Summary
このプロトコルは、外科的大動脈弁置換術中または死体組織から抽出されたヒト大動脈弁の収集、およびその後の患者特異的一次弁内皮細胞および間質細胞の分離、拡張、および特性評価について説明しています。細胞生存率と表現型特異性を確保するために必要なプロセスに関する重要な詳細が含まれています。
Abstract
石灰化大動脈弁疾患(CAVD)は、高齢者人口のほぼ3分の1に存在します。大動脈弁の肥厚、硬化、石灰化は大動脈弁狭窄を引き起こし、心不全や脳卒中の一因となります。疾患の病因は多因子であり、炎症、細胞外マトリックスリモデリング、乱流、機械的ストレスおよびひずみなどのストレスは、弁内皮細胞および弁間質細胞の骨形成分化に寄与する。ただし、健康な細胞の石灰化細胞への骨形成移行を促進する正確な開始因子は完全には定義されていません。さらに、CAVD誘発性大動脈弁狭窄症の唯一の現在の治療法は大動脈弁置換術であり、それによってネイティブ弁が除去されるか(外科的大動脈弁置換術、SAVR)、または完全に折りたたみ可能な置換弁がカテーテルを介して挿入される(経カテーテル大動脈弁置換術、TAVR)。これらの外科的処置は高額で、深刻なリスクが伴います。したがって、創薬のための新しい治療標的を特定することが不可欠です。そのために、本研究では、患者から外科的に除去された組織とドナーの死体組織を使用して、in vitro疾患モデリングのための患者固有の弁膜細胞の一次ラインを作成するワークフローを開発します。このプロトコルでは、臓器移植で一般的に利用される冷蔵ソリューションを利用して、組織切除と実験室処理の間のしばしば長い調達時間によって引き起こされる損傷を軽減し、切除された組織の細胞を大幅に安定化させるという利点をもたらします。本研究の結果は、単離された弁細胞が、ドナーからの弁除去後数日以上の培養において、それらの増殖能力および内皮および間質表現型を保持することを示している。これらの材料を使用すると、コントロール細胞とCAVD細胞の収集が可能になり、そこからコントロール細胞株と疾患細胞株の両方が確立されます。
Introduction
石灰化大動脈弁疾患(CAVD)は、大動脈弁尖の炎症、線維症、および肉眼石灰化を特徴とする慢性病理です。リーフレットの進行性のリモデリングと石灰化(大動脈硬化症と呼ばれる)は、血流の閉塞(大動脈弁狭窄症)を引き起こし、脳卒中の一因となり、心不全を引き起こす可能性があります。現在、CAVDの唯一の治療法は、外科的または経カテーテル的大動脈弁置換術(それぞれSAVRおよびTAVR)です。CAVDの進行を停止または逆転させる非外科的選択肢はなく、弁置換術を行わないと、死亡率は2〜3年以内に50%に近づきます1,2,3。この病態を駆動する根本的なメカニズムを定義することで、潜在的な新しい治療アプローチが特定されます。
健康な成人では、大動脈弁尖の厚さは約1ミリメートルであり、その主な機能は左心室4からの一方向の血流を維持することです。3つのリーフレットのそれぞれは、リーフレットの外面を裏打ちし、バリアとして機能する弁内皮細胞(VEC)の層で構成されています。VECは、透過性、炎症性細胞接着、およびパラクリンシグナル伝達を調節することにより、弁の恒常性を維持します5,6,7。弁間質細胞(VIC)は、弁尖8内の細胞の大部分を構成する。VICは、リーフレットの3つの特徴的な層に配置されています。これらの層は、心室、海綿状筋、および線維症として知られています9。心室は左心室に面しており、コラーゲンとエラスチン繊維を含んでいます。中間層である海綿状菌には、心周期中にせん断の柔軟性を提供する高いプロテオグリカン含有量が含まれています。外側の線維層は大動脈側の流出面の近くに位置し、拡張期10,11,12の間に共離力を維持する強度を提供するI型およびIII型繊維状コラーゲンが豊富です。VICは静止状態にありますが、炎症、細胞外マトリックス(ECM)のリモデリング、機械的ストレスなどの要因により、VICの恒常性が破壊される可能性があります8、9、13、14、15、16。恒常性が失われると、VICは細胞外ミリエウをリモデリングするタンパク質の増殖、収縮、分泌が可能な筋線維芽細胞様表現型を活性化して獲得します17。活性化されたVICは、間葉系幹細胞(MSC)の骨芽細胞への分化を連想させる石灰化細胞に移行することができる15、17、18、19、20、21、22、23、24、25。
石灰化は、VECとVICの両方の寄与からコラーゲンに富む線維症層で開始されるように見えますが、リーフレット8の他の層を拡大して侵入します。したがって、VECとVICの両方が骨形成遺伝子の発現をアップレギュレートする刺激に応答することは明らかですが、骨形成遺伝子の活性化を引き起こす正確なイベント、および細胞とリーフレットの細胞外マトリックスとの間の複雑な相互作用は、明確に定義されていないままです。マウスはCAVD de novo26,27を発症しないため、マウスモデルはCAVD病因の非遺伝的ドライバーを研究するための理想的な情報源ではなく、したがって、初代ヒト組織およびこれらの組織から分離された初代細胞株の使用が必要である。特に、3D細胞培養やオルガノイドモデリングの分野が拡大しており、マウスモデルに代わるex vivoヒトベースの代替となる可能性が高いため、これらの細胞を大量かつ高品質で取得することが不可欠です。
本手法の目的は、ヒトドナーから外科的に除去された弁から得られたVECおよびVICを効率的に分離および成長させるための条件を確立したワークフローを共有することである。以前の研究では、ブタ28およびマウス弁29からのVECおよびVICの分離に成功したことが示されており、我々の知る限り、これはヒト組織におけるこれらの細胞の単離を説明する最初のものである。ここで説明するプロトコルは、ヒト切除弁に適用可能であり、切除された組織の細胞を大幅に安定化させる臓器移植で臨床的に利用される緩衝液である低温保存溶液の利用を導入することにより、組織切除と実験室処理の間のしばしば長い調達時間によって引き起こされる損傷を大幅に回避および改善します。ここで説明するプロトコルは、細胞表現型を決定し、細胞交差汚染を最小限に抑えて細胞生存の高効率を保証する方法も示しています。
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Protocol
すべての患者サンプルは、ヘルシンキ宣言に従ってピッツバーグ大学の治験審査委員会によって承認された研究に登録された個人から収集されます。臓器回復教育センター(CORE)を介して得られた死体組織は、故人が関与する研究および臨床訓練の監視のためのピッツバーグ大学委員会(CORID)によって承認されました。
1.承認と安全性
- ヘルシンキ宣言に従って、治験審査委員会(IRB)の承認または患者サンプルまたは死体組織の収集に関する免除メモを取得します。
- 血液媒介病原体トレーニング、生物医学ヒト被験者研究、プライバシーと情報セキュリティ、生物学的物質の輸送と輸送など、人間の組織を扱うために必要な制度的トレーニングを受けてください。
2.ロジスティクスと準備
- 手術サンプル
- 冷蔵庫が利用可能で、手術室の近くにあることを確認してください。外科スタッフが使用するために、この冷蔵庫に40 mLの滅菌アリコートの冷蔵液を含む匿名化された命名法で事前にラベル付けされた50 mLのコニカルチューブを保管してください。これらのチューブは、元のパッケージの有効期限まで4°Cで安定しています。
- 抽出したら、これらのチューブにバルブ組織を入れます。チューブを、漏れ防止のビニール袋やバイオハザードラベルが付いたプラスチック容器などの密閉された二次容器に入れます。組織は、バイオハザードを輸送するための制度的プロトコルに従って、氷上でピックアップおよび輸送されます。
- 死体サンプル
- 回収した臓器を冷蔵液に浸し、密閉された二次格納容器に入れ、バイオハザードを輸送するための制度的プロトコルに従って氷上で輸送します。
3. 試薬の調製
- 少なくとも前日にコラーゲンコーティングされたプレートを作ります。
- 50 mLのコニカルチューブに、5 mLのイソプロピルアルコール、8.7 mLの酢酸、および0.5 μgのコラーゲンI粉末を混合します。滅菌水で最大50 mLを持参してください。混合し、0.45 μmのフィルターでろ過します。
- 滅菌細胞培養フードの下で、底全体を覆うのに十分なコラーゲン溶液を6ウェルプレートと10 cmディッシュに加えます。プレートを覆い、室温で4〜6時間放置します。滅菌ピペットで余分な溶液を取り除き、新しい滅菌50 mLコニカルチューブに入れ、4°Cで保存して追加のプレートを作成します。溶液は4°Cで数ヶ月間保存できます。
- プレートを37°Cのインキュベーターで一晩乾燥させた後、4°Cで再封可能なバッグに保管します。 コラーゲンコーティングされたプレートと皿は数ヶ月間保存することができます。
- 次のアイテムをオートクレーブします:組織鉗子、組織ハサミ、綿棒、ガーゼパッド。
- VEC増殖培地:メーカーのプロトコルに従って内皮細胞増殖培地を調製して使用します。4°Cの暗所で保管してください。 細胞に使用する直前に37°Cに温め、必要以上に長く培地を温浴に放置しないでください(10〜15分で十分です)。準備後1ヶ月以内に培地を使用してください。
- VIC 増殖培地:DMEM ベース培地 (4.5 g/L グルコース、L-グルタミンサプリメント、110 mg/L ピルビン酸ナトリウム) 30 に 10% 熱不活化 FBS と 100 IU/mL ペニシリンおよび 100 μg/mL ストレプトマイシンを補充します。4°Cの暗所で最大3か月間保管してください。細胞に使用する直前に37°Cに温め、必要以上に長く培地を温浴に放置しないでください(10〜15分で十分です)。
- 使用直前に滅菌すすぎ液を作ります。滅菌PBSに2.5 μg/mLの殺菌剤、0.05 mg/mLのゲンタマイシン、および5 μg/mLの殺菌剤を補給します。
- 使用直前に滅菌コラゲナーゼ溶液を作ります。5 mgのコラゲナーゼIIを5 mLの滅菌済み新鮮なDMEMベース培地に加えます。よく混合し、0.45μmのフィルターを通過させて溶液を滅菌します。使用するまで氷の上に保管してください。
4.組織の準備と処理
注:作業を開始する前に、人間の組織の使用に関する機関の承認を取得する必要があります。ティッシュを取り扱うときは、次の個人用保護具(PPE)を着用する必要があります:使い捨ての液体バリアラップアラウンドガウン、またはエプロンと使い捨てスリーブクローバーの周りに液体バリアラップが付いた専用のボタンフロントラボコート。フルフェイスシールド、またはサージカルマスク付きの安全メガネ。二重手袋;つま先の近い靴;そして足を覆うための服。石灰化評価のための組織調製物(セクション5)および細胞単離(セクション6および7)の包括的なワークフロー図を それぞれ図1A、B に示す。
- 死体臓器標本を受け取ったら、大動脈根を切除し、滅菌すすぎ液の50mLコニカルチューブに沈めます。手術検体を受け取ったら、輸送容器から取り出し、滅菌すすぎ液の50 mLコニカルチューブに浸します。ティッシュの入ったチューブをロッカーのアイスバケットに入れ、室温(RT)で10分間混合します。
注:抽出時にできるだけ近い組織を処理すると、最良の細胞回収が得られますが、生細胞は切除後61時間以上で収集でき、データによると、時間が長くなるにつれてVICはVECよりも堅牢になります。組織をすぐに処理できない場合は、可能であれば組織を取り除き、手順4.1を実行してから、組織を新しい滅菌冷蔵溶液に戻し、続行する準備ができるまで4°Cに保ちます。夜間または週末の手術中に収集された弁は、4°Cの40 mLの冷蔵溶液に保存でき、抽出後2日以上経過しても生細胞を得ることができます。 - チューブに70%エタノールをスプレーし、滅菌フードに移動します。組織を取り除き、2つの弁冊を切除します(図2A)。1枚のリーフレットを極低温バイアル(または将来の分析のためにいくつかの小さな断片が必要な場合は2〜3バイアル)に入れ、液体窒素を滴下してスナップ凍結し、-80°Cで保存します。
- 弁が二尖の場合は、リーフレットを1つだけ切除してください。はさみを使用して、結節からヒンジまでリーフレットを半分に切ります。リーフレットの半分をスナップフリーズに使用し、残りの半分をステップ4.3に使用します。
- パラフィン包埋用の2番目のリーフレットを処理して、結節からヒンジまで半分に切断して石灰化含有量を評価します。両方のピースを4%パラホルムアルデヒド(PFA)に沈めたカセットに入れ、RTのロッカーに最低2時間、4時間以内置きます。
注:固定時間を長くすると、免疫蛍光染色でより多くのバックグラウンドが作成されます。手順 4.2 と 4.3 を実行したら、すぐにセクション 6 に進み、手順 6.12 の後に手順 4.4 に戻ります。 - 固定後、新鮮なPBSに1時間3〜4回沈めて組織を洗浄します。これらの洗浄後、サンプルは必要に応じて4°CのPBSに数ヶ月間留まることができます。埋め込む直前の次のステップに進みます。
- PBSから70%エタノールに徐々に変更します。各ステップを1:4 70%エタノール:PBSで30〜60分洗浄します。1:1 70%エタノール:PBS, 4:1 70%エタノール:PBS;70%エタノール。
- 確立されたプロトコル31に従って切片がリーフレットの3層(図1A)を明らかにするように組織を埋め込む。あるいは、可能であれば、埋め込みおよび切断のために組織を病理コアに持ってくる。
- ティッシュを取り扱った後は、必要に応じてPPEを廃棄または保管し、すぐに手を洗ってください。すべての機器、表面、および固体および液体廃棄物を、漂白剤または洗剤消毒剤の1:10希釈で除染します。除染に20分待ってから、70%エタノールリンスを行います。細胞培養フードをマイコプラズマスプレーで処理します 製造元の指示に従って。
5.カルシウム含有量のフォンコッサ染色
注:これは、細胞の分離とラインの確立後にうまく行うことができますが、組織の石灰化レベルを、確立された初代細胞株に関連する文書にリンクしてください。
- 厚さ5または10 μmのパラフィンスライスをスライドガラスにカットし、スライドを65°Cで1時間焼き、RTまで冷却します。
- 新鮮な溶液を使用して、次のように沈めてスライドを脱パラフィンします:100%キシレンを30分間、2回;100%エタノールで3分間、2回;90%エタノールを3分間;80%エタノールを3分間;70%エタノールを3分間;50%エタノールを3分間;超純水3分間;次のステップまで超純水に保管してください。
注:上記の時間は最小であり、各ステップは長くなる可能性があります。 - メーカーのプロトコルに従ってフォンコッサ染色を進めます。
- 弁の全領域を顕微鏡で評価し、対照組織(石灰化の兆候なし)またはCAVD(石灰化の証拠、 図2B)を割り当てます。
6.弁内皮細胞(VEC)の分離、拡張、および確認
- 滅菌細胞培養フードで、残りのバルブリーフレットを含む円錐形チューブを開き、氷冷PBSで満たされた新しい50 mLコニカルチューブにリーフレットを置きます。チューブにキャップをして、RTで2分間静かに反転またはロッカーに置きます。
- 5〜7 mLの冷たいコラゲナーゼ溶液で満たされた60 mmディッシュに組織を取り除きます。鉗子を使用して、リーフレットの両側を溶液に3〜4回浸します。組織を37°Cの細胞培養インキュベーター内で5〜10分間インキュベートし、2分ごとに組織を3〜4回穏やかに揺り動かします。
- 皿から2 mLの溶液を取り出し、滅菌済みの15 mLコニカルチューブに入れます。結節に鉗子を置き、乾いた滅菌綿棒を使用して鉗子からヒンジまでスワイプし、リーフレットに沿って移動しながら綿棒を回転させます。各スワイプの間に、15 mLコニカルチューブ内の溶液中の綿棒を振り回して、細胞を除去します。繰り返して組織の表面を完全に拭き取り、次に裏返して反対側で繰り返します。
- 片手に鉗子で弁尖を持ち、もう片方の手に1mLピペットを持って、皿の中の溶液で弁尖の表面を洗い流します。すすぎが終わったら、皿内のVECを含むすべての溶液を綿棒からの細胞と同じ15 mLコニカルチューブに移し、ステップ6.5に進みます。残りの弁組織を、7 mLの滅菌コラゲナーゼ溶液を入れた新しい15 mLコニカルチューブに入れ、ステップ7.1に進みます。
- VECを含むチューブを180 x g で5分間遠心分離し、単離されたVECをペレット化します。上清を吸引し、3 mLのVEC増殖培地に再懸濁します。もう一度遠心分離し、上清を取り除きます。細胞を1 mLの増殖培地に再懸濁し、血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞数を決定します。
- VECペレットを2 mLのVEC増殖培地に再懸濁し、細胞を6ウェルプレートのコラーゲンプレコートウェルに約5 x 105 細胞/cm2でプレートします。細胞を少なくとも3〜4日間成長させてから、培地を取り除き、新鮮な培地を補充します。4日ごとにメディア交換を繰り返します。VECは石畳のパッチで成長します(図3B、左パネル)。
- VECパッチがプレートの>80%をカバーする場合、細胞の成長速度に応じて、細胞を約1.3 x 104細胞/ cm 2で分割します(1週間以内に80%に達する場合、わずかに少ない細胞数/ cm2で分割します)。
- 分割するには、2 mL DPBSで細胞を2回洗浄し、細胞の表面を覆うのに十分な解離試薬を加えます。37°Cで2〜3分間インキュベートし、細胞が過剰にインキュベートされていないことを確認します。等量のVEC増殖培地を加えて消化を停止し、液体を15 mLチューブに移します。180 x g で5分間遠心分離し、上清を除去し、必要な数のウェル/プレートに適した量の培地に再懸濁します。
注:10 cmプレートに拡張されると、VECは増殖するにつれて形態を失い、表現型が変化することがあります。これは、VECが細胞株の確立および増殖中に低いコンフルエントで播種されるときに起こる傾向がある。 - 純粋な培養を保証するには、分割するたびにCD31+超常磁性ビーズを利用することを検討してください。
- 1×10個以下の8個以下の細胞(10cmディッシュ1枚以下)の場合は、メーカーのプロトコールに従って洗浄し、25μLの超常磁性ビーズを調製します。
注:VECのトリプシン処理の前に、ステップ6.10を実行することをお勧めします。 - ステップ6.8と同様に細胞を剥離しますが、0.1% BSA、pH 7.4を含む500 μLのPBSに再懸濁し、2 mLの遠沈管に入れます。洗浄および再懸濁したビーズ500 μLを2 mLの細胞チューブに加え、ローテーター上で4°Cで20分間インキュベートします。
- チューブを磁石に2分間置きます。チューブがまだ磁石に入っている間に、上清を慎重に取り除きます。チューブを磁石から取り出し、0.1%BSAを含む1 mLの新鮮なPBSを加え、2〜3回ピペットで軽く動かしてから、磁石に2分間戻します。さらに2回繰り返します。バッファーを最終的に除去した後、再プレーティングに必要な容量の増殖培地に細胞を再懸濁します。
注:細胞にはまだビーズがありますが、これらは成長に影響を与えず、その後の継代で除去されます。 - 細胞が増殖したら、形態に加えて、フォンビルブランド因子(vWF)、カドヘリン5(CDH5)、PECAM-1/CD31などの免疫蛍光マーカーの陽性染色、カルポニン1(CNN)やα-2平滑筋アクチンなどのVICマーカーの陰性染色により、VEC表現型を確認します(αSMA、 図4、左パネル)。
7.バルブ間質細胞(VIC)の分離、拡張、および保管
- ステップ6.4で述べたように、弁組織からVECを除去した後、リーフレットを7mLのコラゲナーゼ溶液を入れた15mLのコニカルチューブに入れる。ガス交換を可能にするためにキャップをわずかに開いた状態で、細胞培養インキュベーターで12時間インキュベートします。VICの単離は、コラゲナーゼ溶液中で最大18時間で成功する可能性があります。
- インキュベーション後、滅菌細胞培養フード内で、血清学的ピペットでピペッティングして組織を穏やかに混合し、リーフレット組織からのVICの放出を確実にします。
- 細胞懸濁液を取り出し、0.70 μmのフィルターを通過して50 mLのコニカルチューブに入れます。
- 7 mLのVIC増殖培地を50 mLチューブに加え、180 x g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLのVIC増殖培地に再懸濁し、細胞数を決定します。VICを60 mmの組織培養処理皿に1.3 x 104 細胞/cm2でプレートします。
- 培地を交換する前に、細胞を少なくとも1〜2日間増殖させます。培地を取り出し、DPBSを2回洗浄して残留破片を取り除き、新しい成長培地と交換します。2〜3日ごとに培地を補充してください。VICは線維芽細胞の形で成長します(図3B、右パネル)。
- VICが>90%のコンフルエンシーに達したら、DPBSで2回洗浄して余分な培地を除去し、プレートを覆うように予熱した解離試薬を適量加えて細胞を剥離します(つまり、10 cmディッシュあたり2〜3 mL)。37°Cのインキュベーターで皿をインキュベートします。VICは、2〜3分のインキュベーション後に皿から剥離します。予熱した培地を4〜6mL加えます。
注:細胞がプレートから持ち上がるのに3分以上かかる場合は、解離試薬が効力を失っている可能性があります。必要に応じて、セルスクレーパーを使用してセルを静かに持ち上げることができます。 - 細胞懸濁液をチューブに移し、180 x g で5分間穏やかに遠心分離します。上清を除去した後、細胞ペレットを予め温めたVIC増殖培地に穏やかに再懸濁し、血球計算盤およびトリパンブルーを用いて生細胞数を決定する。生細胞を元のディッシュの1:2密度で播種します(つまり、10 cmディッシュあたり~1×106 細胞または1.3 x 104 細胞/cm2)。
- αSMA、CNN、SM22αなどの免疫蛍光マーカーのポジティブ染色、CD31、CDH5、vWFなどのVECマーカーのネガティブ染色により、VIC表現型を評価します(図4の右パネル)。
注:ここで紹介するプロトコルワークフローは、VECおよびVICの分離用に1つのリーフレットを偏りなく選択し、残りのリーフレットはフォンコッサ染色(セクション5)およびスナップフリーズに使用されます。
8.長期細胞保存
- 拡張したら、長期保存のために細胞を凍結します。2〜5 mLのDPBSで細胞を2回洗浄し、手順6.8および7.6のように細胞を剥離するのに十分な解離試薬を追加します。等量のVECまたはVIC増殖培地を加えて消化を停止し、細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。
- 血球計算盤とトリパンブルーを使用して生細胞数を決定します。
- 180 x g で5分間遠心分離します。
- 細胞を冷やしたコンディショニング増殖培地に再懸濁して、細胞密度を~3 ×10 6 cells/mLにします。
- 穏やかに旋回しながら、等量の冷やした2x凍結保存培地を加えます。これにより、細胞濃度は~1.5 ×10 6 細胞/mLになります。
- 1 mLを凍結保存バイアルに分注します。バイアルを細胞凍結容器に入れ、閉じて5〜6回反転させて、細胞が浮遊したままになるようにします。容器を-80°Cで6〜72時間、または凍結容器のプロトコルに従って置きます。バイアルを-80°Cから取り出し、液体窒素に移して長期保存します。
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Representative Results
上記のプロトコルは、ヒト弁膜組織の取り扱い、ならびにこれらの組織からの生存細胞株の単離および確立に必要なステップを概説している。大動脈弁のリーフレットは、パラフィン包埋のために処理され、生化学的または遺伝子分析のために長期保存のためにスナップ凍結され、VECおよびVICの単離のために消化されます(図1)。手術標本は大動脈弁狭窄症の臨床診断を受ける可能性が高く、肉眼で見ることができる石灰化の重い結節を示す可能性がありますが、大動脈弁石灰化はかなりの数の高齢者(>65歳)に存在します32、そしてこの有病率のために、すべての組織(外科的および死体)は、石灰化が存在するかどうかを評価するためにフォンコッサ染色または同様の手順を受けます(図2)。
保冷液を用いると、切除弁組織の細胞が大きく安定化することがわかった。冷蔵液は生体臓器移植に使用されます。それは、ドナーからの除去の前後に臓器を通して洗い流され、氷上での輸送中にその臓器の血管系に残されます。VEC系統は外科組織よりもドナー標本から容易に確立され、ドナー系統はより多くの継代にわたって内皮細胞の形態を保持する可能性が高いことが観察された。ドナー組織は死後12〜24時間ラボに到達しないことが多く、外科的組織は2〜4時間で取得されるため、これは当惑しました。手術検体チューブにPBSの代わりに低温保存液を充填すると、細胞回収率が大幅に増加した。 図3に見られるように、実行可能なVECとVICの両方が、バルブ抽出後61時間以上で取得できます。弁切除後1日まで細胞を単離すると、VECよりもわずかに高い割合の生VICが得られますが、細胞は切除後48時間後も生存し続けます。回収された全細胞の最大40%が生細胞に対応し、生物学的複製間で一貫した数値が観察されました。さらに、形態検査は細胞の同一性も確認します。VECは、パックされた石畳のような成長接触阻害細胞として現れますが、VIC形態は紡錘形の筋線維芽細胞に似ています。検体の免疫染色により、拡張VECの91.8%±1.8(n = 3)が内皮マーカーvWFに陽性であり、拡張VECの92.0%±5.0(n = 3)が間質細胞マーカーαSMAに陽性であることが確認されました(図4)。これらの数値は、以前に報告された結果と一致しています33。
図1:バルブ組織処理とヒトコントロールおよびCAVDバルブからの細胞分離 。 (A)弁の石灰化レベルを評価するための組織処理の概略図。(B)対照およびCAVD組織からのヒト弁内皮細胞(VEC)および弁間質細胞(VIC)の単離および特性評価のための時間経過およびステップの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:石灰化の評価 。 (A)ヒトドナーからの対照(上)および石灰化(下)弁組織の代表的な画像。CAVD組織の石灰化結節は、形態とリーフレットをきれいに切除する能力を著しく変化させる可能性があることに注意してください。(B)ヒト弁組織の固定およびさらなる処理後のコントロール(左)およびCAVD(右)弁組織の代表的なフォンコッサ染色。石灰化は、リーフレット組織における暗沈殿の存在によって明らかにされる。バルブ画像はラボカメラでキャプチャされました。フォンコッサ染色バルブは、10倍の対物レンズ、スケールバー200μmで捕捉されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:細胞 生存率(A)VECおよびVICs生存曲線の評価。5つの弁片から3つのリーフレットを得た。各弁からの最初のリーフレットは直ちに処理され(抽出後3〜12時間)、2番目のリーフレットは約24時間後(22〜35時間)に処理され、3番目のリーフレットは組織を取得してから約48時間後(45〜61時間)に処理された。バルブリーフレットは、処理されるまで4°Cの冷蔵溶液に保持した。Y 軸は生細胞の割合を表します。(B)VECの健康な培養物の形態(左パネル)とVIC(右パネル)。グラフは±n=5弁組織から単離された細胞の平均SD生細胞割合を示す。画像は、それぞれ4倍と10倍の対物レンズ、200 μmと100 μmのスケールバーでキャプチャされました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:VECおよびVICの代表的な免疫蛍光染色。 VECは内皮マーカーフォンビルブランド因子(vWF、左パネル)に対して陽性であり、VICは間質マーカーαSMAに対して陽性である。当社の絶縁プロトコルは、高い絶縁効率を保証していることに注意してください。VEC と VIC 間の相互汚染は検出されません。画像は、10倍の対物レンズ、100μmのスケールバーでキャプチャされました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヒトから対照組織および疾患組織を取得することは、in vitroおよびex vivo疾患モデリングにとって重要です。しかし、ベンチとベッドサイドの間のギャップを埋めることの課題についてよく話しますが、手術室からベンチへの逆の順序は、多くの場合、同じように気が遠くなるようなギャップです。基礎科学者が一次ヒト組織標本を入手するために不可欠なのは、看護師、外科技術者、医師助手、医学生と研修医、および患者を登録して同意し、参加して支援できる臨床プロトコルマネージャーのチームを持つ投資された外科医科学者とのコラボレーションです切除された組織の適切な取り扱い、および組織ピックアップに必要なロジスティクスを調整します。切除から細胞分離までの時間を短縮するための関係者全員の最大限の努力がなければ、重要な細胞物質とそれに含まれる情報は取り返しのつかないほど変更または失われます。
組織標本の生存率を維持するために重要なのは、冷蔵液の使用です。これは、UPMCや他の移植医療センターの臓器移植チームが使用しているのと同じソリューションです。手術室からより迅速に得られたが冷たいPBSに保たれた組織よりも、何時間も前にドナーから切除された死体組織からより良い細胞収量が得られました。この偶然の発見は、ヒト組織からの細胞調達に不可欠でした。組織切除から実験室での送達までの調達時間は、外科組織では1〜5時間、死体組織では24時間以上です。それに比べて、動物組織の調達と処理は安楽死から数分以内に行われることが多く、細胞の生存率に理想的です。低温保存溶液がない場合、細胞の培養に適した培地もPBSよりも優れた性能を発揮する可能性がありますが、生体臓器移植における低温保存溶液の成功と、この溶液中の死体組織の受領により、この培地はここではテストされませんでした。この溶液は、手術室での保管に最適な常温保存性であり、アデノシンなどの特定の成分は、虚血/低酸素症などの細胞ストレスに対する有益な反応を促進することが知られています21,34。
生細胞を得るための別の重要なステップは、殺菌剤、ゲンタマイシン、および殺菌剤で組織を洗浄することです。この短いすすぎは、細胞が細菌や真菌によって汚染されていないことを確認するのに役立ちます。同様に重要なのは、VECを弁組織から消化する手順であり、わずか数分でVECが剥離され、弁尖の表面から拭き取られます。リーフレットの高密度細胞外マトリックス上に存在するVICのその後の消化は、持続時間と強度のためにはるかに小刻みに動く余地があります。このプロトコルに記載されている偏りのない組織処理により、弁尖に存在する主要な2つの細胞集団、VECおよびVICの単離が可能になります。最近の単一細胞トランスクリプトーム解析では、CAVD組織中の6つの非弁由来間質細胞を含む、ヒト弁に存在する少なくとも14の異なる細胞サブタイプの共存が示されているが35、この多様性は、これらの硬化組織の処理および消化による影響による変動を表す場合もあれば、リーフレット細胞がさらされる異なる微小環境によるものであってもよい。 VECは2つの異なる血流にさらされ、VICは3つの異なる細胞外マトリックス層に埋め込まれています8,9。本明細書に記載されている大規模な分離プロトコルおよび分析により、VECおよびVICの90%以上がそれらの主要な表現型に対応することが保証される。ある程度の異質性が見出されるかもしれないが、VECおよびVIC恒常性の研究の一般的な結果には影響しない8、9、13、14、15、16。
患者とその弁組織、したがってそれらから調達される細胞株は同一ではないことに注意することも重要です。遺伝学、併存疾患、手術および処理中の取り扱い、および消化溶液成分の鮮度は、増殖速度、さらには単離された細胞の挙動や表現型にさえ影響を与える可能性があります。本研究は、この手順で十分な数の生細胞を生成する能力を示していますが、これらの細胞株には、下流の実験に影響を与える可能性のある先天的または誘発的な違いがある可能性があります。患者またはドナーから組織が除去されてからの時間を正確に知ることはしばしば困難であり、特に後者の場合、循環が停止してからの時間。さらに、得られる生存弁細胞の数、細胞の増殖能力、および細胞表現型の保持に関して、組織間に固有の変動性があります。細胞株は、医師や研究チームが気づいていない先天性または体性の遺伝子変異を抱えている可能性があり、組織のリモデリングとその後の取り扱いも、細胞の表現型またはエピジェネティクスを変更する可能性があります。そのため、これらの初代ヒト細胞を使用するすべての実験では、かなりの時間とコストがかかるにもかかわらず、生物学的複製物、つまり異なる患者から得られた細胞株を使用することが絶対に不可欠です。これは、結果が組織の調達と処理からの交絡効果によるものではないことを確認するのに役立ちます。異なる細胞株の可変増殖速度は、異なる時間に実験で細胞を収集するか、異なる密度での実験のために細胞を播種することによって調整することができる。すべての実験計画に最適な答えはありません。合併症は重要ではありませんが、in vitroおよびex vivo実験モデルのための一次ヒトコントロールおよびCAVD組織由来細胞株の使用は、CAVDの病因を引き起こす開始因子と伝播プロセスを定義するために不可欠です。
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Disclosures
ISは、AtricureとMedtronicから機関研究支援を受けており、Medtronic Vascularのコンサルタントを務めています。これらの競合はいずれもこの作業とは関係ありません。他のすべての著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この原稿の洞察に満ちた議論と批判的な読書をしてくれたジェイソン・ドビンズに感謝します。臓器回復教育センターの支援と支援に感謝し、この研究を可能にしてくれた組織提供者とその家族に感謝します。すべての患者サンプルは、ヘルシンキ宣言に従ってピッツバーグ大学の治験審査委員会によって承認された研究に登録された個人から収集されます。臓器回復教育センター(CORE)を介して得られた死体組織は、故人が関与する研究および臨床訓練の監視のためのピッツバーグ大学委員会(CORID)によって承認されました。
Biorender.com で作成されたいくつかの図。
CSHは、National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917およびR01 HL142932、American Heart Association 20IPA35260111によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
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