Summary
这里描述的方案概述了一种快速有效的方法来测量针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体，方法是评估恢复期血清样品通过增强型绿色荧光蛋白标记的水泡性口炎病毒抑制感染的能力。
Abstract
随着由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的COVID-19大流行的不断发展，很明显，针对该病毒的中和抗体的存在可以提供针对未来感染的保护。因此，随着有效的COVID-19疫苗的创建和转化以前所未有的速度继续，开发快速有效的方法来测量针对SARS-CoV-2的中和抗体对于确定先前感染者和免疫个体的长期感染保护将变得越来越重要。本文介绍了一种高通量方案，该方案使用与SARS-CoV-2刺突蛋白假型的水泡性口炎病毒（VSV）来测量最近从COVID-19中康复的患者的恢复期血清中是否存在中和抗体。使用复制伪型病毒消除了SARS-CoV-2处理所需的3级收容设施的必要性，使几乎任何收容2级实验室都可以访问该协议。使用96孔格式允许同时运行许多样品，周转时间短至24小时。
Introduction
2019年12月，发现了一种新型冠状病毒，我们现在将其称为SARS-CoV-2，这是2019年冠状病毒病（COVID-19）的病原体1。SARS-CoV-2是一种属于 冠状病毒科 的β冠状病毒。这些包膜病毒组成了一个大的阳性感觉RNA基因组，负责人类和动物的呼吸道和肠道感染2。截至 2021 年 5 月，全球已报告超过 1.57 亿例 COVID-19 病例，超过 320 万人死亡3。开发有效的疫苗已成为全球研究人员的主要目标，至少有77种临床前疫苗正在研究中，90种目前正在进行临床试验4。
冠状病毒编码四种结构蛋白，包括刺突蛋白（S），核衣壳（N），包膜蛋白（E）和膜蛋白（M）。SARS-CoV-2的进入需要S的受体结合域（RBD）与宿主受体，人血管紧张素转换酶2（hACE2）的相互作用，以及随后的膜融合，随后通过宿主细胞丝氨酸蛋白酶，跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）5，6，7，8，9，10.SARS-CoV的S蛋白的体液免疫优势以前已有报道，现在也被证明用于SARS-CoV-2 11，12，13。事实上，在感染24个月后，在SARS-CoV患者的恢复期血清中检测到针对S的中和抗体反应14，突出了它们在长期免疫反应中的关键作用。S蛋白已被确定为一种有前途的疫苗靶标，因此已成为大多数正在开发的疫苗的关键成分15，16。
虽然快速检测中和抗体是疫苗开发的一个关键方面，但它也可能揭示受影响地区的感染率和血清流行病学监测17。Whelan及其同事捐赠了一种具有复制能力的VSV假型，用SARS-CoV-2 S糖蛋白代替野生型VSV糖蛋白，在生物安全2级环境中研究SARS-CoV-2感染18。VSV表达尖峰（VSV-S）将用于确定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体反应。由于这里使用的VSV-S也表达增强的绿色荧光蛋白（eGFP），因此可以在24小时内检测到eGFP病灶以量化感染，而斑块形成可能需要48至72小时。这里总结的是一个简单有效的方案，用于确定恢复期患者血清中和VSV-S-eGFP感染的能力。这种方法也可以很容易地适应于询问其他潜在的治疗方法，这些疗法旨在破坏SARS-CoV-2 S蛋白的宿主 - 病毒相互作用。
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Protocol
1. 用于SARS-CoV-2假病毒生产和定量的电镀细胞（第1天）
- 组织培养的准备
- 温热的1倍杜尔贝克磷酸盐缓冲盐水（DPBS）;Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（可选）;和0.25%胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）在水浴中至37°C约15分钟。
- 用70%乙醇消毒组织培养罩，并根据需要将组织培养皿，巴斯德移液器和血清学移液器放入组织培养罩中。从水浴中取出PBS，DMEM和胰蛋白酶，并在放入组织培养罩之前用70%乙醇消毒。
- 电镀和维持电池
- 在T75组织培养瓶中的DMEM（含有10%FBS）中培养Vero E6细胞，或在37°C培养皿中培养15cm组织培养皿，其中CO为5%2。当细胞汇合80-90%时，根据需要传代细胞。
- 通过向每个培养皿中加入10 mL的1x PBS并轻轻摇动4-5次来洗涤细胞;吸出 PBS。在每个培养皿中加入3毫升胰蛋白酶-EDTA，摇动盘子以确保整个表面被覆盖。将细胞在37°C下用5%CO2 孵育约5分钟，或直到细胞分离。
- 加入7mL DMEM（含有10%FBS）以停用胰蛋白酶，并通过上下移液几次来重悬细胞。使用台式离心机以500×g离心5分钟旋转细胞以除去胰蛋白酶，吸出培养基而不干扰细胞沉淀，并将细胞重悬于10mL DMEM（含有10%FBS）中。如果未来的实验需要细胞，将1 mL放入含有15 mL新鲜DMEM（含有10%FBS）的新培养皿中。
- 使用自动细胞计数器或血细胞计数器计数细胞，并向每个15厘米板中加入约1×107 个细胞，并在37°C下孵育5%CO2 直到它们100%汇合（1-2天）。
2. VSV-S-EGFP假病毒制备
- 感染
- 在 12 mL 无血清 DMEM 中，在 37 °C 下用 VSV-S-eGFP 储备病毒在 5% CO 2 下以 5% CO 2 感染多重感染 （MOI）0.01 感染细胞 1 小时，偶尔摇晃板。用新鲜的DMEM（含有2%FBS和20mM HEPES，pH 7.7）代替接种物，并移至设置为34°C，CO2的培养箱。
注意：在细胞培养中VSV-S-eGFP的繁殖需要34°C的温度。 - 在感染后约 48 小时观察广泛细胞病变效应 （CPE） 和细胞脱离后收集细胞上清液。使用荧光显微镜从感染后24小时开始可视化受感染细胞对eGFP的广泛表达。
- 在 12 mL 无血清 DMEM 中，在 37 °C 下用 VSV-S-eGFP 储备病毒在 5% CO 2 下以 5% CO 2 感染多重感染 （MOI）0.01 感染细胞 1 小时，偶尔摇晃板。用新鲜的DMEM（含有2%FBS和20mM HEPES，pH 7.7）代替接种物，并移至设置为34°C，CO2的培养箱。
- 收集
- 使用台式离心机在4°C下以1，000×g离心上清液5分钟以除去细胞碎片。 等分上清液以避免多次冻融循环，并储存在-80°C。
3. 滴定VSV-S-eGFP假病毒
- 连续稀释以确定病毒滴度
- 在DMEM（具有10%FBS）中以每孔6×105 个细胞的接种密度将Vero E6细胞放在6孔板上，并在37°C下孵育过夜，其中5%CO2。
注意：也可以使用过表达TMPRSS2和hACE2的Vero细胞。 - 通过将900μL培养基置于七个微量离心管中，在无感冒血清DMEM中建立10倍连续稀释系列VSV-S-eGFP病毒。从1到7标记管。将100μL病毒储备加入第一管并短暂涡旋。将100μL稀释的病毒从管1转移到管2并短暂涡旋;继续直到管7。
- 从含有Vero E6细胞的6孔板的所有孔中吸出培养基，并用500μL稀释液10-2 至10-7替换。将板在37°C下用5%CO2孵育45分钟，每15分钟轻轻摇动一次。
- 吸出接种物并用含有2x DMEM和6%羧甲基纤维素（CMC）的1：1混合物，终浓度为3%CMC，补充10%FBS的覆盖物替换;在34°C下用5%CO2 孵育48小时。
注意：在感染步骤期间，在37°C水浴中预热覆盖层混合物15分钟。1%琼脂糖与2倍DMEM的1：1混合物，辅以10%FBS代替CMC。要与琼脂糖叠加，煮沸1%琼脂糖（在dH2O中），并与冷的2x DMEM混合。在加入到电池单层（约37-40°C）之前，请确保混合物具有合适的温度。如果使用琼脂糖作为覆盖物，则必须在染色前将细胞在2mL 3：1甲醇：乙酸中孵育至少一小时来固定细胞。
- 在DMEM（具有10%FBS）中以每孔6×105 个细胞的接种密度将Vero E6细胞放在6孔板上，并在37°C下孵育过夜，其中5%CO2。
- 染色和计算病毒滴度
- 通过用晶体紫染色或在荧光显微镜下直接可视化eGFP来可视化斑块。
- 要染色板，吸出覆盖层，用PBS洗涤一次，然后向每个孔中加入2mL的0.1%结晶紫（在80%甲醇和dH 2O中）。在去污之前，在室温下放置在板摇臂上约20分钟。除去结晶紫，并使用dH2O或PBS轻轻清洗每孔两次。
注意：洗涤和染色步骤应通过向每个孔的侧面缓慢移液来轻轻地进行，以确保细胞单层在整个过程中保持完整。 - 在计数斑块之前，让板干燥至少1小时。确保从含有20至200个斑块的孔中获得斑块计数。为了计算每mL的斑块形成单位（PFU）中的病毒滴度，将孔的稀释因子与感染体积相乘，并将该数字从相应孔中存在的斑块中除以。
4. 用于测量市售抗体和恢复期患者血清中和SARS-CoV-2假病毒的电镀细胞（第1天）
- 组织培养的准备
- 按照第1节所述准备培养基和组织培养罩。此外，准备必要数量的96孔板，以容纳每个样品至少2次重复（即，每6个样品1个板）;如果样品体积允许，则添加其他重复项。
- 电镀和维持电池
- 生长和维护Vero E6细胞，如第1节所述。每96孔板制备至少10 mL细胞悬浮液，浓度为每mL2×105 个细胞（板1.5×105 个细胞，用于48小时后进行的测定，如果需要）。使用多通道移液器向96孔板的每个孔中加入100μL细胞悬浮液，并在37°C下孵育24小时，其中5%CO2。
注意：充分混合细胞悬浮液，并在各个方向上轻轻摇动每个板，以确保细胞均匀分布。
- 生长和维护Vero E6细胞，如第1节所述。每96孔板制备至少10 mL细胞悬浮液，浓度为每mL2×105 个细胞（板1.5×105 个细胞，用于48小时后进行的测定，如果需要）。使用多通道移液器向96孔板的每个孔中加入100μL细胞悬浮液，并在37°C下孵育24小时，其中5%CO2。
5. 抗体或血清稀释和感染（第2天）
注意：该协议可用于测量市售抗体和患者血清以及从动物中收集的用于临床前疫苗开发研究的血清对VSV-S-eGFP的中和作用。*请注意处理患者/动物血清样本时列出的其他步骤。
- 系列稀释系列
- 在稀释血清样品之前，在56°C水浴中热灭活每个样品30分钟以灭活补体。确保在处理患者样本时采取必要的安全预防措施;在组织培养罩中时，仅打开样品容器，并确保佩戴适当的2级个人防护装备。
- 在空的96孔板（板1）中设置稀释系列。
- *对于患者样品，通过将8μL血清放入72μL无血清DMEM（含1%青霉素/链霉素）中，在1/10开始稀释系列。
注意：所用中和抗体的浓度将取决于制造商预测的活性。对于此处使用的SARS-CoV-2尖峰中和抗体（见 材料表），从5μg/ mL开始，以观察至少50%的中和。 - 将40μL无血清DMEM（含1%青霉素/链霉素）加入B至G行，80μL至H行。不要将病毒添加到 H 行，因为它可用作仅单元格对照。
- 使用12孔多通道移液器，混合并将40μL稀释的血清或抗体从A行转移到B行。混合并重复直到F行，从F行丢弃40μL。不要将血清添加到G行，因为它代表仅病毒对照行。
- 感染和覆盖
- 准备适当体积的稀释VSV-S-eGFP，以MOI 0.05（或2000 pfu）处理每个孔。（完成此计算时，请记住，总80μL体积中只有60μL将移动到细胞上;因此，请确保将病毒体积乘以1.33以保持2000 pfu）。
注意：由于VSV-S-eGFP对温度敏感，因此请确保病毒储备在不使用时保持在冰上，并避免多次冻融循环，因为重复冷冻后滴度会有所不同。 - 向板1的A至G行中的每个孔中加入40μL稀释的病毒，并通过上下移液4-5次进行混合。将板在37°C下孵育1小时，其中5%CO2。
- 从培养箱中取出含有细胞的板（板2），并小心地从所有孔中吸出培养基。将60μL抗体/病毒混合物从板1转移到板2，并在37°C下用5%CO2孵育1小时，每20分钟摇动板。
- 用DMEM中含有CMC的140μL覆盖物在每个孔中充注，最终浓度为3%CMC（含10%FBS和1%青霉素/链霉素）。在成像前将板2置于设置为34°C且具有5%CO2 的培养箱中约24小时。
注意：在感染步骤期间，在37°C水浴中预热覆盖层混合物15分钟。
- 准备适当体积的稀释VSV-S-eGFP，以MOI 0.05（或2000 pfu）处理每个孔。（完成此计算时，请记住，总80μL体积中只有60μL将移动到细胞上;因此，请确保将病毒体积乘以1.33以保持2000 pfu）。
6. 成像和定量（第3天）
- 使用自动荧光成像仪（使用荧光素异硫氰酸酯（FITC）滤光片或激发波长为488nm的替代滤光片）的成像板。通过创建自动识别和计数单个 eGFP 病灶的协议来量化病毒感染。如果自动计数功能不可用，请使用 ImageJ 软件量化 eGFP 病灶的数量。
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Representative Results
该协议概述了一种通过抑制VSV-S-eGFP假病毒感染（可通过检测到的eGFP病灶的丧失来量化）来检测针对SARS-CoV-2 S蛋白的中和抗体的快速有效方法。该协议的原理图如图 1所示。建议每次运行检测时使用市售抗体作为阳性对照，以确保测定的一致性。在这里，我们展示了与IgG对照相比，使用市售的中和IgG抗体对抗SARS-CoV-2 Spike RBD的稀释曲线（有关两种抗体的详细信息，请参见 材料表 ; 图 2）。
在SARS-CoV-2感染后约三个月收集恢复期患者样本，并使用上述方法测定假病毒中和（图3）。重要的是，使用健康的供体血清观察到最小的背景抑制。此外，值得注意的是，该测定根据住院治疗的需要区分症状严重程度高的患者和病情较轻的患者。与其他报告一致，我们在小型队列中观察到，住院患者往往比不需要住院的患者表现出更高的中和能力19，20。虽然住院和非住院患者样本可能并不总是如此，但该测定区分不同程度的中和的能力是一种资产。也可能存在患者血清的中和能力远高于此处证明的情况。如有必要，可以调整患者血清的起始稀释，或者可以在额外的板上进行额外的稀释步骤。
图1：方案大纲显示恢复期血清对VSV-S-eGFP的中和作用。 缩写： VSV = 水疱性口炎病毒;eGFP = 增强型绿色荧光蛋白;COVID-19 = 冠状病毒病。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：市售的针对SARS-CoV-2的中和抗体已被用作阳性对照的一个例子，与IgG一起作为阴性对照。 中和抗体抑制病毒感染的能力会有所不同;请参阅所购买的特异性抗体的可用信息，以确定开始稀释曲线的浓度（样品一式三份运行，误差线表示±SD）。（A）抑制百分比是根据通过（B）荧光成像检测到的eGFP病灶的数量计算的。缩写：SARS-CoV-2 =严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2;IgG = 免疫球蛋白;SD = 标准偏差;eGFP = 增强型绿色荧光蛋白;RBD = 受体结合结构域。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：患者恢复期血清中和VSV-S-eGFP的能力因症状的严重程度而异。 在SARS-CoV-2感染后约3个月收集患者血清样本，并从未感染患者中收集对照样本（样本一式三份，误差线代表±SD）。（A）抑制百分比是根据通过（B）荧光成像检测到的eGFP病灶的数量计算的。缩写：SARS-CoV-2 =严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2;SD = 标准偏差;eGFP = 增强型绿色荧光蛋白。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
此处描述的方法可以根据需要进行调整，以适应不同的实验室环境和资源。重要的是，该协议的主要局限性是需要2级密封空间和组织培养罩。应用具有SARS-CoV-2尖峰的复制RNA病毒假型，如VSV-S-eGFP，是SARS-CoV-2病毒的强大替代品，SARS-CoV-2病毒需要3级工作区域，但对于某些群体来说可能仍然是一个限制。此处描述的所有其他步骤都非常灵活，几乎可以在任何2级密闭实验室中执行。例如，不需要使用具有自动计数功能的荧光成像仪。这里使用的96孔格式意味着只需要大约4个视野就可以使用可用的最低物镜（2x）对几乎整个孔进行成像。
手动荧光显微镜可用于对每个孔的多个场进行成像，然后可以使用ImageJ（免费软件）来量化eGFP病灶。此外，我们选择使用96孔格式，以尽可能低的血清量，并将耗材使用量保持在最低限度。如果没有荧光显微镜，该方案可以放大到6孔或12孔格式，以检测晶体紫固定和染色后的斑块形成（类似于上述病毒滴度方案）。执行此协议时要记住的最关键的考虑因素是VSV-S-eGFP的温度灵敏度。使用VSV-S-eGFP时，应始终将病毒等分成小体积，以避免多次冻融循环，并尽可能将病毒保持在冰上。此外，24小时后可以检测到稳定的荧光信号;然而，我们在感染后20至28小时的成像后获得了类似的结果。
有几种方法可以检测针对SARS-CoV-2的抗体的存在，包括金标准酶联免疫吸附测定（ELISA）测定，该测定可量化针对S21，22的抗体总量。在这里，我们概述了一种快速可靠的方法，用于特异性检测针对患者恢复期血清中免疫优势SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体。我们通过成功适应96孔格式改进了经典的斑块减少中和测试（PRNT），该测试允许通过自动定量假病毒感染在24小时内检测大量样品中的中和抗体，从而允许快速周转最终数据报告。除了检测血清中的中和抗体外，该方法还可用于对其他治疗策略进行高通量筛选，这些策略旨在直接抑制SARS-CoV-2刺突蛋白与hACE2的相互作用，例如单克隆抗体，重组可溶性hACE2或蛋白酶抑制剂，以阻止病毒进入23.随着几种SARS-CoV-2刺突蛋白变体的出现，同样重要的是要注意，该方法可用于确定在感染病毒24的不同变体后是否发生类似的中和水平。
检测针对SARS-CoV-2的抗体的其他可用方法的例子包括ELISA，基于慢病毒的测定和用于评估血清样品中和能力的商业试剂盒。虽然常用的IgM或IgG结合ELISA是确定是否存在抗体浓度以跟踪先前感染或免疫的有效方法，但它们无法区分结合抗体的中和能力25。基于慢病毒的假型中和测定通过使用非复制性病毒颗粒而不是复制VSV-S-eGFP，具有更高的安全性;然而，这在测试能力方面造成了障碍，因为慢病毒滴度往往要低得多26，27。有几种市售试剂盒可测量抗体在与恢复期血清（例如，CUSABIO、GenScript、Abnova）孵育后，通过竞争性抑制SARS-CoV-2刺突蛋白（特别是RBD）与hACE2受体结合来阻断感染的能力。虽然这些试剂盒中有许多具有良好的灵敏度和特异性，但它们也往往相对昂贵，因此不适合大量样品。此处提供的协议快速、可靠且价格低廉。这种高通量方法可用于测试许多样品，在24小时内实现可靠的读数。
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Disclosures
作者与本出版物没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们要感谢惠兰实验室慷慨地提供了该协议中使用的VSV-S-eGFP病毒（在Case et al. 2020中描述）。我们还感谢Bill Cameron博士和Juthaporn Cowan博士（以及团队）收集患者血液样本（REB协议ID 20200371-01H）。作者披露了对本文的研究，作者身份和/或发表的以下财务支持：这项工作由渥太华医院基金会的慷慨支持和加拿大卫生研究院（#448323）的赠款以及Thistledown COVID-19科学基金会向C.S.I.T.R.J.的快速资助资助，由安大略省研究生奖学金和集群Mitacs奖学金资助。JP由集群Mitacs奖学金资助。T.A.由CIHR Banting奖学金资助。我们还要感谢所有参与并为这项研究捐献血液样本的个人。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
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