Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Brug af Trowell-type organkultur til at studere regulering af dental stamceller

Published: July 8, 2021 doi: 10.3791/62462
Automatic Translation
*1,2, *1
1Research Program in Developmental Biology, Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 2Department of Oral and Maxillofacial diseases, Faculty of Medicine, University of Helsinki
* These authors contributed equally

Summary

Trowell-typen organkulturmetode er blevet brugt til at optrævle komplekse signalnetværk, der styrer tandudvikling og for nylig til at studere regulering involveret i stamceller i den kontinuerligt voksende musefortænder. Fluorescerende dyremodeller og levende billeddannelsesmetoder letter dybdegående analyser af tandstamceller og deres specifikke nichemikromiljø.

Abstract

Organudvikling, funktion og regenerering afhænger af stamceller, som befinder sig inden for diskrete anatomiske rum kaldet stamcellenicher. Den kontinuerligt voksende musefortænder giver en fremragende model til at studere vævsspecifikke stamceller. De epitelvævsspecifikke stamceller i fortænderne er placeret i den proksimale ende af tanden i en niche kaldet livmoderhalssløjfen. De giver en kontinuerlig tilstrømning af celler for at opveje den konstante slid på tandens selvslibende spids. Præsenteret her er en detaljeret protokol for isolering og kultur af den proksimale ende af musefortænderne, der huser stamceller og deres niche. Dette er en modificeret Trowell-type organkulturprotokol, der muliggør in vitro-kultur af vævsstykker (explants) samt de tykke vævsskiver ved væske / luft-grænsefladen på et filter understøttet af et metalgitter. Den organkulturprotokol, der er beskrevet her, muliggør vævsmanipulationer, der ikke er mulige in vivo , og når den kombineres med brugen af en eller flere fluorescerende reportere, giver den en platform til identifikation og sporing af diskrete cellepopulationer i levende væv over tid, herunder stamceller. Forskellige regulatoriske molekyler og farmakologiske forbindelser kan testes i dette system for deres virkning på stamceller og deres nicher. Dette giver i sidste ende et værdifuldt værktøj til at studere stamcelleregulering og vedligeholdelse.

Introduction

Musefortænder vokser kontinuerligt på grund af livslang bevarelse af stamcellerne (SC), der understøtter den uophørlige produktion af tandkomponenter. Disse omfatter epitel SC'er, som genererer emaljeproducerende ameloblaster, og mesenkymale stamceller (MSC'er), der genererer dentinproducerende odontoblaster, blandt andre celler1. Epitel-SC'erne i de stadigt voksende fortænder blev oprindeligt identificeret som etiketbevarende celler2,3 og har siden vist sig at udtrykke en række velkendte stammegener, herunder Sox24. Disse celler deler fælles træk med epitel SC'er i andre organer og bor inden for SC-nichen kaldet livmoderhalssløjfen placeret på labialsiden af fortænderne. Nichen er en dynamisk enhed sammensat af celler og ekstracellulær matrix, der styrer SC-aktivitet5. Afstamningssporingsundersøgelser har vist, at Sox2+ epitel-SC'er kan regenerere hele tandens epitelrum, og at de er afgørende for successionstanddannelse 6,7. MSC'er med dentinreparativt eller regenerativt potentiale rekrutteres stort set uden for organet gennem blodkar og nerver 8,9,10,11, hvilket giver en passende model til at studere rekruttering, migration og boliger af MSC-befolkningen.

At studere SC'er in vivo er ikke altid muligt, da mange af de genetiske og / eller farmakologiske manipulationer kan påvirke organhomeostase og / eller have dødelige konsekvenser. Derfor giver orgelkultur et glimrende værktøj til at studere regulering af SC'er og deres nicher in vitro. Orgelkultursystemet, der bruger et metalgitter, blev oprindeligt udviklet af Trowell12 for at studere organudvikling og er blevet yderligere modificeret af Saxen13 for at studere induktive signaler i nyreudvikling. Siden da er denne in vitro-metode til dyrkning af hele eller en del af orglet blevet anvendt med succes på forskellige områder. Inden for tandudvikling er denne metode blevet brugt i vid udstrækning til at studere epitel-mesenkymale interaktioner, der styrer tandudvikling14 og successionstanddannelse15. Thesleff-laboratoriets arbejde har vist nytten af dette system til tidsmæssig analyse af tandvækst og morfogenese, til analyse af virkningen af forskellige molekyler og vækstfaktorer på tandvækst og til time-lapse levende billeddannelse af tandudvikling16,17. For nylig er denne metode blevet brugt til at studere regulering af incisor SC'er og deres niche18,19, som er beskrevet detaljeret her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol indebærer brug af dyr, og alle procedurer blev godkendt af etiske komitéer for brug og pleje af dyr og dyrefaciliteten ved Helsinki Universitet.

1. Tilberedning af orgelkulturskålen

  1. Udfør alle procedurer i en laminær flowhætte. Rengør arbejdsflader med 70% ethanol, og brug autoklaverede glasinstrumenter og -løsninger. Steriliser saks og andet metaludstyr i en glasperlesterilisator.
  2. Forbered filtre, der normalt opbevares i 70% ethanol, ved at vaske dem tre gange i 1x PBS for at fjerne ethanol (figur 1). Skær filtre i rektangulære stykker (3 x 3-5 x 5 mm).
    BEMÆRK: Vaskede filterstykker kan opbevares i flere dage i 1x PBS ved 4 °C.
  3. Forbered dyrkningsmediet (1:1 DMEM:F12 suppleret med 1% [v/v] 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/ml ascorbinsyre og 0,2% [v/v] penicillin [10.000 I.U./ml] og streptomycin [10.000 μg/ml]). Opbevares ved 4 °C.
  4. Placer 30 mm metalgitter (med huller med en diameter på 1-2 mm, der muliggør vævsbilleddannelse) i en 35 mm petriskål. Tilføj tilstrækkelige medier til at nå gitteroverfladen uden at producere luftbobler. Forvarm den tilberedte kulturskål ved 37 °C, indtil vævet er isoleret og klar til dyrkning (i en standardinkubator med 5% CO2 og 90% -95% fugtighed).

2. Fortænderdissektion og isolering af den proksimale ende

  1. Ofr dyrene efter en godkendt dyreplejeprotokol.
  2. Afhug musen og disseker underkæben. For at gøre det skal du først fjerne huden for at udsætte underkæben og skære gennem massetermusklerne for at adskille den fra maxillaen og resten af hovedet.
  3. Når underkæben er isoleret, skal du fjerne tungen og så meget blødt væv som muligt.
  4. Saml alle underkæberne og opbevar dem i en petriskål indeholdende PBS på is, da dette forbedrer vævets levedygtighed.
  5. Overfør en underkæbe til en glas petriskål og brug engangs 20/26 G hypodermiske nåle til at dissekere fortænderne under et stereomikroskop. Opdel underkæben ved midterlinjen, skær gennem symfysen. Rengør blødt og muskelvæv væk fra knogleoverfladen for bedre visualisering.
    BEMÆRK: En glas petriskål er vigtig, da dette ikke vil stumpe nålene.
  6. Mandibles opnået fra dyr yngre end 10 dage er blødere og mere skrøbelige, brug derfor engangs 20/26 G hypodermiske nåle til at åbne hver halvdel af underkæben i længderetningen for at udsætte fortanden. For mus ældre end 10 dage skal du bruge pincet til at gribe underkæben og bryde knoglen for at udsætte tanden.
  7. Fjern forsigtigt fortænderne fra den omgivende knogle og afskær den proksimale ende, som indeholder livmoderhalssløjfen.
  8. Skær den proksimale ende og fjern den mineraliserede emalje og dentinmatrix.
  9. Opbevar de indsamlede proksimale ender i Dulbeccos PBS på is, indtil de er klar til dyrkning.

3. Kultur

  1. Placer forsigtigt et filterrektangel på toppen af et gitter i en forvarmet kulturskål.
  2. Brug et stereomikroskop til korrekt orientering af vævsstykkerne.
  3. Anbring i en standard inkubator ved 37 °C med 5% CO2 og 90% -95% fugtighed.
  4. Skift mediet hver anden dag og udskift med frisk medium, undgå omhyggeligt dannelse af luftbobler. Overvåg vævsvækst og fotografer dagligt ved hjælp af et kamera, der er fastgjort til stereomikroskopet.

4. Tilføjelse af opløselige faktorer til kulturen

  1. Suppler kulturmediet med opløselige faktorer og molekyler af interesse for at studere deres virkning på regulering af SC'er.
    BEMÆRK: Administrationsprotokollen for ethvert molekyle (vækstfaktorer, signalmolekyler, blokerende antistoffer, farmakologiske forbindelser såsom hæmmere eller aktivatorer, vektorer osv.) afhænger af dets halveringstid og opløselighed. Disse parametre bestemmer også den passende kontrol, der skal anvendes.

5. Molekylære og histologiske analyser

  1. Fjern kulturmediet.
  2. Tilsæt forsigtigt iskold methanol til vævene for at forhindre løsrivelse fra filtrene.
  3. Lad methanol stå i 5 min.
  4. Overfør filtre, der bærer vævseksplanter, til prøveudtagningsrør.
  5. Planterne anbringes i 4% paraformaldehyd i PBS i 10-24 timer ved 4 °C.
  6. Fortsæt med etablerede protokoller til histologisk behandling (paraffin, frosset osv.) eller immunostainings.

6. Kultur af vævsskiver

BEMÆRK: Der er flere variationer til denne protokol, som alle er lige vellykkede og er et spørgsmål om personligt valg afhængigt af brugerens hastighed og dygtighed. Disse henviser til den buffer, der bruges til at indsamle og opretholde vævets levedygtighed. Til dette formål kan Krebs buffer, PBS suppleret med 2% glukose og antibiotika eller PBS anvendes. Hvis der anvendes Krebs-buffer, skal den foretages 1 dag i forvejen og opbevares ved 4 °C.

  1. Før forsøget fremstilles 4%-5% lavsmeltepunkt agarose ved at opløse 2-2,5 g lavsmeltepunkt agarose i 50 ml kogende 2% glucose/PBS, hvorefter opløsningen anbringes i et 45 °C vandbad.
  2. Opsæt vibratomet, vask med 70% ethanol, og fyld med iskold 2% glucose / PBS suppleret med antibiotika (100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin).
  3. Dissekere de proksimale ender af fortænderne og saml dem i den iskolde 2% glucose/PBS suppleret med antibiotika.
  4. Placer en proksimal ende af fortænderne i formen indeholdende 4% -5% lavsmeltepunkt agarose. Under et stereomikroskop orienteres stykket i den ønskede retning og efterlades på is, så agarosen hærder.
  5. Trim den hærdede agaroseblok og læg den i vibratomet. Skær tykke skiver (150-300 μm).
  6. Saml skiverne i en petriskål, der indeholder iskold 2% glucose/PBS suppleret med antibiotika.
  7. Brug en spatel til at overføre de tykke skiver på et filterrektangel placeret på det forvarmede gitter, der er fremstillet som i punkt 1.3.
  8. Inkuber de tykke skiver i inkubatoren og fortsæt med billeddannelse (figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Epitel-SC'erne befinder sig i en niche kaldet livmoderhalssløjfen, som er placeret i den proksimale ende af fortænderne (figur 3A). Cervikale sløjfer er morfologisk forskellige strukturer sammensat af indre og ydre emaljeepitel, der omslutter stellatretikulumet, en kerne af løst arrangerede epitelceller (figur 3B, C). Der er to cervikale sløjfer i hver forstørrelse (figur 3A), men kun den labiale cervikale sløjfe indeholder SC'er. Epitel-SC'erne er lokaliseret til stellat-retikulummet og det tilstødende emaljeepitel på spidsen af livmoderhalssløjfen20,21. De genererer afkom karakteriseret ved Sfrp5-ekspression, som differentierer sig til stærkt proliferative transitforstærkende celler, der producerer forskellige celler, herunder emaljeudskillende ameloblaster 2,7. Ameloblastdifferentiering fra SC'er kan rekapituleres i organkultursystemet beskrevet her2.

I de senere år er reportermus, hvor et fluorescerende protein (såsom GFP) er under kontrol af specifikke genregulerende elementer, blevet et meget anvendt værktøj til at identificere og isolere celler fra forskellige væv og til at følge celleskæbne og afstamningsprogression in vivo og in vitro22,23. Anvendelsen af disse dyremodeller er gavnlig til analyse af effekten af forskellige regulatoriske molekyler, da intensiteten og mønsteret af fluorescerende reporterekspression kan bruges som en aflæsning af endogen genaktivitet eller som en reporter af spredningsstatus (dvs. Fucci reporter musemodel).

Sox2-GFP transgene reportermusmodel24, hvor den forbedrede GFP (EGFP) ekspression er under kontrol af et 5,5 kb fragment af det opstrøms regulatoriske element i Sox2-promotoren, muliggør identifikation og visualisering af Sox2-ekspressive incisor epithelial stamceller (figur 4A-C). Generering af mus, der bærer flere fluorescerende reportere, kan være nyttig til identifikation af mere end en cellepopulation. For eksempel i cervikale sløjfer fra Sox2-GFP; Fucci-mKO transgene dyr stamceller (GFP +, grøn, figur 4D) og ikke-proliferative celler (Fucci-mKO +, rød, figur 4D) kan identificeres. Derudover kan Sox2-GFP-ekspression bruges som reporter, når man analyserer effekten af forskellige molekyler. Tilsætning af Wnt/β-catenin-signalaktivatoren BIO påvirker Sox2-ekspressive stamceller og dermed GFP-ekspression negativt (figur 4E).

Figure 1
Figur 1: Forberedelse af kulturkammeret . (A) Vask filteret i 1x PBS. (B) Skær filteret i rektangulære stykker. (C) Forbered medier i emhætten, og pipet det gennem gitteret. Undgå dannelse af luftbobler. D) Forvarm den færdiglavede dyrkningsskål ved 37 °C, inden der tilsættes vævseksplanterne på et filter, der er anbragt på gitteret. (E) Tegneserierepræsentation af kulturkammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Dyrkning af vævsskiver. Den proksimale ende af en 2-dages postnatal (2PN) musefortænder blev dissekeret og snittet af vibratom. Skiver (150 μm tykke) blev dyrket, og hårdt vævsdannelse (pile) blev observeret efter en 6-dages kultur. Skala 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Cervikal sløjfe. (A) Proximal ende af den fortænderholdige labial (skitseret af sort stiplet linje) og lingual (skitseret af grå stiplet linje) cervikale sløjfer. (B) Histologisk del af labial cervikal loop, som repræsenterer en niche for epitelstamceller. (C) Tegneserie repræsentation af labial cervikal loop og dens komponenter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Brug af fluorescerende reportermusemodeller i et organkultursystem. (A) Brightfield, (B) fluorescerende og (C) overlejringsbillede af den proksimale ende af fortænderne isoleret fra 2-dages postnatal Sox2-GFP-mus. D) Sox2-GFP- og Fucci-mKO-ekspression i den proksimale ende af fortænderne isoleret fra 2-dages postnatal Sox2-GFP Fucci-mKO mus. (E) Effekt af BIO på stamcellerne, der udtrykker Sox2-GFP og stamcellenichen (cervikal loop, skitseret med gul stiplet linje). Skala 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vitro organkultur er blevet brugt i vid udstrækning til at studere induktivt potentiale og epitel-mesenkymale interaktioner, der styrer organvækst og morfogenese. Thesleff-laboratoriet har demonstreret, hvordan man kan tilpasse Saxén-modifikationen af Trowell-typen organkultur og bruge den til at studere tandudvikling14. De reproducerbare forhold og fremskridt inden for fluorescerende journalister har gjort dette til en nyttig metode til overvågning af tandmorfogenese og de forskellige cellepopulationer inden for. Dette papir beskrev, hvordan man anvender denne protokol til at studere epitelstamceller og det mikromiljø, hvor de bor.

En teknik til isolering af den proksimale ende af fortænderne, der indeholder SC-nichen fra postnatale hvalpe og fra ældre dyr, blev beskrevet her. Succesen med denne metode afhænger af isolationstiden (som direkte påvirker vævets levedygtighed) og af evnen til at isolere en ubeskadiget proksimal ende med en intakt labial cervikal loop. Dette er især udfordrende hos ældre dyr med mineraliseret knogle. Protokollen viser, hvordan man bruger kontrolleret mekanisk kraft til at bryde den mineraliserede knogle og isolere fuldt intakt og levedygtigt blødt væv på betydeligt kortere tid sammenlignet med andre offentliggjorte protokoller25. Når det er isoleret, kan vævet dyrkes in vitro, enten som helhed eller som en tyk skive. Ulempen ved den tykke vævsskæringsmetode er, at kun en del af livmoderhalssløjfen er til stede i hver skive; således er det ikke muligt at opnå en reproducerbart identisk del af livmoderhalssløjfen i forskellige sektioner. Organkultur giver en nem og reproducerbar metode til at studere de molekylære og cellulære mekanismer, der regulerer SC'er og deres niche over tid. Der er dog begrænsninger for den samlede kulturperiode, hovedsageligt på grund af det progressive tab af mesenchym efter de første 3-4 dages kultur.

Det isolerede væv kan også behandles yderligere for at opnå en enkeltcellesuspension beriget med fortænderepitelSCs 26. Enzymatisk adskillelse af livmoderhalssløjfen fra resten af den proksimale ende og brugen af specifikke fluorescerende reportere muliggør mere detaljerede mRNA- og proteinanalyser (såsom qPCR, enkeltcellet RNA-sekventering) og en større indsigt i specifikke cellepopulationer inden for nichen.

In vitro-kultur giver en passende platform til screening af forskellige genetiske og farmakologiske manipulationer for deres regulerende virkning på tandepitel-SC'er og deres nicher. Det skal bemærkes, at succesen med de farmakologiske behandlinger afhænger af egenskaberne af de testede molekyler, såsom halveringstid, opløselighed, metabolisk stabilitet, dosering og celletoksicitet. I kombination med en fluorescerende reporter kan den regulerende effekt tildeles en bestemt cellepopulation i et væv, hvilket giver et kraftfuldt værktøj til at afdække de molekylære og cellulære mekanismer, der regulerer tandepitel-SC'er og deres niche.

Ved brug af specifikke fluorescerende reportermus er det muligt at identificere og følge specifikke cellepopulationer i levende væv over tid. For nylig er det blevet påvist, at in vitro-organkultur kan bruges til levende billeddannelse af tandudvikling16. Derudover kan celleadfærd afbildes over en kort periode ved hjælp af in vitro-kultur af tykke vævsskiver7. Som tidligere angivet kan kun en del af SC-nichen afbildes, og billeddannelsesvarigheden er kort. Ideelt set bør hele SC-nichen afbildes. Imidlertid er 4D-time-lapse-billeddannelse af denne struktur udfordrende, hovedsageligt på grund af tykkelsen af nichen og begrænsningerne i de aktuelt tilgængelige billeddannelsesmetoder. Ikke desto mindre lover kontinuerlige fremskridt inden for billeddannelsesteknologi en spændende fremtid i optrævling af cellulær adfærd, der udgør fortænderne SC-niche.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af Jane og Aatos Erkko Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles Terumo
DMEM Gibco 61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14287
Extra Fine Bonn Scissors F.S.T. 14084-08
F-12 Gibco 31765-027
FBS South American (CE) LifeTechn. 10270106 divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer Simon Keller Ltd 4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Gibco 35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter MerckMillipore VCTP02500 Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid Sigma A4544-25g diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose TopVision R0801
Metal grids Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps Medicon 07.60.03
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. Gibco 15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass DWK Life Sciences 9170442
Petridish 35 mm, with vent Duran 237554008
Petridish 90 mm, no vent classic Thermo Fisher 101RT/C
Small scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
  2. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  3. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  4. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  5. Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
  6. Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
  7. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  8. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  9. Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
  10. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  11. Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
  12. Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
  13. Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
  14. Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
  15. Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
  16. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  17. Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
  18. Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
  19. Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
  20. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  21. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
  22. Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
  23. Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
  24. D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
  25. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  26. Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 173 organkultur tand musefortænder cervikalsløjfe epitelstamceller stamcelleniche fluorescerende reportermodeller
Brug af Trowell-type organkultur til at studere regulering af dental stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Juuri, E., Balic, A. Use of… More

Juuri, E., Balic, A. Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells. J. Vis. Exp. (173), e62462, doi:10.3791/62462 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter