Summary
Qui dimostriamo un metodo per applicare lo stress da taglio fluido alle cellule tumorali in sospensione per modellare gli effetti dello stress emodinamico sulle cellule tumorali circolanti.
Abstract
Durante le metastasi, le cellule tumorali dei tessuti solidi, compresi gli epiteli, ottengono l'accesso alla circolazione linfatica ed ematogena dove sono esposte a stress meccanici dovuti al flusso emodinamico. Uno di questi sottolinea che le cellule tumorali circolanti (CTC) sperimentano è lo stress da taglio fluido (FSS). Mentre le cellule tumorali possono sperimentare bassi livelli di FSS all'interno del tumore a causa del flusso interstiziale, le CTC sono esposte, senza attaccamento della matrice extracellulare, a livelli molto maggiori di FSS. Fisiologicamente, la FSS varia su 3-4 ordini di grandezza, con bassi livelli presenti nei linfatici (<1 dyne/cm2) e i livelli più alti presenti brevemente mentre le cellule passano attraverso il cuore e intorno alle valvole cardiache (>500 dynes/cm2). Esistono alcuni modelli in vitro progettati per modellare diverse gamme di stress da taglio fisiologico in vari intervalli di tempo. Questo documento descrive un modello per studiare le conseguenze di brevi impulsi (millisecondi) di FSS di alto livello sulla biologia delle cellule tumorali utilizzando un semplice sistema di siringhe e aghi.
Introduction
Le metastasi, o la diffusione del cancro oltre il sito tumorale iniziale, sono un fattore importante alla base della mortalità per cancro1. Durante le metastasi, le cellule tumorali utilizzano il sistema circolatorio come un'autostrada per diffondersi in siti distanti in tutto il corpo2,3. Mentre sono in viaggio verso questi siti, le cellule tumorali circolanti (CTC) esistono all'interno di un microambiente fluido dinamico diverso da quello del loro tumore primario originale3,4,5. È stato proposto che questo microambiente fluido sia una delle tante barriere alle metastasi4. C'è ampio accordo nel concetto di inefficienza metastatica, cioè che la maggior parte delle CTC che entrano in circolazione periscono o non formano colonie metastatiche produttive6,7,8. Tuttavia, il motivo per cui le metastasi sono inefficienti dal punto di vista di un singolo CTC è meno certo e rimane un'area attiva di indagine. Le CTC sono staccate dalla matrice extracellulare, private dei fattori di crescita e sopravvivenza solubili che possono essere presenti nel tumore primario ed esposte al sistema immunitario e alle forze emodinamiche in modo molto diverso rispetto al tumore primario4. Ognuno di questi fattori può contribuire alla scarsa sopravvivenza dei CTC, ma i loro contributi relativi non sono chiari. Questo documento affronta la questione di come le forze emodinamiche influenzano le CTC.
Studiare gli effetti delle forze emodinamiche sulle CTC è piuttosto impegnativo. Attualmente, non esistono sistemi ingegnerizzati in vitro in grado di replicare l'intera dinamica spaziotemporale (dal cuore ai capillari) e le proprietà reologiche del sistema vascolare umano. Inoltre, il modo in cui le CTC sperimentano il sistema circolatorio non è del tutto chiaro. Prove sperimentali indicano che la maggior parte delle cellule tumorali non circolano continuamente come le cellule del sangue. Piuttosto, a causa delle loro dimensioni relativamente grandi (10-20 μm di diametro), la maggior parte dei CTC si intrappolano in letti capillari (6-8 μm di diametro) per periodi di tempo variabili (da s a giorni) dove possono morire, stravasare o essere spostati nel letto capillare successivo8,9,10,11. Tuttavia, ci sono alcune prove che le dimensioni del CTC possono essere più eterogenee in vivo e che le CTC più piccole sono rilevabili12. Pertanto, in base alla distanza e alla velocità del flusso sanguigno, le CTC possono circolare liberamente solo per una questione di secondi tra questi periodi di intrappolamento, sebbene manchi una descrizione quantitativa di questo comportamento13.
Inoltre, a seconda di dove le CTC entrano in circolazione, possono passare attraverso più letti capillari nel polmone e in altri siti periferici e attraverso il cuore destro e sinistro prima di raggiungere la loro destinazione finale. Lungo la strada, le CTC sono esposte a vari stress emodinamici tra cui lo stress da taglio del fluido (FSS), le forze di compressione durante il loro intrappolamento nel microcircolo e, potenzialmente, le forze di trazione in circostanze in cui potrebbero esibire un rotolamento simile a quello dei leucociti lungo le pareti dei vasi sanguigni14. Pertanto, sia la capacità di modellare la circolazione che la comprensione del comportamento CTC da modellare sono limitate. A causa di questa incertezza, qualsiasi risultato proveniente da sistemi modello in vitro dovrebbe essere convalidato in un organismo vertebrato sperimentale e, in definitiva, nei pazienti oncologici.
Con le avvertenze di cui sopra, questo documento dimostra un modello relativamente semplice per applicare FSS alle cellule in sospensione per sondare gli effetti di FSS sulle CTC descritte per la prima volta nel 201215. FSS deriva dall'attrito del flusso sanguigno contro la parete del vaso, che produce un gradiente di velocità parabolica in condizioni di flusso laminare in vasi più grandi. Le cellule sperimentano livelli più elevati di FSS vicino alle pareti dei vasi e livelli più bassi vicino al centro del vaso sanguigno. La viscosità del fluido, la portata e le dimensioni del condotto attraverso il quale avviene il flusso influenzano FSS, come descritto dall'equazione di Hagen-Poiseuille. Questo vale per i flussi sanguigni che si comportano come fluidi newtoniani, ma non vale per la microcircolazione. La FSS fisiologica varia su diversi ordini di grandezza con i livelli più bassi nei linfatici (<1 dyn / cm2) e i più alti nelle regioni intorno alle valvole cardiache e alle placche aterosclerotiche (>500 dyn / cm2)5. Lo sforzo medio di taglio della parete nelle arterie è di 10-70 dyn/cm2 e 1-6 dyn/cm2 nelle vene16,17.
Nel cuore, le cellule possono essere esposte a flussi turbolenti intorno ai lembi valvolari dove si può sperimentare FSS di livello molto alto, ma di brevissima durata18,19. Sebbene il campo del bioprocessing abbia a lungo studiato gli effetti di FSS sulle cellule di mammifero in sospensione, queste informazioni possono avere un valore limitato per comprendere gli effetti di FSS sulle CTC in quanto generalmente si concentrano su livelli molto più bassi di FSS applicati per una lunga durata20. Come descritto di seguito, utilizzando una siringa e un ago, si può applicare FSS relativamente alto (da decine a migliaia di dyn / cm2) per una durata relativamente breve (millisecondi) a una sospensione cellulare. Dalla descrizione iniziale di questo modello15,altri lo hanno impiegato per studiare gli effetti della FSS sulle celluletumorali21,22,23. "Impulsi" multipli di FSS possono essere applicati alle sospensioni cellulari in un breve periodo di tempo per facilitare le analisi sperimentali a valle. Ad esempio, questo modello può essere utilizzato per misurare la capacità delle cellule di resistere alla distruzione meccanica da parte di FSS misurando la vitalità delle celle in funzione del numero di impulsi applicati. In alternativa, gli effetti dell'esposizione a FSS sulla biologia delle cellule tumorali possono essere esplorati raccogliendo cellule per una varietà di analisi a valle. È importante sottolineare che parte della sospensione cellulare è riservata come controllo statico per confrontare gli effetti di FSS da quelli che potrebbero essere associati al distacco cellulare e al tempo tenuto in sospensione.
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Protocol
1. Preparazione cellulare
- Rilasciare le cellule dal piatto di coltura tissutale quando il 70-90% confluente seguendo le linee guida raccomandate per la linea cellulare in uso.
- Ad esempio, aspirare il mezzo di crescita per le cellule PC-3 e lavare il piatto di 10 cm di cellule con 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) priva di calcio e magnesio.
- Aspirare il PBS prima di aggiungere 1 ml di tripsina allo 0,25% utilizzando il protocollo del produttore.
- Dopo aver osservato il distacco delle cellule al microscopio invertito, aggiungere 5 ml di DMEM:F12 medio contenente il 10% di siero bovino fetale per inibire la tripsina.
- Posizionare la sospensione cellulare in un tubo conico.
- Determinare la concentrazione cellulare e il numero totale di cellule.
- Le cellule a pellet per centrifugazione (300 × g per 3 min), aspirano il surnatante e sospendono le cellule in terreno di coltura tissutale privo di siero a 5 × 105 cellule/mL.
NOTA: È fondamentale che il mezzo di analisi contenga almeno 1,17 mM Ca++ poiché è stato dimostrato che ca++ extracellulare è necessario per la resistenza cellulare a FSS15.
2. Esposizione allo stress da taglio del fluido
- Prima di esporre le celle a FSS, tagliare un tubo di polistirene da 14 mL a fondo tondo sulla linea da 7 mL. Mescolare la sospensione cellulare, posizionare 5 ml della sospensione nel tubo tagliato e raccogliere campioni di controllo statico.
NOTA: il volume necessario da raccogliere per il campione statico dipende dal saggio di vitalità utilizzato (vedere il passaggio 3). - Aspirare la sospensione cellulare in una siringa da 5 ml e attaccare un ago da 30 G da 1/2". Aprire l'ago, posizionare la siringa su una pompa a siringa, fissare la siringa e impostare la portata per raggiungere il livello desiderato di FSS.
NOTA: la Tabella 1 mostra lo sforzo massimo di taglio della parete per diversi aghi e portate, nonché il livello minimo di FSS a seconda delle dimensioni della cella (10, 15 e 20 μm). Ispezionare l'ago prima dell'uso per assicurarsi che non sia piegato; se incerto, sostituisca l'ago con uno nuovo. L'integrità dell'ago può avere un impatto significativo sul livello di FSS applicato. - Aeggiare la pompa della siringa e raccogliere il campione tranciato nel tubo tagliato con un angolo approssimativo di 45° per ridurre la formazione di schiuma. Raccogliere un campione a seconda del tipo di test di fattibilità o delle esigenze del test a valle.
- Rimuovere con cautela la siringa e l'ago dalla pompa della siringa e utilizzare le pinze per rimuovere l'ago dalla siringa, facendo attenzione a non toccare l'ago.
NOTA: gli aghi non smussati possono essere utilizzati in modo intercambiabile con aghi smussati come ulteriore misura di sicurezza.
- Rimuovere con cautela la siringa e l'ago dalla pompa della siringa e utilizzare le pinze per rimuovere l'ago dalla siringa, facendo attenzione a non toccare l'ago.
- Riportare la sospensione tranciata nella siringa, ricollegare con cura l'ago con una pinza e ricommetterlo nella pompa della siringa.
- Ripetere i passaggi 2.3 e 2.4 fino a quando la sospensione cellulare non è stata esposta al numero desiderato di impulsi di FSS.
NOTA: Per valutare la capacità delle cellule di resistere alla distruzione meccanica dall'esposizione fSS, la sospensione cellulare è tipicamente soggetta a 10 impulsi di FSS. Tuttavia, è stato dimostrato che le cellule iniziano a subire adattamenti biologici in risposta a FSS dopo 2 impulsi24.
3. Misurazione della redditività
NOTA: La vitalità può essere valutata utilizzando saggi enzimatici (luciferasi, resazurina e WST-1), contando cellule intatte, citometria a flusso o saggi clonogenici.
- Per tutte le misure di vitalità, raccogliere un campione prima di esporre le cellule a FSS.
- Per i saggi enzimatici, prendere aliquote duplicate da 100 μL e metterle in una piastra a 96 pozzetti.
- Per la citometria a flusso, prendere un'aliquota da 500 μL e metterla in un tubo da 1,5 ml.
- Per il saggio clonogenico, raccogliere un'aliquota di 100 μL.
- Saggio enzimatico
- Raccogliere campioni da 100 μL dopo 1, 2, 4, 6, 8 e 10 impulsi di esposizione FSS e metterli in una piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere il substrato desiderato e seguire il protocollo per il test utilizzato:
- Per la resazurina, aggiungere 20 μL di una soluzione da 0,15 mg/mL a ciascun pozzet. Aggiungere 20 μL di 0,15 mg/mL di soluzione di resazurina ai pozzi contenenti 100 μL di mezzo da solo. Incubare per 2 ore in un incubatore di colture tissutali a 37 °C. Misurare l'assorbanza utilizzando un lettore di piastre in grado di leggere la fluorescenza (579 eccitazione/ 584 di emissione).
- Per le cellule che esprimono luciferasi, aggiungere 100 μL di 15 mg/mL di D-luciferina a 5 mL di mezzo. Aggiungere 100 μL di quella soluzione a ciascun pozzo contenente cellule. Attendere 5 minuti, quindi leggere la piastra utilizzando un lettore compatibile con la luminescenza.
- Per WST-1, aggiungere 10 μL di WST-1 a ciascun pozzo, compresi i pozzi contenenti solo il mezzo. Incubare per 4 ore, quindi leggere l'assorbanza tra 420 e 480 nm utilizzando un lettore di piastre.
- Confrontare il segnale mediato da ciascuno dei campioni esposti a FSS con il campione di controllo statico medio per ottenere la percentuale di cellule vitali.
- Citometria aflusso 24
- Raccogliere campioni da 500 μL e metterli in tubi centrifughi da 1,5 mL dopo 1, 2, 5 e 10 impulsi di FSS.
- Centrifugare i campioni (500 × g per 3 min) ed eliminare i supernatanti.
- Spese di sospensione dei pellet con 1 mL di PBS privo di calcio e magnesio e centrifugare i campioni (300 × g per 3 min).
- Sospendere il pellet con 500 μL di tampone facS (fluorescence-activated cell sorting) (PBS con albumina sierica bovina allo 0,5% e azide di sodio allo 0,1%) con perle di conteggio e coloranti impermeabili o vitali a membrana come lo ioduro di propidio (1,75 μg/mL).
- Determinare la vitalità confrontando il rapporto tra cellule vitali, normalizzato al conteggio delle perle, nei campioni tranciati e quello del campione statico.
- Saggio clonogenico
- Prendere 100 μL del campione statico e aggiungere 900 μL di terreno di coltura per effettuare una diluizione 1:10.
- Prendere 100 μL del campione diluito 1:10 e aggiungere 900 μL di terreno di coltura per effettuare una diluizione finale 1:100.
- Aggiungere 100 μL del campione di diluizione 1:100 in ciascuno dei 3 pozzeli di un piatto a 6 pozzene contenente 2 ml di terreno di coltura.
- Ripetere i passaggi 3.4.1-3.4.3 con campioni che sono stati sottoposti a 10 impulsi di FSS.
- Lascia che le cellule crescano per 7-10 giorni senza cambiare il mezzo e controlla la formazione della colonia. Una volta formate colonie di ≥50 cellule, aspirare il mezzo di crescita, risciacquare ogni pozzetti con 1 mL di PBS, aspirare il PBS e fissare per 5 minuti usando 1 mL di etanolo al 70% ghiacciato (EtOH). È importante sottolineare che fissare contemporaneamente sia i campioni tranciati che quelli statici
- Dopo aver fissato i campioni, aspirare l'EtOH e aggiungere da 1 a 2 ml di soluzione di cristallo viola (0,1% di viola cristallino in 90% H2O, 10% EtOH) per 5 minuti.
- Risciacquare con un eccesso di acqua e lasciare asciugare la piastra
- Contare le colonie (gruppi di ≥50 cellule) sia per i campioni statici che per quelli tranciati. Confrontare il rapporto tra il numero medio di colonie dal campione tranciato e il numero medio di colonie dal campione statico per determinare la vitalità.
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Representative Results
L'elevata resistenza alla distruzione meccanica indotta da FSS ha precedentemente dimostrato di essere un fenotipo conservato su più linee cellulari tumorali e cellule tumorali appena isolate dai tumori rispetto ai comparatori di cellule epiteliali non trasformate15,24. Qui, sono state testate ulteriori linee cellulari tumorali da una varietà di origini tissutali (Tabella 2) per dimostrare che la maggior parte di queste cellule mostra vitalità ≥ 20% dopo 10 impulsi di FSS a 250 μL / s. L'unica eccezione sono le cellule MiaPaCa2, che erano relativamente sensibili alla distruzione meccanica da FSS (vitalità ≤ 10%). Per descrivere adeguatamente il profilo di resistenza FSS di una linea cellulare, si raccomandano n ≥ 3 repliche biologiche.
A titolo di confronto, tutte le cellule epiteliali non trasformate esaminate hanno vitalità < 10% in queste condizioni15,24. Pertanto, mentre vi è un intervallo nella resistenza FSS osservata, la maggior parte delle linee cellulari tumorali testate mostrano una maggiore resistenza FSS rispetto alle cellule non trasformate. Le linee cellulari tumorali possono essere derivate sia dai tessuti tumorali primari che dalle metastasi. Si potrebbe postulare che le cellule derivate dalle metastasi possano mostrare una maggiore resistenza FSS in quanto questo fenotipo potrebbe essere stato selezionato durante la disseminazione metastatica. Tuttavia, è stato dimostrato che il livello di resistenza FSS non dipende dal fatto che le cellule siano derivate da tumori primari o metastasi15,24. Inoltre, i livelli di resistenza FSS non sono correlati con il potenziale metastatico in una serie di linee cellulari di cancro alla prostata umano15.
Per testare ulteriormente questo, sono state utilizzate cellule epiteliali mammarie BALB/c con potenziale metastatico variabile (4T1 = altamente metastatico, 4T07 = potenziale metastatico da debole a moderato, 67NR = no a basso potenzialemetastatico 25,26). Questo esperimento ha rivelato che la resistenza FSS non è correlata con il potenziale metastatico (Figura 1). Inoltre, sia le cellule 4T1 che 4T07 mostrano una perdita bifasica di vitalità cellulare, una maggiore perdita di vitalità negli impulsi 1-2 rispetto a quella osservata negli impulsi successivi. Questo è tipico della maggior parte delle linee cellulari tumorali studiate da questo gruppo. Al contrario, 67NR mostra una perdita più lineare di vitalità cellulare in funzione di FSS. Collettivamente, i dati della Tabella 2 e della Figura 1 dimostrano che la resistenza FSS è una proprietà delle cellule trasformate.
Figura 1: Resistenza allo stress da taglio fluido delle cellule tumorali epiteliali mammarie BALB/c sinergiche. Le cellule sono state esposte a FSS (ago da 30 G, 10 pulses@250 mL/s) e la vitalità è stata misurata utilizzando la conversione della resazurina (n = 4/linea cellulare). Mentre l'esposizione a FSS riduceva il numero di cellule vitali (p < 0,0001, ANOVA a 2 vie) e ogni linea cellulare mostrava diversi profili di resistenza (p = 0,0446, ANOVA a 2 vie), non vi era alcuna differenza significativa tra le linee cellulari dopo 10 impulsi di esposizione fSS (p = 0,2833, ANOVA a 2 vie). Abbreviazioni: FSS = stress di taglio del fluido; ANOVA = analisi della varianza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Taglio (τ): | parete (massimo) | minimo | |||||||||||
| Diametro della cella: | N/D | 10 μm | 15 μm | 20 μm | |||||||||
| Calibro dell'ago: | 30 | 27 | 25 | 30 | 27 | 25 | 30 | 27 | 25 | 30 | 27 | 25 | |
| Portata (μL/s) | 20 | 507 | 220 | 116 | 32 | 10 | 4 | 48 | 16 | 7 | 64 | 21 | 9 |
| 50 | 1267 | 550 | 290 | 80 | 26 | 11 | 120 | 39 | 17 | 159 | 52 | 22 | |
| 100 | 2534 | 1100 | 580 | 159 | 52 | 22 | 239 | 79 | 33 | 319 | 105 | 45 | |
| 150 | 3801 | 1650 | 869 | 239 | 79 | 33 | 359 | 118 | 50 | 478 | 157 | 67 | |
| 200 | 5068 | 2200 | 1159 | 319 | 105 | 45 | 478 | 157 | 67 | 637 | 210 | 89 | |
| 250 | 6335 | 2750 | 1449 | 398 | 131 | 56 | 598 | 196 | 84 | 797 | 262 | 111 | |
Tabella 1: Livelli massimi di sforzo di taglio (parete τ). La tabella elenca i livelli FSS massimi di parete in dyn/cm2 per aghi da 30 G, 27 G e 25 G alle portate di 20, 50, 100, 150, 200 e 250 μL/s. I livelli di sforzo di taglio sono stati calcolati utilizzando l'equazione di Poiseuille ( 
), le informazioni disponibili per il diametro interno di ciascun misuratore dell'ago, nonché l'ipotesi che μ = 0,01 dyn·s/cm2. I livelli minimi di FSS per ogni dimensione sono stati calcolati utilizzando 
dove r è il raggio della cellula e R è il raggio dell'ago. Abbreviazione: FSS = stress di taglio del fluido; τ = taglio; τwall = taglio massimo; μ = viscosità; Q = portata volumetrica.
| Linea cellulare | Fonte di tessuto | Specie | Vitalità media (%) dopo 10 impulsi |
| TRAMPC1 | Prostata | Topo | 40 |
| 4T01 · | Seno | Topo | 32 |
| 4T7 · | Seno | Topo | 43 |
| 67NR | Seno | Topo | 46 |
| 66CL4 | Seno | Topo | 28 |
| RT4 | Vescica | Umano | 62 |
| W17-266-4 | Melanoma | Umano | 46 |
| HS852 | Melanoma | Umano | 41 |
| HS695 | Melanoma | Umano | 41 |
| A2058 | Melanoma | Umano | 37 |
| A375 | Melanoma | Umano | 37 |
| RPMI-7951 · | Melanoma | Umano | 35 |
| SKMEL2 · | Melanoma | Umano | 29 |
| A101D | Melanoma | Umano | 28 |
| MiaPaCa | Pancreatico | Umano | 7 |
Tabella 2: Resistenza allo stress da taglio fluido di varie linee cellulari tumorali. Ogni linea cellulare tumorale è stata esposta a stress di taglio fluido dal modello di siringa e ago (ago da 30 G, 10 pulses@250 mL/s) (n ≥ linea 3/cellulare) e la vitalità è stata misurata mediante attività della luciferasi o conversione della resazurina.
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Discussion
Questo documento dimostra l'applicazione di FSS alle cellule tumorali in sospensione utilizzando una siringa e un ago. Utilizzando questo modello, le cellule tumorali hanno dimostrato di essere più resistenti a brevi impulsi di FSS di alto livello rispetto alle cellule epiteliali non trasformate15,22,24. Inoltre, l'esposizione a FSS utilizzando questo modello si traduce in un rapido aumento della rigidità cellulare, attivazione di RhoA e aumento della contrattilità corticale basata su F-actina e miosina II24,27. Il rapido meccano-adattamento (la capacità dei CTC di diventare più o meno rigidi a seconda delle circostanze) può prevenire la distruzione meccanica delle CTC e facilitare altri aspetti della colonizzazione metastatica24,28. In effetti, i risultati fatti utilizzando questo modello in vitro sono stati confermati utilizzando CTC sperimentali in modelli animali24. Questo rapido adattamento meccano-adattamento probabilmente spiega la perdita bifasica della vitalità cellulare tipicamente osservata in questo modello (Figura 1), cioè le cellule naïve FSS sono più suscettibili alla distruzione rispetto alle cellule che sono state esposte anche a un singolo impulso di FSS. Nel complesso, ciò indica che FSS induce un rapido irrigidimento cellulare nelle cellule tumorali che le protegge dai successivi impulsi di FSS.
Sebbene l'asse RhoA-actomiosina sia un importante driver della resistenza FSS15,21,24,ci sono probabilmente altri meccanismi coinvolti29. Un'ulteriore prova che la rigidità cellulare è un determinante chiave della resistenza FSS è che l'interruzione della lamina A, che controlla l'integrità strutturale del nucleo, il componente più rigido della cellula, riduce la resistenza FSS nelle cellule tumorali utilizzando questo modello22. Stiamo usando questo modello per sondare ulteriormente i meccanismi di resistenza FSS nelle cellule tumorali. Qui, questo modello è stato utilizzato per misurare la capacità di varie linee cellulari tumorali di resistere alla distruzione meccanica esponendo le cellule a brevi impulsi di alti livelli di FSS. Sebbene questo sia un modello relativamente economico e semplice da sviluppare in laboratorio, con l'elemento più costoso che è la pompa a siringa, è necessario prestare attenzione a seguire fedelmente il protocollo per ottenere risultati riproducibili. Impulsi multipli di FSS possono essere applicati alle cellule in un tempo molto breve, < 10 minuti. Il tempo totale trascorso per l'esperimento dipende dal volume della sospensione, dalla portata, dal numero di impulsi e dalla destrezza dell'utente che trasferisce la sospensione tra gli impulsi. Con l'esperienza, una sospensione da 5 mL esposta a FSS con un ago da 30 G per 10 pulses@250 μL / s può essere elaborata in ~ 10 minuti. Per la maggior parte delle linee cellulari, c'è una perdita minima di vitalità a causa della sospensione per questo periodo di tempo.
Poiché l'esposizione a FSS avviene relativamente rapidamente, FSS viene in genere applicato alle sospensioni cellulari in mezzo privo di siero per ridurre la formazione di schiuma dei campioni. La differenza di viscosità tra lo 0-10% di siero bovino fetale è trascurabile in questo test. Tuttavia, è fondamentale garantire livelli fisiologici di calcio nel mezzo in cui le cellule vengono tranciate. Inoltre, per quanto riguarda i metodi di dissociazione cellulare prima dell'esposizione a FSS, non è stata rilevata alcuna differenza nella resistenza FSS nelle sospensioni cellulari PC-3 preparate mediante tripsinizzazione o trattamento con agenti di dissociazione non enzimatici15. La concentrazione cellulare può essere maggiore o inferiore a 5 × 105 celle/mL a seconda delle esigenze di applicazione a valle. La risposta delle cellule tumorali della prostata PC-3 è simile in un intervallo da 5 × 104 a 5 × 105,15. Tuttavia, gli effetti della concentrazione cellulare sulla vitalità dopo l'esposizione a FSS devono essere determinati empiricamente.
Per la maggior parte delle applicazioni previste con cellule in coltura, la densità cellulare non dovrebbe influenzare in modo significativo la viscosità e, quindi, la quantità di FSS applicata. Le variabili, come il tempo per il quale le cellule sono tenute in sospensione prima dell'esposizione a FSS, dovrebbero essere mantenute costanti attraverso le repliche sperimentali. Come accennato in precedenza, anche l'integrità dell'ago è fondamentale. Variazioni di lotto sono state osservate negli aghi rispetto a questo test nel tempo. Gli aghi ipodermici sono stati progettati per uso clinico, non per le portate impiegate qui. In rare occasioni, il mozzo dell'ago può essere parzialmente occluso, che durante gli impulsi successivi, occlude il passaggio della sospensione attraverso l'ago e, infine, il riflusso attorno allo stantuffo della siringa. Inoltre, è molto importante capire che le cellule morte / morenti sono eccezionalmente sensibili alla FSS, come mostrato in precedenza24. Pertanto, se una particolare linea cellulare ha un alto livello di cellule morenti, sia come caratteristica di routine che come manipolazioni sperimentali (ad esempio, trattamenti farmacologici), ciò comporterà una perdita molto ripida della vitalità cellulare che potrebbe non essere completamente normalizzata rispetto al controllo statico.
L'applicazione di FSS può essere abbinata ad altri saggi, come immunofluorescenza, test pulldown e western blotting, per studiare l'effetto di FSS sulla biologia delle cellule tumorali 24. In linea di principio, questo modello potrebbe anche essere utilizzato per esplorare gli effetti della FSS di alto livello e di breve durata su altri tipi di cellule, comprese le cellule del sangue. I globuli rossi e i leucociti normali sono molto più resistenti alla FSS applicata in questo modo rispetto anche alle cellule tumorali, il che è ovvio fisiologicamente15. Infatti, il livello di FSS applicato, utilizzando un ago da 30 G 1/2" ad una portata di 250 mL/s, fa quadrare il range necessario per la rottura della membrana dei globuli rossi (in base all'applicazione millisecondi della forza)30,31. Una limitazione di questo modello, o di qualsiasi altra che comporta il passaggio di fluido attraverso un condotto, è che il livello preciso di FSS che le cellule sperimentano nell'intervallo dalla massima sollecitazione di taglio della parete e il minimo al centro del condotto non è noto. Pertanto, ad ogni impulso, tutte le cellule non sperimentano lo stesso livello di FSS e, su impulsi ripetuti, ci si aspetterebbe che le singole cellule sperimentino diversi livelli di FSS ad ogni impulso all'interno dell'intervallo specificato.
Tuttavia, la messa a fuoco idrodinamica nelle condizioni impiegate in questo modello si traduce in cellule dirette verso il centro del flusso, lontano dalla parete, e quindi verso una minore esposizione FSS32. Altri modelli, come i viscosimetri a cono e piastra o le camere Couette, sono più adatti per l'applicazione di FSS a livelli costanti a una sospensione cellulare. Come accennato in precedenza, rimane difficile modellare l'esposizione FSS delle CTC in vitro. Questo modello è più adatto per testare gli effetti di un'esposizione elevata, ma breve, alla FSS come potrebbe accadere attraversando il cuore. Il flusso attraverso le arterie e le vene si traduce in un'esposizione più lunga a livelli più bassi di FSS. Tuttavia, come accennato, per quanto tempo i CTC rimangono in flusso continuo nella circolazione non è chiaro, e la maggior parte delle prove sperimentali fino ad oggi è coerente con brevi periodi (secondi) di flusso libero punteggiati da periodi più lunghi di intrappolamento nel microcircolo.
I modelli che espongono le cellule tumorali in sospensione a livelli più bassi di FSS (0,5-60 dyn / cm2) per periodi più lunghi (da minuti a giorni) includono viscosimetri a cono e piastra, camere Couette, anelli di flusso continui, siringa con estensione del tubo e dispositivi microfluidici33,34,35,36,37. Questi sono stati anche utilizzati per ottenere informazioni su come FSS potrebbe influenzare le CTC e hanno portato a scoprire che l'esposizione a FSS aumenta lo stress ossidativo, la proliferazione e l'invasione cellulare e le caratteristiche simili alle cellule staminali in varie linee cellulari tumorali. Sarà interessante confrontare i risultati derivati da quei modelli con quello qui descritto. Ad esempio, utilizzando un modello di loop di flusso continuo, Xin et al. hanno scoperto che l'asse ROCK-actomiosina promuoveva una perdita di vitalità cellulare nelle linee cellulari tumorali esposte a FSS (20 dyn / cm2) per 2-12h in netto contrasto con i dati sopra descritti38. Pertanto, è molto probabile che il contesto biologico sia importante per tutti questi modelli in vitro, rafforzando la necessità di tradurre i risultati sulle CTC in modelli in vivo e, in definitiva, in pazienti oncologici.
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Disclosures
MDH è co-fondatore, presidente e azionista di SynderBio, Inc. DLM è consulente per SynderBio, Inc.
Acknowledgments
Lo sviluppo del modello qui dimostrato è stato supportato dalla sovvenzione DOD W81XWH-12-1-0163, dalle sovvenzioni NIH R21 CA179981 e R21 CA196202 e dal Sato Metastasis Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| 14 mL round bottom tubes | Falcon - Corning | 352059 | |
| 30 G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 96-well black bottom plate | Costar - Corning | 3915 | |
| Bioluminescence detector | AMI | AMI HTX | |
| BSA, Fraction V | Sigma | 10735086001 | |
| Cell Titer Blue | Promega | G8081 | |
| crystal violet | Sigma | C0775 | |
| D-luciferin | GoldBio | D-LUCK | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HT | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S2002 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3005 |
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