Figura 1A) secondo i protocolli stabiliti31. In alternativa, e se disponibile, portare il tessuto a un nucleo patologico per l'incorporazione e il taglio.
- Dopo aver maneggiato i fazzoletti, smaltire o conservare i DPI a seconda dei casi e lavarsi immediatamente le mani. Decontaminare tutte le apparecchiature, le superfici e i rifiuti solidi e liquidi con una diluizione 1:10 di candeggina o detergente disinfettante. Lasciare 20 minuti per la decontaminazione, quindi seguire con un risciacquo con etanolo al 70%. Trattare la cappa di coltura cellulare con spray al micoplasma secondo le istruzioni del produttore.
5. Colorazione di Von Kossa per il contenuto di calcio
NOTA: Questo può essere fatto bene dopo l'isolamento cellulare e la creazione della linea, ma assicurarsi di collegare il livello di calcificazione del tessuto ai documenti relativi alla linea cellulare primaria stabilita.
- Tagliare fette di paraffina spesse 5 o 10 μm su vetrini di vetro e cuocere i vetrini a 65 °C per 1 ora, quindi raffreddare a RT.
- Utilizzando soluzioni fresche, deparaffinizzare i vetrini immergendoli come segue: xilene al 100% per 30 minuti, 2x; 100% etanolo per 3 min, 2x; 90% etanolo per 3 min; 80% etanolo per 3 min; 70% etanolo per 3 min; 50% etanolo per 3 min; acqua ultrapura per 3 min; Conservare in acqua ultrapura fino ai passaggi successivi.
NOTA: i tempi sopra riportati sono minimi, ogni passaggio potrebbe richiedere più a lungo. - Procedere con la colorazione Von Kossa secondo i protocolli del produttore.
- Valutare l'intera area della valvola al microscopio e assegnare un tessuto di controllo (nessun segno di calcificazione) o CAVD (qualsiasi evidenza di calcificazione, Figura 2B).
6. Isolamento, espansione e conferma delle cellule endoteliali valvolari (VEC)
- In una cappa di coltura cellulare sterile, aprire il tubo conico contenente il foglietto della valvola rimanente e posizionare il foglio in un nuovo tubo conico da 50 mL riempito con PBS ghiacciato. Tappare il tubo e invertire delicatamente o posizionare su un bilanciere per 2 minuti a RT.
- Rimuovere il tessuto in un piatto da 60 mm riempito con 5-7 ml di soluzione fredda di collagenasi. Usando una pinza, immergere entrambi i lati del foglietto nella soluzione 3-4 volte. Incubare il tessuto per 5-10 minuti nell'incubatore di coltura cellulare a 37 °C, facendo oscillare delicatamente il tessuto ogni 2 minuti 3-4 volte.
- Rimuovere 2 mL della soluzione dal piatto e metterli in un tubo conico sterile da 15 ml. Posizionare una pinza sul nodulo e utilizzare un batuffolo di cotone sterile asciutto per scorrere dalla pinza alla cerniera, facendo roteare il tampone mentre lo si sposta lungo il foglietto. Tra un colpo e l'altro, scorrere il tampone nella soluzione nel tubo conico da 15 mL per rimuovere le cellule. Ripetere per tamponare completamente la superficie del tessuto, quindi capovolgere e ripetere sull'altro lato.
- Tenendo il foglietto della valvola con una pinza in una mano e una pipetta da 1 mL nell'altra, sciacquare le superfici del foglietto con la soluzione nel piatto. Una volta risciacquato, trasferire tutta la soluzione contenente i VEC nel piatto nello stesso tubo conico da 15 mL con le cellule del tampone e procedere al punto 6.5. Introdurre il tessuto valvolare rimanente in un nuovo tubo conico da 15 mL con 7 mL di soluzione sterile di collagenasi e procedere al punto 7.1.
- Centrifugare il tubo contenente i VEC a 180 x g per 5 minuti per pellettare i VEC isolati. Aspirare il surnatante e risospendere in 3 mL di terreno di coltura VEC. Centrifugare ancora una volta e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno di crescita e determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e un tripano blu.
- Risospendere il pellet VEC in 2 ml di terreno di crescita VEC e placcare le cellule in un pozzetto pre-rivestito di collagene di una piastra a 6 pozzetti a circa 5 x 105 cellule / cm2. Lasciare che le cellule crescano almeno 3-4 giorni, quindi rimuovere i terreni e ricostituire con mezzi freschi. Ripetere il cambio del supporto ogni 4 giorni. I VEC cresceranno in chiazze a forma di ciottoli (Figura 3B, pannelli di sinistra).
- Quando i cerotti VEC coprono il >80% della piastra, dividono le cellule a circa 1,3 x 104 cellule / cm 2 a seconda della velocità con cui crescono (se raggiungono l'80% in meno di 1 settimana diviso a un numero leggermente inferiore di cellule / cm2).
- Per dividere, lavare le cellule due volte con 2 mL di DPBS, quindi aggiungere abbastanza reagente di dissociazione per coprire solo la superficie delle cellule. Incubare per 2-3 minuti a 37 °C, controllando che le cellule non siano troppo incubate. Interrompere la digestione aggiungendo lo stesso volume di terreno di crescita VEC e trasferire il liquido in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 180 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere in un volume appropriato di mezzi per il numero di pozzetti/piastre necessari.
NOTA: Una volta espansi in una piastra di 10 cm, i VEC possono talvolta perdere la loro morfologia e cambiare fenotipo man mano che proliferano. Ciò tende a verificarsi quando i VEC sono seminati a bassa confluenza durante la creazione e l'espansione della linea cellulare. - Per garantire una coltura pura, considerare l'utilizzo di sfere superparamagnetiche CD31+ ad ogni spaccatura.
- Per 1 x 108 o meno celle (un piatto da 10 cm o meno), preparare 25 μL di perle superparamagnetiche lavando secondo i protocolli del produttore.
NOTA: si consiglia di eseguire il passaggio 6.10 prima della tripsinizzazione dei VEC. - Staccare le cellule come al punto 6.8 ma risospendere in 500 μL di PBS con 0,1% BSA, pH 7,4, e metterle in una provetta da centrifuga da 2 ml. Aggiungere 500 μL di perle lavate e risospese al tubo da 2 mL di cellule e incubare su un rotatore per 20 minuti a 4 °C.
- Posizionare i tubi sul magnete per 2 minuti. Mentre il tubo è ancora nel magnete, rimuovere con attenzione il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete, aggiungere 1 mL di PBS fresco con BSA allo 0,1%, pipettare delicatamente 2-3 volte, quindi riposizionare sul magnete per 2 minuti. Ripeti altre 2 volte. Dopo la rimozione finale del tampone, risospendere le celle nei substrati di crescita nel volume necessario per la riplaccatura.
NOTA: Le cellule avranno ancora perline, ma queste non influenzeranno la crescita e verranno rimosse nei passaggi successivi. - Una volta che le cellule sono state espanse, oltre alla morfologia, confermare il fenotipo VEC mediante colorazione positiva per marcatori immunofluorescenti come il fattore di von Willebrand (vWF), la caderina 5 (CDH5) o PECAM-1 / CD31 e colorazione negativa per marcatori VIC come la calponina 1 (CNN) o l'actina della muscolatura liscia alfa-2 (αSMA, Figura 4, pannelli di sinistra).
7. Isolamento, espansione e stoccaggio delle celle interstiziali valvolari (VIC)
- Come indicato nella fase 6.4, dopo aver rimosso i VEC dal tessuto valvolare, il foglietto viene posto in un tubo conico da 15 mL con soluzione di collagenasi da 7 ml. Incubare per 12 ore nell'incubatore di coltura cellulare con il tappo leggermente aperto per consentire lo scambio di gas. L'isolamento riuscito delle VIC può ancora verificarsi fino a 18 ore in soluzione di collagenasi.
- Dopo l'incubazione, in una cappa di coltura cellulare sterile, mescolare delicatamente il tessuto mediante pipettaggio con una pipetta sierologica per garantire il rilascio di VIC dal tessuto del foglietto.
- Rimuovere la sospensione cellulare e passare attraverso un filtro da 0,70 μm in un tubo conico da 50 ml.
- Aggiungere 7 mL di terreno di crescita VIC al tubo da 50 mL e centrifugare a 180 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di crescita VIC e determinare il numero di cellule. Placcare i VIC in un piatto trattato con coltura tissutale da 60 mm a 1,3 x 104 cellule/cm2.
- Lasciare che le cellule crescano almeno 1-2 giorni prima di sostituire i media. Rimuovere i media e lavare due volte DPBS per rimuovere i detriti residui e sostituirli con un nuovo terreno di crescita. Ricostituire il mezzo ogni 2-3 giorni. I VIC cresceranno in forma di fibroblasti (Figura 3B, pannelli di destra).
- Quando i VIC raggiungono una confluenza del >90%, lavare due volte con DPBS per rimuovere il mezzo in eccesso e staccare le cellule aggiungendo un volume appropriato di reagente di dissociazione preriscaldato per coprire la piastra (cioè 2-3 ml per piatto da 10 cm). Incubare il piatto in un'incubatrice a 37 °C. I VIC si staccheranno dal piatto dopo 2-3 minuti di incubazione. Aggiungere 4-6 ml di fluido preriscaldato.
NOTA: Se le cellule impiegano più di 3 minuti per sollevarsi dalla piastra, il reagente di dissociazione potrebbe aver perso potenza. Se necessario, è possibile utilizzare un raschietto cellulare per sollevare delicatamente le cellule. - Trasferire la sospensione cellulare in un tubo e centrifugare delicatamente a 180 x g per 5 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere delicatamente il pellet cellulare nei mezzi di crescita VIC preriscaldati e determinare il numero di cellule vitali utilizzando un emocitometro e un tripano blu. Seminare le cellule vitali ad una densità 1:2 del piatto originale (cioè ~ 1 × 106 celle per piatto da 10 cm o 1,3 x 104 celle/cm2).
- Valutare il fenotipo VIC mediante colorazione positiva per marcatori immunofluorescenti come αSMA, CNN o SM22α e colorazione negativa per marcatori VEC come CD31, CDH5 o vWF (Figura 4, pannelli di destra).
NOTA: Il flusso di lavoro del protocollo qui presentato seleziona in modo imparziale un foglietto illustrativo per l'isolamento di VEC e VIC, mentre i foglietti rimanenti vengono utilizzati per la colorazione di Von Kossa (Sezione 5) e il congelamento a scatto.
8. Conservazione cellulare a lungo termine
- Una volta espanso, congelare le celle per la conservazione a lungo termine. Lavare le cellule due volte con 2-5 mL di DPBS, quindi aggiungere abbastanza reagente di dissociazione per staccare le cellule come nei passaggi 6.8 e 7.6. Interrompere la digestione aggiungendo un volume uguale di mezzi di crescita VEC o VIC e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml.
- Determinare il numero di cellule vitali utilizzando un emocitometro e tripano blu.
- Centrifugare a 180 x g per 5 min.
- Risospendere le cellule in terreni di crescita condizionati refrigerati a una densità cellulare di ~ 3 × 106 cellule / ml.
- Delicatamente con vortice, aggiungere un volume uguale di mezzo di crioconservazione refrigerato 2x. Ciò porterà la concentrazione cellulare a ~ 1,5 × 106 cellule / ml.
- Aliquote 1 mL in flaconcini di crioconservazione. Posizionare i flaconcini in un contenitore di congelamento cellulare, chiudere e capovolgere 5-6 volte per assicurarsi che le cellule rimangano sospese. Porre il contenitore a -80 °C per 6-72 ore o secondo il protocollo del contenitore di congelamento. Rimuovere i flaconcini da -80 °C e trasferirli in azoto liquido per una conservazione a lungo termine.
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Representative Results
Il protocollo di cui sopra delinea i passaggi necessari per la manipolazione dei tessuti valvolari umani e l'isolamento e la creazione di linee cellulari vitali da questi tessuti. I foglietti della valvola aortica vengono elaborati per l'incorporazione di paraffina, congelati a scatto per la conservazione a lungo termine per analisi biochimiche o genetiche e digeriti per l'isolamento di VEC e VIC (Figura 1). Mentre i campioni chirurgici avranno probabilmente una diagnosi clinica di stenosi aortica e possono presentare pesanti noduli di calcificazione che possono essere visibili ad occhio nudo, la calcificazione della valvola aortica è presente in un numero significativo di individui anziani (>65 anni)32, e a causa di questa prevalenza tutti i tessuti - chirurgici e cadaverici - sono sottoposti a colorazione di Von Kossa o procedura simile per valutare se la calcificazione è presente (Figura 2).
È stato riscontrato che l'uso di una soluzione di conservazione a freddo ha notevolmente stabilizzato le cellule del tessuto valvolare asportato. La soluzione di conservazione a freddo viene utilizzata nei trapianti di organi vivi. Viene lavato attraverso gli organi prima o dopo la rimozione dal donatore e lasciato nella vascolarizzazione di quell'organo durante il trasporto sul ghiaccio. È stato osservato che le linee VEC erano più facilmente stabilite da campioni di donatori rispetto ai tessuti chirurgici e le linee donatrici avevano maggiori probabilità di mantenere la loro morfologia delle cellule endoteliali per più passaggi. Questo era sconcertante, poiché i tessuti dei donatori spesso non raggiungevano il laboratorio per 12-24 ore dopo l'autopsia, mentre il tessuto chirurgico veniva ottenuto tra le 2 e le 4 ore. Dopo aver imballato le provette del campione chirurgico con una soluzione di conservazione a freddo anziché PBS, il recupero cellulare è notevolmente aumentato. Come mostrato nella Figura 3, sia i VEC vitali che i VIC possono essere ottenuti fino a 61 ore dopo l'estrazione della valvola. Mentre una percentuale leggermente superiore di VIC vivi si ottiene rispetto ai VEC quando le cellule vengono isolate fino a un giorno dopo l'escissione valvolare, le cellule rimangono vitali dopo 48 ore dall'escissione. Fino al 40% del totale delle cellule recuperate corrisponde a cellule vive e abbiamo osservato cifre coerenti tra le repliche biologiche. Inoltre, l'ispezione morfologica conferma anche l'identità cellulare; mentre i VEC appaiono come cellule impaccate, simili a ciottoli e inibite dalla crescita a contatto, la morfologia VIC è simile ai miofibroblasti con una forma a fuso. L'immunocolorazione dei campioni ha confermato che il 91,8% ± 1,8 (n = 3) delle VEC espanse erano positive per il marcatore endoteliale vWF, mentre il 92,0% ± 5,0 (n = 3) delle VIC espanse erano positive per il marcatore delle cellule interstiziali αSMA (Figura 4). Queste cifre sono in linea con i risultati riportati in precedenza33.
Figura 1: Trattamento del tessuto valvolare e isolamento cellulare dal controllo umano e dalle valvole CAVD . (A) Rappresentazione schematica del trattamento tissutale per la valutazione dei livelli di calcificazione delle valvole. (B) Rappresentazione schematica del decorso temporale e delle fasi per l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule endoteliali valvolari umane (VEC) e delle cellule interstiziali valvolari (VIC) da tessuti di controllo e CAVD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Valutazione della calcificazione . (A) Immagine rappresentativa dei tessuti valvolari di controllo (in alto) e calcificati (in basso) di donatori umani. Si noti che i noduli di calcificazione del tessuto CAVD possono alterare gravemente la morfologia e la capacità di asportare in modo pulito i foglietti. (B) Colorazione rappresentativa di Von Kossa del tessuto valvolare di controllo (a sinistra) e CAVD (destra) dopo la fissazione e l'ulteriore trattamento del tessuto valvolare umano. La calcificazione della nota è rivelata dalla presenza di precipitazioni scure nel tessuto del foglietto. Le immagini di Valve sono state acquisite con una telecamera da laboratorio. Le valvole colorate di Von Kossa sono state catturate con un obiettivo 10x, barra scala 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Valutazione delle curve di sopravvivenza cellulare (A) VEC e VICs. Tre foglietti sono stati ottenuti da cinque campioni di valvole. Il primo foglietto di ciascuna valvola è stato elaborato immediatamente (3-12 ore dopo l'estrazione), il secondo foglietto è stato elaborato circa 24 ore dopo (22-35 ore) e il terzo foglietto è stato elaborato circa 48 ore dopo aver ottenuto il tessuto (45-61 ore). I foglietti delle valvole sono stati conservati in una soluzione di conservazione a 4 °C fino alla loro lavorazione. L'asse y rappresenta la percentuale di cellule vive. (B) Morfologia di colture sane di VEC (pannelli di sinistra) e VIC (pannelli di destra). I grafici mostrano la proporzione media di cellule vive SD ± di cellule isolate da n = 5 tessuti valvolari. Le immagini sono state catturate con un obiettivo 4x e 10x, barre di scala 200 μm e 100 μm, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Colorazione immunofluorescente rappresentativa su VEC e VIC. Le VEC sono positive per il marcatore endoteliale von Willebrand Factor (vWF, pannelli di sinistra) mentre le VIC sono positive per il marcatore interstiziale αSMA. Nota che il nostro protocollo di isolamento garantisce un'elevata efficienza di isolamento; non viene rilevata alcuna contaminazione incrociata tra VEC e VIC. Le immagini sono state catturate con un obiettivo 10x, barra di scala 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ottenere il controllo e i tessuti della malattia dall'uomo è fondamentale per la modellizzazione della malattia in vitro ed ex vivo; Tuttavia, mentre si parla spesso delle sfide di colmare il divario tra banco e capezzale, l'ordine inverso - passando dalla suite chirurgica al banco - è spesso un divario altrettanto scoraggiante. Essenziale per uno scienziato di base per ottenere campioni di tessuto umano primario è una collaborazione con uno scienziato chirurgo investito che ha un team di infermieri, tecnici chirurgici, assistenti medici, studenti di medicina e residenti e gestori di protocolli clinici che possono arruolare e consentire i pazienti, partecipare e assistere nella corretta gestione dei tessuti asportati e coordinare la logistica richiesta per il prelievo dei tessuti. Senza il massimo sforzo da parte di tutti i soggetti coinvolti per ridurre il tempo dall'escissione all'isolamento cellulare, il materiale cellulare vitale e le informazioni in esso contenute saranno irrimediabilmente alterati o persi.
Fondamentale per mantenere la vitalità dei campioni di tessuto è l'uso di una soluzione di conservazione a freddo. Questa è la stessa soluzione utilizzata dalle équipe di trapianto di organi di UPMC e di altri centri medici per trapianti. Una migliore resa cellulare è stata ottenuta da tessuti cadaverici che erano stati asportati dal donatore molte ore prima rispetto ai tessuti ottenuti più rapidamente dalla sala operatoria ma conservati in PBS freddo. Questa scoperta accidentale è stata essenziale per l'approvvigionamento cellulare dai tessuti umani. Il tempo di approvvigionamento dall'escissione del tessuto alla consegna in laboratorio varia da 1 a 5 ore per il tessuto chirurgico e verso l'alto di 24 ore per il tessuto cadaverico. In confronto, l'approvvigionamento e la lavorazione di tessuti animali possono spesso essere effettuati entro pochi minuti dall'eutanasia, che è l'ideale per la vitalità cellulare. In assenza di una soluzione di conservazione a freddo, è probabile che un mezzo adatto alla coltura di cellule potrebbe anche funzionare meglio del PBS, tuttavia questo mezzo non è stato testato qui a causa del successo della soluzione di conservazione a freddo nel trapianto di organi vivi e della ricezione di tessuti cadaverici in questa soluzione. La soluzione è stabile a scaffale, ideale per la conservazione in sala operatoria, e ingredienti specifici come l'adenosina sono noti per promuovere risposte benefiche agli stress cellulari come ischemia / ipossia21,34.
Un altro passo essenziale per ottenere cellule vitali è lavare i tessuti con fungicida, gentamicina e battericida. Questo breve risciacquo aiuta a garantire che le cellule rimangano incontaminate da batteri e funghi. Altrettanto critici sono i passaggi per digerire i VEC dal tessuto valvolare, dove nell'arco di pochi minuti, i VEC vengono staccati e quindi tamponati dalla superficie dei lembi valvolari. La successiva digestione dei VIC che risiedono sulla densa matrice extracellulare del foglietto ha molto più spazio di manovra per durata e forza. Il trattamento tissutale imparziale descritto in questo protocollo consente l'isolamento delle principali due popolazioni cellulari presenti nel foglietto valvolare, VEC e VIC. Sebbene una recente analisi del trascrittoma a singola cellula abbia mostrato la coesistenza di almeno quattordici diversi sottotipi cellulari residenti nella valvola umana, tra cui sei cellule stromali non derivate dalla valvola nel tessuto CAVD35, questa diversità può rappresentare variazioni dovute agli effetti dell'elaborazione e della digestione di questi tessuti induriti, o può essere dovuta a diversi microambienti a cui sono esposte le cellule del foglietto: I VEC sono esposti a due diversi flussi sanguigni mentre i VIC sono incorporati in tre diversi strati della matrice extracellulare 8,9. Il protocollo di isolamento su larga scala e l'analisi qui descritti assicurano che oltre il 90% dei VEC e dei VIC corrisponda al loro fenotipo principale. Sebbene si possa trovare un certo grado di eterogenicità, ciò non influisce sui risultati generali dello studio dell'omeostasi VEC e VIC 8,9,13,14,15,16.
È anche importante notare che i pazienti e i loro tessuti valvolari, e quindi le linee cellulari ottenute da loro, non sono identici. La genetica, le comorbilità, la manipolazione durante l'intervento chirurgico e la lavorazione e la freschezza degli ingredienti della soluzione digestiva possono influenzare il tasso di crescita e forse anche il comportamento o il fenotipo delle cellule isolate. Mentre il presente studio dimostra la capacità di produrre un numero sufficiente di cellule vitali con questa procedura, ci possono essere differenze innate o indotte in queste linee cellulari che possono influire sulla sperimentazione a valle. Spesso è difficile conoscere con precisione il tempo trascorso da quando il tessuto è stato prelevato dal paziente o dal donatore e, in particolare nel caso di quest'ultimo, il tempo trascorso dall'interruzione della circolazione. Inoltre, esiste una variabilità intrinseca tra i tessuti per quanto riguarda il numero di cellule valvolari vitali ottenute, la capacità proliferativa delle cellule e la conservazione del fenotipo cellulare. Le linee cellulari possono ospitare mutazioni genetiche - congenite o somatiche - di cui il medico e il team di ricerca non sono a conoscenza, e il rimodellamento e la successiva manipolazione dei tessuti possono anche modificare il fenotipo cellulare o addirittura l'epigenetica. Pertanto, per tutti gli esperimenti in cui vengono utilizzate queste cellule umane primarie, è assolutamente essenziale che vengano utilizzate repliche biologiche, cioè linee cellulari ottenute da pazienti diversi, nonostante i tempi e i costi considerevoli che comportano. Ciò aiuta a garantire che i risultati non siano dovuti a effetti confondenti derivanti dall'approvvigionamento e dalla lavorazione del tessuto. Il tasso di proliferazione variabile di diverse linee cellulari può essere regolato raccogliendo cellule in esperimenti in tempi diversi o seminando cellule per esperimenti a diverse densità; Nessuna risposta è la migliore per tutti i progetti sperimentali. Mentre le complicanze non sono insignificanti, l'uso del controllo umano primario e delle linee cellulari derivate dal tessuto CAVD per modelli sperimentali in vitro ed ex vivo è essenziale per definire i fattori scatenanti e i processi di propagazione che guidano la patogenesi CAVD.
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Disclosures
IS riceve supporto di ricerca istituzionale da Atricure e Medtronic e funge da consulente per Medtronic Vascular. Nessuno di questi conflitti è legato a questo lavoro. Tutti gli altri Autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Jason Dobbins per la discussione perspicace e la lettura critica di questo manoscritto. Vorremmo ringraziare il Center for Organ Recovery and Education per il loro aiuto e supporto e ringraziare i donatori di tessuti e le loro famiglie per aver reso possibile questo studio. Tutti i campioni di pazienti sono raccolti da individui iscritti a studi approvati dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Pittsburgh in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. I tessuti cadaverici ottenuti tramite il Center for Organ Recovery and Education (CORE) sono stati approvati dal Comitato per la supervisione della ricerca e della formazione clinica che coinvolge i decedenti (CORID).
Alcune figure create con Biorender.com.
CSH è supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 e R01 HL142932, dall'American Heart Association 20IPA35260111.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
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