Summary
De Trowell-type orgaankweekmethode is gebruikt om complexe signaleringsnetwerken te ontrafelen die de tandontwikkeling regelen en, meer recent, voor het bestuderen van regulatie die betrokken is bij stamcellen van de continu groeiende muizensnijder. Fluorescerende reporter diermodellen en live-imaging methoden vergemakkelijken diepgaande analyses van tandheelkundige stamcellen en hun specifieke niche micro-omgeving.
Abstract
Orgaanontwikkeling, functie en regeneratie zijn afhankelijk van stamcellen, die zich bevinden in discrete anatomische ruimtes die stamcelniches worden genoemd. De continu groeiende muizensnijtand biedt een uitstekend model om weefselspecifieke stamcellen te bestuderen. De epitheliale weefselspecifieke stamcellen van de snijtand bevinden zich aan het proximale uiteinde van de tand in een nis die de cervicale lus wordt genoemd. Ze zorgen voor een continue instroom van cellen om de constante slijtage van de zelfslijpende punt van de tand te compenseren. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor de isolatie en cultuur van het proximale uiteinde van de muizensnijder die stamcellen en hun niche herbergt. Dit is een gemodificeerd Trowell-type orgaankweekprotocol dat in vitro kweek van weefselstukken (explantaten) mogelijk maakt, evenals de dikke weefselplakken op de vloeistof / lucht-interface op een filter ondersteund door een metalen rooster. Het hier beschreven orgaankweekprotocol maakt weefselmanipulaties mogelijk die in vivo niet haalbaar zijn, en in combinatie met het gebruik van een fluorescerende verslaggever (s), biedt het een platform voor de identificatie en tracking van discrete celpopulaties in levende weefsels in de loop van de tijd, inclusief stamcellen. Verschillende regulerende moleculen en farmacologische verbindingen kunnen in dit systeem worden getest op hun effect op stamcellen en hun niches. Dit biedt uiteindelijk een waardevol hulpmiddel om stamcelregulatie en -onderhoud te bestuderen.
Introduction
Muizensnijtanden groeien continu door levenslang behoud van de stamcellen (SC) die de onophoudelijke productie van tandcomponenten ondersteunen. Deze omvatten epitheliale SC's, die glazuurproducerende ameloblasten genereren, en mesenchymale stamcellen (MSC's), die dentineproducerende odontoblasten genereren, naast andere cellen1. De epitheliale SC's in de continu groeiende snijtanden werden aanvankelijk geïdentificeerd als labelkerende cellen 2,3 en sindsdien is aangetoond dat ze een aantal bekende stamgenen tot expressie brengen, waaronder Sox24. Deze cellen delen gemeenschappelijke kenmerken met epitheliale SC's in andere organen en bevinden zich in de SC-niche die de cervicale lus aan de labiale kant van de snijtand wordt genoemd. De niche is een dynamische entiteit die bestaat uit cellen en extracellulaire matrix die SC-activiteit5 regelen. Afstammingsonderzoeken hebben aangetoond dat Sox2+ epitheliale SC's het hele epitheliale compartiment van de tand kunnen regenereren en dat ze cruciaal zijn voor successietandvorming 6,7. MSC's met dentine herstellend of regeneratief potentieel worden grotendeels van buiten het orgaan gerekruteerd via bloedvaten en zenuwen 8,9,10,11, waardoor een geschikt model wordt geboden om werving, migratie en huisvesting van de MSC-populatie te bestuderen.
Het is niet altijd haalbaar om SC's in vivo te bestuderen, omdat veel van de genetische en /of farmacologische manipulaties de homeostase van organen kunnen beïnvloeden en / of dodelijke gevolgen kunnen hebben. Daarom biedt orgaancultuur een uitstekend hulpmiddel om de regulatie van SC's en hun niches in vitro te bestuderen. Het orgaankweeksysteem dat gebruik maakt van een metalen raster werd aanvankelijk ontwikkeld door Trowell12 om orgaanontwikkeling te bestuderen en is verder aangepast door Saxen13 om inductieve signalen in de nierontwikkeling te bestuderen. Sindsdien is deze in vitro methode om het geheel of een deel van het orgaan te kweken met succes toegepast op verschillende gebieden. Op het gebied van tandontwikkeling is deze methode op grote schaal gebruikt om de epitheliaal-mesenchymale interacties te bestuderen die de tandontwikkelingregelen 14 en de successietandvorming15. Het werk van het Thesleff-laboratorium heeft het nut van dit systeem aangetoond voor temporele analyse van tandgroei en morfogenese, voor analyse van het effect van verschillende moleculen en groeifactoren op tandgroei, en voor time-lapse live beeldvorming van tandontwikkeling 16,17. Meer recent is deze methode gebruikt om de regulatie van snijtandSC's en hun niche18,19 te bestuderen, die hier in detail wordt beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol omvat het gebruik van dieren en alle procedures zijn goedgekeurd door ethische commissies voor het gebruik en de verzorging van dieren en de dierenfaciliteit aan de Universiteit van Helsinki.
1. Bereiding van de orgelcultuurschaal
- Voer alle procedures uit in een laminaire stromingskap. Reinig werkoppervlakken met 70% ethanol en gebruik instrumenten en oplossingen van autoclaved glas. Steriliseer een schaar en andere metalen apparatuur in een sterilisator met glaskralen.
- Bereid filters voor die normaal in 70% ethanol worden bewaard door ze drie keer in 1x PBS te wassen om ethanol te verwijderen (figuur 1). Snijd filters in rechthoekige stukken (3 x 3-5 x 5 mm).
LET OP: Gewassen filterstukken kunnen meerdere dagen bewaard worden in 1x PBS bij 4 °C. - Bereid het kweekmedium (1:1 DMEM:F12 aangevuld met 1% [v/v] 200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide in 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/ml ascorbinezuur en 0,2% [v/v] penicilline [10.000 I.U./ml] en streptomycine [10.000 μg/ml]). Bewaren bij 4 °C.
- Plaats de metalen roosters van 30 mm (met gaten met een diameter van 1-2 mm die weefselbeeldvorming mogelijk maken) in een petrischaaltje van 35 mm. Voeg voldoende media toe om het rasteroppervlak te bereiken zonder luchtbellen te produceren. Verwarm de bereide kweekschaal voor op 37 °C totdat het weefsel geïsoleerd en klaar is voor kweek (in een standaard incubator met 5% CO2 en 90%-95% luchtvochtigheid).
2. Snijtandsectie en isolatie van het proximale uiteinde
- Offer de dieren volgens een goedgekeurd dierverzorgingsprotocol.
- Onthoofd de muis en ontleed de onderkaak. Om dit te doen, verwijdert u eerst de huid om de onderkaak bloot te leggen en snijdt u door de kauwspieren om deze te scheiden van de maxilla en de rest van het hoofd.
- Zodra de onderkaak is geïsoleerd, verwijdert u de tong en zoveel mogelijk zacht weefsel.
- Verzamel alle kaken en bewaar ze in een petrischaal met PBS op ijs, omdat dit de levensvatbaarheid van de weefsels verbetert.
- Breng één onderkaak over op een glazen petrischaal en gebruik wegwerpbare 20/26 G hypodermische naalden om de snijtand onder een stereomicroscoop te ontleden. Splits de onderkaak op de middellijn en snijd door de symfyse. Reinig het zachte en spierweefsel weg van het botoppervlak voor een betere visualisatie.
OPMERKING: Een glazen petrischaal is essentieel, omdat dit de naalden niet zal stompen. - Kaken verkregen van dieren jonger dan 10 dagen zijn zachter en kwetsbaarder, gebruik daarom wegwerpbare 20/26 G hypodermische naalden om elke helft van de onderkaak in de lengterichting te openen om de snijtand bloot te leggen. Voor muizen ouder dan 10 dagen, gebruik een pincet om de onderkaak vast te pakken en het bot te breken om de tand bloot te leggen.
- Maak de snijtand voorzichtig los van het omliggende bot en snijd het proximale uiteinde af, dat de cervicale lus bevat.
- Snijd het proximale uiteinde en verwijder het gemineraliseerde glazuur en dentinematrix.
- Bewaar de verzamelde proximale uiteinden in Dulbecco's PBS op ijs totdat ze klaar zijn voor cultuur.
3. Cultuur
- Plaats voorzichtig een filterrechthoek op de bovenkant van een rooster in een voorverwarmde kweekschaal.
- Gebruik een stereomicroscoop om de weefselstukken goed te oriënteren.
- Plaats in een standaard incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 90%-95% luchtvochtigheid.
- Vervang het medium om de dag en vervang het door een vers medium, waarbij de vorming van luchtbellen zorgvuldig wordt vermeden. Monitor de weefselgroei en fotografeer dagelijks met behulp van een camera die op de stereomicroscoop is aangesloten.
4. Oplosbare factoren toevoegen aan de kweek
- Vul het kweekmedium aan met oplosbare factoren en moleculen van belang om hun effect op de regulatie van SC's te bestuderen.
OPMERKING: Het toedieningsprotocol voor elk molecuul (groeifactoren, signaalmoleculen, blokkerende antilichamen, farmacologische verbindingen zoals remmers of activatoren, vectoren, enz.) hangt af van de halfwaardetijd en oplosbaarheid. Deze parameters bepalen ook de juiste controle die moet worden gebruikt.
5. Moleculaire en histologische analyses
- Verwijder het kweekmedium.
- Voeg voorzichtig ijskoude methanol toe aan de weefsels om loslating van de filters te voorkomen.
- Laat methanol 5 min staan.
- Breng filters die weefselexplantaten dragen over naar bemonsteringsbuizen.
- Bevestig de explantaten in 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10-24 uur bij 4 °C.
- Ga verder met gevestigde protocollen voor histologische verwerking (paraffine, bevroren, enz.) of immunostainings.
6. Kweek van plakjes weefsel
OPMERKING: Er zijn verschillende variaties op dit protocol, die allemaal even succesvol zijn en een kwestie van persoonlijke keuze zijn, afhankelijk van de snelheid en de vaardigheid van de gebruiker. Deze verwijzen naar de buffer die wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van weefsel te verzamelen en te behouden. Hiervoor kan Krebs buffer, PBS aangevuld met 2% glucose en antibiotica, of PBS worden gebruikt. Als Krebs buffer wordt gebruikt, moet deze 1 dag van tevoren worden gemaakt en op 4 °C worden bewaard.
- Bereid vóór het experiment 4% -5% laagsmeltpunt agarose voor door 2-2,5 g laagsmeltpunt agarose op te lossen in 50 ml kokende 2% glucose / PBS, waarna de oplossing in een waterbad van 45 ° C moet worden geplaatst.
- Zet het vibratoom op, was met 70% ethanol en vul met ijskoude 2% glucose / PBS aangevuld met antibiotica (100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine).
- Ontleed de proximale uiteinden van de snijtand en verzamel ze in de ijskoude 2% glucose / PBS aangevuld met antibiotica.
- Plaats één proximaal uiteinde van de snijtand in de mal met 4%-5% laagsmeltpunt agarose. Richt het stuk onder een stereomicroscoop in de gewenste richting en laat het op ijs staan zodat de agarose uithardt.
- Knip het verharde agaroseblok bij en plaats het in het vibratoom. Snijd dikke plakken (150-300 μm).
- Verzamel de plakjes in een petrischaaltje met ijskoude 2% glucose/PBS aangevuld met antibiotica.
- Gebruik een spatel om de dikke plakken over te brengen op een filterrechthoek die op het voorverwarmde rooster is geplaatst, zoals bereid in punt 1.3.
- Incubeer de dikke plakken in de incubator en ga verder met beeldvorming (figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De epitheliale SC's bevinden zich in een niche die de cervicale lus wordt genoemd, die zich aan het proximale uiteinde van de snijtand bevindt (figuur 3A). Cervicale lussen zijn morfologisch verschillende structuren die bestaan uit binnenste en buitenste glazuurepitheel die het stellaire reticulum omhullen, een kern van losjes gerangschikte epitheelcellen (figuur 3B,C). Er zijn twee cervicale lussen in elke snijtand (figuur 3A), maar alleen de labiale cervicale lus bevat SC's. De epitheliale SC's zijn gelokaliseerd in het stellaat reticulum en het aangrenzende glazuurepitheel aan de punt van de cervicale lus20,21. Ze genereren nakomelingen die worden gekenmerkt door Sfrp5-expressie, die differentiëren in zeer proliferatieve transit-amplificerende cellen die verschillende cellen produceren, waaronder glazuurafscheidende ameloblasten 2,7. Ameloblastdifferentiatie van SC's kan worden samengevat in het hier beschreven orgaankweeksysteem2.
In de afgelopen jaren zijn reportermuizen waarbij een fluorescerend eiwit (zoals GFP) onder controle staat van specifieke genregulerende elementen een veelgebruikt hulpmiddel geworden om cellen uit verschillende weefsels te identificeren en te isoleren en om het lot van cellen en de progressie van de afstamming in vivo en in vitrote volgen 22,23. Het gebruik van deze diermodellen is gunstig voor het analyseren van het effect van verschillende regulerende moleculen, omdat de intensiteit en het patroon van fluorescerende reporterexpressie kunnen worden gebruikt als een uitlezing van endogene genactiviteit, of als een verslaggever van proliferatiestatus (d.w.z. Fucci reporter muismodel).
Het Sox2-GFP transgene reportermuismodel24, waarin de verbeterde GFP (EGFP) expressie onder controle staat van een 5,5 kb fragment van het upstream regulerende element van de Sox2 promotor, maakt identificatie en visualisatie van Sox2-expresserende incisor epitheliale stamcellen mogelijk (Figuur 4A-C). Generatie van muizen die meerdere fluorescerende verslaggevers dragen, kan nuttig zijn voor de identificatie van meer dan één celpopulatie. Bijvoorbeeld in cervicale lussen van Sox2-GFP; Fucci-mKO transgene dierlijke stamcellen (GFP+, groen, figuur 4D) en niet-proliferatieve cellen (Fucci-mKO+, rood, figuur 4D) kunnen worden geïdentificeerd. Bovendien kan Sox2-GFP-expressie worden gebruikt als verslaggever bij het analyseren van het effect van verschillende moleculen. Toevoeging van de Wnt/β-catenine signaleringsactivator BIO heeft een negatieve invloed op Sox2-expresserende stamcellen en bijgevolg op de GFP-expressie (figuur 4E).
Figuur 1: Voorbereiding van de kweekkamer. (A) Was het filter in 1x PBS. (B) Snijd het filter in rechthoekige stukken. (C) Bereid media in de kap voor en pipetteer deze door het rooster. Vermijd luchtbelvorming. D) De voorbereide kweekschaal bij 37 °C voorbewerken voordat weefselexplantaten worden toegevoegd aan een filter dat op het rooster is geplaatst. (E) Cartooneske weergave van de cultuurkamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het kweken van plakjes weefsel. Het proximale uiteinde van een 2-daagse postnatale (2PN) muiscisor werd ontleed en gesneden door vibratome. Plakjes (150 μm dik) werden gekweekt en harde weefselvorming (pijlen) werd waargenomen na een kweek van 6 dagen. Schaal 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cervicale lus. (A) Proximaal uiteinde van de incisor-bevattende labiale (omlijnd door zwarte stippellijn) en linguale (omlijnde grijze stippellijn) cervicale lussen. (B) Histologisch gedeelte van de labiale cervicale lus, die een niche vormt voor epitheliale stamcellen. (C) Cartooneske weergave van de labiale cervicale lus en zijn componenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gebruik van fluorescerende reportermuismodellen in een orgaankweeksysteem. (A) Brightfield, (B) fluorescerend en (C) overlaybeeld van het proximale uiteinde van de snijtand geïsoleerd uit 2-daagse postnatale Sox2-GFP-muizen. (D) Sox2-GFP en Fucci-mKO expressie in het proximale uiteinde van de snijtand geïsoleerd van 2-daagse postnatale Sox2-GFP; Fucci-mKO muizen. (E) Effect van BIO op de stamcellen die Sox2-GFP tot expressie brengen en de stamcelniche (cervicale lus, omlijnd door gele stippellijn). Schaal 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro orgaankweek is op grote schaal gebruikt om inductief potentieel en epitheliaal-mesenchymale interacties te bestuderen die orgaangroei en morfogenese regelen. Het Thesleff-laboratorium heeft aangetoond hoe de Saxén-modificatie van de Trowell-type orgaancultuur kan worden aangepast en gebruikt om de ontwikkeling van tanden tebestuderen 14. De reproduceerbare omstandigheden en vooruitgang in fluorescerende verslaggevers hebben dit een nuttige methode gemaakt voor het monitoren van tandmorfogenese en de verschillende celpopulaties daarbinnen. Dit artikel beschreef hoe dit protocol kan worden toegepast om epitheliale stamcellen en de micro-omgeving waarin ze zich bevinden te bestuderen.
Een techniek voor het isoleren van het proximale uiteinde van de snijtand die de SC-niche bevat van postnatale pups en van oudere dieren werd hier beschreven. Het succes van deze methode hangt af van de isolatietijd (die rechtstreeks van invloed is op de levensvatbaarheid van weefsel) en van het vermogen om een onbeschadigd proximaal uiteinde te isoleren met een intacte labiale cervicale lus. Dit is vooral een uitdaging bij oudere dieren met gemineraliseerd bot. Het protocol laat zien hoe gecontroleerde mechanische kracht kan worden gebruikt om het gemineraliseerde bot te breken en volledig intact en levensvatbaar zacht weefsel te isoleren in een aanzienlijk kortere tijd in vergelijking met andere gepubliceerde protocollen25. Eenmaal geïsoleerd, kan het weefsel in vitro worden gekweekt, hetzij als geheel of als een dikke plak. Het nadeel van de dikke weefsel snijmethode is dat slechts een deel van de cervicale lus aanwezig is in elke plak; het verkrijgen van een reproduceerbaar identiek deel van de cervicale lus in verschillende secties is dus niet mogelijk. Orgaancultuur biedt een eenvoudige en reproduceerbare methode om de moleculaire en cellulaire mechanismen te bestuderen die SC's en hun niche in de loop van de tijd reguleren. Er zijn echter beperkingen aan de totale kweekperiode, voornamelijk als gevolg van het progressieve verlies van mesenchym na de eerste 3-4 dagen cultuur.
Het geïsoleerde weefsel kan ook verder worden verwerkt om een eencellige suspensie te verkrijgen die verrijkt is met snijtandenepitheel SC's26. Enzymatische scheiding van de cervicale lus van de rest van het proximale uiteinde en het gebruik van specifieke fluorescerende reporters maakt meer gedetailleerde mRNA- en eiwitanalyses mogelijk (zoals qPCR, single-cell RNA sequencing) en een beter inzicht in specifieke celpopulaties binnen de niche.
In vitro kweek biedt een geschikt platform voor het screenen van verschillende genetische en farmacologische manipulaties op hun regulerend effect op tandepitheel SC's en hun niches. Opgemerkt moet worden dat het succes van de farmacologische behandelingen afhangt van de eigenschappen van de geteste moleculen, zoals halfwaardetijd, oplosbaarheid, metabole stabiliteit, dosering en celtoxiciteit. In combinatie met een fluorescerende reporter kan het regulerende effect worden toegewezen aan een specifieke celpopulatie in een weefsel, waardoor een krachtig hulpmiddel wordt geboden om de moleculaire en cellulaire mechanismen te ontdekken die tandepitheel-SC's en hun niche reguleren.
Met behulp van specifieke fluorescerende reportermuizen is het mogelijk om specifieke celpopulaties in levend weefsel in de loop van de tijd te identificeren en te volgen. Onlangs is aangetoond dat in vitro orgaankweek kan worden gebruikt voor live beeldvorming van tandontwikkeling16. Bovendien kan celgedrag over een korte periode in beeld worden gebracht met behulp van in vitro kweek van dikke weefselplakken7. Zoals eerder aangegeven, kan slechts een deel van de SC-niche worden afgebeeld en is de beeldduur kort. Idealiter moet de hele SC-niche in beeld worden gebracht. 4D time-lapse beeldvorming van deze structuur is echter een uitdaging, voornamelijk vanwege de dikte van de niche en de beperkingen van de momenteel beschikbare beeldvormingsmethoden. Niettemin beloven voortdurende vooruitgang in beeldvormingstechnologie een opwindende toekomst in het ontrafelen van cellulair gedrag dat de snijtand SC-niche vormt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Jane and Aatos Erkko Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
