Summary
Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten.
Abstract
Phagozytose ist ein orchestrierter Prozess, der verschiedene Schritte umfasst: Erkennen, Binden und Verinnerlichen. Professionelle Phagozyten nehmen Leishmanien-Parasiten durch Phagozytose auf, die aus der Erkennung von Liganden auf Parasitenoberflächen durch mehrere Wirtszellrezeptoren besteht. Die Bindung von Leishmanien an Makrophagenmembranen erfolgt durch Komplementrezeptor Typ 1 (CR1) und Komplementrezeptor Typ 3 (CR3) und Mustererkennungsrezeptoren. Lipophosphoglycan (LPG) und 63 kDa Glykoprotein (gp63) sind die Hauptliganden, die an Makrophagen-Leishmanien-Interaktionen beteiligt sind. Nach der ersten Erkennung von Parasitenliganden durch Wirtszellrezeptoren werden Parasiten internalisiert, überleben und vermehren sich in parasitophoren Vakuolen. Der Reifungsprozess von Leishmanien-induzierten Vakuolen beinhaltet den Erwerb von Molekülen aus intrazellulären Vesikel, einschließlich des monomeren G-Proteins Rab 5 und Rab 7, des lysosomalen assoziierten Membranproteins 1 (LAMP-1), des lysosomalen assoziierten Membranproteins 2 (LAMP-2) und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1A / 1B-Lichtkette 3 (LC3).
Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der frühen Ereignisse, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten, mittels konfokaler Mikroskopie, einschließlich (i) Bindung, (ii) Internalisierung und (iii) Phagosomenreifung. Durch die Erweiterung des Wissens über diese Determinanten des Infektionsergebnisses hoffen wir, das Verständnis der Pathogenese der Leishmanien-Infektion zu verbessern und die Suche nach neuen chemotherapeutischen Zielen zu unterstützen.
Introduction
Leishmaniose ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die durch Protozoenparasiten der Gattung Leishmanien verursacht wird und zu einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen im Wirbeltierwirt führt, einschließlich kutaner Leishmaniose, mukokutaner Leishmaniose und viszeraler Leishmaniose 1. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt, dass über eine Milliarde Menschen gefährdet sind, wobei mehr als eine Million neue Fälle pro Jahr gemeldetwerden 2.
Leishmania spp. sind obligate intrazelluläre Protozoen, die in Wirtszellen überleben, einschließlich Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen3. Leishmanien-Makrophagen-Interaktion ist ein komplexer Prozess, an dem mehrere Wirtszellrezeptoren und Parasitenliganden beteiligt sind, entweder durch direkte Interaktion oder durch Opsonisierung mit Komplementrezeptoren 4,5. Klassische Oberflächenrezeptoren wie CR1, CR3, Mannose-Fucose, Fibronektin, Toll-like- und Scavenger-Rezeptoren vermitteln die Parasitenbindung an Makrophagen 6,7,8. Diese Rezeptoren erkennen Moleküle auf der Oberfläche von Leishmania, darunter das 63 kDa-Glykoprotein (gp63) und das Glykolipid Lipophosphoglycan (LPG)9. Dies sind die am häufigsten vorkommenden Moleküle auf der Oberfläche von Promastigoten und spielen eine wesentliche Rolle bei der Subversion der Immunantwort des Wirts, was die Etablierung einer Parasiteninfektion in Säugetierzellen begünstigt10. Nachdem Parasitenoberflächenliganden an Makrophagenrezeptoren gebunden haben, reichert sich F-Aktin auf den Zelloberflächen von Säugetieren an und umgibt Parasiten, wenn sie phagozytiert werden. Anschließend führt dies zur Bildung eines parasiteninduzierten Kompartiments, das als parasitophoröse Vakuole (PV) bezeichnet wird und phagolysosomale Merkmale aufweist11. Sobald sie sich in diesen Phagolysosomen befinden, durchlaufen Parasiten mehrere Veränderungen, die für das Überleben und die Vermehrung unerlässlich sind3.
Die Biogenese von PVs ist ein stark regulierter Membrantransportprozess, der für das intrazelluläre Überleben dieses Erregers entscheidend ist12. Die Bildung dieses Kompartiments resultiert aus sequentiellen Fusionsereignissen zwischen Phagosomen und Kompartimenten des endozytären Signalwegs des Wirts. Klassische zellbiologische Studien haben gezeigt, dass die Reifung von PVs den Erwerb von monomeren G-Proteinen Rab 5 und Rab 7 beinhaltet, die hauptsächlich mit einer frühen bzw. späten Endosomenreifung assoziiert sind13. Zusätzlich erwerben diese Kompartimente die Lysosom-assoziierten Membranproteine 1 und 2 (LAMP 1, LAMP 2), die Hauptproteinbestandteile der lysosomalen Membran und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1A/1B-Lichtkette 3 (LC3), einen Autophagosomenmarker14. Trotz offensichtlicher Ähnlichkeiten variieren die Kinetik der PV-Bildung15,16 und die Morphologie dieser Kompartimente je nach Leishmania-Spezies. Zum Beispiel induziert eine Infektion durch L. mexicana oder L. amazonensis die Bildung großer Kompartimente, die eine große Anzahl von Parasiten enthalten17. Im Gegensatz dazu bilden andere Arten, wie L. braziliensis und L. infantum, kleinere Vakuolen, die normalerweise nur einen oder zwei Parasiten in jeder Vakuoleenthalten 18.
Trotz dieses Wissens über die Interaktion zwischen Wirtszelle und Leishmanie sind die anfänglichen Ereignisse, die durch den Kontakt zwischen Wirtsrezeptoren und Parasitenliganden ausgelöst werden, nicht vollständig aufgeklärt. Es ist bekannt, dass diese Ereignisse Determinanten des Ergebnisses einer Parasiteninfektion sind und von der Parasitenart, der Art der Wirtszellrezeptoren, die zur Erkennung von Parasiten rekrutiert werden, und der Aktivierung von Makrophagen-Signalwegen abhängen19,20. Daher ist es wichtig, die Moleküle zu identifizieren, die an der Biogenese von Leishmanien-induzierten PVs beteiligt sind, und die Rolle(n) zu bestimmen, die diese Moleküle bei der Etablierung und dem Ergebnis von Infektionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Überwachung früher Ereignisse, die während der Phagozytose von Leishmania auftreten, einschließlich Bindung, Internalisierung, Phagosomenbildung und Reifung. Diese Arbeit könnte dazu beitragen, die Beteiligung von PLC, Akt, Rab5, Rab7 und LC3 an der Bildung von PVs zu klären, die durch verschiedene Leishmania-Arten induziert werden. Wichtig ist, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Beteiligung anderer Proteine zu untersuchen, die an der PV-Reifung beteiligt sind. Zukünftige Studien werden das Wissen über die Mechanismen der Leishmania-Wirtszellinteraktion erweitern und zur Entwicklung neuartiger chemotherapeutischer Strategien beitragen.
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Protocol
Die Zellen wurden von gesunden Spendern nach Genehmigung der Verfahren durch die Nationalen Forschungsethikkommissionen gewonnen (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Zellkulturen
- Humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen
HINWEIS: Um humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen für die In-vitro-Differenzierung in Makrophagen zu erhalten, sammeln Sie Blut von gesunden Spendern und reinigen Sie periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC), wie von D. English und B. R. Andersen beschrieben21.- Nachdem Sie peripheres Blut (50 ml) gesammelt haben, gießen Sie es in ein heparinisiertes Röhrchen und verdünnen Sie das Blut 1: 1 in einer Phosphatpufferlösung (PBS) bei Raumtemperatur. Legen Sie verdünntes heparinisiertes Blut vorsichtig auf das zuvor verteilte Dichtegradientenmedium.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 252 × g für 30 min bei 24 °C, um eine Hämolyse zu vermeiden.
HINWEIS: Stellen Sie den Zentrifugenabbruch ein, um eine Vermischung von Verlaufsschichten zu vermeiden. Nach der Zentrifugation bilden sich diskontinuierliche Gradientenschichten von unten nach oben: Erythrozyten, Dichtegradientenmedium, PBMC-Ring und Plasma. - Übertragen Sie den PBMC-Ring, der sich zwischen dem Dichtegradientenmedium und den Plasmaschichten befindet, in ein neues Rohr und füllen Sie ihn mit PBS, um das überschüssige Dichtegradientenmedium auszuwaschen.
- Die Zellen einmal waschen und bei 190 × g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml vollständigem RPMI-Medium.
- Zählen Sie die Zellen und die Platte 2 × 106 Zellen in 500 ml des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), ergänzt mit 25 mM N-[2-hydroxyethyl] piperazin-N′-[2-ethansulfonsäure] (HEPES), 2 g/L Natriumbicarbonat, 2 mM Glutamin, 20 g/ml Ciprofloxacin und 10% inaktiviertem Fetal Bovine Serum (FBS) (vollständiges RPMI-Medium) für 7 Tage bei 37 °C unter 5%CO2 in einer 24-Well-Platte, damit sich Monozyten zu Makrophagen differenzieren können durch Adhäsion.
- THP-1 Kulturen
- THP-1-Zelllinie in einer Konzentration von 2 × 105 Zellen in 10 ml vollständigem RPMI-Medium in 75 cm2 Kulturkolben züchten.
- Zellkulturen 7 Tage lang in einem Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2 halten.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 720 × g für 10 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Pellet in vollständigem RPMI-Medium.
- Zellen in einer Neubauer-Kammer zählen.
- Plattenzellen auf 13 mm Glasdeckgläsern in einer Konzentration von 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung in 500 μL komplettem RPMI-Medium mit 100 nM Phorbolmyristatacetat (PMA) bei 37 °C unter5 %CO2 , um die Differenzierung von THP1-Zellen in Makrophagen zu ermöglichen.
- Nach drei Tagen die Zellen zweimal mit 0,9% iger NaCl-Lösung waschen, um PMA-haltiges Medium zu entfernen.
- Inkubieren Sie differenzierte THP-1-Zellen in PMA-freiem vollständigem RPMI-Medium bei 37 °C unter 5%CO2 für weitere 2 Tage, bevor Sie mit dem Experimentieren beginnen.
2. Parasitenkulturen und CellTracker Red Färbung
HINWEIS: Um Parasiten durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen, führen Sie eine Färbung mit CellTracker Red fluoreszierendem Farbstoff (CMTPX) durch. Alternativ können andere Marker, einschließlich Carboxyfluorescein, gemäß den Anweisungen des Herstellers oder Promastigoten verwendet werden, die GFP, RFP oder andere fluoreszierende Reportergene konstitutiv exprimieren. Parasiten, die zur Infektion von Zellen verwendet werden, sind diejenigen in der stationären Wachstumsphase, die aus einer promastigoten axenischen Kultur von nicht mehr als 7 Passagen gewonnen werden.
- Leishmania spp. Promastigoten bei 1 x 10 5 Parasiten pro 1.000 μL Medium in einem Zellkulturkolben mit5 mL Schneider-Medium, ergänzt mit 50 μg/ml Gentamicin und 10% FBS.
- Nach der Inkubation von axenischen Parasitenkulturen in einem biochemischen Sauerstoffbedarf (B.O.D.) bei 24 °C wird täglich in einer Neubauer-Kammer gezählt. Überprüfen Sie auf Parasitenform (dünn, länglich) und Mobilität für 5 Tage. Parasiten werden in der stationären Wachstumsphase betrachtet, wenn zwei aufeinanderfolgende Zählungen mit 8 Stunden Intervall ähnliche Mengen anzeigen.
- Nach Erreichen der stationären Wachstumsphase inkubieren Sie die Parasiten in 4 ml 0,9% NaCl-Lösung mit 1 μM CMTPX für 15 min bei 37 °C unter 5%CO2 , wobei der Kontakt mit Licht vermieden wird.
- Fügen Sie FBS im Verhältnis 1:1 hinzu und inkubieren Sie die Parasitensuspension für weitere 1 Min.
- Parasiten dreimal mit PBS waschen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.781 × g für 10 min.
- Parasitenpellet in 1.000 μL RPMI Komplettmedium resuspendieren.
- Zählen Sie Parasiten in einer Neubauer-Kammer.
3. Beurteilung der Leishmania-Bindung an Makrophagen
- Seed 2 × 105 THP-1-Zellen oder humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen in 500 μL komplettem RPMI-Medium pro Vertiefung auf einer 24-Well-Platte mit 13 mm Glasdeckgläsern.
- Zellen bei 37 °C unter 5%CO2 für 24 h kultivieren.
- Die Zellen werden zweimal mit 0,9% NaCl-Lösung gewaschen und 10 min lang in vollständigem RPMI-Medium bei 4 °C inkubiert.
- Stationäre Phasenpromastigoten, wie von A. L. Petersen22 beschrieben, im Verhältnis 10:1 zu Vertiefungsplatten zugeben und dann bei 720 × g für 5 min unter 4 °C zentrifugieren.
- Bei 4 °C 5 min inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,9% NaCl-Lösung, um nicht internalisierte Promastigoten zu entfernen.
- Fixieren Sie die Zellen in 4% Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur.
- Die Deckgläser mit 15 mMNH4Cl 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Dreimal mit PBS 0,15% Rinderserumalbumin (BSA) waschen. Mit Blockierlösung (3% BSA in PBS) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Dreimal mit PBS waschen und dann mit 0,15% PBS-Saponin für 15 min bei Raumtemperatur permeabilisieren.
- Phalloidin (verdünnt 1:1.200) für 1 h bei Raumtemperatur zugeben und vor Licht schützen.
- Deckgläser mit Montagemedien montieren.
- Erfassen Sie Bilder über ein konfokales Fluoreszenzmikroskop mit einem 63×/1,4-Objektiv.
4. Beurteilung der Leishmania-Phagozytose durch Makrophagen
- Seed 2 × 105 THP-1-Zellen oder humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen in 500 μL komplettem RPMI-Medium pro Vertiefung auf einer 24-Well-Platte mit 13 mm Glasdeckgläsern.
- Zellen 24 h bei 37 °C unter 5%CO2 kultivieren.
- Die Zellen werden zweimal in 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen und in vollständigem RPMI-Medium in einer 24-Well-Platte bei 4 °C für 10 min inkubiert.
- Die stationäre Phase Leishmania spp. wie von A. L. Petersen22 beschrieben in einem Verhältnis von 10:1 (Parasit:Wirtszelle) zugeben und dann bei 720 × g für 10 min unter 4 °C zentrifugieren.
- Zellen bei 4 °C für 5 min inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,9% NaCl-Lösung, um nicht internalisierte Promastigoten zu entfernen.
- Inkubieren Sie die Zellen in ergänztem RPMI-Medium bei 37 °C für 1 h.
- Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 15 min.
- Montieren Sie Deckgläser mit bevorzugten Montagemedien.
- Zählen Sie nicht weniger als 400 Zellen in zufälligen Feldern unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 100×/1,4-Objektiv.
5. Bewertung der Leishmanien-induzierten Vakuolenreifung
HINWEIS: Die THP-1-Zelltransfektion sollte wie von M. B. Maess, B. Wittig und S. Lorkowski 23 beschrieben durchgeführt werden. Hier fassen wir dieses Protokoll mit minimalen Änderungen zusammen. Nukleofektion ist eine spezifische Transfektionsmethode, die einen Nukleofector erfordert. Als alternative Methode können Zellen mit Lipofectamin24 und Lentivirus-Transduktion25 transfiziert werden.
- Um die Biogenese von Leishmania-induzierter PV zu untersuchen, transfizieren THP1-Zellen mit PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 oder Rab 728,29,31 Plasmiden.
HINWEIS: Diese Methode kann verwendet werden, um THP-1-Zellen mit anderen Genen als den oben aufgeführten zu transfizieren. - Seed THP-1 Zellen an 1,5 x 107 in 75 cm² Gewebekulturkolben mit 10 mL vollständigem RPMI-Medium, ergänzt mit 100 ng/mL PMA und 50 μM 2-Mercaptoethanol für 48 h.
- Die Zellen einmal in 0,9%iger NaCl-Lösung waschen.
- Zellen mit einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung lösen und 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren (250 × g).
- Resuspendieren Sie THP-1-Zellen in 1 ml RPMI-Medium und führen Sie Zählungen in einer Neubauer-Kammer durch.
- THP-1-Zellen erneut bei 250 × g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie 2 × 106 Zellen in 100 μL Nucleofector-Lösung und inkubieren Sie mit 0,5 μg des Plasmids, das für das interessierende Protein kodiert, markiert mit einem fluoreszierenden Protein.
- Die Suspension, die THP-1-Zellen und Nukleinsäure enthält, wird in die Nucleofector-Küvette überführt.
- Transfizieren Sie THP1-Zellen mit dem Nucleofector-Programm Y-001.
- Gewinnung der transfizierten Zellen (2x106) und Aussaat in 500 μL RPMI-Medium auf 24-Well-Platten mit 13 mm Glasdeckgläsern (4 Wells/Transfektion).
- Inkubieren Sie THP-1-Zellen in vollständigem RPMI-Medium bei 37 °C für 0,5, 2, 4, 6, 12 und 24 h.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.13 und 3.13.
6. Bewertung der Rekrutierung von LC3 für Leishmania spp. PVs
HINWEIS: Der autophagische Membranmarker LC3 kann verwendet werden, um zu untersuchen, ob Phagosomen autophagische Merkmale aufweisen. Die LC3-Rekrutierung zu Leishmanien-induzierten PVs kann während der Infektion durch Immunmarkierung von Zellen mit dem Anti-LC3-Antikörper beurteilt werden, wie zuvor von C. Matte 32 und B. R. S. Dias 33 beschrieben.
- Seed 2 × 105 THP-1 Zellen oder humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen in 500 μL komplettes RPMI-Medium auf einer 24-Well-Platte mit 13 mm Glasdeckgläsern.
- Zellen 24 h bei 37 °C unter 5%CO2 kultivieren.
- Die Zellen zweimal in 0,9% NaCl-Lösung waschen und in vollständigem RPMI-Medium inkubieren.
- Fügen Sie stationäre Phase Leishmania spp. promastigotes wie von A. L. Petersen22 beschrieben im Verhältnis 10:1 (Parasit: Wirtszellen) und Zentrifugenzellen bei 720 × g für 5 min unter 4 °C hinzu.
- Bei 37 °C für 30 min oder 4 h inkubieren. Dann waschen Sie zweimal und fixieren Sie die Zellen, um die LC3-Rekrutierung auf Leishmanien-induzierte PV-Membranen in den frühen Stadien der Infektion zu bewerten.
- Alternativ, um LC3-Rekrutierung zu PV-Membranen in späteren Stadien der Infektion zu beurteilen, waschen Sie zweimal eine andere Makrophagengruppe nach 4 Stunden der Infektion, um alle nicht internalisierten Promastigoten zu entfernen. Inkubieren Sie infizierte Zellen in vollständigem RPMI-Medium für weitere 12 h und 24 h, um schließlich zweimal zu waschen und zu fixieren.
HINWEIS: Festsitzende Zellen können bis zur Etikettierung in PBS oder 0,9% NaCl-Lösung bei 4 °C aufbewahrt werden.
- Alternativ, um LC3-Rekrutierung zu PV-Membranen in späteren Stadien der Infektion zu beurteilen, waschen Sie zweimal eine andere Makrophagengruppe nach 4 Stunden der Infektion, um alle nicht internalisierten Promastigoten zu entfernen. Inkubieren Sie infizierte Zellen in vollständigem RPMI-Medium für weitere 12 h und 24 h, um schließlich zweimal zu waschen und zu fixieren.
- Gleichzeitig blockieren und permeabilisieren Sie die fixierten Zellen in 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 20% normalem Ziegenserum, 6% fettfreier Trockenmilch und 50% FBS für 20 min bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-LC3-Antikörper (1: 200), verdünnt in PBS für 2 h bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Als Negativkontrolle der Immunfärbung sollte eine Gruppe von Zellen mit Immunglobulin G (IgG) aus dem Tier primären Antikörperursprungs in einer Konzentration inkubiert werden, die der für den primären Antikörper verwendeten entspricht. - Waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,9% iger NaCl-Lösung bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Zellen mit AlexaFluor 488-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:500) oder den bevorzugten fluoreszierenden Farbstoff-konjugierten sekundären Antikörpern für 1 h bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,9% iger NaCl-Lösung bei Raumtemperatur.
- Montieren Sie Deckgläser mit bevorzugten Montagemedien.
- Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einem 63x/1,4-Objektiv auf.
7. Konfokalmikroskopische Erfassung und Fidschi-Quantifizierung
HINWEIS: Die Aufnahme von Immunfluoreszenzbildern sollte mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop durchgeführt werden. Um eine bessere Auflösung zu erreichen, verwenden Sie ein Ölimmersionsobjektiv mit 63-fachem Objektiv.
- Lassen Sie die 13 mm Glasdeckgläser bei Raumtemperatur stehen und schützen Sie sie mindestens 30 min vor der Aufnahme vor dem Licht.
- Reinigen Sie die Deckgläser mit einem saugfähigen Tuch.
- Fügen Sie einen Tropfen Tauchöl zum Objektiv hinzu und fügen Sie den Objektträger hinzu.
- Bewegen Sie das Objektiv nach oben, bis das Öl den Objektträger berührt.
- Beobachten und justieren Sie den Fokus am Mikroskop und wählen Sie die Option 63x Objektiv mit Öl.
- Öffnen Sie das Leica Programm und stellen Sie die Laser in den Wellenlängen 488, 552 und 405 ein.
- Wählen Sie die Bildauflösung 1.024 x 1.024.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Live , stellen Sie den Z-Stack ein und drücken Sie die Option Begin . Wiederholen Sie dann den Vorgang und drücken Sie die Taste Beenden . Wir empfehlen 20 μm für die Schichtdicke, um konfokale Bilder mit guten Auflösungen zu erhalten.
- Warten Sie auf die Bildaufnahme und wählen Sie dann in den Leica Werkzeugen die Option "Maximale Projektion".
- Speichern Sie das Experiment.
- Exportieren Sie die Bilder im LIF- oder TIFF-Format auf einen Computer und öffnen Sie das FIJI-Programm.
- Öffnen Sie das Experiment, und legen Sie den Ansichtsstapel mit dem Hyperstapel fest. Wählen Sie dann Dateien einzeln öffnen aus und fügen Sie Kacheln zusammen.
- Wählen Sie das Freihandwerkzeug in der Fidschi-Symbolleiste aus und zeichnen Sie die Zelle sorgfältig von Hand nach.
- Drücken Sie die Schaltfläche Analyze (Analysieren ) und messen Sie, um die Fluoreszenzintensität zu visualisieren.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zelle pro Gruppe.
- Speichern Sie die Messungen und exportieren Sie sie in einen Tabellenkalkulationseditor.
- Fügen Sie diese Daten einem statistischen Analyseprogramm hinzu und führen Sie die statistische Analyse durch.
8. Statistische Auswertung
HINWEIS: Verwenden Sie für Datenanalysen und Grafiken ein statistisches Analyseprogramm.
- Öffnen Sie das Programm.
- Fügen Sie die erhaltenen Daten ein und testen Sie die Normalitätsparameter.
- Verwenden Sie für Daten mit Normalverteilung den Student-t-Test und für nichtparametrische Tests den Mann-Whitney-Test.
- Betrachten Sie Daten mit einem statistisch signifikanten Unterschied, wenn der p-Wert kleiner als 0,05 ist.
- Bereiten Sie Grafiken vor, die die Daten darstellen, mit zentralen Tendenzmessungen (Mittelwert oder Median) und Variationsmaßen.
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Representative Results
Dieser Bericht zielt darauf ab, die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Phagozytose von L. braziliensis auftreten, die von Patienten mit L. braziliensis-LCL- oder L. braziliensis-DL-Form von CL isoliert wurden. Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie untersuchten wir die wichtigsten Ereignisse, die mit der Phagozytose von Parasiten verbunden sind: Bindung, Internalisierung und Phagosomenreifung. Wir untersuchten zuerst die L. braziliensis-LCL- oder L. braziliensis-DL-Bindung und Phagozytose durch menschliche Monozyten-abgeleitete Makrophagen. Die Daten zeigen, dass sowohl L. braziliensis-LCL als auch L. braziliensis-DL in ähnlicher Weise an Makrophagen binden (Abbildung 1). Auch wurden keine Unterschiede in Bezug auf L. braziliensis-LCL und L. braziliensis-DL Phagozytose durch Wirtszellen beobachtet (Abbildung 2). Schließlich verglichen wir die Rekrutierung von LC3 mit den PVs, die durch L. braziliensis-LCL oder L. braziliensis-DL in infizierten Zellen induziert wurden. Nach 30 min, 4 und 12 h Infektion beobachteten wir ähnliche Prozentsätze von LC3-dekorierten PVs in L. braziliensis-LCL- und L. braziliensis-DL-infizierten Makrophagen (Abbildung 3). Diese repräsentativen Ergebnisse zeigten, dass L. braziliensis-LCL und L. braziliensis-DL in ähnlicher Weise mit Makrophagen während der Bindung, Phagozytose und Biogenese von PVs interagieren, was die LC3-Rekrutierung betrifft.
Mikroskopische Bilder von THP-1-Zellen, die effizient mit PLC-GFP-, Rab5-GFP- und Rab7-GFP-Plasmiden transfiziert wurden, sind in Abbildung 4 dargestellt.
Abbildung 1. Bewertung der Bindung von L. braziliensis-LCL und L. braziliensis-DL an humane Makrophagen. Humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen wurden mit L. braziliensis-LCL- oder L. braziliensis-DL infiziert. Nach 10 min bei 4 °C wurde die Bindung konfokalmikroskopisch beurteilt. (A) Konfokalmikroskopische Bilder von L. braziliensis-LCL oder L. braziliensis-DL (markiert mit CMTPX, rot) Bindung an Makrophagen (markiert mit Phalloidin, grün). Für die konfokale Mikroskopie wurden Zellkerne mit DAPI (blau) markiert. Pfeile zeigen Leishmanien-Makrophagen-Bindung. (B) Prozentsatz der Leishmanien, die an die Makrophagen binden. Insgesamt wurden 30 Zellen pro Gruppe analysiert. Die Daten repräsentieren jede Wiederholung eines Experiments, das im Quintuplikat durchgeführt wurde (ungepaarter t-Test, p > 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Bewertung der L. braziliensis-LCL und L. braziliensis-DL Phagozytose durch humane Makrophagen. Humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen wurden mit L. braziliensis-LCL oder L. braziliensis-DL für 10 min bei 4 °C inkubiert, gefolgt von weiteren 1 h bei 37 °C. Die Zellen wurden dann mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert, indem insgesamt 400 Zellen gezählt wurden. (A) Konfokalmikroskopische Bilder von menschlichen Makrophagen, die mit L. braziliensis-LCL oder L. braziliensis-DL infiziert sind. Für die konfokale Mikroskopie wurden Zellkerne mit DAPI (blau) markiert. Pfeile zeigen Leishmania-Parasitenkerne. (B) Prozentsatz der Leishmania-Phagozytose. Kreise repräsentieren Daten aus jeder Wiederholung eines Experiments, das in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurde (ungepaarter t-Test, p > 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Bewertung der LC3-Rekrutierung zu PVs, induziert durch L. braziliensi s-LCL oder L. braziliensis-DL in Makrophagen. Humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen wurden infiziert und dann für 30 min, 4 und 12 h mit Anti-LC3-Antikörpern angefärbt. (A) Konfokalmikroskopische Bilder von L. braziliensi s-LCL oder L. braziliensis-DL-infizierten Makrophagen, markiert mit Anti-LC3, gefolgt von dem sekundären Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, der an Alexa Fluor 488 (grün) konjugiert ist. Für die konfokale Mikroskopie wurden Zellkerne mit DAPI markiert (blau); (B) Prozentsatz der L. braziliensi s-LCL oder L. braziliensis-DL-induzierten PVs, die mit LC3-II dekoriert sind. Insgesamt wurden 30 Zellen pro Gruppe analysiert. Die Kreise entsprechen jedem zufällig ausgewählten analysierten Feld (ungepaarter t-Test, p > 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. THP-1-Zellen, die PLC, Rab5 oder Rab7 exprimieren. Nach der Differenzierung in Makrophagen wurden THP-1-Zellen einer Nukleofektion unterzogen, wobei jedes interessierende Gen an GFP-Fluoreszenzsonden gekoppelt war: PLC, Rab5 und Rab7. Anschließend wurden diese Zellen fixiert, der Zellkern mit DAPI (blau) angefärbt und unter einem konfokalen Mikroskop mit einem 63x/1,4-Objektiv beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Leishmanien-Makrophagen-Interaktion ist ein komplexer Prozess und umfasst mehrere Schritte, die die Krankheitsentwicklung beeinflussen können5. Um die Mechanismen der Interaktion von nicht opsonisierten Leishmanien und Wirtszellen besser zu verstehen, haben wir ein Protokoll beschrieben, das konfokale Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Phagozytose vom frühen bis zum späten Stadium der Leishmanien-Infektion zu beurteilen. Die Verwendung von Fluoreszenztechniken mit zwei oder mehr Fluorophoren zur Untersuchung zellbiologischer Mechanismen, einschließlich der Immunmarkierung und der Expression fluoreszenzmarkierter Proteine, ermöglicht es uns, die Position mehrerer Proteine zu analysieren und gleichzeitig die Zellmorphologie zu bewerten. Die Vorteile dieser Methoden machen sie zu den besten Werkzeugen zur Überwachung der Interaktion zwischen Krankheitserregern und Wirtszellen34.
Um den phagozytischen Prozess mit verschiedenen Partikeln besser zu verstehen, ist es entscheidend, diesen hochdynamischen Prozess auf molekularer Ebene zu analysieren35. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie wird seit Jahrzehnten zu diesem Zweck eingesetzt und hat sich als hervorragendes Werkzeug zur Quantifizierung der Phagozytose durch die Bestimmung der Anzahl internalisierter Partikel oder der Arten von Proteinen erwiesen, von denen bekannt ist, dass sie an frühen Stadien der Wirt-Pathogen-Interaktion beteiligt sind34. Die vorliegende Studie schlug die Verwendung der konfokalen Mikroskopie vor, um Ereignisse zu analysieren, die während der Phagozytose von L. braziliensis auftreten, die von Patienten mit verschiedenen klinischen Formen (LCL und DL) isoliert wurden. Diese Technik ermöglicht es uns, Zellen zu untersuchen, die spezifische fluoreszierende Proteine exprimieren, einschließlich PLC, Akt, Rab 5 und Rab 7, und anschließend die Beteiligung dieser Proteine an der Phagozytose von Leishmania-Isolaten zu bewerten, um Elemente zu identifizieren, die für verschiedene Infektionsergebnisse relevant sind.
Die vorliegende Studie verwendete primäre Makrophagen und THP1-Zellen, um die Phagozytose von L. braziliensis in frühen Stadien der Infektion zu beurteilen. Das derzeit beschriebene Protokoll kann auch verwendet werden, um Phagozytose in Leishmania spp. durch andere Phagozyten, einschließlich dendritische Zellen, Monozyten, Makrophagenzelllinien und Neutrophile aus menschlichem peripherem Blut zu untersuchen. Während des Parasiteninternalisierungsprozesses tritt eine dynamische Veränderung des F-Aktins an der Zellmembranoberfläche11 auf. Wir markierten dann Proteine, die sich in der Zellmembran befinden, mit einem spezifischen Marker der Phagozytose36, wie z.B. fluoreszierende PLC, die es uns ermöglichten, das Bindungsstadium von Leishmania an Wirtszellen zu beobachten, wie in Abbildung 4 gezeigt. Die Färbung von Parasiten mit fluoreszierenden Markern wie CMTPX oder CSFE ist ebenfalls entscheidend, um die Bindung von Parasiten an Wirtszellen durch Immunfluoreszenz zu beurteilen. Es ist erwähnenswert, dass dieser Test eine sorgfältige Ausführung erfordert: i) Waschen Sie Deckgläser vorsichtig mit Waschlösungen bei Raumtemperatur (25 ° C), da sonst die Proben beschädigt werden können; ii) Reagenzverdünnungen präzise vorbereiten; und iii) die Proben vor Lichtschützen 34.
Ein konfokales Mikroskop, das auf die optimale Laseranregungswellenlänge konfiguriert ist, ist in der Lage, ein qualitativ hochwertiges Probenbild zu erhalten. Markierte Zellen können wochenlang im Dunkeln bei 4 °C gelagert oder bis zur Analyse eingefroren werden. Die Verwendung der konfokalen Mikroskopie zur Beurteilung der Phagozytose ist durch längere Expositionszeiten und hochintensive Laserstrahlen begrenzt, die Proben beschädigen und in einigen Fällen zu einer hohen Hintergrunderkennung in Bildern führen können35,37.
In der vorliegenden Studie haben wir, anstatt Live-Bildgebung zu verwenden, um die Phagozytose von Leishmania spp. zu verfolgen, eine kinetische Studie durchgeführt, indem wir Zellen zu mehreren frühen Zeitpunkten der Infektion (30 min, 4 h und 12 h) fixiert haben. Es muss berücksichtigt werden, dass die Live-Bildgebung einige Vorteile bietet, wie das Potenzial, die räumliche und zeitliche Dynamik unzähliger zellulärer Prozesse, einschließlich Phagozytose, zu analysieren und Details zu erfassen, die in statischen Bildern nicht beobachtbar sind34. Die Live-Bildgebung erfordert jedoch, dass die Zellen während des gesamten Experimentierprozesses gesund sind, einschließlich der Kontrolle von Temperatur, pH-Wert und Sauerstoffbedingungen in einer mikroskopischen Kammer. Es ist wichtig zu beachten, dass dies in mehreren Laboren auf der ganzen Welt nicht zuverlässig durchgeführt werden kann.
Das beschriebene Nukleofektionsprotokoll hat Wirksamkeit bei der Transfektion von THP-1-Zellen gezeigt, wie bereits von M. B. Maess, B. Wittig und S. Lorkowski berichtet 23. In diesem Prozess ist es wichtig, Zellen sanft zu lösen, um Zellschäden oder Verlust der Zelllebensfähigkeit zu vermeiden. Aufgrund unserer Erfahrung empfehlen wir, eine nicht-enzymatische Zelldissoziationslösung zu verwenden, um Zellen vor der Transfektion von Platten zu lösen. Die Autoren des ursprünglichen Protokolls23 stellen fest, dass die Haupteinschränkungen dieses Verfahrens die Notwendigkeit sind, dass Zellen während des Nukleofektionsprozesses in Suspension gehalten werden, und die Tatsache, dass eine unzureichende Ablösung Stress verursachen kann. Trotz dieser Einschränkungen ermöglicht das Protokoll eine zuverlässige Transfektion und erreicht eine erfolgreiche Transfektionsrate von 90%, ohne die Zelllebensfähigkeit zu verlieren.
Die Charakterisierung von PVs unter Verwendung einer Reihe endozytärer Marker, einschließlich PLC, Akt, Rab5 und Rab7, ist unerlässlich, um unser Verständnis der Leishmanien-Phagozytose zu verbessern. Die Identifizierung neuer Proteine, die an der PV-Biogenese beteiligt sind, und die umfassende Charakterisierung dieser Kompartimente können Unterschiede in der Makrophagenantwort während der Leishmania spp. Der Beitrag unserer Ergebnisse zum Wissensschatz über das Ergebnis der Leishmanien-Infektion wird zweifellos unser Verständnis der Pathogenese der Leishmanien-Infektion verbessern und die letztendliche Suche nach neuen chemotherapeutischen Zielen unterstützen. Es ist erwähnenswert, dass diese Technik auch auf andere Arten von Studien ausgedehnt werden kann, einschließlich der Infektion durch Bakterien, Hefen oder Perlenverschlingung durch viele Arten von Zellen38,39.
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Disclosures
Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung oder -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts. Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Acknowledgments
Wir danken dem Gonçalo Moniz Institut, Fiocruz Bahia, Brasilien und der Abteilung für Mikroskopie für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde von INOVA-FIOCRUZ Nummer 79700287000 unterstützt, P.S.T.V. hält einen Zuschuss für Produktivität in der Forschung von CNPq (305235/2019-2). Plasmide wurden freundlicherweise von Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA, zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken Andris K. Walter für die Überarbeitung der englischen Sprache und die Unterstützung beim Manuskriptlektorat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
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