Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Modellering virkningerne af hæmodynamisk stress på cirkulerende tumorceller ved hjælp af en sprøjte og nål

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/62478
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 1, 1,2,4,5,6
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 3MD program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Department of Pathology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Department of Urology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 6Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa

Summary

Her demonstrerer vi en metode til at anvende væskeforskydningsstress på kræftceller i suspension for at modellere virkningerne af hæmodynamisk stress på cirkulerende tumorceller.

Abstract

Under metastaser får kræftceller fra fast væv, herunder epithelia, adgang til lymfe- og hæmatotogen cirkulation, hvor de udsættes for mekanisk stress på grund af hæmodynamisk flow. En af disse understreger, at cirkulerende tumorceller (CTCs) erfaring er væske forskydning stress (FSS). Mens kræftceller kan opleve lave niveauer af FSS i tumoren på grund af interstitiel flow, CTCs er udsat, uden ekstracellulære matrix vedhæftet fil, til langt større niveauer af FSS. Fysiologisk, FSS varierer over 3-4 størrelsesordener, med lave niveauer til stede i lymfeknuder (<1 dyne / cm2) og de højeste niveauer til stede kort som celler passerer gennem hjertet og omkring hjerteklapper (>500 dynes / cm2). Der er et par in vitro modeller designet til at modellere forskellige intervaller af fysiologiske forskydning stress over forskellige tidsrammer. Dette papir beskriver en model til at undersøge konsekvenserne af korte (millisekund) pulser af højt niveau FSS på kræft cellebiologi ved hjælp af en simpel sprøjte og nål system.

Introduction

Metastase, eller spredning af kræft ud over den oprindelige tumor site, er en vigtig faktor, der ligger til grund forkræftdødelighed 1. Under metastaser, kræftceller udnytte kredsløbssygdomme som en motorvej til at formidle til fjerne steder i hele kroppen2,3. Mens på vej til disse steder, cirkulerende tumorceller (CTCs) findes inden for en dynamisk flydende mikromiljø i modsætning til deres oprindelige primære tumor3,4,5. Det er blevet foreslået, at dette flydende mikromiljø er en af mange barrierer for metastaser4. Der er bred enighed om begrebet metastatisk ineffektivitet, dvs. Men hvorfor metastaser er ineffektive set ud fra en individuel CTC er mindre sikker og er fortsat et aktivt område for undersøgelsen. CTC'er er løsrevet fra ekstracellulær matrix, berøvet opløselige vækst- og overlevelsesfaktorer, der kan være til stede i den primære tumor, og udsættes for immunsystemet og hæmodynamiske kræfter på en meget anden måde end i den primære tumor4. Hver af disse faktorer kan bidrage til CTC'ernes dårlige overlevelse, men deres relative bidrag er uklare. Dette dokument behandler spørgsmålet om, hvordan hæmodynamiske kræfter påvirker CTCs.

At studere virkningerne af hæmodynamiske kræfter på CTC'er er ret udfordrende. I øjeblikket er der ingen manipuleret in vitro-systemer, der kan kopiere hele spatiotemporal dynamik (hjerte til kapillærer) og reologiske egenskaber af det menneskelige vaskulære system. Desuden er det ikke helt klart, hvordan CTC'er oplever kredsløbssystemet. Eksperimentelle beviser tyder på, at de fleste kræftceller ikke cirkulerer kontinuerligt som blodlegemer. På grund af deres relativt store størrelse (10-20 μm i diameter) bliver de fleste CTC'er i de fleste CTC'er i kapillar (6-8 μm i diameter) i varierende længder (s til dage), hvor de kan dø, ekstravasere eller fortrænges til den næste kapillær seng8,9,10,11. Der er dog noget, der tyder på, at CTC-størrelsen kan være mere heterogen in vivo, og at mindre CTC'er kan påvises12. Derfor, baseret på afstand og blodgennemstrømningshastighed, kan CTC'er kun cirkulere frit i et spørgsmål om sekunder mellem disse perioder med fastklemning, selvom en kvantitativ beskrivelse af denne adfærd mangler13.

Desuden, afhængigt af hvor CTC'er kommer ind i omløb, kan de passere gennem flere kapillære senge i lungerne og andre perifere steder og gennem både højre og venstre hjerte, før de når deres endelige destination. Undervejs udsættes CTC'er for forskellige hæmodynamiske belastninger, herunder væskeforskydningsstress (FSS), trykkræfter under deres fastklemning i mikrocirkulationen og potentielt trækkraftkræfter under omstændigheder, hvor de kan udvise leukocytlignende rulning langsblodkarvæggene 14. Således er både evnen til at modellere cirkulationen og forståelsen af CTC-adfærd, der skal modelleres, begrænset. På grund af denne usikkerhed bør eventuelle fund fra in vitro-modelsystemer valideres i en eksperimentel hvirveldyrorganisme og i sidste ende hos kræftpatienter.

Med de ovennævnte forbehold viser dette papir en relativt enkel model til at anvende FSS på celler i suspension for at undersøge virkningerne af FSS på CTC'er, der først blev beskrevet i 201215. FSS skyldes friktion af blodgennemstrømningen mod karvæggen, som producerer en parabolsk hastighed gradient under forhold med laminar flow i større fartøjer. Celler oplever højere niveauer af FSS nær karvægge og lavere niveauer nær midten af blodkarrene. Flydende viskositet, strømningshastighed og dimensioner af den kanal, gennem hvilken strømmen opstår, påvirker FSS, som beskrevet af Hagen-Poiseuille-ligningen. Dette gælder for blodstrømme, der opfører sig som newtonske væsker, men holder ikke for mikrocirkulationen. Fysiologisk FSS varierer over flere størrelsesordener med de laveste niveauer i lymfetiden (<1 dyn/cm2)og den højeste i områder omkring hjerteklapper og aterosklerotiske plaques (>500 dyn/cm2)5. Gennemsnitlig vægforskydningsbelastning i arterier er 10-70 dyn/cm2 og 1-6 dyn/cm2 i vener16,17.

I hjertet kan celler blive udsat for turbulente strømme omkring ventilfoldere, hvor meget højt niveau, men meget kort varighed FSS kan opleves18,19. Selv om biobehandlingsfeltet længe har undersøgt FSS' virkninger på pattedyrceller i suspension, kan disse oplysninger være af begrænset værdi for forståelsen af FSS' virkninger på CTC'er, da de generelt fokuserer på meget lavere niveauer af FSS anvendt over en lang varighed20. Som beskrevet nedenfor, ved hjælp af en sprøjte og nål, kan man anvende relativt høj (titusinder dyn / cm2) FSS for en relativt kort (millisekunder) varighed til en celle suspension. Siden den første beskrivelse af denne model15, andre har ansat den til at studere virkningerne af FSS på kræftceller21,22,23. Flere "pulser" af FSS kan anvendes på celleaffjedring på kort tid for at lette downstream eksperimentelle analyser. For eksempel kan denne model bruges til at måle cellernes evne til at modstå mekanisk ødelæggelse af FSS ved at måle celle levedygtighed som en funktion af antallet af anvendte impulser. Alternativt kan virkningerne af FSS eksponering på biologi kræftceller udforskes ved at indsamle celler til en række downstream-analyser. Det er vigtigt, at en del af celleophænget er reserveret som et statisk kontrolelement til sammenligning af virkningerne af FSS fra dem, der kan være forbundet med celleløsning og tid, der holdes i suspension.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Celleforberedelse

  1. Slip celler fra vævskultur parabol, når 70-90% sammenflydende ved at følge de anbefalede retningslinjer for cellelinjen i brug.
    1. For eksempel indsug vækstmediet til PC-3-celler, og vask 10 cm skålen af celler med 5 mL calcium- og magnesiumfri fosfatbufferet saltvand (PBS).
    2. Aspirere PBS før du tilføjer 1 mL af 0,25% trypsin ved hjælp af producentens protokol.
    3. Efter at have observeret løsrivelsen af cellerne under et omvendt mikroskop tilsættes 5 mL DMEM:F12-medium, der indeholder 10% føtalt kvægserum for at hæmme trypsin.
  2. Placer celleaffjedringen i et konisk rør.
  3. Bestem cellekoncentrationen og det samlede celletal.
  4. Pelletceller ved centrifugering (300 × g i 3 min.), aspirere supernatanten og opbruge celler i serumfri vævskulturmedium til 5 × 105 celler/mL.
    BEMÆRK: Det er afgørende, at analysemediet indeholder mindst 1,17 mM Ca++ som ekstracellulær Ca++ har vist sig at være påkrævet for cellulær resistens over for FSS15.

2. Eksponering for væskeforskydningsstress

  1. Før cellerne udsættes for FSS, skæres et rundbundet 14 mL polystyrenrør ved 7 mL-linjen. Celleaffjedringen blandes, affjedringens 5 mL anbringes i det afskårne rør, og der indsamles statiske kontrolprøver.
    BEMÆRK: Den mængde, der er nødvendig for at indsamle til den statiske prøve, afhænger af den anvendte levedygtighedsanalyse (se trin 3).
  2. Træk celleaffjedringen ind i en 5 mL sprøjte, og fastgør en 30 G 1/2" nål. Tag kanylen ud, placer sprøjten på en sprøjtepumpe, fastgør sprøjten, og indstil strømningshastigheden for at opnå det ønskede niveau af FSS.
    BEMÆRK: Tabel 1 viser den maksimale vægforskydningsbelastning for forskellige nåle og strømningshastigheder samt det mindste niveau af FSS afhængigt af cellestørrelse (10, 15 og 20 μm). Undersøg nålen inden brug for at sikre, at den ikke er bøjet hvis det er usikkert, skal du udskifte nålen med en ny. Nåleintegritet kan have en betydelig indvirkning på niveauet af FSS anvendt.
  3. Kør sprøjtepumpen, og saml den udskårne prøve i snitrøret i en omtrentlig vinkel på 45° for at reducere skummende. Der udtages en prøve afhængigt af typen af behov for levedygtighedsanalyse eller downstream-analyse.
    1. Fjern forsigtigt sprøjten og nålen fra sprøjtepumpen, og brug en tang til at fjerne nålen fra sprøjten, og pas på ikke at røre ved nålen.
      BEMÆRK: Ikke-facetterede nåle kan bruges i flæng med skrånende nåle som en ekstra sikkerhedsforanstaltning.
  4. Træk den klippede affjedring tilbage i sprøjten, fastgør forsigtigt nålen igen ved hjælp af tænger, og læg den tilbage i sprøjtepumpen.
  5. Gentag trin 2.3 og 2.4, indtil celleaffjedringen har været udsat for det ønskede antal impulser fra FSS.
    BEMÆRK: For at vurdere cellernes evne til at modstå mekanisk destruktion fra FSS-eksponering udsættes celleaffjedringen typisk for 10 impulser af FSS. Det er dog blevet påvist, at celler begynder at gennemgå biologiske tilpasninger som reaktion på FSS efter 2 pulser24.

3. Måling af levedygtighed

BEMÆRK: Levedygtigheden kan vurderes ved hjælp af enzymatiske assays (luciferase, resazurin og WST-1), tælle intakte celler, flow cytometry eller ved clonogene assays.

  1. For alle målinger af levedygtighed, indsamle en prøve, før udsætter celler til FSS.
    1. For enzymatiske assays, tage dubletter 100 μL aliquots og læg dem i en 96-brønd plade.
    2. For flowcytometri skal du tage en 500 μL aliquot og placere den i et 1,5 mL rør.
    3. For clonogenic assay, indsamle en 100 μL aliquot.
  2. Enzymatisk analyse
    1. Der indsamles 100 μL prøver efter 1, 2, 4, 6, 8 og 10 impulser FSS-eksponering, og de anbringes i en 96-brøndsplade.
    2. Tilføj det ønskede substrat, og følg protokollen for den anvendte analyse:
      1. For resazurin tilsættes 20 μL af en 0,15 mg/mL opløsning til hver brønd. Der tilsættes 20 μL på 0,15 mg/mL resazurinopløsning til brønde, der indeholder 100 μL medium alene. Inkuber i 2 timer i en 37 °C vævskulturinkubator. Absorbansen måles ved hjælp af en pladelæser, der er i stand til at aflæse fluorescens (579 excitation / 584-emission).
      2. For luciferase-udtrykkende celler tilsættes 100 μL på 15 mg/mL D-luciferin til 5 mL medium. Der tilsættes 100 μL af opløsningen til hver brøndholdige celler. Vent i 5 minutter, og læs derefter pladen ved hjælp af en læser, der er kompatibel med luminescens.
      3. For WST-1 tilsættes 10 μL WST-1 til hver brønd, herunder brønde, der kun indeholder medium. Inkuber i 4 timer, og læs derefter absorbansen mellem 420 og 480 nm ved hjælp af en pladelæser.
    3. Sammenlign det gennemsnitlige signal fra hver af de FSS-eksponerede prøver med den gennemsnitlige statiske kontrolprøve for at opnå procentdelen af levedygtige celler.
  3. Strømning af cytomi24
    1. Der indsamles 500 μL prøver, og de anbringes i 1,5 mL centrifugerør efter 1, 2, 5 og 10 impulser fra FSS.
    2. Centrifugeprøver (500 × g i 3 min. ) og kassér supernatanterne.
    3. Pellets genbruges med 1 mL calcium- og magnesiumfri PBS, og prøverne centrifuges (300 × g i 3 min.).
    4. Pellets med 500 μL fluorescensaktiveret cellesorteringsbuffer (PBS med 0,5% serumalbumin af kvæg og 0,1% natriumazide) med tælleperler og membranuige eller levedygtighedsfarvningsfarver som propidium-iodide (1,75 μg/mL).
    5. Bestemmelse af levedygtigheden ved at sammenligne forholdet mellem levedygtige celler, normaliseret til tælleperler, i forskrevne prøver med forholdet mellem den statiske prøve.
  4. Clonogenic analyse
    1. Der udtages 100 μL af den statiske prøve, og der tilsættes 900 μL vækstmedium for at foretage en 1:10-fortynding.
    2. Der udtages 100 μL af den fortyndede prøve på 1:10, og der tilsættes 900 μL vækstmedium for at foretage en endelig fortynding på 1:100.
    3. Der tilsættes 100 μL af 1:100 fortyndingsprøven til hver af 3 brønde i en 6-brønds skål, der indeholder 2 mL vækstmedium.
    4. Gentag trin 3.4.1-3.4.3 med prøver, der har været udsat for 10 impulser af FSS.
    5. Lad cellerne vokse i 7-10 dage uden at ændre mediet, og kontroller for kolonidannelse. Når kolonier af ≥50 celler er dannet, indsug vækstmediet, skyl hver godt med 1 mL PBS, indsug PBS, og fix i 5 min ved hjælp af 1 mL iskold 70% ethanol (EtOH). Det er vigtigt, at rette både forskredne og statiske prøver på samme tid
    6. Efter fastgørelse af prøverne, aspirere EtOH, og tilsæt 1 til 2 ml krystal violet opløsning (0,1% krystal violet i 90% H2O, 10% EtOH) i 5 min.
    7. Skyl med et overskud af vand, og lad pladen tørre
    8. Tæl kolonierne (klynger af ≥50 celler) for både statiske og forskydede prøver. Sammenlign forholdet mellem det gennemsnitlige antal kolonier fra den forskrevne prøve med det gennemsnitlige antal kolonier fra den statiske prøve for at bestemme levedygtigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forhøjet resistens over for FSS-induceret mekanisk destruktion har tidligere vist sig at være en bevaret fænotype på tværs af flere kræftcellelinjer og kræftceller frisk isoleret fra tumorer i forhold til ikke-omdannede epitelcellekomparatorer15,24. Her blev yderligere kræftcellelinjer fra en række forskellige vævsoprindelser (tabel 2) testet for at påvise, at størstedelen af disse celler udviser levedygtighed ≥ 20% efter 10 impulser af FSS ved 250 μL/s. Den eneste undtagelse er MiaPaCa2 celler, som var relativt følsomme over for mekanisk ødelæggelse fra FSS (levedygtighed ≤ 10%). For at beskrive FSS-modstandsprofilen for en cellelinje på passende vis anbefales n ≥ 3 biologiske replikater.

Til sammenligning har alle de undersøgte ikke-transformerede epitelceller levedygtighed < 10% under disse forhold15,24. Således, mens der er et interval i FSS observeret resistens, de fleste af de kræft cellelinjer testet udviser større FSS modstand end ikke-transformerede celler. Kræft cellelinjer kan udledes af både primære tumor væv og metastaser. Man kunne postulere, at celler afledt af metastaser kan udvise større FSS-resistens, da denne fænotype kan være blevet valgt under metastatisk formidling. Imidlertid viste FSS-resistensniveauet sig ikke at afhænge af, om cellerne var afledt af primære tumorer eller metastaser15,24. Desuden korreleret niveauerne af FSS-resistens ikke med metastatisk potentiale i en række humane prostatakræftcellelinjer15.

For at teste dette yderligere blev balb/c bryst epitelceller med varierende metastatisk potentiale (4T1 = meget metastatisk, 4T07 = svagt til moderat metastatisk potentiale, 67NR = nej til lavt metastatisk potentiale25,26) anvendt. Dette eksperiment viste, at FSS-resistens ikke er korreleret med metastatisk potentiale (Figur 1). Desuden udviser både 4T1 og 4T07 celler et bifasisk tab af celle levedygtighed-et større tab af levedygtighed i pulser 1-2 end observeret i efterfølgende pulser. Dette er typisk for de fleste kræft cellelinjer undersøgt af denne gruppe. I modsætning hertil udviser 67NR et mere lineært tab af celle levedygtighed som en funktion af FSS. Samlet set viser dataene fra tabel 2 og figur 1, at FSS-modstand er en egenskab ved transformerede celler.

Figure 1
Figur 1:Væskeforskydningsspændingsresistens over for syngeneiske BALB/c bryst-epitelkræftceller. Celler blev eksponeret for FSS (30 G nål, 10 pulses@250 mL/s), og levedygtigheden blev målt ved hjælp af resazurinkonvertering (n = 4/cellelinje). Mens FSS-eksponering reducerede antallet af levedygtige celler (p < 0,0001, 2-vejs ANOVA), og hver cellelinje viste forskellige modstandsprofiler (p = 0,0446, 2-vejs ANOVA), var der ingen signifikant forskel mellem cellelinjer efter 10 impulser af FSS-eksponering (p = 0,2833, 2-vejs ANOVA). Forkortelser: FSS = væskeforskydningsstress; ANOVA = analyse af varians. Klik her for at se en større version af dette tal.

Forskydning (τ): væg (maksimum) minimum
Cellediameter: NIELSEN 10 μm 15 μm 20 μm
Nålemåler: 30 27 25 30 27 25 30 27 25 30 27 25
Strømningshastighed (μL/s) 20 507 220 116 32 10 4 48 16 7 64 21 9
50 1267 550 290 80 26 11 120 39 17 159 52 22
100 2534 1100 580 159 52 22 239 79 33 319 105 45
150 3801 1650 869 239 79 33 359 118 50 478 157 67
200 5068 2200 1159 319 105 45 478 157 67 637 210 89
250 6335 2750 1449 398 131 56 598 196 84 797 262 111

Tabel 1: Maksimal forskydningsbelastning (τvæg)niveauer. Tabellen viser de maksimale FSS-niveauer for vægF'er i dyn/cm2 for 30 G, 27 G og 25 G nåle ved strømningshastighederne 20, 50, 100, 150, 200 og 250 μL/s. Forskydningsspændingsniveauerne blev beregnet ved hjælp af Poiseuille-ligningen ( Equation 1 ), tilgængelige oplysninger om den indvendige diameter af hver nålemåler samt antagelsen om, at μ = 0,01 dyn·s/cm2. Mindste FSS-niveauer for hver størrelse blev beregnet ved hjælp Equation 2 af hvori r er celleradius, og R er nålens radius. Forkortelse: FSS = væskeforskydningsstress; τ = forskydning; τvæg = maksimal forskydning; μ = viskositet; Q = volumenstrøm.

Cellelinje Vævskilde Art Gennemsnitlig levedygtighed (%) efter 10 impulser
TRAMPC1 Prostata Mus 40
4T01 af 17. Bryst Mus 32
4T7 Bryst Mus 43
67NR Bryst Mus 46
66CL4 Bryst Mus 28
RTforst blevet Blære Menneskelig 62
W17-266-4 Melanom Menneskelig 46
HS852 Melanom Menneskelig 41
HS695 Melanom Menneskelig 41
A2058 Melanom Menneskelig 37
A375 Melanom Menneskelig 37
RPMI-7951 Melanom Menneskelig 35
SKMEL2 Melanom Menneskelig 29
A101D Melanom Menneskelig 28
MiaPaCa Pancreas Menneskelig 7

Tabel 2: Væskeforskydningsspændingsresistens for forskellige kræftcellelinjer. Hver kræftcellelinje blev udsat for væskeforskydningsstress fra sprøjte- og nålemodellen (30 G nål, 10 pulses@250 mL/s) (n ≥ 3/cellelinje), og levedygtigheden blev målt enten ved luciferaseaktivitet eller resazurinkonvertering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papir viser anvendelsen af FSS til kræftceller i suspension ved hjælp af en sprøjte og nål. Ved hjælp af denne model har kræftceller vist sig at være mere modstandsdygtige over for korte impulser af højt niveau FSS i forhold til ikke-transformerede epitelceller15,22,24. Desuden eksponering for FSS ved hjælp af denne model resulterer i en hurtig stigning i celle stivhed, aktivering af RhoA, og øget kortikale F-actin og myosin II-baserede kontraktilitet24,27. Hurtig mekanotilpasning (CTC'ernes evne til at blive mere eller mindre stiv afhængigt af omstændighederne) kan forhindre mekanisk ødelæggelse af CTC'er og lette andre aspekter af metastatisk kolonisering24,28. Faktisk er resultaterne foretaget ved hjælp af denne in vitro-model blevet bekræftet ved hjælp af eksperimentelle CTC'er i dyremodeller24. Denne hurtige mekano-tilpasning forklarer sandsynligvis det bifasede tab af celleleveevne, der typisk observeres i denne model (Figur 1), dvs. Samlet set indikerer dette, at FSS fremkalder hurtig cellestivning i kræftceller, der beskytter dem mod efterfølgende pulser af FSS.

Selv om RhoA-actomyosin aksen er en vigtig drivkraft for FSS modstand15,21,24, der er sandsynligvis andre mekanismer involveret29. Yderligere beviser for, at cellestivhed er en vigtig determinant for FSS-resistens, er, at forstyrrelse af lamin A, som styrer kernens strukturelle integritet- den stiveste komponent i cellen, reducerer FSS-resistens i kræftceller ved hjælp af denne model22. Vi bruger denne model til at sonde mekanismerne i FSS resistens i kræftceller yderligere. Her er denne model blevet brugt til at måle kapaciteten af forskellige kræftcellelinjer til at modstå mekanisk ødelæggelse ved at udsætte celler for korte impulser af høje niveauer af FSS. Selv om dette er en relativt billig, enkel model til at udvikle sig i laboratoriet, med det dyreste element er sprøjten pumpen, skal man sørge for at følge protokollen trofast for at opnå reproducerbare resultater. Flere impulser af FSS kan anvendes på celler i en meget kort tid, <10min. Den samlede forløbne tid for eksperimentet afhænger af suspensionsvolumen, strømningshastighed, pulsnummer og fingerfærdigheden hos den bruger, der overfører suspensionen mellem impulser. Med erfaring kan en 5 mL suspension udsat for FSS med en 30 G nål i 10 pulses@250 μL/s behandles på ~10 min. For de fleste cellelinjer er der minimalt tab af levedygtighed på grund af at blive holdt i suspension i denne periode.

Da eksponeringen for FSS sker relativt hurtigt, anvendes FSS typisk på celleaffjedringer i serumfrit medium for at reducere skumning af prøverne. Forskellen i viskositet mellem 0-10% føtalt kvægserum er ubetydelig i denne analyse. Det er dog afgørende at sikre fysiologiske niveauer af calcium i det medium, hvor cellerne er skåret. Med hensyn til metoderne til celleafkobling før FSS-eksponering blev der desuden ikke påvist nogen forskel i FSS-resistens i PC-3-celleaffjedring tilberedt ved trypsinisering eller behandling med ikke-enzymatiske dissociationsmidler15. Cellekoncentrationen kan være større eller mindre end 5 × 105 celler/mL afhængigt af downstream-applikationsbehovet. Reaktionen af PC-3 prostatakræft celler er ens i et interval fra 5 × 104 til 5 × 105,15. Virkningerne af cellekoncentrationen på levedygtigheden efter FSS-eksponeringen bør dog bestemmes empirisk.

For de fleste applikationer, der er forestillet med dyrkede celler, bør celletæthed ikke påvirke viskositeten og dermed mængden af FSS, der anvendes. Variabler, såsom den tid, hvor cellerne holdes i suspension før FSS-eksponering, bør holdes konstante på tværs af eksperimentelle replikater. Som nævnt ovenfor er nåleintegritet også kritisk. Parti variationer er blevet bemærket i nåle med hensyn til denne analyse over tid. Hypodermiske nåle blev designet til klinisk brug, ikke til de flowhastigheder, der anvendes her. I sjældne tilfælde kan nålens hub delvist okkluderes, hvilket under efterfølgende impulser omfatter passagen af suspension gennem nålen og i sidste ende tilbagestrømningen omkring sprøjtedysten. Desuden er det meget vigtigt at forstå, at døde / døende celler er usædvanligt følsomme over for FSS, som vist tidligere24. Derfor, hvis en bestemt cellelinje har et højt niveau af døende celler, enten som en rutinemæssig egenskab eller eksperimentelle manipulationer (f.eks. lægemiddelbehandlinger), vil dette resultere i et meget stejlt tab af celle levedygtighed, der måske ikke er helt normaliseret i forhold til den statiske kontrol.

Anvendelsen af FSS kan parres med andre assays, såsom immunfluorescens, pulldown assays, og vestlige blotting, at studere effekten af FSS på kræft cellebiologi 24. I princippet kan denne model også bruges til at undersøge virkningerne af højt niveau, kort varighed FSS på andre celletyper, herunder blodlegemer. Normale røde blodlegemer og leukocytter er meget mere modstandsdygtige over for FSS anvendt på denne måde end selv kræftceller, som står til at ræsonnere fysiologisk15. Faktisk er niveauet af FSS anvendt, ved hjælp af en 30 G 1 / 2 "nål ved en strømningshastighed på 250 mL / s, beslag det område, der kræves for afbrydelse af den røde cellemembran (baseret på millisekund anvendelse af kraft)30,31. En begrænsning af denne model, eller enhver, der involverer passerer væske gennem en kanal, er, at det præcise niveau af FSS, at cellerne oplever inden for området fra den maksimale væg forskydning stress og minimum i midten af kanalen er ikke kendt. Således oplever alle cellerne ved hver puls ikke det samme niveau af FSS, og over gentagne impulser forventes individuelle celler at opleve forskellige niveauer af FSS ved hver puls inden for det angivne interval.

Hydrodynamisk fokusering under de forhold, der er anvendt i denne model, resulterer imidlertid i, at cellerne rettes mod midten af strømmen, væk fra væggen og dermed mod lavere FSS-eksponering32. Andre modeller, såsom kegle- og pladevisometer eller Couette-kamre, er bedre egnet til anvendelse af FSS i konstante niveauer på en celleaffjedring. Som nævnt ovenfor er det fortsat udfordrende at modellere FSS-eksponering af CTC'er in vitro. Denne model er bedst egnet til at teste virkningerne af høj, men kort, eksponering for FSS som kan ske gennemkører hjertet. Flow gennem arterier og vener resulterer i længere eksponering for lavere niveauer af FSS. Som nævnt er det imidlertid uklart, hvor længe CTC'erne forbliver i kontinuerlig strøm i cirkulationen, og de fleste eksperimentelle beviser til dato er i overensstemmelse med korte perioder (sekunder) af frit flow præget af længere perioder med fastklemning i mikrocirkulationen.

Modeller, der udsætter kræftceller i suspension til lavere niveauer af FSS (0,5-60 dyn/cm2)i længere varigheder (minutter til dage) omfatter kegle- og pladevisometer, Couette-kamre, kontinuerlige flowsløjfer, sprøjte med rørudvidelse og mikrofluidiske enheder33,34,35,36,37. Disse er også blevet brugt til at få indsigt i, hvordan FSS kan påvirke CTCs og har ført til konstateringen af, at eksponering for FSS øger oxidativ stress, cellespredning og invasion, og stamcelle-lignende egenskaber i forskellige kræft cellelinjer. Det bliver interessant at sammenligne resultater fra disse modeller med den, der er beskrevet her. For eksempel fandt Xin et al. ved hjælp af en kontinuerlig flow loop-model, at ROCK-actomyosin-aksen fremmede et tab af celle levedygtighed i kræftcellelinjer udsat for FSS (20 dyn / cm2)i 2-12 timer i skarp kontrast til de data, der er beskrevetovenfor 38. Således biologiske sammenhæng er meget sandsynligt, at sagen for alle disse in vitro modeller, styrke behovet for at omsætte resultaterne om CTCs i in vivo modeller og i sidste ende, kræftpatienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MDH er medstifter, president og aktionær i SynderBio, Inc. DLM er konsulent for SynderBio, Inc.

Acknowledgments

Udviklingen af den model, der demonstreres her, blev støttet af DOD-tilskud W81XWH-12-1-0163, NIH-tilskud R21 CA179981 og R21 CA196202 og Sato Metastasis Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Gibco 25200-056
14 mL round bottom tubes Falcon - Corning 352059
30 G 1/2" Needle BD 305106
5 mL syringe BD 309646
96-well black bottom plate Costar - Corning 3915
Bioluminescence detector AMI AMI HTX
BSA, Fraction V Sigma 10735086001
Cell Titer Blue Promega G8081
crystal violet Sigma C0775
D-luciferin GoldBio D-LUCK
DMEM Gibco 11965-092
FBS Atlanta Biologicals S11150
PBS Gibco 10010023
Plate Reader BioTek Synergy HT
Sodium Azide (NaN3) Sigma S2002
Syringe Pump Harvard Apparatus 70-3005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Strilic, B., Offermanns, S. Intravascular survival and extravasation of tumor cells. Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).
  4. Labelle, M., Hynes, R. O. The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination. Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).
  5. Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
  6. Weiss, L. Metastatic inefficiency. Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).
  7. Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor. Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).
  8. Fidler, I. J. Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine. Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).
  9. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  10. Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).
  11. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  12. Takagi, H., et al. Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types. International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031 (2020).
  13. Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. Unifying metastasis--integrating intravasation, circulation and end-organ colonization. Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells. PLoS One. 7 (12), 50973 (2012).
  16. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  17. Brass, L. F., Diamond, S. L. Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).
  18. Stein, P. D., Sabbah, H. N. Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves. Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).
  19. Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis. The American Journal of Physiology. 265 (5), Pt 2 1787-1796 (1993).
  20. Chalmers, J. J. Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about. Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).
  21. Vennin, C., et al. Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis. Science Translational Medicine. 9 (384), 126 (2017).
  22. Mitchell, M. J., et al. Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).
  23. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).
  24. Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
  25. Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines. British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).
  26. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399 (1992).
  27. Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study. Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).
  28. Gensbittel, V., et al. Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis. Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).
  29. O'Leary, B. R., et al. Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism. Scientific Reports. 10 (1), 17649 (2020).
  30. Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. Hemolysis near a transversely oscillating wire. Science. 169 (3948), 871-873 (1970).
  31. Rooney, J. A. Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble. Science. 169 (3948), 869-871 (1970).
  32. Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions. Scientific Reports. 10 (1), 1711 (2020).
  33. Brooks, D. E. The biorheology of tumor cells. Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).
  34. Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition. Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).
  35. Fan, R., et al. Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells. Scientific Reports. 6, 27073 (2016).
  36. Fu, A., et al. High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin. Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).
  37. Li, S., et al. Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).
  38. Xin, Y., et al. Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow. Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).

Tags

Kræftforskning Udsendelse 170
Modellering virkningerne af hæmodynamisk stress på cirkulerende tumorceller ved hjælp af en sprøjte og nål
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moose, D. L., Williams-Perez, S.,… More

Moose, D. L., Williams-Perez, S., Cafun, R., Krog, B. L., Henry, M. D. Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle. J. Vis. Exp. (170), e62478, doi:10.3791/62478 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter