Summary
本协议对区分人类牙浆干细胞（hDPSC）与 体外胰腺谱系的两种不同的诱导协议进行了比较：综合协议和非综合协议。综合协议产生更多的胰岛素产生细胞（IPCs）。
Abstract
截至2000年，使用埃德蒙顿协议治疗I型糖尿病胰岛移植的成功仍然面临一些障碍。其中包括数量有限的尸体胰腺捐献者和免疫抑制剂的长期使用。默森奇马尔干细胞（MSCs）被认为是胰岛细胞生成的替代来源的潜在候选者。我们以前的报告成功地说明了建立诱导协议，将人类牙髓干细胞（hDPSC）与胰岛素生成细胞（IPCs）区分。然而，上岗效率差别很大。本文通过综合（微环境和遗传操作）和非集成（微环境操作）诱导协议，演示了通过综合（微环境和遗传操作）来提供 hDPSC 衍生 IPC （hDPSC-IPCs） 的 hDPSC 胰腺感应效率的比较。结果表明，在多剂量葡萄糖挑战下，在三维菌落结构、产量、胰腺mRNA标记和功能特性方面，诱导方法具有明显的感应效率。这些发现将支持未来建立一个临床适用的IPC和胰腺血统生产平台。
Introduction
糖尿病是一个持续的全球关注。国际糖尿病联合会（IDF）的一份报告估计，全球糖尿病患病率将从2000年的1.51亿增加到2015年的4.15亿。最新的流行病学研究预测，全球糖尿病患病率将从2017年的4.51亿增加到2045年的6.93亿。胰岛移植利用埃德蒙顿协议的成功首次证明在2000年，当它被证明保持内源性胰岛素生产和稳定规范的血糖状况在I型糖尿病患者3。然而，埃德蒙顿协议的应用仍然面临瓶颈问题。尸体胰腺捐献者数量有限是主要问题，因为每个I型糖尿病患者至少需要2-4个小岛捐赠者。此外，长期使用免疫抑制剂可能会导致危及生命的副作用4，5。为了解决这个问题，在过去十年中，糖尿病的潜在疗法的开发主要侧重于从各种来源的干细胞6中产生有效的胰岛素生成细胞（IPCs）。
干细胞成为许多疾病的替代疗法，包括糖尿病I型，这是由β细胞的损失引起的。IPC移植是控制这些患者血糖的新方法。本文介绍了生成 IPC 的两种方法，即集成和非集成感应协议。诱导协议模仿自然胰腺发育过程，使成熟和功能IPC8，9。
在这项研究中，hDPSC的特点是MSC表面标记检测的流细胞学，多系分分潜力，和RT-qPCR，以确定干性特性和增殖基因标记（未显示的数据）8，9，10的表达。hDPSC被诱导走向明确的内皮，胰腺内皮，胰腺内分泌，胰腺β细胞或IPC（图1），分别7。为了诱导细胞，使用三步感应方法作为骨干协议。此协议称为非综合协议。在综合协议中，基本胰腺转录因子PDX1在 hDPSC 中表达过度，然后使用三步分化协议在 hDPSC 中引入过度表达PDX1。 非集成协议和集成协议之间的区别在于PDX1在集成协议中过度表达，而不是在非集成协议中过度表达。在这项研究中，胰腺分化被比较为综合和非综合协议。
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Protocol
这项工作是根据《赫尔辛基宣言》进行的，并经朱拉隆功大学牙科学院人类研究伦理委员会批准。由于智齿问题，人类DPC（hDPSC）从从前摩尔和摩尔中提取的人类牙浆组织中被分离出来。根据批准的协议（HREC-DCU 2018/054）从患者那里获得知情同意。
1. 综合上岗协议
- 携带PDX1的扁豆载体的准备
- 使用人类胚胎肾（HEK）293FT细胞进行病毒包装。培养和维持这些细胞在杜尔贝科的改良鹰介质 （DMEM） 补充 10% 胎儿牛血清 （FBS）， 1% L-谷氨酰胺， 和 1% 抗生素抗菌剂.
- 使用磷酸钙转染系统（如psPAX2、pMD2）将每包10微克的包装和包络质粒和20微克的靶向基因质粒共同转化为 HEK293FT 细胞，生成PDX1-伦蒂病毒载体。 G，和人类pWPT-PDX111。确保细胞在感染期间是 80%-90% 的汇流。
- 转染后，在 48 小时和 72 小时收集含有扁豆颗粒的介质。
- 通过 0.45 μm 过滤器过滤收集的介质;在 100 kDa 名义分子重量截止 （NMWCO） 下用离心过滤器将病毒集中。
- PDX1 过度表达
- 使用 70-80% 汇合的 3-5 hDPSC 通道。使用细胞计数器尝试和计数细胞。种子 1 x 106 hDPSC 到 60 毫米组织培养处理盘上，并在一夜之间孵育。
- 24小时后，加入从第1.1.4步获得的新鲜病毒颗粒，在所需的感染倍数（MOI）中转录多啤酒酯预处理细胞（4微克/mL多布伦，30分钟低于37°C和5%CO2）。例如，在这种情况下，使用的 MOI 是 20。在 37 °C 时将细胞保持在细胞培养孵化器中的细胞 24 小时，并保持 5% CO2。
- 24小时感染期后，丢弃含有病毒颗粒的介质。添加新鲜的培养基，并继续生长48小时的细胞。所有文化都保持在37°C和5%CO2。
- 在进入感应步骤之前，检查转染细胞的聚合形态。PDX1转导通过基因表达分析得到证实（补充图1）。
注意：在进入下一步之前，请在显微镜下检查细胞形态。 - 收获并进入三步感应协议（第 1.3 步），作为微环境诱导方法。
- 三步上岗协议
注：三步诱导协议导致hDPSC的胰腺分化系列，以确定内皮、胰腺内分泌/内分泌和胰腺β细胞/IPC分别使用无血清介质（SFM）-A、SFM-B和SFM-C。- 丢弃培养基，然后用 1 倍磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 清洗转导的 hDPSC。
- 在细胞中加入0.25%的试用蛋白-EDTA溶液，在37°C、5%CO2下孵育1分钟。
- 添加培养介质，以阻止试金素活性，并轻轻地冲洗细胞，以获得单细胞悬浮。将细胞和阿利库特 1 x 106 细胞数入每个收集管中。
- 以 468 x g（ 相对离心力：RCF）离心细胞悬架为 4 °C，为 5 分钟。丢弃超高超，保存细胞颗粒。
- 将颗粒重新填充到第一个胰腺感应介质的 3 mL 中，即无血清介质 （SFM）-A. 将细胞播种在低附件培养板（60 mm）上。将细胞保持在 37 °C 和 5% CO2 3 天。
注意：在进入下一步之前，在倒置显微镜下观察细胞形态。 - 移除 SFM-A 并添加第二感应介质的 3 mL，即 SFM-B。在接下来的两天里，将细胞保持在37°C，5%CO2。
注意：在进入下一步之前，在倒置显微镜下观察细胞形态。 - 移除 SFM-B 并添加第三感应介质的 3 mL，即 SFM-C。将细胞在未来5天中保持在37°C的细胞培养器中，5%的CO2。每 48 小时更改一次介质。5天后观察它们的形态。
注：每个感应介质都辅以不同的试剂，如所述：SFM-A： 1% 牛血清白蛋白 （BSA）， 1x 胰岛素转移素- 氦 （ITS）， 4 nM 活性剂 A， 1 nM 丁酸钠， 和 50μM 的β-麦芽醇;SFM-B：1% BSA、1x ITS 和 0.3 mM 牛磺酸;和SFM C： 1.5% BSA， 1x ITS， 3 mM 牛磺酸， 100 nM 的胰高血糖素样肽 （GLP）-1， 1 mM 烟酰胺， 和 1x 非必需氨基酸 （NEAA）.。 - 确保每一步后在倒置显微镜下检查细胞形态。细胞将变得更加聚集和漂浮作为殖民地。
- 收集细胞群落以作进一步分析。检查殖民地形态和大小。执行胰腺基因标记表达分析和功能分析（葡萄糖刺激C-肽分泌分析）。
2. 非综合上岗协议
注：非集成协议是交付IPC的骨干协议，采用三步感应过程作为微环境感应方法8、9。
- 在 70%-80% 的汇流下使用通道 3-5 hDPSC。
- 丢弃培养基，用 1 倍 PBS 清洗 hDPSC。
- 在细胞中加入0.25%的试金素-EDTA溶液，在37°C、5%CO2下孵育1分钟。
- 添加培养介质，以阻止试金石活性，并轻轻地移液细胞，以获得单细胞悬浮。将细胞和阿利库特 1 x 106 细胞数入每个收集管中。
- 将细胞悬架离心，468 x g （RCF），4 °C，5分钟。丢弃超高纳特。
- 将颗粒重新沉入 SFM-A 中，并播种到低附件培养板（60 mm）上。在 37 °C 和 5% CO2 下培养细胞 3 天。在倒置显微镜下检查细胞形态。
- 取出 SFM-A，添加 SFM-B（第 3 天），然后在接下来的 2 天内保持细胞在 37 °C 以下，5% CO2。
- 取出 SFM-B，添加 SFM-C（第 5 天），然后在接下来的 5 天内保持细胞在 37 °C 以下，5% CO2。SFM-C 每 48 小时更改一次。
注：每个感应介质都辅以不同的试剂，如所述：SFM-A： 1% BSA， 1x ITS， 4 nM 活性剂 A， 1 nM 丁酸钠， 和 50μM 的β-麦芽醇;SFM-B：1% BSA、1x ITS 和 0.3 mM 牛磺酸;和 Sfm C： 1.5% Bsa， 1x Its， 3 mm 牛磺酸， 100 nm 的 Glp - 1， 1 mm 烟酰胺， 和 1x Nea 。 - 确保在每一步之后和第10天检查倒置显微镜下的细胞形态。
注：细胞将变得更加聚合，并将作为殖民地漂浮。 - 收集细胞群落以作进一步分析。检查殖民地形态和大小。执行胰腺基因标记表达分析和功能分析（葡萄糖刺激C-肽分泌分析）。
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Representative Results
本文比较了两种上岗协议的结果。两个上岗协议的图表在图2A，C中都有说明。在这两个协议中，评估都是在光显微镜下进行的，图像是用 ImageJ 分析的。hDPSC 能够从上岗的第一天起在两个上岗协议中形成类似殖民地的结构。殖民地的形态是圆的和密集的，所有的殖民地漂浮在文化容器在整个上岗期间（图2B，D）。还确定了两个协议的总殖民地数：结果表明，与非综合诱导协议（图2E）相比，综合诱导协议的总菌落数略高。然而，这种差异在统计学上并不显著。此外，还评估了两个上岗协议中的菌落大小分布（图2F）。根据我们的结果，中小型菌落是在综合诱导下形成的，这对减少殖民地内的坏死核心非常重要。
胰腺基因标记分析是使用RT-qPCR根据我们最近的出版物10进行的。有关本研究中使用的引数列表的信息包含在表1中。mRNA 值通过规范化到 18S 核糖核素 RNA 和使用 2（-é Ct）公式进行控制而呈现为相对 mRNA 表达。这项研究的结果表明，综合诱导协议产生具有高表达晚胰腺标记的菌落，包括ISL-1、MAF-A、GLUT-2、INSULIN和GLP-1R（图3），表明hDPSC与IPC的分化。 本研究亦描述了hDPSC-IPCs的功能评估（图4）。使用ELISA试剂盒进行葡萄糖刺激C-肽分泌8、9检测。结果表明，综合和非综合诱导协议产生了能够分泌C-肽的菌落。
图1：MSC对IPC的区分图，请点击这里查看此图的较大版本。
图2：使用两种不同的协议，IPC的形态学、总殖民地数和殖民地大小分布。 综合协议图通过对基本转录因子 （PDX1） 的过度表达，然后是三陡感应协议（A）。每一步感应中转染的 hDPSC 的形态（B）。非集成图作为骨干协议（C）。使用非综合协议（D）的 hDPSC-IPC 形态学。两种不同协议的总殖民地（E） 和殖民地大小分布（F） 。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：从两种不同的协议中获取的hDPSC-IPCs的胰腺基因表达分析。分析了胰腺内皮（PDX1和NGN-3）（A）、胰岛标记（ISL-1、MAF-A、GLUT-2和胰岛素）和胰腺相关标记（GLP-1R）的mRNA表达。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：从两种不同的协议中获取的hDPSC-IPC的功能分析。 每个诱导协议中的 C 肽分泌物（综合（A）和非集成（B）协议，由葡萄糖刺激的 C 肽分泌物 （GSCS） 检测确定。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1：PDX1转导后PDX1 mRNA分析。PDX1 mRNA 表达分析后 48 小时的PDX1转导在 MOI 20 在 hDPSC 显示。请点击这里下载此文件。
| 基因 | 加入编号 | 前进引数 | 长度 | Tm | |
| 反向引数 | （bp） | （+C） | |||
| PDX-1 | NM_000209.4 | 5' - 阿格特卡格格加格 - 3' | 145 | 57.89 | |
| 5' - 格格格加特加特克塔克特格特格 - 3' | 52.38 | ||||
| NGN-3 | NM_020999.3 | 5' - 格格塔加加加格特克茨 - 3' | 138 | 59.54 | |
| 5' - GGTCTCTCTCCCGAGG - 3' | 60.11 | ||||
| ISL-1 | NM_002202.2 | 5' - 特克塔格特格特格格 - 3' | 200 | 60.32 | |
| 5' - 特格格卡特加特克塔 - 3' | 60.39 | ||||
| 马夫-阿 | NM_201589.3 | 5' - 格卡查特加加加加 - 3' | 102 | 59.83 | |
| 5' - TTCTCCTG塔格特克切克 - 3' | 58.74 | ||||
| 格鲁特-2 | NM_000340.1 | 5' - 格特克塔克塔克塔格 - 3' | 211 | 52.25 | |
| 5' - 海合会塔格特格塔特加格加格 » 3' | 54.24 | ||||
| 胰岛素 | NM_000207.2 | 5' -CCCGCCTTGGGAACCAaca - 3' | 215 | 64.34 | |
| 5' - 特卡卡特卡奇克克特克特克 - 3' | 64.45 | ||||
| GLP-1R | NM_002062.4 | 5' - 特格特加特加 # 3' | 189 | 59.38 | |
| 5' - 特克切克特克特克特克 - 3' | 60.25 | ||||
| 18s | NR_003286.2 | 5' - 格特加特克切克塔加特克 - 3' | 233 | 55.04 | |
| 5' - 卡塔卡塔格塔格 - 3' | 54.86 | ||||
表1：引言信息。
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Discussion
实现 MSC 的 IPC 产量提高在糖尿病治疗中起着至关重要的作用。集成协议的关键步骤依赖于用于转导的细胞质量和转导细胞的质量。一些细胞要求，应该检查成功的转导是确保细胞健康，细胞银行管理和细胞处于间歇活动状态。此外，监测转导细胞的生存能力也起着重要作用。转导不太成功是由于受刺激细胞12的生存能力差造成的。对于非综合协议，形态外观和浮动菌落应实现，因为它们与胰腺分化9的成熟有关。
在综合诱导方案技术的修改和故障排除方面，可以通过在3-5和70%-80%的汇合通道中使用细胞获得健康和优质的细胞，同时应通过在进入下一步之前定期检查受刺激细胞的质量来监测转导细胞的质量。这一发现与先前的一项研究有关，该研究提到影响转导效率的几个因素取决于细胞健康、细胞汇合和通道数13。在这项研究中，带有三步感应过程的非综合协议仍然面临局限性，主要涉及殖民地大小和殖民地数量的形成。这个结果和我们之前的研究8，9是一致的。为了克服这个问题，我们建议检查细胞的质量以及低附件培养容器的质量。
此技术的局限性在于集成感应协议的复杂性，这是由于使用了两个不同的连续平台。此外，较高的 MOI 并不意味着更高的转导效率。在一项使用伦蒂病毒转导的类似研究中，更高的MOI无法达到更好的转导效率。作者建议使用一种辅助剂，如硫酸丙胺14。使用非综合协议的局限性与技术问题有关，例如殖民地的生产和收获处理技术以及生产的IPC的不同大小和形态结构。
基本转录因子PDX1具有重大意义，因此在MSC诱导对成熟的IPC15、16、17、18的承诺中具有潜在的作用。采用PDX1超标hDPSC，然后采用三步感应协议来修改骨干协议，主要目的是成功生产成熟和实用的IPC19、20、21。该协议的发现反映了MSC对成熟IPC的诱导需要PDX19的内分泌前表达。形态学评价表明，通过使用低附件容器，可以在两个协议中获得殖民地的非附加三维结构。这种结构对于实现胰腺分化的成熟非常重要，7、9、22、23。此外，根据殖民地大小评估，综合协议导致总殖民地数量和中小型殖民地生产的积极趋势，可以防止殖民地的坏死核心。因此，它将有助于进一步移植7，19，21，24，25。本协议中观察到晚期胰腺基因标记（ISL-1、MAF-A、GLUT-2、胰岛素和GLP-1R）的上升。与骨干协议相比，综合诱导协议中的晚期胰腺基因标记更高。据透露，PDX1的过度表达增加了胰腺祖体的数量，即在中后期胰腺发育的进展方面可以取得更好的结果，可以达到19，26，27，28。此外，为了澄清IPC的功能，进行了GSCS检测。hDPSC-IPC由两个协议产生的分泌C-肽，表明功能活跃的殖民地。
为了总结本研究中使用的技术的未来应用，两个胰腺诱导协议都能够在体外生成IPC。在菌落总数、中小型菌落生产、胰腺标记表达等方面，综合方案显示出IPC形成的有利趋势，支持MC在人类和兽医实践7、29、30、31、32的干细胞糖尿病治疗中进一步应用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
SK、WR 和 QDL 得到了朱拉隆功大学兽医干细胞和生物工程研究组、拉查达菲塞克松博特捐赠基金的支持。托和人民党得到了朱拉隆功学术进步到其2 世纪项目的支持。CS得到了兽医科学学院、朱拉隆功学术促进二世纪项目 、兽医干细胞和生物工程研究组、拉查达菲塞克松博特捐赠基金、朱拉隆功大学和政府研究基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
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