Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme menschlicher Aortenklappen, die während chirurgischer Aortenklappenersatzverfahren oder aus Leichengewebe extrahiert werden, und die anschließende Isolierung, Expansion und Charakterisierung patientenspezifischer primärer Klappenendothel- und interstitieller Zellen. Enthalten sind wichtige Details zu den Prozessen, die erforderlich sind, um die Zelllebensfähigkeit und Phänotypspezifität sicherzustellen.
Abstract
Die kalzifische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist bei fast einem Drittel der älteren Bevölkerung vorhanden. Verdickung, Versteifung und Verkalkung der Aortenklappe verursacht Aortenstenose und trägt zu Herzinsuffizienz und Schlaganfall bei. Die Krankheitspathogenese ist multifaktoriell, und Belastungen wie Entzündungen, extrazelluläres Matrixumbau, turbulenter Fluss und mechanische Belastung und Belastung tragen zur osteogenen Differenzierung von Klappendothel- und Klappeninterstitialzellen bei. Die genauen auslösenden Faktoren, die den osteogenen Übergang einer gesunden Zelle in eine kalzifizierende Zelle vorantreiben, sind jedoch nicht vollständig definiert. Weiterhin ist die einzige aktuelle Therapie bei CAVD-induzierter Aortenstenose der Aortenklappenersatz, bei dem die native Klappe entfernt wird (chirurgischer Aortenklappenersatz, SAVR) oder eine vollständig zusammenklappbare Ersatzklappe über einen Katheter eingeführt wird (Transkatheter-Aortenklappenersatz, TAVR). Diese chirurgischen Eingriffe sind mit hohen Kosten und ernsthaften Risiken verbunden. Daher ist die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele für die Wirkstoffforschung unerlässlich. Zu diesem Zweck entwickelt die vorliegende Studie einen Workflow, bei dem chirurgisch entferntes Gewebe von Patienten und Spenderkadavergewebe verwendet werden, um patientenspezifische primäre Linien von Herzklappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung zu erstellen. Dieses Protokoll führt die Verwendung einer Kühllagerlösung ein, die üblicherweise bei Organtransplantationen verwendet wird, um die Schäden zu reduzieren, die durch die oft lange Beschaffungszeit zwischen der Gewebeentfernung und der Laborverarbeitung verursacht werden, mit dem Vorteil, dass die Zellen des herausgeschnittenen Gewebes stark stabilisiert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass isolierte Klappenzellen ihre proliferative Kapazität und endothelialen und interstitiellen Phänotypen in Kultur über mehrere Tage nach der Klappenentfernung vom Spender behalten. Die Verwendung dieser Materialien ermöglicht die Sammlung von Kontroll- und CAVD-Zellen, aus denen sowohl Kontroll- als auch Krankheitszelllinien gebildet werden.
Introduction
Die kalzifische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist eine chronische Pathologie, die durch Entzündung, Fibrose und Makroverkalzifizierung von Aortenklappenflügeln gekennzeichnet ist. Ein fortschreitender Umbau und eine Verkalkung der Blättchen (Aortensklerose genannt) kann zur Behinderung des Blutflusses (Aortenstenose) führen, was zum Schlaganfall beiträgt und zu Herzversagen führt. Derzeit ist die einzige Behandlung für CAVD der chirurgische oder Transkatheter-Aortenklappenersatz (SAVR bzw. TAVR). Es gibt keine nicht-chirurgische Möglichkeit, die CAVD-Progression zu stoppen oder umzukehren, und ohne Klappenersatz nähern sich die Sterblichkeitsraten innerhalb von 2-3 Jahren 50% 1,2,3. Die Definition der zugrunde liegenden Mechanismen, die dieser Pathologie zugrunde liegen, wird potenzielle neue therapeutische Ansätze identifizieren.
Bei einem gesunden Erwachsenen sind die Aortenklappenflügel etwa einen Millimeter dick und ihre Hauptfunktion besteht darin, den unidirektionalen Blutfluss aus dem linken Ventrikel aufrechtzuerhalten4. Jedes der drei Blättchen besteht aus einer Schicht von Klappendothelzellen (VECs), die die äußere Oberfläche des Blattes auskleidet und als Barriere fungiert. VECs halten die Klappenhomöostase aufrecht, indem sie die Permeabilität, die entzündliche Zelladhäsion und die parakrine Signalisierung regulieren 5,6,7. Klappeninterstitielle Zellen (VICs) umfassen die Mehrheit der Zellen innerhalb des Klappenblattes8. VICs sind in drei unterschiedlichen Schichten in der Packungsbeilage angeordnet. Diese Schichten sind als Ventricularis, Spongiosa und Fibrosa9 bekannt. Die Ventricularis ist dem linken Ventrikel zugewandt und enthält Kollagen- und Elastinfasern. Die mittlere Schicht, die Spongiosa, enthält einen hohen Proteoglykangehalt, der während des Herzzyklus für Scherflexibilität sorgt. Die äußere Fibrosaschicht befindet sich in der Nähe der Ausflussoberfläche auf der Aortenseite und ist reich an fibrillärem Kollagen Typ I und Typ III, das Kraft zur Aufrechterhaltung der Koaptation während der Diastole10,11,12 bietet. VICs befinden sich in einem Ruhezustand, jedoch können Faktoren wie Entzündungen, Umbau der extrazellulären Matrix (ECM) und mechanischer Stress die VIC-Homöostase 8,9,13,14,15,16 stören. Mit Verlust der Homöostase aktivieren und erwerben VICs einen myofibroblastenähnlichen Phänotyp, der zur Proliferation, Kontraktion und Sekretion von Proteinen fähig ist, die das extrazelluläre Millieu17 umgestalten. Aktivierte VICs können in kalzifizierende Zellen übergehen, was an die Differenzierung einer mesenchymalen Stammzelle (MSC) in einen Osteoblasten 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25 erinnert.
Die Verkalkung scheint in der kollagenreichen Fibrosaschicht durch Beiträge von VECs und VICs zu beginnen, dehnt sich jedoch aus und dringt in die anderen Schichten des Blättchensein 8. So ist es klar, dass sowohl VECs als auch VICs auf Reize reagieren, um die Expression osteogener Gene hochzuregulieren, aber die genauen Ereignisse, die die Aktivierung osteogener Gene vorantreiben, sowie das komplexe Zusammenspiel zwischen den Zellen und der extrazellulären Matrix des Blättchens bleiben unklar. Murine Modelle sind keine ideale Quelle, um nicht-genetische Treiber der CAVD-Pathogenese zu untersuchen, da Mäuse kein CAVD de novo26,27 entwickeln, daher ist die Verwendung von primärem menschlichem Gewebe und den aus diesen Geweben isolierten primären Zelllinien notwendig. Insbesondere ist es unerlässlich, diese Zellen in hoher Anzahl und guter Qualität zu erhalten, da sich das Feld der 3D-Zellkulturen und der Organoidmodellierung erweitert und wahrscheinlich zu einer ex vivo humanbasierten Alternative zu Mausmodellen wird.
Der Zweck der vorliegenden Methode besteht darin, einen Workflow zu teilen, der die Bedingungen für die effiziente Isolierung und Züchtung von VECs und VICs, die aus chirurgisch entfernten Ventilen von menschlichen Spendern gewonnen werden, geschaffen hat. Frühere Studien haben eine erfolgreiche Isolierung von VECs und VICs aus Schweineklappen28 und murinen Klappen29 gezeigt, nach unserem Wissen ist dies die erste, die die Isolierung dieser Zellen in menschlichem Gewebe beschreibt. Das hier beschriebene Protokoll ist auf menschliche herausgeschnittene Klappen anwendbar und umgeht und verbessert den Schaden, der durch die oft lange Beschaffungszeit zwischen der Gewebeentfernung und der Laborverarbeitung verursacht wird, erheblich, indem es die Verwendung einer Kühllagerlösung einführt, einer gepufferten Lösung, die klinisch bei Organtransplantationen verwendet wird und die Zellen des ausgeschnittenen Gewebes stark stabilisiert. Das hier beschriebene Protokoll zeigt auch, wie der Zellphänotyp bestimmt und eine hohe Effizienz des Zellüberlebens bei minimaler Zellkreuzkontamination gewährleistet werden kann.
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Protocol
Alle Patientenproben stammen von Personen, die an Studien teilnehmen, die vom institutionellen Prüfungsausschuss der Universität Pittsburgh in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki genehmigt wurden. Leichengewebe, das über das Center for Organ Recovery and Education (CORE) gewonnen wurde, wurde vom University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID) genehmigt.
1. Zulassung und Sicherheit
- Einholung der Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) oder eines freigestellten Vermerks für die Entnahme von Patientenproben oder Leichengewebe gemäß der Deklaration von Helsinki.
- Nehmen Sie an der erforderlichen institutionellen Ausbildung teil, um mit menschlichem Gewebe zu arbeiten, z. B. Bloodborne Pathogens Training, Biomedical Human Subjects Research, Privacy and Information Security sowie Transport und Versand von biologischem Material.
2. Logistik und Vorbereitung
- Chirurgische Proben
- Stellen Sie sicher, dass ein Kühlschrank verfügbar ist und sich in der Nähe des Operationssaals befindet. Bewahren Sie 50-ml-konische Röhrchen mit einer anonymisierten Nomenklatur vor, die 40 ml sterile Aliquots der Kühllagerlösung enthält, in diesem Kühlschrank für die Verwendung durch chirurgisches Personal. Diese Röhrchen sind bis zum Verfallsdatum auf der Originalverpackung bei 4 °C stabil.
- Legen Sie nach der Extraktion Klappengewebe in diese Röhrchen. Legen Sie die Röhrchen in einen versiegelten sekundären Behälter, z. B. einen auslaufsicheren Plastikbeutel oder einen Kunststoffbehälter, der mit einem Biogefahrenetikett gekennzeichnet ist. Gewebe werden nach institutionellen Protokollen für den Transport von Biogefahren aufgenommen und auf Eis transportiert.
- Leichenproben
- Geborgene Organe in Kühllagerlösung tauchen, in ein versiegeltes sekundäres Sicherheitsgefäß geben und auf Eis gemäß den institutionellen Protokollen für den Transport biologischer Gefahren transportieren.
3. Zubereitung der Reagenzien
- Machen Sie kollagenbeschichtete Teller mindestens am Vortag.
- Mischen Sie in einem 50-ml-konischen Röhrchen 5 ml Isopropylalkohol, 8,7 ml Essigsäure und 0,5 μg Kollagen-I-Pulver. Bis zu 50 ml mit sterilem Wasser bringen. Mischen und filtrieren Sie durch einen 0,45-μm-Filter.
- Unter einer sterilen Zellkulturhaube genügend Kollagenlösung zu 6 Well-Platten und 10 cm Geschirr hinzufügen, um den gesamten Boden zu bedecken. Den Teller abdecken und 4-6 h bei Raumtemperatur ruhen lassen. Entfernen Sie die überschüssige Lösung mit einer sterilen Pipette, geben Sie sie in ein neues steriles 50-ml-konisches Röhrchen und speichern Sie bei 4 °C, um zusätzliche Platten herzustellen. Die Lösung kann mehrere Monate bei 4 °C gelagert werden.
- Trocknen Sie die Platten über Nacht in einem 37 °C Inkubator und lagern Sie sie anschließend in einem wiederverschließbaren Beutel bei 4 °C. Kollagenbeschichtete Teller und Geschirr können mehrere Monate gelagert werden.
- Autoklavieren Sie die folgenden Artikel: Gewebezange, Taschentuchschere, Wattestäbchen und Mullpads.
- VEC-Wachstumsmedien: Bereiten Sie das Wachstumsmedium für Endothelzellen gemäß den Protokollen des Herstellers vor und verwenden Sie es. Im Dunkeln bei 4 °C lagern. Kurz vor der Anwendung auf Zellen auf 37 °C erwärmen, Medien nicht länger als nötig im Wärmebad lassen (10-15 min sind ausreichend). Verwenden Sie die Medien innerhalb eines Monats nach der Vorbereitung.
- VIC-Wachstumsmedien: Ergänzung DMEM-Basismedium (4,5 g / L Glukose, L-Glutamin-Ergänzung, 110 mg / L Natriumpyruvat)30 mit 10% hitzeinaktiviertem FBS und 100 I.E./ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin. Im Dunkeln bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern. Kurz vor der Anwendung auf Zellen auf 37 °C erwärmen, Medien nicht länger als nötig im Wärmebad lassen (10-15 min sind ausreichend).
- Stellen Sie kurz vor Gebrauch eine sterile Spüllösung her. Ergänzen Sie steriles PBS mit 2,5 μg/ml Fungizid, 0,05 mg/ml Gentamicin und 5 μg/ml Bakterizid.
- Stellen Sie kurz vor Gebrauch sterile Kollagenaselösung her. Fügen Sie 5 mg Kollagenase II zu 5 ml sterilem frischem DMEM-Basismedium hinzu. Mischen Sie gut und sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie einen 0,45-μm-Filter passieren. Bis zum Gebrauch auf Eis halten.
4. Gewebeaufbereitung und -verarbeitung
HINWEIS: Vor Beginn der Arbeiten muss eine institutionelle Genehmigung für die Verwendung von menschlichem Gewebe eingeholt werden. Beim Umgang mit Geweben muss die folgende persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen werden: ein Einweg-Flüssigkeitsbarriere-Wickelkittel oder ein spezieller Laborkittel mit Flüssigkeitsbarriere um die Schürze und Einweg-Ärmelklee; ein Vollgesichtsschutz oder eine Schutzbrille mit einer chirurgischen Maske; Doppelhandschuhe; enge Schuhe; und Kleidung, um die Beine zu bedecken. Umfassende Workflow-Diagramme der Gewebevorbereitung für die Verkalkungsbeurteilung (Abschnitt 5) und die Zellisolierung (Abschnitte 6 und 7) sind in Abbildung 1A,B dargestellt.
- Nach Erhalt der Leichenorganprobe die Aortenwurzel herausschneiden und in ein 50 ml konisches Röhrchen steriler Spüllösung tauchen. Nach Erhalt der chirurgischen Probe aus den Transportgefäßen entnehmen und in ein 50 ml konisches Röhrchen steriler Spüllösung tauchen. Röhrchen mit dem Gewebe in Eiskübel auf Wippe legen und 10 min bei Raumtemperatur (RT) mischen.
HINWEIS: Die Verarbeitung von Geweben so nah wie möglich am Zeitpunkt der Extraktion führt zur besten Zellerholung, jedoch können lebensfähige Zellen bis zu 61 Stunden nach der Exzision gesammelt werden, und die Daten zeigen, dass VICs mit zunehmender Zeit robuster sind als VECs. Wenn das Gewebe nicht sofort verarbeitet werden kann, entfernen Sie, wenn möglich, das Gewebe, führen Sie Schritt 4.1 durch, legen Sie das Gewebe dann wieder in eine frische, sterile Kühllösung und bewahren Sie es bei 4 °C auf, bis Sie fortfahren können. Ventile, die während Nacht- oder Wochenendoperationen gesammelt werden, können in 40 ml Kühllagerlösung bei 4 °C gelagert werden und sind noch in der Lage, lebensfähige Zellen mehr als 2 Tage nach der Extraktion zu liefern. - Sprühen Sie die Röhrchen mit 70% Ethanol ein und geben Sie sie in eine sterile Haube. Entfernen Sie das Gewebe und entfernen Sie zwei Klappenflügel (Abbildung 2A). Geben Sie ein Blättchen in eine kryogene Durchstechflasche (oder 2-3 Durchstechflaschen, wenn mehrere kleinere Stücke für zukünftige Analysen benötigt werden) und frieren Sie ein, indem Sie flüssigen Stickstoff eintauchen und dann bei -80 °C lagern.
- Wenn das Ventil bikuspid ist, schneiden Sie nur eine Packungsbeilage aus. Schneiden Sie das Blättchen mit einer Schere vom Knötchen bis zum Scharnier in zwei Hälften. Verwenden Sie eine Hälfte der Packungsbeilage für das Einfrieren von Schnappschüssen und die andere Hälfte für Schritt 4.3.
- Verarbeiten Sie die zweite Packungsbeilage für die Paraffineinbettung, um den Verkalkungsgehalt zu beurteilen, indem Sie sie von Knötchen zu Scharnier halbieren. Legen Sie beide Teile in eine Kassette, die in 4% Paraformaldehyd (PFA) getaucht ist, und legen Sie sie dann für mindestens 2 h, aber nicht mehr als 4 h auf eine Wippe bei RT.
HINWEIS: Längere Fixierungszeiten erzeugen mehr Hintergrund mit immunfluoreszierender Färbung. Sobald die Schritte 4.2 und 4.3 ausgeführt wurden, fahren Sie sofort mit Abschnitt 6 fort und kehren nach Schritt 6.12 zu Schritt 4.4 zurück. - Nach der Fixierung waschen Sie das Gewebe durch Eintauchen in frisches PBS für 1 h 3-4 mal. Nach diesen Wäschen können die Proben bei Bedarf mehrere Monate in PBS bei 4 °C verbleiben. Fahren Sie kurz vor dem Einbetten mit dem nächsten Schritt fort.
- Wechseln Sie allmählich von PBS zu 70% Ethanol. Waschen Sie 30-60 Minuten pro Schritt mit 1:4 70% Ethanol:PBS; 1:1 70% Ethanol:PBS, 4:1 70% Ethanol:PBS; 70% Ethanol.
- Betten Sie das Gewebe so ein, dass Abschnitte die drei Schichten des Blattes (Abbildung 1A) gemäß den festgelegten Protokollen31 offenbaren. Alternativ und falls verfügbar, bringen Sie das Gewebe zu einem Pathologiekern zum Einbetten und Schneiden.
- Entsorgen oder lagern Sie PSA nach dem Umgang mit Taschentüchern und waschen Sie sich sofort die Hände. Dekontamination aller Geräte, Oberflächen sowie fester und flüssiger Abfälle mit einer 1:10-Verdünnung von Bleichmittel oder Reinigungsmitteldesinfektionsmittel. Lassen Sie 20 Minuten für die Dekontamination, dann folgen Sie mit einer 70% Ethanol-Spülung. Behandeln Sie die Zellkulturhaube mit Mykoplasmenspray gemäß den Anweisungen des Herstellers.
5. Von Kossa-Färbung für Calciumgehalt
HINWEIS: Dies kann gut nach der Zellisolierung und Linienetablierung erfolgen, aber stellen Sie sicher, dass Sie den Verkalkungsgrad des Gewebes mit Dokumenten verknüpfen, die sich auf die etablierte primäre Zelllinie beziehen.
- 5 oder 10 μm dicke Paraffinscheiben auf Glasobjektträger schneiden und Objektträger bei 65 °C 1 h backen, dann auf RT abkühlen lassen.
- Mit frischen Lösungen die Objektträger wie folgt entparaffinieren: 100% Xylol für 30 min, 2x; 100% Ethanol für 3 min, 2x; 90% Ethanol für 3 min; 80% Ethanol für 3 min; 70% Ethanol für 3 min; 50% Ethanol für 3 min; Reinstwasser für 3 min; Bis zu den nächsten Schritten in Reinstwasser aufbewahren.
HINWEIS: Die oben genannten Zeiten sind minimal, jeder Schritt kann länger dauern. - Fahren Sie mit der Von Kossa-Färbung gemäß den Protokollen des Herstellers fort.
- Beurteilen Sie den gesamten Klappenbereich mikroskopisch und weisen Sie ein Kontrollgewebe (keine Anzeichen einer Verkalkung) oder CAVD (Anzeichen einer Verkalkung, Abbildung 2B) zu.
6. Isolierung, Expansion und Bestätigung von Klappendothelzellen (VEC)
- Öffnen Sie in einer sterilen Zellkulturhaube das konische Röhrchen mit dem verbleibenden Ventilflügel und legen Sie das Blättchen in ein neues 50-ml-konisches Röhrchen, das mit eiskaltem PBS gefüllt ist. Kappenrohr und vorsichtig umdrehen oder für 2 min bei RT auf eine Wippe legen.
- Entfernen Sie das Gewebe in eine 60 mm große Schale, die mit 5-7 ml kalter Kollagenaselösung gefüllt ist. Tauchen Sie mit einer Pinzette beide Seiten des Blättchens 3-4 Mal in die Lösung. Inkubieren Sie das Gewebe für 5-10 min im Zellkulturinkubator bei 37 °C und schaukeln Sie das Gewebe vorsichtig alle 2 min 3-4 mal.
- Nehmen Sie 2 ml der Lösung aus der Schale und geben Sie sie in ein steriles 15 ml konisches Röhrchen. Legen Sie eine Pinzette an den Knoten und verwenden Sie ein trockenes steriles Wattestäbchen, um von der Pinzette zum Scharnier zu streichen, wobei Sie den Tupfer drehen, während Sie ihn entlang des Blättchens bewegen. Zwischen jedem Wischen schwenken Sie den Tupfer in der Lösung im 15-ml-Konikusröhrchen, um die Zellen zu entfernen. Wiederholen Sie, um die Oberfläche des Gewebes vollständig abzutupfen, drehen Sie sich dann um und wiederholen Sie auf der anderen Seite.
- Halten Sie das Ventilblatt mit einer Pinzette in der einen Hand und eine 1-ml-Pipette in der anderen Hand und spülen Sie die Oberflächen des Flügels mit der Lösung in der Schale ab. Nach dem Spülen wird die gesamte Lösung, die die VECs in der Schale enthält, in dasselbe 15-ml-konische Röhrchen mit den Zellen aus dem Tupfer gegeben und mit Schritt 6.5 fortgefahren. Legen Sie das verbleibende Klappengewebe in ein neues 15-ml-konisches Röhrchen mit 7 ml steriler Kollagenaselösung und fahren Sie mit Schritt 7.1 fort.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit den VECs bei 180 x g für 5 min, um die isolierten VECs zu pelletieren. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie ihn in 3 ml VEC-Wachstumsmedium. Zentrifugieren Sie noch einmal und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Wachstumsmedien und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau.
- Resuspendieren Sie das VEC-Pellet in 2 ml VEC-Wachstumsmedien und legen Sie die Zellen in eine kollagenvorbeschichtete Vertiefung einer 6-Well-Platte bei etwa 5 x 105 Zellen /cm2. Lassen Sie die Zellen mindestens 3-4 Tage wachsen, entfernen Sie dann Medien und füllen Sie sie mit frischen Medien auf. Wiederholen Sie den Medienwechsel alle 4 Tage. VECs wachsen in kopfsteinpflasterförmigen Flecken (Abbildung 3B, linke Felder).
- Wenn VEC-Pflaster >80% der Platte bedecken, teilen Sie die Zellen bei etwa 1,3 x 104 Zellen / cm 2, je nachdem, wie schnell sie wachsen (wenn sie 80% in weniger als 1 Woche erreichen, teilen Sie sich bei einer etwas geringeren Anzahl von Zellen / cm2).
- Um zu spalten, waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml DPBS und fügen Sie dann genügend Dissoziationsreagenz hinzu, um nur die Oberfläche der Zellen zu bedecken. Inkubieren Sie für 2-3 min bei 37 °C, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht überbrütet sind. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie das gleiche Volumen VEC-Wachstumsmedien hinzufügen und Flüssigkeit in ein 15-ml-Röhrchen überführen. Bei 180 x g für 5 min zentrifugieren, Überstand entfernen und in geeignetem Medienvolumen für die Anzahl der benötigten Vertiefungen/Platten resuspendieren.
HINWEIS: Einmal zu einer 10 cm großen Platte expandiert, können VECs manchmal ihre Morphologie verlieren und den Phänotyp ändern, wenn sie sich vermehren. Dies tritt tendenziell auf, wenn VECs während des Auf- und Ausbaus der Zelllinie an einem geringen Konfluenz ausgesät werden. - Um eine reine Kultur zu gewährleisten, sollten Sie bei jeder Spaltung superparamagnetische CD31+-Perlen verwenden.
- Für 1 x 108 oder weniger Zellen (eine 10-cm-Schale oder weniger) bereiten Sie 25 μL superparamagnetische Perlen durch Waschen gemäß den Protokollen des Herstellers vor.
HINWEIS: Es wird empfohlen, Schritt 6.10 vor der Trypsinisierung von VECs durchzuführen. - Zellen wie in Schritt 6.8 ablösen, aber in 500 μL PBS mit 0,1% BSA, pH 7,4 resuspendieren und in ein 2 mL Zentrifugenröhrchen geben. 500 μL gewaschene und resuspendierte Kügelchen in das 2-ml-Zellröhrchen geben und 20 min bei 4 °C auf einem Rotator inkubieren.
- Legen Sie die Schläuche für 2 min auf den Magneten. Während sich die Röhre noch im Magneten befindet, entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Röhrchen vom Magneten entfernen, 1 ml frisches PBS mit 0,1% BSA hinzufügen, 2-3 Mal vorsichtig pipetten und dann wieder für 2 min auf den Magneten legen. Wiederholen Sie 2 weitere Male. Nach dem endgültigen Entfernen des Puffers resuspendieren Sie die Zellen in Wachstumsmedien in einem für die Replattierung erforderlichen Volumen.
HINWEIS: Zellen haben immer noch Perlen, aber diese beeinflussen das Wachstum nicht und werden in nachfolgenden Passagen entfernt. - Sobald die Zellen expandiert wurden, bestätigen Sie zusätzlich zur Morphologie den VEC-Phänotyp durch positive Färbung für Immunfluoreszenzmarker wie von-Willebrand-Faktor (vWF), Cadherin 5 (CDH5) oder PECAM-1/CD31 und negative Färbung für VIC-Marker wie Calponin 1 (CNN) oder alpha-2-Aktin der glatten Muskulatur (αSMA, Abbildung 4, linkes Bild).
7. Isolierung, Expansion und Speicherung von Ventilzellen (VIC)
- Wie in Schritt 6.4 angegeben, wird das Blättchen nach Entfernung von VECs aus dem Klappengewebe in ein 15 ml konisches Röhrchen mit 7 ml Kollagenaselösung gegeben. Inkubieren Sie für 12 h im Zellkulturinkubator mit leicht geöffneter Kappe, um den Gasaustausch zu ermöglichen. Eine erfolgreiche Isolierung von VICs kann noch mit bis zu 18 h in Kollagenaselösung erfolgen.
- Nach der Inkubation in einer sterilen Zellkulturhaube das Gewebe vorsichtig durch Pipettieren mit einer serologischen Pipette mischen, um die Freisetzung von VICs aus dem Blättchengewebe sicherzustellen.
- Entfernen Sie die Zellsuspension und geben Sie einen 0,70-μm-Filter in ein 50-ml-konisches Röhrchen.
- 7 mL VIC-Wachstumsmedium in das 50-ml-Röhrchen geben und bei 180 x g für 5 min zentrifugieren. Überstand aspirieren und Zellpellet in 1 ml VIC-Wachstumsmedien resuspendieren und die Zellzahl bestimmen. Die VICs werden in einer mit 60 mm Gewebekultur behandelten Schale mit 1,3 x 104 Zellen/cm2 beschichtet.
- Lassen Sie die Zellen mindestens 1-2 Tage wachsen, bevor Sie Medien ersetzen. Entfernen Sie Medien und waschen Sie zweimal DPBS, um Restablagerungen zu entfernen und durch frisches Wachstumsmedium zu ersetzen. Medium alle 2-3 Tage auffüllen. VICs wachsen in Fibroblastenform (Abbildung 3B, rechte Felder).
- Wenn VICs einen Konfluency von >90% erreichen, waschen Sie zweimal mit DPBS, um das überschüssige Medium zu entfernen, und lösen Sie die Zellen durch Zugabe eines geeigneten Volumens eines vorgewärmten Dissoziationsreagenzes ab, um die Platte abzudecken (dh 2-3 ml pro 10 cm Schale). Die Schale in einem 37 °C heißen Inkubator ausbrüten. VICs lösen sich nach 2-3 min Inkubation von der Schale. Fügen Sie 4-6 ml vorgewärmtes Medium hinzu.
HINWEIS: Wenn Zellen länger als 3 Minuten brauchen, um von der Platte abzuheben, kann das Dissoziationsreagenz seine Wirksamkeit verloren haben. Bei Bedarf kann ein Zellschaber verwendet werden, um die Zellen sanft anzuheben. - Die Zellsuspension in ein Röhrchen geben und bei 180 x g vorsichtig für 5 min zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstands das Zellpellet vorsichtig in vorgewärmten VIC-Wachstumsmedien resuspendieren und die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau bestimmen. Säen Sie die lebensfähigen Zellen mit einer Dichte von 1: 2 der ursprünglichen Schale (dh ~ 1 × 106 Zellen pro 10 cm Schale oder 1,3 x 104 Zellen / cm2).
- Beurteilen Sie den VIC-Phänotyp durch positive Färbung für immunfluoreszierende Marker wie αSMA, CNN oder SM22α und negative Färbung für VEC-Marker wie CD31, CDH5 oder vWF (Abbildung 4, rechte Felder).
HINWEIS: Der hier vorgestellte Protokoll-Workflow wählt unvoreingenommen ein Merkblatt für die Isolierung von VECs und VICs aus, während die restlichen Packungsbeilagen für die Von Kossa-Färbung (Abschnitt 5) und das Einfrieren von Snap verwendet werden.
8. Langfristige Zellspeicherung
- Nach der Expansion frieren Sie die Zellen für die Langzeitlagerung ein. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 2-5 ml DPBS und fügen Sie dann genügend Dissoziationsreagenz hinzu, um die Zellen wie in den Schritten 6.8 und 7.6 zu lösen. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie das gleiche Volumen VEC oder VIC Wachstumsmedien und Transferzellsuspension in ein 15 ml Röhrchen geben.
- Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau.
- Zentrifuge bei 180 x g für 5 min.
- Resuspendieren Sie Zellen in gekühlten konditionierten Wachstumsmedien auf eine Zelldichte von ~ 3 × 106 Zellen / ml.
- Vorsichtig mit Schwenken ein gleiches Volumen gekühltes 2x Kryokonservierungsmedium hinzufügen. Dies bringt die Zellkonzentration auf ~ 1,5 × 106 Zellen / ml.
- Aliquot 1 ml in Kryokonservierungsfläschchen. Legen Sie die Durchstechflaschen in einen Zellgefrierbehälter, schließen Sie sie und kehren Sie sie 5-6 Mal um, um sicherzustellen, dass die Zellen suspendiert bleiben. Stellen Sie den Behälter bei -80 °C für 6-72 h oder gemäß dem Gefrierbehälterprotokoll auf. Durchstechflaschen aus -80 °C entnehmen und zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführen.
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Representative Results
Das obige Protokoll beschreibt die Schritte, die für den Umgang mit menschlichem Klappengewebe und die Isolierung und Etablierung lebensfähiger Zelllinien aus diesen Geweben erforderlich sind. Leaflets der Aortenklappe werden zur Paraffineinbettung verarbeitet, für die Langzeitlagerung für biochemische oder genetische Analysen eingefroren und zur Isolierung von VECs und VICs verdaut (Abbildung 1). Während chirurgische Proben wahrscheinlich eine klinische Diagnose einer Aortenstenose haben und schwere Knötchen der Verkalkung aufweisen können, die mit bloßem Auge sichtbar sein können, ist eine Aortenklappenverkalkung bei einer signifikanten Anzahl älterer (>65 Jahre alter) Personen vorhanden32, und aufgrund dieser Prävalenz werden alle Gewebe - chirurgische und Leichengewebe - einer Von-Kossa-Färbung oder einem ähnlichen Verfahren unterzogen, um zu beurteilen, ob eine Verkalkung vorliegt (Abbildung 2).
Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von Kühlspeicherlösung die Zellen des ausgeschnittenen Klappengewebes stark stabilisierte. Kühllagerlösung wird bei lebenden Organtransplantationen verwendet. Es wird entweder vor oder nach der Entnahme vom Spender durch Organe gespült und während des Transports auf Eis im Gefäßsystem dieses Organs belassen. Es wurde beobachtet, dass VEC-Linien leichter aus Spenderproben als aus chirurgischem Gewebe hergestellt wurden, und die Spenderlinien ihre Endothelzellmorphologie eher für mehr Passagen beibehielten. Dies war verblüffend, da Spendergewebe das Labor oft 12-24 Stunden postmortal nicht erreichte, während chirurgisches Gewebe zwischen 2 und 4 Stunden gewonnen wurde. Beim Verpacken der chirurgischen Probenröhrchen mit Kühllagerlösung anstelle von PBS erhöhte sich die Zellausbeute erheblich. Wie in Abbildung 3 zu sehen ist, können sowohl lebensfähige VECs als auch VICs über 61 Stunden nach der Ventilextraktion erhalten werden. Während ein etwas höherer Prozentsatz lebender VICs als VECs erhalten wird, wenn Zellen bis zu einem Tag nach der Klappenexzision isoliert werden, bleiben die Zellen nach 48 Stunden nach der Exzision lebensfähig. Bis zu 40% der gesamten gewonnenen Zellen entsprechen lebenden Zellen und wir haben konsistente Zahlen zwischen biologischen Replikaten beobachtet. Darüber hinaus bestätigt die Morphologieuntersuchung auch die Zellidentität; Während VECs als gepackte, kopfsteinpflasterartige und wachstumskontaktgehemmte Zellen erscheinen, ähnelt die VIC-Morphologie Myofibroblasten mit Spindelform. Die Immunfärbung der Proben bestätigte, dass 91,8% ± 1,8 (n = 3) der expandierten VECs positiv für den Endothelmarker vWF waren, während 92,0% ± 5,0 (n = 3) der expandierten VICs positiv für den interstitiellen Zellmarker αSMA waren (Abbildung 4). Diese Zahlen stimmen mit den zuvor gemeldeten Ergebnissenüberein 33.
Abbildung 1: Klappengewebeverarbeitung und Zellisolierung aus menschlicher Kontrolle und CAVD-Ventilen . (A) Schematische Darstellung der Gewebeverarbeitung zur Beurteilung der Verkalkungsgrade der Klappen. (B) Schematische Darstellung des zeitlichen Verlaufs und der Schritte zur Isolierung und Charakterisierung von humanen Klappenendothelzellen (VECs) und Klappeninterstitiellen Zellen (VICs) aus Kontroll- und CAVD-Geweben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beurteilung der Verkalkung . (A) Repräsentatives Bild von Kontroll- (oben) und verkalktem (unten) Klappengewebe von menschlichen Spendern. Beachten Sie, dass die Verkalkungsknoten des CAVD-Gewebes die Morphologie und die Fähigkeit, die Blättchen sauber zu entfernen, stark verändern können. (B) Vertreter von Kossa Färbung von Kontroll- (links) und CAVD-Klappengewebe (rechts) nach Fixierung und Weiterverarbeitung des menschlichen Klappengewebes. Beachten Sie, dass die Verkalkung durch das Vorhandensein von dunklem Niederschlag im Blättchengewebe aufgedeckt wird. Die Ventilbilder wurden mit einer Laborkamera aufgenommen. Von Kossa gefärbte Ventile wurden mit einem 10-fachen Objektiv, Maßstabsbalken 200 μm erfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Bewertung der Überlebenskurven von Zellüberleben (A) VECs und VICs. Aus fünf Ventilproben wurden drei Blättchen gewonnen. Das erste Blättchen jeder Klappe wurde sofort verarbeitet (3-12 h nach der Extraktion), das zweite Blättchen wurde ca. 24 h später (22-35 h) und das dritte Blättchen ca. 48 h nach der Entnahme des Gewebes verarbeitet (45-61 h). Die Klappenblättchen wurden bis zur Verarbeitung in Kühllagerlösung bei 4 °C aufbewahrt. Die y-Achse stellt den Prozentsatz der lebenden Zellen dar. (B) Morphologie gesunder Kulturen von VECs (linkes Feld) und VICs (rechtes Feld). Grafiken zeigen den mittleren ± SD-Lebendzellanteil von Zellen, die aus n = 5 Klappengeweben isoliert wurden. Die Bilder wurden mit einem 4x- und 10x-Objektiv aufgenommen, Maßstabsbalken 200 μm bzw. 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung auf VECs und VICs. VECs sind positiv für den endothelialen Marker von Willebrand Factor (vWF, linke Panels), während VICs für den interstitiellen Marker αSMA positiv sind. Beachten Sie, dass unser Isolationsprotokoll eine hohe Isolationseffizienz garantiert. Es wird keine Kreuzkontamination zwischen VECs und VICs festgestellt. Die Bilder wurden mit einem 10-fachen Objektiv, Maßstabsbalken 100 μm aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Gewinnung von Kontroll- und Krankheitsgewebe vom Menschen ist entscheidend für die In-vitro- und Ex-vivo-Krankheitsmodellierung. Während man jedoch oft über die Herausforderungen spricht, die Lücke zwischen Bank und Krankenbett zu überbrücken, ist die umgekehrte Reihenfolge - vom OP-Raum zur Bank - oft genauso entmutigend. Wesentlich für einen Grundlagenwissenschaftler, um primäre menschliche Gewebeproben zu erhalten, ist eine Zusammenarbeit mit einem investierten Chirurgenwissenschaftler, der über ein Team von Krankenschwestern, chirurgischen Technikern, Arzthelferinnen, Medizinstudenten und Assistenzärzten sowie klinischen Protokollmanagern verfügt, die Patienten aufnehmen und einwilligen, an der ordnungsgemäßen Handhabung von herausgeschnittenem Gewebe teilnehmen und helfen und die für die Gewebeentnahme erforderliche Logistik koordinieren können. Ohne die größte Anstrengung aller Beteiligten, die Zeit von der Exzision bis zur Zellisolierung zu verkürzen, werden lebenswichtiges Zellmaterial und die darin enthaltenen Informationen irreparabel verändert oder gehen verloren.
Entscheidend für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Gewebeproben ist die Verwendung von Kühllagerlösung. Dies ist die gleiche Lösung, die von den Organtransplantationsteams bei UPMC und anderen medizinischen Transplantationszentren verwendet wird. Eine bessere Zellausbeute wurde aus Leichengewebe erzielt, das dem Spender viele Stunden zuvor entnommen worden war, als aus Geweben, die schneller aus dem Operationssaal gewonnen wurden, aber in kaltem PBS gehalten wurden. Diese zufällige Entdeckung war für die Zellgewinnung aus menschlichem Gewebe unerlässlich. Die Beschaffungszeit von der Gewebeentfernung bis zur Lieferung im Labor beträgt 1-5 Stunden für chirurgisches Gewebe und mehr als 24 Stunden für Leichengewebe. Im Vergleich dazu kann die Beschaffung und Verarbeitung von tierischem Gewebe oft innerhalb von Minuten nach der Euthanasie erfolgen, was ideal für die Zelllebensfähigkeit ist. In Ermangelung einer Kühllagerlösung ist es wahrscheinlich, dass ein für die Kultivierung von Zellen geeignetes Medium auch besser abschneiden könnte als PBS, jedoch wurde dieses Medium aufgrund des Erfolgs der Kühllagerlösung bei der Lebendorgantransplantation und des Empfangs von Leichengewebe in dieser Lösung nicht getestet. Die Lösung ist lagerstabil, was ideal für die Lagerung in Operationssälen ist, und bestimmte Inhaltsstoffe wie Adenosin sind dafür bekannt, positive Reaktionen auf zelluläre Belastungen wie Ischämie / Hypoxie zu fördern21,34.
Ein weiterer wesentlicher Schritt zur Gewinnung lebensfähiger Zellen ist das Waschen des Gewebes mit Fungizid, Gentamicin und Bakterizid. Diese kurze Spülung trägt dazu bei, dass die Zellen nicht von Bakterien und Pilzen kontaminiert bleiben. Ebenso kritisch sind die Schritte zur Verdauung von VECs aus dem Klappengewebe, wo innerhalb weniger Minuten die VECs abgelöst und dann von der Oberfläche der Klappenflügel abgetupft werden. Die anschließende Verdauung der VICs, die sich auf der dichten extrazellulären Matrix des Blättchens befinden, hat viel mehr Spielraum für Dauer und Stärke. Die in diesem Protokoll beschriebene unvoreingenommene Gewebebehandlung ermöglicht die Isolierung der beiden wichtigsten Zellpopulationen im Klappenflügel, VECs und VICs. Obwohl eine kürzlich durchgeführte Einzelzell-Transkriptomanalyse die Koexistenz von mindestens vierzehn verschiedenen Zellsubtypen gezeigt hat, die sich in der menschlichen Klappe befinden, einschließlich sechs nicht aus Ventilen gewonnenen Stromazellen im CAVD-Gewebe35, kann diese Vielfalt Variationen aufgrund von Effekten der Verarbeitung und Verdauung dieser verhärteten Gewebe darstellen oder auf unterschiedliche Mikroumgebungen zurückzuführen sein, denen die Blattzellen ausgesetzt sind: VECs sind zwei verschiedenen Blutströmen ausgesetzt, während VICs in drei verschiedene extrazelluläre Matrixschichten eingebettet sind 8,9. Das hier beschriebene groß angelegte Isolationsprotokoll und die Analyse stellen sicher, dass über 90% der VECs und VICs ihrem Hauptphänotyp entsprechen. Obwohl ein gewisses Maß an Heterogenität festgestellt werden kann, hat dies keinen Einfluss auf die allgemeinen Ergebnisse der Studie der VEC- und VIC-Homöostase 8,9,13,14,15,16.
Es ist auch wichtig zu beachten, dass Patienten und ihr Klappengewebe und damit die von ihnen gewonnenen Zelllinien nicht identisch sind. Genetik, Komorbiditäten, Handhabung während der Operation und Verarbeitung sowie Frische der Inhaltsstoffe der Verdauungslösung können die Wachstumsrate und vielleicht sogar das Verhalten oder den Phänotyp der isolierten Zellen beeinflussen. Während die vorliegende Studie die Fähigkeit zeigt, mit diesem Verfahren eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Zellen zu erhalten, kann es angeborene oder induzierte Unterschiede in diesen Zelllinien geben, die sich auf nachgeschaltete Experimente auswirken können. Es ist oft schwierig, den Zeitpunkt genau zu kennen, seit dem Patienten oder Spender das Gewebe entnommen wurde, und insbesondere im letzteren Fall die Zeit seit dem Stillstand der Zirkulation zu kennen. Darüber hinaus gibt es inhärente Variabilität zwischen den Geweben in Bezug auf die Anzahl der erhaltenen lebensfähigen Klappenzellen, die Proliferationskapazität der Zellen und die Beibehaltung des Zellphänotyps. Zelllinien können genetische Mutationen beherbergen - entweder angeboren oder somatisch -, von denen der Arzt und das Forschungsteam nichts wissen, und der Umbau und die anschließende Handhabung der Gewebe können auch den Zellphänotyp oder sogar die Epigenetik verändern. Daher ist es für alle Experimente, in denen diese primären menschlichen Zellen verwendet werden, absolut notwendig, dass biologische Replikate - d.h. Zelllinien, die von verschiedenen Patienten gewonnen werden - verwendet werden, trotz des erheblichen Zeit- und Kostenaufwands, den sie verursachen. Dies trägt dazu bei, dass die Ergebnisse nicht auf Störeffekte bei der Beschaffung und Verarbeitung des Gewebes zurückzuführen sind. Die variable Proliferationsrate verschiedener Zelllinien kann eingestellt werden, indem entweder Zellen in Experimenten zu unterschiedlichen Zeiten gesammelt oder Zellen für Experimente mit unterschiedlichen Dichten gesät werden; Keine Antwort ist die beste für alle experimentellen Designs. Während die Komplikationen nicht unbedeutend sind, ist die Verwendung von primärer menschlicher Kontrolle und CAVD-Gewebe-abgeleiteten Zelllinien für in vitro und ex vivo experimentelle Modelle unerlässlich, um die initiierenden Faktoren und Ausbreitungsprozesse zu definieren, die die CAVD-Pathogenese vorantreiben.
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Disclosures
IS erhält institutionelle Forschungsunterstützung von Atricure und Medtronic und fungiert als Berater für Medtronic Vascular. Keiner dieser Konflikte steht im Zusammenhang mit dieser Arbeit. Alle anderen Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Jason Dobbins für die aufschlussreiche Diskussion und kritische Lektüre dieses Manuskripts. Wir möchten dem Center for Organ Recovery and Education für seine Hilfe und Unterstützung danken und danken den Gewebespendern und ihren Familien, die diese Studie ermöglicht haben. Alle Patientenproben stammen von Personen, die an Studien teilnehmen, die vom institutionellen Prüfungsausschuss der Universität Pittsburgh in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki genehmigt wurden. Leichengewebe, das über das Center for Organ Recovery and Education (CORE) gewonnen wurde, wurde vom University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID) genehmigt.
Einige Figuren, die mit Biorender.com erstellt wurden.
CSH wird vom National Heart, Lung and Blood Institute K22 HL117917 und R01 HL142932, der American Heart Association 20IPA35260111 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
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