Summary
Het mechanisme geassocieerd met fagocytose bij Leishmania-infectie blijft slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die plaatsvinden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen.
Abstract
Fagocytose is een georkestreerd proces dat verschillende stappen omvat: herkenning, binding en internalisatie. Professionele fagocyten nemen Leishmania-parasieten op door fagocytose, bestaande uit het herkennen van liganden op parasietoppervlakken door meerdere gastheercelreceptoren. Binding van Leishmania aan macrofaagmembranen vindt plaats via complementreceptor type 1 (CR1) en complementreceptor type 3 (CR3) en patroonherkenningsreceptoren. Lipofosfosfaliek (LPG) en 63 kDa glycoproteïne (gp63) zijn de belangrijkste liganden die betrokken zijn bij macrofaag-Leishmania interacties. Na de eerste herkenning van parasietliganden door gastheercelreceptoren, worden parasieten geïnternaliseerd, overleven en vermenigvuldigen zich in parasitofore vacuolen. Het rijpingsproces van leishmania-geïnduceerde vacuolen omvat de verwerving van moleculen uit intracellulaire blaasjes, waaronder monomeer G-eiwit Rab 5 en Rab 7, lysosomaal geassocieerd membraaneiwit 1 (LAMP-1), lysosomaal geassocieerd membraaneiwit 2 (LAMP-2) en microtubule-geassocieerd eiwit 1A / 1B-lichtketen 3 (LC3).
Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die optreden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen met behulp van confocale microscopie, waaronder (i) binding (ii) internalisatie en (iii) fagosoomrijping. Door toe te voegen aan de hoeveelheid kennis rond deze determinanten van infectie-uitkomst, hopen we het begrip van de pathogenese van Leishmania-infectie te verbeteren en de uiteindelijke zoektocht naar nieuwe chemotherapeutische doelen te ondersteunen.
Introduction
Leishmaniasis is een verwaarloosde tropische ziekte veroorzaakt door protozoaire parasieten van het geslacht Leishmania, resulterend in een breed spectrum van klinische manifestaties in de gewervelde gastheer, waaronder cutane leishmaniasis, mucocutane leishmaniasis en viscerale leishmaniasis1. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) schat dat meer dan een miljard mensen risico lopen, met meer dan een miljoen nieuwe gevallen gemeld per jaar2.
Leishmania spp. zijn obligate intracellulaire protozoën die overleven in gastheercellen, waaronder monocyten, macrofagen en dendritische cellen3. Leishmania-macrofaaginteractie is een complex proces waarbij meerdere gastheercelreceptoren en parasietliganden betrokken zijn, hetzij door directe interactie of door opsonisatie waarbij complementreceptoren betrokken zijn 4,5. Klassieke oppervlaktereceptoren, zoals CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectine, tolachtige en aaseterreceptoren, bemiddelen parasitaire aanhechting aan macrofagen 6,7,8. Deze receptoren herkennen moleculen op het oppervlak van Leishmania, waaronder het 63 kDa glycoproteïne (gp63) en glycolipide lipofosfosfornaat (LPG)9. Dit zijn de meest voorkomende moleculen op het oppervlak van promastigoten en spelen een essentiële rol in de ondermijning van de immuunrespons van de gastheer, waardoor de vestiging van parasietinfectie in zoogdiercellenwordt bevorderd 10. Nadat parasiet oppervlakteliganden binden aan macrofaagreceptoren, hoopt F-actine zich op op zoogdierceloppervlakken, die parasieten omringen terwijl ze gefagocyteerd zijn. Vervolgens leidt dit tot de vorming van een parasiet-geïnduceerd compartiment genaamd parasitophorous vacuole (PV), dat fagolysosomale kenmerken vertoont11. Eenmaal binnen deze fagolysosomen ondergaan parasieten verschillende veranderingen die essentieel zijn voor overleving en vermenigvuldiging3.
De biogenese van PV's is een sterk gereguleerd membraanhandelproces dat cruciaal is voor de intracellulaire overleving van deze ziekteverwekker12. De vorming van dit compartiment is het gevolg van opeenvolgende fusiegebeurtenissen tussen fagosomen en compartimenten van de endocytische route van de gastheer. Klassieke celbiologische studies hebben aangetoond dat de rijping van PV's de verwerving van monomere G-eiwitten Rab 5 en Rab 7-eiwitten omvat, die voornamelijk geassocieerd zijn met vroege en late endosoomrijping, respectievelijk13. Bovendien verwerven deze compartimenten lysosoom-geassocieerde membraaneiwitten 1 en 2 (LAMP 1, LAMP 2), de belangrijkste eiwitbestanddelen van het lysosomale membraan en microtubule-geassocieerd eiwit 1A/1B-lichte keten 3 (LC3), een autofagosoommarker14. Ondanks schijnbare overeenkomsten variëren de kinetiek van PV-formatie15,16 en de morfologie van deze compartimenten afhankelijk van Leishmania-soorten. Infectie veroorzaakt door L. mexicana of L. amazonensis induceert bijvoorbeeld de vorming van grote compartimenten met een groot aantal parasieten17. Andere soorten, zoals L. braziliensis en L. infantum, vormen daarentegen kleinere vacuolen die normaal gesproken slechts één of twee parasieten bevatten in elke vacuole18.
Ondanks deze kennis rond gastheercel-Leishmania interactie, zijn de initiële gebeurtenissen veroorzaakt door contact tussen gastheerreceptoren en parasietliganden niet volledig opgehelderd. Van deze gebeurtenissen is bekend dat ze determinanten zijn van de uitkomst van parasietinfectie en zijn afhankelijk van parasietsoorten, het type gastheercelreceptoren dat wordt gerekruteerd om parasieten te herkennen en de activering van macrofaagsignaleringsroutes19,20. Daarom is het essentieel om de moleculen te identificeren die betrokken zijn bij de biogenese van door Leishmania geïnduceerde PV's en de rol (en) te bepalen die deze moleculen spelen bij het vaststellen en uitpakken van infecties. Hier beschrijven we een methode voor het monitoren van vroege gebeurtenissen die optreden tijdens de fagocytose van Leishmania, inclusief binding, internalisatie, fagosoomvorming en rijping. Dit werk zou kunnen helpen bij het verduidelijken van de deelname van PLC, Akt, Rab5, Rab7 en LC3 aan de vorming van PV's geïnduceerd door verschillende Leishmania-soorten. Belangrijk is dat dit protocol kan worden gebruikt om de deelname van andere eiwitten die betrokken zijn bij PV-rijping te onderzoeken. Toekomstige studies zullen de kennis uitbreiden rond mechanismen die betrokken zijn bij leishmania-gastheer celinteractie en bijdragen aan het ontwerp van nieuwe chemotherapeutische strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cellen werden verkregen van gezonde donoren na goedkeuring van procedures door de Nationale Ethische Commissies voor Onderzoek (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Celculturen
- Van menselijke monocyten afgeleide macrofagen
OPMERKING: Om van menselijke monocyten afgeleide macrofagen te verkrijgen voor in vitro differentiatie in macrofagen, verzamelt u bloed van gezonde donoren en zuivert u perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) zoals beschreven door D. English en B. R. Andersen21.- Na het verzamelen van perifeer bloed (50 ml), giet het in een gehepariniseerde buis en verdun het bloed vervolgens 1: 1 in een fosfaatbufferoplossing (PBS) bij kamertemperatuur. Plaats voorzichtig verdund gehepariniseerd bloed bovenop het eerder verdeelde dichtheidsgradiëntmedium.
- Centrifugeer de buizen bij 252 × g gedurende 30 minuten bij 24 °C om hemolyse te voorkomen.
OPMERKING: Stel centrifuge break-off in om vermenging van gradiëntlagen te voorkomen. Na centrifugatie worden discontinue gradiëntlagen gevormd van onder naar boven: erytrocyten, dichtheidsgradiëntmedium, PBMC-ring en plasma. - Breng de PBMC-ring, gelegen tussen het dichtheidsgradiëntmedium en de plasmalagen, over naar een nieuwe buis en vul deze met PBS om het gradiëntmedium met overtollige dichtheid uit te spoelen.
- Was de cellen eenmaal en centrifugeer op 190 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en resuspend pellet in 1 ml volledig RPMI-medium.
- Tel de cellen en plaat 2 × 106 cellen in 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) aangevuld met 25 mM N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N′-[2-ethaansulfonzuur] (HEPES), 2 g/L natriumbicarbonaat, 2 mM glutamine, 20 g/ml ciprofloxacine en 10% geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) (volledig RPMI-medium) gedurende 7 dagen bij 37 °C onder 5% CO2 in een 24-well plaat om monocyten te laten differentiëren in macrofagen door hechting.
- THP-1 culturen
- Kweek THP-1 cellijn in een concentratie van 2 × 105 cellen in 10 ml volledig RPMI-medium in een kweekkolf van 75 cm2 .
- Houd celculturen in een incubator bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende 7 dagen.
- Centrifugeer cellen bij 720 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en resuspeneer de pellet in volledig RPMI-medium.
- Tel cellen in een Neubauer-kamer.
- Plaatcellen op 13 mm glazen afdekkingen in een concentratie van 2 × 105 cellen per put in 500 μL volledig RPMI-medium met 100 nM phorbolmyristaatacetaat (PMA) bij 37 °C onder 5% CO2 om differentiatie van THP1-cellen in macrofagen mogelijk te maken.
- Was na drie dagen twee cellen met 0,9% NaCl-oplossing om medium met PMA te verwijderen.
- Incubeer gedifferentieerde THP-1-cellen in PMA-vrij volledig RPMI-medium bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende nog eens 2 dagen voordat met het experimenteren wordt begonnen.
2. Parasietculturen en CellTracker Rode kleuring
OPMERKING: Om parasieten te visualiseren door middel van fluorescentiemicroscopie, voert u kleuring uit met CellTracker Red fluorescent dye (CMTPX). Als alternatief kunnen andere markers, waaronder carboxyfluoresceïne, worden gebruikt in overeenstemming met de instructies van de fabrikant of promastigoten die constitutief GFP-, RFP- of andere fluorescerende reportergenen tot expressie brengen. Parasieten die worden gebruikt om cellen te infecteren, zijn die in de stationaire groeifase die worden verkregen uit een promastigote axeencultuur van niet meer dan 7 passages.
- Kweek Leishmania spp. promastigoten bij 1 x 105 parasieten per 1.000 μL medium in een celkweekkolf met 5 ml Schneiders medium aangevuld met 50 μg/ml gentamicine en 10% FBS.
- Na het incuberen van parasitaire axeenculturen in een biochemisch zuurstofverbruik (B.O.D.) bij 24 °C, voert u dagelijks telling uit in een Neubauer-kamer. Controleer op parasietvorm (dun, langwerpig) en mobiliteit gedurende 5 dagen. Parasieten worden beschouwd als in de stationaire groeifase wanneer twee opeenvolgende tellingen met een interval van 8 uur vergelijkbare hoeveelheden vertonen.
- Bij het bereiken van de stationaire groeifase incubeer de parasieten in 4 ml 0,9% NaCl-oplossing met 1 μM CMTPX gedurende 15 minuten bij 37 °C onder 5% CO2 , waarbij contact met licht wordt vermeden.
- Voeg FBS toe in een verhouding van 1:1 en incubeer de parasietensuspensie gedurende nog eens 1 minuut.
- Was parasieten driemaal met PBS, gevolgd door centrifugatie bij 1.781 × g gedurende 10 minuten.
- Ressuspend parasiet pellet in 1.000 μL RPMI compleet medium.
- Tel parasieten in een Neubauer-kamer.
3. Beoordeling van Leishmania binding aan macrofagen
- Zaad 2 × 105 THP-1 cellen of van menselijke monocyten afgeleide macrofagen in 500 μL volledig RPMI-medium per put op een 24-well plaat met 13 mm glazen coverslips.
- Kweek cellen bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Was de cellen tweemaal met 0,9% NaCl-oplossing en incubeer in volledig RPMI-medium bij 4 °C gedurende 10 minuten.
- Voeg stationaire fasepromastigoten zoals beschreven door A. L. Petersen22 toe in een verhouding van 10:1 aan putplaten en centrifugeer vervolgens bij 720 × g gedurende 5 minuten onder 4 °C.
- Incubeer bij 4 °C gedurende 5 min.
- Was de cellen tweemaal met 0,9% NaCl-oplossing om niet-geïnternaliseerde promastigoten te verwijderen.
- Bevestig de cellen in 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de coverslips met 15 mM NH4Cl gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Was driemaal met PBS 0,15% runderserumalbumine (BSA). Incubeer met blokkerende oplossing (3% BSA in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was driemaal met PBS en permeabiliseer vervolgens met 0,15% PBS-Saponine gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg falloidine (verdund 1:1.200) toe gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en bescherm tegen licht.
- Monteer coverslips met behulp van montagemedia.
- Verkrijg beelden via een confocale fluorescentiemicroscoop met behulp van een 63×/1.4 objectief.
4. Beoordeling van Leishmania fagocytose door macrofagen
- Zaad 2 × 105 THP-1 cellen of van menselijke monocyten afgeleide macrofagen in 500 μL volledig RPMI-medium per put op een 24-well plaat met 13 mm glazen coverslips.
- Kweek cellen gedurende 24 uur bij 37 °C onder 5% CO2.
- Wascellen tweemaal in 0,9% NaCl-oplossing en incubeer in volledig RPMI-medium in 24-wellsplaat bij 4 °C gedurende 10 min.
- Voeg stationaire fase Leishmania spp. toe zoals beschreven door A. L. Petersen22 in een verhouding van 10:1 (parasiet:gastheercel) en centrifugeer vervolgens bij 720 × g gedurende 10 minuten onder 4 °C.
- Incubeer cellen bij 4 °C gedurende 5 min.
- Was de cellen tweemaal met 0,9% NaCl-oplossing om niet-geïnternaliseerde promastigoten te verwijderen.
- Incubeer de cellen in een aangevuld RPMI-medium bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Bevestig de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten.
- Monteer coverslips met behulp van de gewenste montagemedia.
- Tel maar liefst 400 cellen in willekeurige velden onder een fluorescentiemicroscoop met een 100×/1.4 objectief.
5. Evaluatie van Leishmania -geïnduceerde vacuole rijping
OPMERKING: THP-1 celtransfectie moet worden uitgevoerd zoals beschreven door M. B. Maess, B. Wittig en S. Lorkowski 23. Hier vatten we dit protocol samen, met minimale wijzigingen. Nucleofection is een specifieke transfectiemethode die een nucleofector vereist. Als alternatieve methode kunnen cellen worden getransfecteerd met behulp van lipofectamine24 en lentivirustransductie25.
- Om de biogenese van leishmania-geïnduceerde PV te onderzoeken, transfecte THP1-cellen met PLC26,27, Akt26,27, Rab 5 28,29,30 of Rab 7 28,29,31 plasmiden.
OPMERKING: Deze methodologie kan worden gebruikt om THP-1-cellen te transfecteren met andere genen dan de hierboven genoemde. - Zaad THP-1 cellen op 1,5 x 107 in 75 cm² weefselkweekkolven met 10 ml compleet RPMI-medium aangevuld met 100 ng/ml PMA en 50 μM 2-mercaptoethanol gedurende 48 uur.
- Was cellen eenmaal in 0,9% NaCl-oplossing.
- Maak cellen los met behulp van een niet-enzymatische celdissociatieoplossing en centrifuge (250 × g) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer THP-1 cellen in 1 ml RPMI-medium en voer tellingen uit in een Neubauer-kamer.
- Centrifugeer THP-1 cellen opnieuw bij 250 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer 2 × 106 cellen in 100 μL Nucleofectoroplossing en incubeer met 0,5 μg van het plasmide dat codeert voor het eiwit van belang, gelabeld met een fluorescerend eiwit.
- Breng de suspensie met THP-1-cellen en nucleïnezuur over naar het Nucleofector-cuvet.
- Transfecte THP1-cellen met behulp van Nucleofector Program Y-001.
- Herstel de getransfecteerde cellen (2x106) en zaad in 500 μL RPMI-medium op 24-wellplaten met 13 mm glazen coverslips (4 putten /transfectie).
- Incubeer THP-1-cellen in volledig RPMI-medium bij 37 °C gedurende 0,5, 2, 4, 6, 12 en 24 uur.
- Herhaal stap 3.13 en 3.13.
6. Evaluatie van de rekrutering van LC3 voor Leishmania spp. PVs
OPMERKING: De autofagische membraanmarker LC3 kan worden gebruikt om te onderzoeken of fagosomen autofagische kenmerken vertonen. LC3-rekrutering naar door Leishmania geïnduceerde PV's kan tijdens infectie worden beoordeeld door cellen te labelen met het anti-LC3-antilichaam, zoals eerder beschreven door C. Matte32 en B. R. S. Dias33.
- Zaad 2 × 105 THP-1 cellen of van menselijke monocyten afgeleide macrofagen in 500 μL compleet RPMI-medium op een 24-well plaat met 13 mm glazen coverslips.
- Kweek cellen gedurende 24 uur bij 37 °C onder 5% CO2.
- Was cellen tweemaal in 0,9% NaCl-oplossing en incubeer in volledig RPMI-medium.
- Voeg stationaire fase Leishmania spp. promastigoten toe zoals beschreven door A. L. Petersen22 in een verhouding van 10:1 (parasiet: gastheercellen) en centrifuge cellen bij 720 × g gedurende 5 minuten onder 4 °C.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min of 4 uur. Was vervolgens twee keer en fixeer de cellen om de LC3-rekrutering naar Leishmania-geïnduceerde PV-membranen in de vroege stadia van infectie te evalueren.
- Als alternatief, om LC3-rekrutering naar PV-membranen in latere stadia van infectie te beoordelen, wast u tweemaal een andere macrofaaggroep na 4 uur infectie om niet-geïnternaliseerde promastigoten te verwijderen. Incubeer geïnfecteerde cellen in volledig RPMI-medium gedurende nog eens 12 uur en 24 uur, om uiteindelijk twee keer te wassen en te fixeren.
OPMERKING: Vaste cellen kunnen worden bewaard in PBS of 0,9% NaCl-oplossing bij 4 °C totdat ze worden geëtiketteerd.
- Als alternatief, om LC3-rekrutering naar PV-membranen in latere stadia van infectie te beoordelen, wast u tweemaal een andere macrofaaggroep na 4 uur infectie om niet-geïnternaliseerde promastigoten te verwijderen. Incubeer geïnfecteerde cellen in volledig RPMI-medium gedurende nog eens 12 uur en 24 uur, om uiteindelijk twee keer te wassen en te fixeren.
- Blokkeer en permeabiliseer tegelijkertijd de vaste cellen in 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 20% normaal geitenserum, 6% vetvrije droge melk en 50% FBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de cellen met anti-LC3-antilichaam (1: 200) verdund in PBS gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Als negatieve controle van de immunostaining moet een groep cellen worden geïncubeerd met immunoglobuline G (IgG) van het dier van primaire antilichaamoorsprong in een concentratie die gelijk is aan die welke wordt gebruikt voor het primaire antilichaam. - Was de cellen driemaal met 0,9% NaCl-oplossing op kamertemperatuur.
- Incubeer de cellen met AlexaFluor 488-geconjugeerde geiten-anti-konijn IgG (1:500) of de voorkeur fluorescerende kleurstof geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was de cellen driemaal met 0,9% NaCl-oplossing op kamertemperatuur.
- Monteer coverslips met behulp van de gewenste montagemedia.
- Verkrijg beelden via een confocale fluorescentiemicroscoop met behulp van een 63x/1.4 objectief.
7. Confocale microscopie acquisitie en Fiji kwantificering
OPMERKING: Het verkrijgen van immunofluorescentiebeelden moet worden uitgevoerd met behulp van een confocale laserscanmicroscoop. Om een betere resolutie te bereiken, gebruikt u een olie-immersie 63x objectief lens.
- Laat de 13 mm glazen afdekplaten op kamertemperatuur staan en bescherm ze ten minste 30 minuten voor de verwerving tegen het licht.
- Reinig de coverslips met een absorberend weefsel.
- Voeg een druppel dompelolie toe aan het objectief en voeg de dia toe.
- Verplaats het objectief omhoog totdat de olie de dia raakt.
- Observeer en pas de scherpstelling aan op de microscoop en kies de optie 63x objectief met olie.
- Open het Leica-programma en pas de lasers aan in de golflengten 488, 552 en 405.
- Selecteer de afbeeldingsresolutie 1.024 x 1.024.
- Klik op de knop Live , stel de Z-stapel in en druk op de optie Begin . Doe het vervolgens opnieuw en druk op de knop Beëindigen . We raden 20 μm aan voor plakdikte om confocale afbeeldingen met goede resoluties te krijgen.
- Wacht op de beeldacquisitie en selecteer vervolgens de optie "Maximale projectie" in de Leica-gereedschappen.
- Sla het experiment op.
- Exporteer de lif- of tiff-indelingsafbeeldingen naar een computer en open het FIJI-programma.
- Open het experiment en stel de weergavestack in met de hyperstack. Selecteer vervolgens bestanden afzonderlijk openen en tegels naaien.
- Selecteer de vrije handen tool in de Fiji werkbalk en traceer de cel zorgvuldig met de hand.
- Druk op de knop Analyseren en meet om de fluorescentie-intensiteit te visualiseren.
- Herhaal dit proces naar elke cel per groep.
- Sla de metingen op en exporteer ze naar een spreadsheeteditor.
- Voeg deze gegevens toe aan een statistisch analyseprogramma en voer de statistische analyse uit.
8. Statistische analyse
OPMERKING: Gebruik voor gegevensanalyse en afbeeldingen een statistisch analyseprogramma.
- Open het programma.
- Voeg de verkregen gegevens in en test de normaliteitsparameters.
- Gebruik voor gegevens met een normale verdeling de Student t-test en voor niet-parametrische tests de Mann-Whitney-test.
- Overweeg gegevens met een statistisch significant verschil wanneer de p-waarde lager is dan 0,05.
- Bereid afbeeldingen voor die de gegevens weergeven, met centrale tendensmetingen (gemiddelde of mediaan) en variatiemetingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit rapport is bedoeld om de vroege gebeurtenissen te evalueren die optreden tijdens de fagocytose van L. braziliensis geïsoleerd van patiënten met L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL vorm van CL. Met behulp van confocale microscopie onderzochten we de belangrijkste gebeurtenissen geassocieerd met fagocytose van parasieten: binding, internalisatie en fagosoomrijping. We evalueerden eerst de L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL binding en fagocytose door menselijke monocyten-afgeleide macrofagen. Uit de gegevens blijkt dat zowel L. braziliensis-LCL als L. braziliensis-DL op vergelijkbare wijze binden aan macrofagen (figuur 1). Ook werden geen verschillen waargenomen met betrekking tot L. braziliensis-LCL en L. braziliensis-DL fagocytose door gastheercellen (figuur 2). Ten slotte vergeleken we de rekrutering van LC3 met de PV's geïnduceerd door L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL in geïnfecteerde cellen. Na 30 minuten, 4 en 12 uur infectie zagen we vergelijkbare percentages LC3-versierde PV's in L. braziliensis-LCL en L. braziliensis-DL-geïnfecteerde macrofagen (figuur 3). Deze representatieve resultaten toonden aan dat L. braziliensis-LCL en L. braziliensis-DL op dezelfde manier interageren met macrofagen tijdens binding, fagocytose en biogenese van PV's, met betrekking tot de LC3-rekrutering.
Microscopische beelden van THP-1-cellen die efficiënt zijn getransfecteerd met PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP plasmiden zijn weergegeven in figuur 4.
Figuur 1. Evaluatie van L. braziliensis-LCL en L. braziliensis-DL binding aan menselijke macrofagen. Menselijke monocyten-afgeleide macrofagen waren geïnfecteerd met L. braziliensis-LCL- of L. braziliensis-DL. Na 10 min bij 4 °C werd de binding beoordeeld met confocale microscopie. (A) Confocale microscopiebeelden van L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL (gelabeld met CMTPX, rood) die binden aan macrofagen (gelabeld met falloidine, groen). Voor confocale microscopie werden celkernen gelabeld met DAPI (blauw). Pijlen tonen Leishmania-macrofaagbinding. (B) Percentage Leishmania dat aan de macrofagen bindt. In totaal werden 30 cellen per groep geanalyseerd. De gegevens vertegenwoordigen elke replica van één experiment dat in kwintuplicaat is uitgevoerd (ongepaarde t-test , p > 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Evaluatie van L. braziliensis-LCL en L. braziliensis-DL fagocytose door menselijke macrofagen. Van menselijke monocyten afgeleide macrofagen werden geïncubeerd met L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL gedurende 10 minuten bij 4 °C, gevolgd door nog eens 1 uur bij 37 °C. Cellen werden vervolgens geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie door in totaal 400 cellen te tellen. (A) Confocale microscopiebeelden van menselijke macrofagen geïnfecteerd met L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL. Voor confocale microscopie werden celkernen gelabeld met DAPI (blauw). Pijlen tonen Leishmania parasieten kernen. (B) Percentage van Leishmania fagocytose. Cirkels vertegenwoordigen gegevens van elke replica van één experiment dat in drievoud is uitgevoerd (ongepaarde t-test , p > 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Beoordeling van LC3-rekrutering voor PV's geïnduceerd door L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL in macrofagen. Menselijke monocyten-afgeleide macrofagen werden geïnfecteerd en vervolgens gekleurd met anti-LC3-antilichaam gedurende 30 minuten, 4 en 12 h. (A) Confocale microscopiebeelden van L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL-geïnfecteerde macrofagen gelabeld met anti-LC3 gevolgd door het secundaire anti-konijn IgG-antilichaam geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 (groen). Voor confocale microscopie werden celkernen gelabeld met DAPI (blauw); (B) Percentage van L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL-geïnduceerde PV's versierd met LC3-II. In totaal werden 30 cellen per groep geanalyseerd. De cirkels komen overeen met elk willekeurig geselecteerd veld dat wordt geanalyseerd (ongepaarde t-test , p > 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. THP-1 cellen die PLC, Rab5 of Rab7 tot expressie brengen. Na differentiatie in macrofagen werden THP-1-cellen onderworpen aan nucleofection met elk gen van belang gekoppeld aan GFP fluorescerende sondes: PLC, Rab5 en Rab7. Vervolgens werden deze cellen gefixeerd, de kern gekleurd met DAPI (blauw) en werden waargenomen onder een confocale microscoop met behulp van een 63x/1.4 objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leishmania-macrofaag interactie is een complex proces en omvat verschillende stappen die de ontwikkeling van de ziekte kunnen beïnvloeden5. Om de mechanismen die betrokken zijn bij de interactie van niet-geopsoniseerde Leishmania en gastheercellen beter te begrijpen, hebben we een protocol beschreven dat confocale fluorescentiemicroscopie gebruikt om fagocytose te beoordelen van vroege tot late stadia van Leishmania-infectie . Het gebruik van fluorescentietechnieken met twee of meer fluoroforen om celbiologische mechanismen te onderzoeken, waaronder immunolabeling en de expressie van fluorescerend gelabelde eiwitten, stelt ons in staat om de locatie van verschillende eiwitten te analyseren en tegelijkertijd de celmorfologie te evalueren. De voordelen van deze methoden maken ze de beste hulpmiddelen om de interactie tussen pathogeen en gastheercellen te volgen34.
Om het fagocytische proces met verschillende deeltjes beter te begrijpen, is het cruciaal om dit zeer dynamische proces op moleculair niveau te analyseren35. Confocale fluorescentiemicroscopie wordt hiervoor al tientallen jaren gebruikt en is een uitstekend hulpmiddel gebleken voor het kwantificeren van fagocytose door de bepaling van aantallen geïnternaliseerde deeltjes, of de soorten eiwitten waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij vroege stadia van gastheer-pathogeeninteractie34. De huidige studie stelde het gebruik van confocale microscopie voor om gebeurtenissen te analyseren die optreden tijdens de fagocytose van L. braziliensis geïsoleerd uit patiënten met verschillende klinische vormen (LCL en DL). Deze techniek stelt ons in staat om cellen te bestuderen die specifieke fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, waaronder PLC, Akt, Rab 5 en Rab 7, en vervolgens de deelname van deze eiwitten aan de fagocytose van Leishmania-isolaten te evalueren om elementen te identificeren die relevant zijn voor verschillende infectie-uitkomsten.
De huidige studie gebruikte primaire macrofagen en THP1-cellen om L. braziliensis fagocytose in vroege stadia van infectie te beoordelen. Het momenteel beschreven protocol kan ook worden gebruikt om fagocytose in Leishmania spp. te bestuderen door andere fagocyten, waaronder dendritische cellen, monocyten, macrofaagcellijnen en neutrofielen afgeleid van menselijk perifeer bloed. Tijdens het parasiet internalisatieproces treedt een dynamische verandering in F-actine op aan het celmembraanoppervlak11. Vervolgens labelden we eiwitten in het celmembraan met behulp van een specifieke marker van fagocytose36, zoals fluorescerende PLC, waardoor we het bindingsstadium van Leishmania aan gastheercellen konden observeren, zoals weergegeven in figuur 4. Kleuringsparasieten met fluorescerende markers, zoals CMTPX of CSFE, is ook cruciaal om de parasietbinding aan gastheercellen door immunofluorescentie te beoordelen. Het is vermeldenswaard dat deze test een zorgvuldige uitvoering vereist: i) was coverslips voorzichtig met wasoplossingen bij kamertemperatuur (25 ° C), anders kunnen monsters worden beschadigd; ii) reagensverdunningen nauwkeurig bereiden; en iii) de monsters te beschermen tegen licht34.
Een confocale microscoop die is geconfigureerd voor de optimale golflengte van laser opwinding is in staat om een monsterbeeld van hoge kwaliteit te verkrijgen. Gelabelde cellen kunnen wekenlang in het donker bij 4 °C worden bewaard of worden ingevroren tot het moment van analyse. Het gebruik van confocale microscopie om fagocytose te evalueren wordt beperkt door langdurige blootstellingstijden en laserstralen met hoge intensiteit, die monsters kunnen beschadigen en in sommige gevallen kunnen leiden tot hoge niveaus van achtergronddetectie in afbeeldingen35,37.
In de huidige studie, in plaats van live beeldvorming te gebruiken om de fagocytose van Leishmania spp. te volgen, voerden we een kinetische studie uit door cellen te fixeren op verschillende vroege tijdstippen van infectie (30 min, 4 h en 12 h). Er moet rekening mee worden gehouden dat live beeldvorming enkele voordelen biedt, zoals het potentieel om de ruimtelijke en temporele dynamiek van talloze cellulaire processen, waaronder fagocytose, te analyseren en details vast te leggen die niet waarneembaar zijn in statische beelden34. Live beeldvorming vereist echter dat cellen gezond zijn gedurende het hele experimenteerproces, inclusief het regelen van temperatuur, pH en zuurstofcondities in een microscopische kamer. Het is belangrijk op te merken dat dit niet betrouwbaar kan worden uitgevoerd in verschillende laboratoria over de hele wereld.
Het beschreven nucleofectionprotocol heeft werkzaamheid aangetoond bij de transfectie van THP-1-cellen, zoals eerder gerapporteerd door M. B. Maess, B. Wittig en S. Lorkowski 23. In dit proces is het cruciaal om cellen voorzichtig los te maken om celbeschadiging of verlies van levensvatbaarheid van cellen te voorkomen. Op basis van onze ervaring raden we aan om een niet-enzymatische celdissociatieoplossing te gebruiken om cellen los te maken van platen voorafgaand aan het uitvoeren van transfectie. De auteurs van het oorspronkelijke protocol23 stellen dat de belangrijkste beperkingen van deze procedure de noodzaak zijn dat cellen in suspensie zijn tijdens het nucleofectionproces en het feit dat onvoldoende onthechting stress kan veroorzaken. Ondanks deze beperkingen zorgt het protocol voor betrouwbare transfectie, waarbij een 90% succesvolle transfectiesnelheid wordt bereikt zonder de levensvatbaarheid van cellen te verliezen.
De karakterisering van PV's met behulp van een reeks endocytische markers, waaronder PLC, Akt, Rab5 en Rab7, is essentieel voor het verbeteren van ons begrip van Leishmania fagocytose. Het identificeren van nieuwe eiwitten die deelnemen aan PV-biogenese en het uitgebreid karakteriseren van deze compartimenten kan verschillen in macrofaagrespons tijdens Leishmania spp. infectie verduidelijken. De bijdrage van onze resultaten aan de hoeveelheid kennis rond de uitkomst van Leishmania-infecties zal ongetwijfeld ons begrip van de pathogenese van Leishmania-infectie bevorderen en de uiteindelijke zoektocht naar nieuwe chemotherapeutische doelen ondersteunen. Het is vermeldenswaard dat deze techniek ook kan worden uitgebreid naar andere soorten studies, waaronder infectie door bacteriën, gisten of kralenoverwelming door vele soorten cellen38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De financiers hadden geen rol in de studieopzet, gegevensverzameling of -analyse, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript. De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Wij danken het Gonçalo Moniz Instituut, Fiocruz Bahia, Brazilië en de afdeling microscopie voor hulp. Dit werk werd ondersteund door INOVA-FIOCRUZ nummer 79700287000, P.S.T.V. heeft een subsidie voor productiviteit in onderzoek van CNPq (305235/2019-2). Plasmiden werden vriendelijk verstrekt door Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA. De auteurs willen Andris K. Walter bedanken voor de Engelstalige revisie en hulp bij het bewerken van manuscripten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
References
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A.
- World Health Organization.
- Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
- Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
- Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
- Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
- Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
- Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
- Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
- Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
- Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
- Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
- Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
- Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
- Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
- Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
- Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
- Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
- English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
- Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
- Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
- Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
- Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
- Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
- Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
- Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
- Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
- Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D.
- Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
- Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G.
- Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).
