Summary
El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped.
Abstract
La fagocitosis es un proceso orquestado que implica distintos pasos: reconocimiento, unión e internalización. Los fagocitos profesionales absorben los parásitos Leishmania por fagocitosis, que consiste en reconocer ligandos en las superficies del parásito por múltiples receptores de células huésped. La unión de Leishmania a las membranas de macrófagos ocurre a través del receptor del complemento tipo 1 (CR1) y el receptor del complemento tipo 3 (CR3) y los receptores de reconocimiento de patrones. El lipofosfoglicano (LPG) y la glicoproteína de 63 kDa (gp63) son los principales ligandos implicados en las interacciones macrófago-leishmania . Tras el reconocimiento inicial de los ligandos del parásito por los receptores de la célula huésped, los parásitos se internalizan, sobreviven y se multiplican dentro de las vacuolas parasitóforas. El proceso de maduración de las vacuolas inducidas por Leishmania implica la adquisición de moléculas de vesículas intracelulares, incluidas las proteínas G monoméricas Rab 5 y Rab 7, la proteína de membrana lisosomal asociada 1 (LAMP-1), la proteína de membrana lisosomal asociada 2 (LAMP-2) y la proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-cadena ligera 3 (LC3).
Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped utilizando microscopía confocal, incluyendo (i) unión (ii) internalización y (iii) maduración del fagosoma. Al agregar al cuerpo de conocimiento que rodea estos determinantes del resultado de la infección, esperamos mejorar la comprensión de la patogénesis de la infección por Leishmania y apoyar la eventual búsqueda de nuevos objetivos quimioterapéuticos.
Introduction
La leishmaniasis es una enfermedad tropical desatendida causada por parásitos protozoarios del género Leishmania, que da lugar a un amplio espectro de manifestaciones clínicas en el huésped vertebrado, incluyendo leishmaniasis cutánea, leishmaniasis mucocutánea y leishmaniasis visceral1. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que más de mil millones de personas están en riesgo, con más de un millón de nuevos casos reportados por año2.
Leishmania spp. son protozoos intracelulares obligados que sobreviven dentro de las células huésped, incluyendo monocitos, macrófagos y células dendríticas3. La interacción Leishmania-macrófagos es un proceso complejo que involucra múltiples receptores de células huésped y ligandos parásitos, ya sea a través de interacción directa o por opsonización que involucra receptores del complemento 4,5. Los receptores de superficie clásicos, como CR1, CR3, manosa-fucosa, fibronectina, toll-like y receptores eliminadores, median la unión del parásito a los macrófagos 6,7,8. Estos receptores reconocen moléculas en la superficie de Leishmania, incluyendo la glicoproteína de 63 kDa (gp63) y el lipofosfoglicano glicolípido (LPG)9. Estas son las moléculas más abundantes en la superficie de los promastigotes y juegan un papel esencial en la subversión de la respuesta inmune del huésped, favoreciendo el establecimiento de la infección parasitaria en células de mamíferos10. Después de que los ligandos de superficie del parásito se unen a los receptores de macrófagos, la actina F se acumula en las superficies celulares de los mamíferos, rodeando a los parásitos a medida que se fagocitan. Posteriormente, esto conduce a la formación de un compartimento inducido por parásitos denominado vacuola parasitófora (PV), que presenta características fagolisosomales11. Una vez dentro de estos fagolisomas, los parásitos sufren varias alteraciones esenciales para la supervivencia y la multiplicación3.
La biogénesis de PVs es un proceso de tráfico de membrana altamente regulado crítico para la supervivencia intracelular de este patógeno12. La formación de este compartimento resulta de eventos de fusión secuencial entre fagosomas y compartimentos de la vía endocítica del huésped. Los estudios clásicos de biología celular han revelado que la maduración de PVs implica la adquisición de proteínas monoméricas G Rab 5 y Rab 7, que se asocian principalmente con la maduración temprana y tardía del endosoma, respectivamente13. Además, estos compartimentos adquieren proteínas de membrana asociadas a lisosomas 1 y 2 (LAMP 1, LAMP 2), los principales constituyentes proteicos de la membrana lisosomal y proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-cadena ligera 3 (LC3), un marcador autofagosómico14. A pesar de las similitudes aparentes, la cinética de la formación de PV15,16 y la morfología de estos compartimentos varían dependiendo de las especies de Leishmania. Por ejemplo, la infección causada por L. mexicana o L. amazonensis induce la formación de grandes compartimentos que contienen un gran número de parásitos17. Por el contrario, otras especies, como L. braziliensis y L. infantum, forman vacuolas más pequeñas que normalmente contienen sólo uno o dos parásitos en cada vacuola18.
A pesar de este conocimiento que rodea la interacción entre la célula huésped y Leishmania, los eventos iniciales desencadenados por el contacto entre los receptores del huésped y los ligandos del parásito no se han dilucidado completamente. Se sabe que estos eventos son determinantes del resultado de la infección parasitaria y dependen de las especies de parásitos, el tipo de receptores de células huésped reclutados para reconocer parásitos y la activación de las vías de señalización de macrófagos19,20. Por lo tanto, es esencial identificar las moléculas involucradas en la biogénesis de PV inducidas por Leishmania y determinar el papel (s) desempeñado por estas moléculas en el establecimiento y el resultado de la infección. Aquí, describimos un método para monitorear los eventos tempranos que ocurren durante la fagocitosis de Leishmania, incluida la unión, la internalización, la formación de fagosomas y la maduración. Este trabajo podría ayudar a aclarar la participación de PLC, Akt, Rab5, Rab7 y LC3 en la formación de PVs inducidos por diferentes especies de Leishmania. Es importante destacar que este protocolo se puede utilizar para investigar la participación de otras proteínas involucradas en la maduración fotovoltaica. Los estudios futuros ampliarán el conocimiento sobre los mecanismos involucrados en la interacción Leishmania-célula huésped y contribuirán al diseño de nuevas estrategias quimioterapéuticas.
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Protocol
Las células se obtuvieron de donantes sanos tras la aprobación de los procedimientos por parte de los Comités Nacionales de Ética en Investigación (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Cultivos celulares
- Macrófagos humanos derivados de monocitos
NOTA: Para obtener macrófagos derivados de monocitos humanos para la diferenciación in vitro en macrófagos, recolectar sangre de donantes sanos y purificar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como lo describen D. English y B. R. Andersen21.- Después de recolectar sangre periférica (50 ml), viértala en un tubo heparinizado y luego diluya la sangre 1: 1 en una solución tampón de fosfato (PBS) a temperatura ambiente. Coloque suavemente la sangre heparinizada diluida sobre el medio de gradiente de densidad previamente distribuido.
- Centrifugar los tubos a 252 × g durante 30 min a 24 °C para evitar la hemólisis.
NOTA: Ajuste la ruptura de la centrífuga para evitar la mezcla de capas de degradado. Después de la centrifugación, se forman capas de gradiente discontinuo de abajo hacia arriba: eritrocitos, medio de gradiente de densidad, anillo PBMC y plasma. - Transfiera el anillo PBMC, ubicado entre el medio de gradiente de densidad y las capas de plasma, a un nuevo tubo y llénelo con PBS para eliminar el exceso de medio de gradiente de densidad.
- Lavar las celdas una vez y centrifugar a 190 × g durante 10 min a 4 °C.
- Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio RPMI completo.
- Contar las células y la placa 2 × 106 células en 500 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 25 mM de N-[2-hidroxietil] piperazina-N′-[2-etano sulfónico] (HEPES), 2 g/L de bicarbonato de sodio, 2 mM de glutamina, 20 g/ml de ciprofloxacino y 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado (medio RPMI completo) durante 7 días a 37 °C bajo 5% deCO2 en una placa de 24 pocillos para permitir que los monocitos se diferencien en macrófagos por adhesión.
- Cultivos de THP-1
- Cultivar la línea celular THP-1 a una concentración de 2 × 105 células en 10 ml de medio RPMI completo en matraz de cultivo de 75 cm2 .
- Mantener los cultivos celulares en una incubadora a 37 °C por debajo del 5% deCO2 durante 7 días.
- Centrifugar las células a 720 × g durante 10 min a 4 °C y resuspender el pellet en medio RPMI completo.
- Contar celdas en una cámara Neubauer.
- Células en placa en cubreobjetos de vidrio de 13 mm a una concentración de 2 × 105 células por pocillo en 500 μL de medio RPMI completo que contiene 100 nM de acetato de miristato de forbol (PMA) a 37 °C bajo 5% deCO2 para permitir la diferenciación de células THP1 en macrófagos.
- Después de tres días, lavar dos veces las células con solución de NaCl al 0,9% para eliminar el medio que contiene PMA.
- Incubar células THP-1 diferenciadas en medio RPMI completo libre de PMA a 37 °C bajo 5% deCO2 durante 2 días adicionales antes de comenzar la experimentación.
2. Cultivos de parásitos y tinción roja de CellTracker
NOTA: Para visualizar parásitos a través de microscopía de fluorescencia, realice la tinción utilizando el colorante fluorescente rojo CellTracker (CMTPX). Alternativamente, se pueden usar otros marcadores, incluida la carboxifluoresceína, de acuerdo con las instrucciones del fabricante o promastigotes que expresan constitutivamente GFP, RFP u otros genes reporteros fluorescentes. Los parásitos utilizados para infectar células son aquellos en fase estacionaria de crecimiento obtenidos de un cultivo axénico promastigote de no más de 7 pasajes.
- Cultivar Leishmania spp. promastigotes a 1 x 10 5 parásitos por 1.000 μL de medio en un matraz de cultivo celular que contiene5 ml de medio de Schneider suplementado con 50 μg/ml de gentamicina y 10% de FBS.
- Después de incubar cultivos axénicos de parásitos en una demanda bioquímica de oxígeno (D.O.B.) a 24 °C, realizar el recuento diario en una cámara Neubauer. Verifique la forma del parásito (delgado, alargado) y la movilidad durante 5 días. Los parásitos se consideran en fase estacionaria de crecimiento cuando dos recuentos consecutivos con 8 horas de intervalo muestran cantidades similares.
- Al alcanzar la fase estacionaria de crecimiento, incubar los parásitos en 4 mL de solución de NaCl al 0,9% con CMTPX 1 μM durante 15 min a 37 °C bajo 5% deCO2 evitando el contacto con la luz.
- Agregue FBS en una proporción de 1: 1 e incube la suspensión del parásito durante 1 minuto adicional.
- Lave los parásitos tres veces con PBS, seguido de centrifugación a 1.781 × g durante 10 min.
- Ressuspender el pellet del parásito en 1.000 μL de medio completo RPMI.
- Contar parásitos en una cámara Neubauer.
3. Evaluación de la unión de Leishmania a macrófagos
- Semilla 2 × 105 células THP-1 o macrófagos derivados de monocitos humanos en 500 μL de medio RPMI completo por pocillo en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 mm.
- Cultivar células a 37 °C bajo 5% deCO2 durante 24 h.
- Lavar las células dos veces con solución de NaCl al 0,9% e incubar en medio RPMI completo a 4 °C durante 10 min.
- Añadir promastigotes de fase estacionaria como los descritos por A. L. Petersen22 en una proporción de 10:1 a las placas de pozo, y luego centrifugar a 720 × g durante 5 min por debajo de 4 °C.
- Incubar a 4 °C durante 5 min.
- Lave las células dos veces con una solución de NaCl al 0,9% para eliminar cualquier promastigotes no internalizado.
- Fijar las células en paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente.
- Incubar los cubedores con 15 mM NH4Cl durante 15 min a temperatura ambiente.
- Lavar tres veces con PBS 0,15% de albúmina sérica bovina (BSA). Incubar con solución bloqueante (BSA al 3% en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar tres veces con PBS y luego permeabilizar con PBS-Saponina al 0,15% durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir faloidina (diluida 1:1.200) durante 1 h a temperatura ambiente y proteger de la luz.
- Monte cubreobjetos utilizando medios de montaje.
- Adquiera imágenes a través de un microscopio de fluorescencia confocal utilizando un objetivo de 63×/1.4.
4. Evaluación de la fagocitosis de Leishmania por macrófagos
- Semilla 2 × 105 células THP-1 o macrófagos derivados de monocitos humanos en 500 μL de medio RPMI completo por pocillo en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 mm.
- Cultivar células durante 24 h a 37 °C bajo 5% deCO2.
- Lavar las células dos veces en solución de NaCl al 0,9% e incubar en medio RPMI completo en placa de 24 pocillos a 4 °C durante 10 min.
- Añadir Leishmania spp. en fase estacionaria como la descrita por A. L. Petersen22 en una relación 10:1 (parásito:célula huésped), y luego centrifugar a 720 × g durante 10 min a 4 °C.
- Incubar las células a 4 °C durante 5 min.
- Lave las células dos veces con una solución de NaCl al 0,9% para eliminar cualquier promastigotes no internalizado.
- Incubar las células en medio RPMI suplementado a 37 °C durante 1 h.
- Fijar las células con paraformaldehído al 4% durante 15 min.
- Monte los cubreobjetos utilizando los medios de montaje preferidos.
- Contar no menos de 400 células en campos aleatorios bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un objetivo de 100×/1.4.
5. Evaluación de la maduración de la vacuola inducida por Leishmania
NOTA: La transfección de células THP-1 debe realizarse como lo describen M. B. Maess, B. Wittig y S. Lorkowski 23. Aquí resumimos este protocolo, con modificaciones mínimas. La nucleofección es un método de transfección específico que requiere un nucleofector. Como método alternativo, las células pueden ser transfectadas usando lipofectamina24 y transducción de lentivirus25.
- Para investigar la biogénesis de PV inducida por Leishmania, transfectar células THP1 con plásmidos PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 o Rab7 28,29,31.
NOTA: Esta metodología se puede utilizar para transfectar células THP-1 con otros genes distintos de los mencionados anteriormente. - Semilla de células THP-1 a matraces de cultivo tisular de 1,5 x 107 en 75 cm² que contienen 10 ml de medio RPMI completo suplementado con 100 ng/ml de PMA y 50 μM de 2-mercaptoetanol durante 48 h.
- Lave las células una vez en solución de NaCl al 0,9%.
- Separar las células utilizando una solución de disociación celular no enzimática y centrifugar (250 × g) durante 5 min a temperatura ambiente.
- Resuspender células THP-1 en 1 ml de medio RPMI y realizar recuentos en una cámara Neubauer.
- Centrifugar las células THP-1 de nuevo a 250 × g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender 2 × 106 células en 100 μL de solución de nucleofector e incubar con 0,5 μg del plásmido que codifica para la proteína de interés, marcado con una proteína fluorescente.
- Transfiera la suspensión que contiene células THP-1 y ácido nucleico a la cubeta Nucleofector.
- Transfectar células THP1 utilizando el programa Nucleofector Y-001.
- Recuperar las células transfectadas (2x106) y sembrar en medio RPMI de 500 μL en placas de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 mm (4 pocillos/transfección).
- Incubar células THP-1 en medio RPMI completo a 37 °C durante 0,5, 2, 4, 6, 12 y 24 h.
- Repita los pasos 3.13 y 3.13.
6. Evaluación del reclutamiento de LC3 para Leishmania spp. PVs
NOTA: El marcador de membrana autofágica LC3 se puede utilizar para investigar si los fagosomas presentan características autofágicas. El reclutamiento de CL3 a PV inducidos por Leishmania puede evaluarse durante la infección mediante células inmunomarcadas con el anticuerpo anti-LC3, como se describió previamente por C. Matte32 y B. R. S. Dias33.
- Semilla 2 × 105 células THP-1 o macrófagos derivados de monocitos humanos en medio RPMI completo de 500 μL en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 mm.
- Cultivar células durante 24 h a 37 °C bajo 5% deCO2.
- Lave las células dos veces en una solución de NaCl al 0,9% e incube en un medio RPMI completo.
- Añadir promastigotes de Leishmania spp. en fase estacionaria como la descrita por A. L. Petersen22 en una relación 10:1 (parásito: células huésped) y células centrífugas a 720 × g durante 5 min bajo 4 °C.
- Incubar a 37 °C durante 30 min o 4 h. Luego lavar dos veces y fijar las células para evaluar el reclutamiento de LC3 a las membranas fotovoltaicas inducidas por Leishmania en las primeras etapas de la infección.
- Alternativamente, para evaluar el reclutamiento de CL3 a las membranas fotovoltaicas en etapas posteriores de la infección, lavar dos veces otro grupo de macrófagos a las 4 h de la infección para eliminar cualquier promastigotes no internalizados. Incubar las células infectadas en un medio RPMI completo durante 12 h y 24 h adicionales, para finalmente lavar dos veces y fijar.
NOTA: Las células fijas se pueden mantener en PBS o solución de NaCl al 0,9% a 4 °C hasta su etiquetado.
- Alternativamente, para evaluar el reclutamiento de CL3 a las membranas fotovoltaicas en etapas posteriores de la infección, lavar dos veces otro grupo de macrófagos a las 4 h de la infección para eliminar cualquier promastigotes no internalizados. Incubar las células infectadas en un medio RPMI completo durante 12 h y 24 h adicionales, para finalmente lavar dos veces y fijar.
- Bloquee y permeabilice simultáneamente las células fijas en 0.1% Triton X-100, 1% BSA, 20% de suero de cabra normal, 6% de leche en polvo sin grasa y 50% de FBS durante 20 min a temperatura ambiente.
- Incubar las células con anticuerpo anti-LC3 (1: 200) diluido en PBS durante 2 h a temperatura ambiente.
NOTA: Como control negativo de la inmunotinción, se debe incubar un grupo de células con inmunoglobulina G (IgG) del animal de origen anticuerpo primario en una concentración equivalente a la utilizada para el anticuerpo primario. - Lave las células tres veces con solución de NaCl al 0,9% a temperatura ambiente.
- Incubar las células con AlexaFluor 488-conjugado cabra anti-conejo IgG (1:500) o los anticuerpos secundarios conjugados con colorante fluorescente preferidos durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave las células tres veces con solución de NaCl al 0,9% a temperatura ambiente.
- Monte los cubreobjetos utilizando los medios de montaje preferidos.
- Adquiera imágenes a través del microscopio de fluorescencia confocal utilizando un objetivo de 63x/1.4.
7. Adquisición de microscopía confocal y cuantificación de Fiji
NOTA: La adquisición de imágenes de inmunofluorescencia debe realizarse utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Para alcanzar una mejor resolución, utilice una lente objetivo 63x de inmersión en aceite.
- Deje los cubreobjetos de vidrio de 13 mm a temperatura ambiente y protéjalos de la luz al menos 30 minutos antes de la adquisición.
- Limpie los cubreobjetos con un pañuelo absorbente.
- Añade una gota de aceite de inmersión al objetivo y añade el portaobjetos.
- Mueva el objetivo hacia arriba hasta que el aceite toque la corredera.
- Observe y ajuste el enfoque en el microscopio y elija la opción objetivo 63x con aceite.
- Abra el programa Leica y ajuste los láseres en las longitudes de onda 488, 552 y 405.
- Seleccione la resolución de imagen 1.024 x 1.024.
- Haga clic en el botón Live , configure la pila Z y presione la opción Comenzar . Luego, hágalo nuevamente y presione el botón Fin . Recomendamos 20 μm para el grosor del corte para obtener imágenes confocales con buenas resoluciones.
- Espere a que se adquiera la imagen y, a continuación, seleccione la opción "Proyección máxima" en las herramientas de Leica.
- Guarde el experimento.
- Exporte las imágenes en formato lif o tiff a un ordenador y abra el programa FIJI.
- Abra el experimento y establezca la pila de vistas con la hiperpila. A continuación, seleccione abrir archivos individualmente y unir mosaicos.
- Seleccione la herramienta Manos libres en la barra de herramientas de Fiji y trace la celda cuidadosamente a mano.
- Pulse el botón Analizar y mida para visualizar la intensidad de la fluorescencia.
- Repita este proceso en cada celda por grupo.
- Guarde las medidas y expórtelas a un editor de hojas de cálculo.
- Agregue estos datos a un programa de análisis estadístico y realice el análisis estadístico.
8. Análisis estadístico
NOTA: Para el análisis de datos y gráficos, utilice un programa de análisis estadístico.
- Abra el programa.
- Inserte los datos obtenidos y pruebe los parámetros de normalidad.
- Para datos con distribución normal, utilice la prueba t de Student y para pruebas no paramétricas, la prueba de Mann-Whitney.
- Considere los datos con una diferencia estadísticamente significativa cuando el valor p es inferior a 0,05.
- Preparar gráficos que representen los datos, con medidas de tendencia central (media o mediana) y medidas de variación.
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Representative Results
Este informe tiene como objetivo evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la fagocitosis de L. braziliensis aislada de pacientes que presentan L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL forma de CL. Utilizando microscopía confocal, investigamos los principales eventos asociados con la fagocitosis de los parásitos: unión, internalización y maduración del fagosoma. Primero evaluamos la unión a L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL y la fagocitosis por macrófagos humanos derivados de monocitos. Los datos muestran que tanto L. braziliensis-LCL como L. braziliensis-DL se unen de manera similar a los macrófagos (Figura 1). Además, no se observaron diferencias con respecto a la fagocitosis de L. braziliensis-LCL y L. braziliensis-DL por células huésped (Figura 2). Finalmente, comparamos el reclutamiento de CL3 con los PVs inducidos por L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL en células infectadas. Después de 30 min, 4 y 12 h de infección, observamos porcentajes similares de PV decorados con CL3 en macrófagos infectados con L. braziliensis-LCL y L. braziliensis-DL (Figura 3). Estos resultados representativos mostraron que L. braziliensis-LCL y L. braziliensis-DL interactúan de manera similar con los macrófagos durante la unión, la fagocitosis y la biogénesis de PV, con respecto al reclutamiento de LC3.
Las imágenes microscópicas que representan células THP-1 transfectadas eficientemente con plásmidos PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP se muestran en la Figura 4.
Figura 1. Evaluación de la unión de L. braziliensis-LCL y L. braziliensis-DL a macrófagos humanos. Los macrófagos humanos derivados de monocitos fueron infectados con L. braziliensis-LCL- o L. braziliensis-DL. Después de 10 min a 4 °C, la unión se evaluó mediante microscopía confocal. (A) Imágenes de microscopía confocal de L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL (marcadas con CMTPX, rojo) que se unen a macrófagos (marcadas con faloidina, verde). Para la microscopía confocal, los núcleos celulares se marcaron con DAPI (azul). Las flechas representan la unión Leishmania-macrófagos. (B) Porcentaje de Leishmania que se une a los macrófagos. Se analizaron un total de 30 células por grupo. Los datos representan cada réplica de un experimento realizado en quintuplicado (prueba t no pareada, p > 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Evaluación de la fagocitosis de L. braziliensis-LCL y L. braziliensis-DL por macrófagos humanos. Los macrófagos derivados de monocitos humanos se incubaron con L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL durante 10 min a 4 °C seguido de 1 h adicional a 37 °C. Las células se analizaron mediante microscopía de fluorescencia contando un total de 400 células. (A) Imágenes de microscopía confocal de macrófagos humanos infectados por L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL. Para la microscopía confocal, los núcleos celulares se marcaron con DAPI (azul). Las flechas representan núcleos de parásitos de Leishmania. b) Porcentaje de fagocitosis de Leishmania. Los círculos representan datos de cada réplica de un experimento realizado por triplicado (prueba t no pareada, p > 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Evaluación del reclutamiento de LC3 a PVs inducido por L. braziliensi s-LCL o L. braziliensis-DL en macrófagos. Los macrófagos derivados de monocitos humanos se infectaron y luego se tiñeron con anticuerpos anti-LC3 durante 30 min, 4 y 12 h. (A) Imágenes de microscopía confocal de macrófagos infectados con L. braziliensi s-LCL o L. braziliensis-DL marcados con anti-LC3 seguidos del anticuerpo secundario anti-conejo IgG conjugado con Alexa Fluor 488 (verde). Para la microscopía confocal, los núcleos celulares se marcaron con DAPI (azul); (B) Porcentaje de PV inducidos por L. braziliensi s-LCL o L. braziliensis-DL decorados con LC3-II. Se analizaron un total de 30 células por grupo. Los círculos corresponden a cada campo seleccionado aleatoriamente analizado (prueba t no pareada, p > 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Células THP-1 que expresan PLC, Rab5 o Rab7. Después de diferenciarse en macrófagos, las células THP-1 fueron sometidas a nucleofección con cada gen de interés acoplado a sondas fluorescentes GFP: PLC, Rab5 y Rab7. Posteriormente, estas células fueron fijadas, se teñió el núcleo con DAPI (azul) y se observaron bajo un microscopio confocal utilizando un objetivo de 63x/1.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La interacción leishmania-macrófagos es un proceso complejo e involucra varios pasos que pueden influir en el desarrollo de la enfermedad5. Para comprender mejor los mecanismos implicados en la interacción de la Leishmania no opsonizada y las células huésped, hemos descrito un protocolo que emplea microscopía de fluorescencia confocal para evaluar la fagocitosis desde las etapas tempranas hasta las últimas de la infección por Leishmania. El uso de técnicas de fluorescencia que involucran dos o más fluoróforos para investigar mecanismos de biología celular, incluido el inmunomarcaje y la expresión de proteínas marcadas con fluorescencia, nos permite analizar la ubicación de varias proteínas, así como evaluar simultáneamente la morfología celular. Las ventajas ofrecidas por estos métodos los convierten en las mejores herramientas para monitorear la interacción patógeno-célula huésped34.
Para comprender mejor el proceso fagocítico que involucra diferentes partículas, es crucial analizar este proceso altamente dinámico a nivel molecular35. La microscopía de fluorescencia confocal ha sido utilizada durante décadas para este fin y ha demostrado ser una excelente herramienta para cuantificar la fagocitosis a través de la determinación del número de partículas internalizadas, o los tipos de proteínas que se sabe que están involucradas en las primeras etapas de la interacción huésped-patógeno34. El presente estudio propuso el uso de microscopía confocal para analizar eventos ocurridos durante la fagocitosis de L. braziliensis aislada de pacientes con diferentes formas clínicas (LCL y DL). Esta técnica nos permite estudiar células que expresan proteínas fluorescentes específicas, incluyendo PLC, Akt, Rab 5 y Rab 7, y posteriormente evaluar la participación de estas proteínas en la fagocitosis de aislados de Leishmania para identificar elementos relevantes para diferentes resultados de infección.
El presente estudio empleó macrófagos primarios y células THP1 para evaluar la fagocitosis de L. braziliensis en las primeras etapas de la infección. El protocolo actualmente descrito también se puede utilizar para estudiar la fagocitosis en Leishmania spp. por otros fagocitos, incluyendo células dendríticas, monocitos, líneas celulares de macrófagos y neutrófilos derivados de la sangre periférica humana. Durante el proceso de internalización del parásito, ocurre un cambio dinámico en la actina F en la superficie de la membrana celular11. Luego marcamos proteínas localizadas en la membrana celular utilizando un marcador específico de fagocitosis36, como PLC fluorescente, que nos permitió observar la etapa de unión de Leishmania a las células huésped, como se muestra en la Figura 4. La tinción de parásitos con marcadores fluorescentes, como CMTPX o CSFE, también es crucial para evaluar la unión del parásito a las células huésped por inmunofluorescencia. Vale la pena señalar que este ensayo requiere una ejecución cuidadosa: i) lave suavemente los cubreobjetos utilizando soluciones de lavado a temperatura ambiente (25 ° C), de lo contrario, las muestras pueden dañarse; ii) preparar diluciones de reactivos con precisión; y iii) proteger las muestras de la luz34.
Un microscopio confocal configurado para la longitud de onda óptima de excitación láser es capaz de obtener una imagen de muestra de alta calidad. Las células marcadas pueden almacenarse durante semanas en la oscuridad a 4 °C o congelarse hasta el momento del análisis. El uso de microscopía confocal para evaluar la fagocitosis está limitado por tiempos prolongados de exposición y rayos láser de alta intensidad, que pueden dañar las muestras y, en algunos casos, conducir a altos niveles de detección de fondo en las imágenes35,37.
En el presente estudio, en lugar de utilizar imágenes en vivo para seguir la fagocitosis de Leishmania spp., realizamos un estudio cinético fijando células en varios momentos tempranos de la infección (30 min, 4 h y 12 h). Debe considerarse que la imagen en vivo ofrece algunas ventajas, como el potencial para analizar la dinámica espacial y temporal de innumerables procesos celulares, incluyendo la fagocitosis, y la captura de detalles que no son observables en imágenes estáticas34. Sin embargo, las imágenes en vivo requieren que las células estén sanas durante todo el proceso de experimentación, incluido el control de la temperatura, el pH y las condiciones de oxígeno en una cámara microscópica. Es importante tener en cuenta que esto no se puede realizar de manera confiable en varios laboratorios de todo el mundo.
El protocolo de nucleofección descrito ha demostrado eficacia en la transfección de células THP-1, como lo informaron previamente M. B. Maess, B. Wittig y S. Lorkowski 23. En este proceso, es crucial separar suavemente las células para evitar el daño celular o la pérdida de viabilidad celular. Basándonos en nuestra experiencia, recomendamos utilizar una solución de disociación celular no enzimática para separar las células de las placas antes de realizar la transfección. Los autores del protocolo original23 afirman que las principales limitaciones de este procedimiento son la necesidad de que las células estén en suspensión durante el proceso de nucleofección, y el hecho de que un desprendimiento inadecuado puede causar estrés. A pesar de estas limitaciones, el protocolo permite una transfección confiable, alcanzando una tasa de transfección exitosa del 90% sin perder la viabilidad celular.
La caracterización de PV utilizando un conjunto de marcadores endocíticos, incluidos PLC, Akt, Rab5 y Rab7, es esencial para mejorar nuestra comprensión de la fagocitosis de Leishmania. La identificación de nuevas proteínas que participan en la biogénesis PV y la caracterización exhaustiva de estos compartimentos puede aclarar las diferencias en la respuesta de los macrófagos durante la infección por Leishmania spp. La contribución de nuestros resultados al cuerpo de conocimiento que rodea el resultado de la infección por Leishmania sin duda avanzará nuestra comprensión de la patogénesis de la infección por Leishmania y apoyará la eventual búsqueda de nuevos objetivos quimioterapéuticos. Vale la pena señalar que esta técnica también puede extenderse a otros tipos de estudios, incluyendo la infección por bacterias, levaduras o la absorción de cuentas por muchos tipos de células38,39.
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Disclosures
Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación o el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al Instituto Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahía, Brasil y al departamento de microscopía por su ayuda. Este trabajo fue apoyado por INOVA-Fiocruz número 79700287000, P.S.T.V. tiene una beca para productividad en investigación del CNPq (305235/2019-2). Los plásmidos fueron amablemente proporcionados por Mauricio Terebiznik, Universidad de Toronto, CA. Los autores desean agradecer a Andris K. Walter por la revisión del idioma inglés y la asistencia en la edición de manuscritos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
References
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A.
- World Health Organization.
- Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
- Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
- Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
- Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
- Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
- Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
- Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
- Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
- Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
- Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
- Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
- Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
- Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
- Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
- Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
- Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
- English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
- Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
- Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
- Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
- Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
- Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
- Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
- Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
- Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
- Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D.
- Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
- Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G.
- Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).
