Summary
यहां, हम बोन मैरो एक्सप्लांट विधि का विस्तार करते हैं, नमूना तैयारी से लेकर सूक्ष्म स्लाइड विश्लेषण तक, मेगाकारियोसाइट्स की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, जिन्होंने अपने शारीरिक वातावरण में प्रॉलेटलेट बनाने के लिए विभेदित किया है।
Abstract
मेगाकारियोपोइसिस के अंतिम चरण में परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स, तथाकथित प्रोपलेटलेट्स से साइटोप्लाज्मिक एक्सटेंशन होता है। इन विट्रो-विभेदित मेगाकारियोसाइट्स का उपयोग करके प्रॉप्लेलेट गठन के बारे मेंबहुत कुछ सीखा गया है; हालांकि, इस बात का सबूत बढ़ रहा है कि पारंपरिक संस्कृति प्रणालियां अस्थि मज्जा के अंदर होने वाली भेदभाव/परिपक्वता प्रक्रिया को ईमानदारी से पुनर्मूल्यांकन नहीं करती हैं । इस पांडुलिपि में, हम शुरू में थिएरी और बेसिस द्वारा 1 9 56 में वर्णित एक एक्सप्लांट विधि प्रस्तुत करते हैं ताकि मेगाकारियोसाइट्स की कल्पना की जा सके जो उनके मूल वातावरण में परिपक्व हो गए हैं, इस प्रकार संभावित कलाकृतियों और गलत व्याख्याओं को दरकिनार करते हैं। ताजा अस्थि मज्जा चूहों के फीमर को फ्लश करके एकत्र किए जाते हैं, 0.5 मिमी क्रॉस सेक्शन में कटा हुआ है, और एक इनक्यूबेशन कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है जिसमें शारीरिक बफर होता है। मेगाकारियोसाइट्स एक्सप्लांट परिधि में धीरे-धीरे दिखाई देते हैं और एक वीडियो कैमरे के साथ मिलकर एक उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे 6 घंटे तक देखे जाते हैं। समय के साथ, मेगाकारियोसाइट्स अपना आकार बदलते हैं, कुछ कोशिकाओं के पास गोलाकार रूप होता है और अन्य मोटी एक्सटेंशन विकसित करते हैं या व्यापक ब्रांचिंग के साथ कई पतले प्रोपलेटलेट का विस्तार करते हैं। गुणात्मक और मात्रात्मक दोनों जांच की जाती है । इस विधि में सरल, प्रजनन योग्य और तेज होने का लाभ है क्योंकि कई मेगाकारियोसाइट्स मौजूद हैं, और उनमें से आधे सुसंस्कृत माउस मेगाकारियोसाइट्स के लिए 4 दिनों की तुलना में 6 घंटे में प्रोपलेटलेट बनाते हैं। उत्परिवर्ती चूहों के अध्ययन के अलावा, इस विधि का एक दिलचस्प अनुप्रयोग संस्कृतियों में होने वाली भेदभाव प्रक्रिया में हस्तक्षेप किए बिना, प्रोपलेटेलेट विस्तार प्रक्रिया पर औषधीय एजेंटों का सीधा मूल्यांकन है।
Introduction
बोन मैरो एक्सप्लांट तकनीक को सबसे पहले 1956 में थिएरी और बेसिस द्वारा विकसित किया गया था ताकि प्लेटलेट निर्माण में प्रारंभिक घटना के रूप में चूहा मेगाकारियोसाइट साइटोप्लाज्मिक एक्सटेंशन केगठनका वर्णन किया जा सके। चरण के विपरीत और छायांकन तकनीकों का उपयोग करते हुए, इन लेखकों ने परिपक्व दौर मेगाकारियोसाइट्स के परिवर्तन को "स्क्विड-लाइक" थ्रोम्बोसाइटोजेनिक कोशिकाओं में चित्रित किया, जिसमें साइटोप्लाज्मिक एक्सटेंशन के साथ विस्तार और संकुचन के गतिशील आंदोलनों को दिखाया गया था। ये हथियार उत्तरोत्तर पतले हो जाते हैं जब तक कि वे बाहों के साथ और सुझावों पर छोटी सूजन के साथ फिलीफॉर्म न हो जाएं। इन विशिष्ट मेगाकार्योसाइट विस्तार, विट्रो और तरल मीडिया में प्राप्त, निश्चित अस्थि मज्जा में मनाए गए प्लेटलेट्स के साथ कुछ समानताएं हैं, जहां मेगाकारियोसाइट्स साइनसॉयड दीवारों के माध्यम से रक्त परिसंचरण2,3मेंलंबेविस्तार को फैलाते हैं। 1994 में टीपीओ की खोज और क्लोनिंग ने संस्कृति में मेगाकारियोसाइट्स को अंतर करने की अनुमति दी, जो बोन मैरोएक्सप्लांट4,5,6में वर्णित प्रोपलेट एक्सटेंशन के समान है। हालांकि, मेगाकारियोसाइट परिपक्वता संस्कृति की स्थितियों में बहुत कम कुशल है, विशेष रूप से अस्थि मज्जा परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स का व्यापक आंतरिक झिल्ली नेटवर्क सुसंस्कृत मेगाकारियोसाइट्स में अविकसित है, प्लेटलेट बायोजेनेसिस7,8के तंत्र पर अध्ययन में बाधा डालता है।
हम यहां विस्तार से थेरी और बीसिस पर आधारित बोन मैरो एक्सप्लांट मॉडल, माउस मेगाकारियोसाइट्स के वास्तविक समय के प्रोपलेट गठन में पालन करने के लिए, जो अपने मूल वातावरण में पूरी तरह से परिपक्व हो गए हैं, इस प्रकार विट्रो कलाकृतियों और गलत व्याख्याओं में संभव दरकिनार करते हैं। जंगली प्रकार के वयस्क चूहों में प्राप्त परिणामों को प्रोपलेटलेट, उनकी आकृति विज्ञान और प्रोपलेटर की जटिलता का विस्तार करने के लिए मेगाकार्योसाइट की क्षमता को चित्रित करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है। हम मेगाकारियोसाइट रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान डेटा सटीकता और मजबूती सुनिश्चित करने के लिए गुणवत्ता सत्यापन के लिए एक तेजी से मात्रात्मक रणनीति भी पेश करते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक पुस्तक अध्याय के रूप में प्रकाशित विधि का सबसे हाल ही में संस्करण है9पहले ।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों यूरोपीय मानकों के अनुसार प्रदर्शन किया गया 2010/63/यूरोपीय संघ और स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर CREMEAS समिति (Comité Régional d' Ethique en Matière d ' Expérimentation Animale स्ट्रासबर्ग) ।
1. रिएजेंट्स की तैयारी
- टेबल 1में वर्णित रिएजेंट्स तैयार करें ।
- स्टॉक I के लिए, प्रत्येक पाउडर को अलग से भंग करें। सुनिश्चित करें कि तैयारी की ऑस्मोलारिटी 295 mOsm/L से अधिक है। इस घोल को एक साल तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
- टायरोड की बफर तैयारी के लिए, टेबल 1में वर्णित समाधान बनाएं, आसुत पानी के साथ वॉल्यूम को 100 मिली लीटर में समायोजित करें और 0.1 ग्राम निर्जल डी (+) सुक्रोज जोड़ें। आवश्यकतानुसार 1 एन एचसीएल का उपयोग करके पीएच 7.3 में समायोजित करें और ऑस्मोलएरिटी को 295 mOsm/L करें। बैक्टीरियल ग्रोथ को रोकने के लिए 10 यू/एमएल फाइनल कंसंट्रेशन और स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट पर ०.२९ मिलीग्राम/एमएल फाइनल कंसोरीट्यूशन में पेनिसिलिन जी डालें । 0.22 माइक्रोन छिद्रों के माध्यम से अंतिम समाधान फ़िल्टर करें।
2. प्रायोगिक सेट अप की तैयारी
- प्रयोग के दिन 37 डिग्री सेल्सियस पर टायरोड के बफर को गर्म करें और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक लाने के लिए माइक्रोस्कोप के हीटिंग चैंबर को चालू करें।
- सभी आवश्यक उपकरण तैयार करें, जैसे टाइमर, इनक्यूबेशन चैम्बर्स, 5 एमएल सीरिंज, 21 जी, संदंश, रेजर ब्लेड, पाश्चर पिपेट, ग्लास स्लाइड, और 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब(चित्रा 1A)।
3. माउस बोन मैरो का अलगाव
- सीओ2 एस्फिक्सेशन और सर्वाइकल अपभ्रंश द्वारा 8-12 सप्ताह की आयु के C57BL/6 चूहों को इच्छामृत्यु । यह काम किसी सक्षम और योग्य व्यक्ति को जल्दी करना चाहिए।
- माइक्रोबियल संदूषण से बचने के लिए, फीमर को हटाने से पहले माउस शरीर को 70% (v/v) इथेनॉल में भिगो दें। विच्छेदन के लिए 70% इथेनॉल में कीटाणुरहित उपकरणों का उपयोग करें। दो फीमर ले लीजिए और किसी भी अनुयायी ऊतक को हटाकर उन्हें साफ करें। इथेनॉल में तेजी से विसर्जन के बाद, उन्हें 2 मिलील टायरोड के बफर युक्त 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें।
- एक तेज रेजर ब्लेड का उपयोग करके एपिफिसिस को काट लें और 2 एमएल टायरोड के बफर से भरे 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करके बोन मैरो को फ्लश करें। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, फीमर (घुटने की ओर) के उद्घाटन में 21 जी सुई पेश करें और धीरे-धीरे एक अक्षुण्ण मैरो सिलेंडर(चित्रा 1B,सी)को पुनः प्राप्त करने के लिए प्लंजर दबाएं। मैरो संग्रह सत्र को यथासंभव संक्षिप्त (10 मिनट के तहत) रखें।
4. बोन मैरो खंड और इनक्यूबेशन कक्ष में प्लेसमेंट
- ध्यान से और धीरे एक गिलास स्लाइड पर बरकरार अस्थि मज्जा हस्तांतरण करने के लिए एक 3 एमएल प्लास्टिक पिपेट का प्रयोग करें। यह महत्वपूर्ण है कि नमूनों को सूखने से रोकने के लिए बफर से ढका जाता है(चित्रा 1D)।
नोट: ऊतक को अलग करने वाले कैंची को कम करने के लिए प्रवाह-फिर से प्रवाह से बचें। - एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (10x) के तहत, फ्लश के समय संकुचित हो सकता है कि मज्जा के सिरों को काट दें। फिर एक तेज रेजर ब्लेड के साथ ट्रांसवर्सल सेक्शन काटें। विस्तृत अवलोकन की अनुमति देने के लिए अनुभाग काफी पतले होने चाहिए लेकिन यह सुनिश्चित करें कि मेगाकरियोसाइट्स संपीड़न (आमतौर पर 0.5 मिमी के आसपास मोटाई)(चित्रा 1E,एफ)से क्षतिग्रस्त न हों।
नोट: वर्गों के बारे में 0.5 मिमी करने के लिए अपनी मोटाई को समायोजित करने के लिए एक तेज रेजर ब्लेड के साथ और एक आवर्धक के नीचे किया जाता है। केवल एक समान मोटाई के वर्गों का चयन किया जाता है। यह प्रक्रिया जटिल नहीं है लेकिन इसके मानकीकरण के लिए कुछ अनुभव की आवश्यकता है। - प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके, 1 एमएल ट्यूब में 10 वर्गों को इकट्ठा करें जिसमें टायरोड के बफर(चित्रा 1G) होते हैं।
- ध्यान से 13 मिमी(चित्रा 1H)के व्यास के साथ एक इनक्यूबेशन कक्ष में वर्गों को स्थानांतरित करें।
- बफर को एस्पिरेट करें और वॉल्यूम को 5% माउस सीरम के साथ पूरक टायरोड के बफर के 30 माइक्रोल में समायोजित करें।
नोट: यह इस स्तर पर है कि प्रोपलेट गठन पर उनके प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए औषधीय एजेंटों को जोड़ा जा सकता है। - दूरी पर वर्गों की स्थिति। आयाम 22 x 55 मिमी के कवरलिप के साथ आत्म-चिपकने वाले कक्ष को सील करें। हवा के बुलबुले(चित्रा 1I)के गठन से बचने के लिए चिपके हुए कवरस्लिप को झुकाएं।
- कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग चैंबर में रखें। इस पल से, क्रोनोमीटर (टी = 0 एच) शुरू हो गया है। प्रयोग 37 डिग्री सेल्सियस (टी = 6 एच) पर 6 घंटे के लिए चलता है।
5. मैरो एक्सप्लांट का वास्तविक समय अवलोकन
- बोन मैरो एक्सप्लांट्स का निरीक्षण करने के लिए एक वीडियो कैमरे के साथ मिलकर एक उल्टे चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (आवर्धन के लिए 40x लेंस) का उपयोग करें। प्रेक्षण शुरू करने से पहले कोशिकाओं को 30 मिनट तक इनक्यूबेट करने दें। देखते समय, ध्यान को समायोजित करना आवश्यक है क्योंकि मेगाकारियोसाइट्स आगे बढ़ रहे हैं।
नोट: अन्य अवलोकन मोड संभव हैं (उदाहरण के लिए, डीआईसी, फ्लोरेसेंस चूहों का उपयोग करके जिनके मेगाकारियोसाइट्स एक एंडोजेनस फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त करते हैं), लेकिन चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी लंबे और पतले मेगाकारियोसाइट एक्सटेंशन की स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए इष्टतम है, सटीक मात्राकरण की अनुमति देता है। 30 मिनट के बाद, मैरो कोशिकाएं धीरे-धीरे एक्सप्लांट की परिधि में स्थानांतरित हो जाते हैं, जिससे मोनोलेयर बन जाता है। इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद, मेगाकारियोसाइट्स को उनके बड़े आकार और पॉलीलोबुलेटेड नाभिक(चित्रा 1J,K) द्वारा पहचाना जासकता है। 3 घंटे इनक्यूबेशन के बाद मेगाकारियोसाइट्स की संख्या बढ़ जाती है और कुछ में लंबे एक्सटेंशन होते हैं। - मेगाकारियोसाइट्स के परिवर्तन को रिकॉर्ड करने के लिए वीडियो बनाएं।
6. प्रोपलेट-विस्तार मेगाकारियोसाइट्स का परिमाणीकरण
- इनक्यूबेशन कक्ष(चित्रा 1K)में प्रत्येक अनुभाग को स्थानीयकृत करने के लिए एक नक्शा बनाएं।
- 1 घंटे के बाद, प्रत्येक खंड की परिधि पर दृश्यमान मेगाकारियोसाइट्स (यानी, विशाल पॉलीलोबेटेड कोशिकाओं) की पहचान करें और ड्राइंग पर अपनी स्थिति को प्लॉट करें। 3 और 6 घंटे के बाद इस प्रक्रिया को दोहराएं।
नोट: ड्राइंग के आधार पर, प्रत्येक मेगाकार्योसाइट को समय के साथ आसानी से स्थित किया जा सकता है और उनके आकृति विज्ञान के विकास का विश्लेषण किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, आकार, विरूपण, प्रोपलेट एक्सटेंशन, आदि)। एक अन्य संभावना एक विशिष्ट नेविगेशन सॉफ्टवेयर का उपयोग है।
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Representative Results
गुणात्मक परिणाम। प्रयोग की शुरुआत में, सभी कोशिकाओं को बोन मैरो सेक्शन में कॉम्पैक्ट किया जाता है। यह कोशिकाओं के लिए 30 मिनट लगते है explants की परिधि में स्पष्ट रूप से दिखाई हो जाते हैं । मेगाकारियोसाइट्स तो उनके बड़े आकार से पहचानने योग्य हैं और उनके विकास तो समय के साथ अध्ययन किया जा सकता है (आकार, आकार, आकार, गतिशील, प्रोपलेटलेट विस्तार और प्लेटलेट रिलीज)(चित्रा 2A)। छोटे मेगाकारियोसाइट्स का व्यास 20 से 30 माइक्रोन के बीच होता है और उनके नाभिक को पॉलीलोब्लुलेटेड किया जाता है जबकि परिपक्व गोल मेगाकारियोसाइट्स बढ़े हुए साइटोप्लाज्म के साथ बड़े (व्यास में 30 माइक्रोन) > होते हैं। कुछ डार्क मेगाकारियोसाइट्स(चित्रा 2C)मनाया जा सकता है। ये मृत कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनका अनुपात 0.5% से अधिक नहीं होना चाहिए। इस मूल्य से अधिक अनुपात नमूना तैयारी की समस्या को इंगित करता है। नाभिक की आकृति विज्ञान को ध्यान में रहकर आसानी से कल्पना की जा सकती है।
मात्रात्मक परिणाम। मेगाकारियोसाइट्स को मैन्युअल रूप से गिना जाता है जैसा कि 6.2 में वर्णित है। और इनक्यूबेशन कक्ष को सील करने के बाद 3 घंटे और 6 घंटे में उनकी आकृति विज्ञान के अनुसार वर्गीकृत किया गया। चित्रा 2A चार आवश्यक मेगाकार्योसाइट्स कक्षाओं का सारांश देता है: (1) छोटे एमकेएस, (2) बड़े एमकेएस, (3) मोटी एक्सटेंशन के साथ एमके, (4) एमके्स पतले, लम्बी और रैमिफाइड एक्सटेंशन के साथ। ये बाद में विशिष्ट प्रोप्लेलेट बनाने वाले मेगाकारियोसाइट्स हैं, जिसमें प्रोपलेट के साथ सूजन की प्रमुख विशेषताएं और उनके चरम हिस्सों पर अपवर्तक कलियों की उपस्थिति है। मानचित्रण(चित्रा 1K)की मदद से, समय के साथ उनके विकास का पालन किया जा सकता है। परिणाम प्रत्येक अवलोकन समय पर प्रत्येक वर्ग के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए जाते हैं । शास्त्रीय रूप से, परिधि में दिखाई देने वाले मेगाकारियोसाइट्स का आधा हिस्सा जंगली प्रकार के C57BL/6 माउस बोन मैरो(चित्रा 2B)के लिए 6 घंटे में प्रोपलेटलेट्स का विस्तार करता है।
समय के साथ अनुक्रमिक छवियों को कैप्चर करके गोल एमकेएस के भाग्य का पालन करना संभव है कि वे प्रोपलेटलेट(वीडियो 1)कैसे बनाते हैं। दिलचस्प बात यह है कि जब मोटी एक्सटेंशन वाले एमकेएस पर 3 एच की अवधि में नजर रखी गई थी, तो यह देखा गया कि मोटी एक्सटेंशन या तो सेल बॉडी और ब्रांच से प्रोपलेटलेट्स में अलग हो सकती है या बड़े दौर के एमके में सुधार करने के लिए वापस ले सकती है।
| अभिकर्मकों | एच2ओ | ||||
| स्टॉक I* | 16 ग्राम | 0.4 ग्राम | 2 ग्राम | 0.116 ग्राम | |
| नैक | केसीएल | नाहको3 | एनएएच 2पीओ4, | 100 एमएल करने के लिए | |
| (2.73 मीटर) | (53.6 mM) | (238 mM) | (8.6 mM) | ||
| स्टॉक II | 2.033 ग्राम एमजीसीएल2.6H2O (0.1 M) | ||||
| स्टॉक III | 2.19 ग्राम सीएसीएल2.6H2O (0.1 M) | 100 एमएल करने के लिए | |||
| हेपेस स्टॉक ** | 119 ग्राम हेप्स * (0.5 M) | 1 एल करने के लिए | |||
| टायरोड के बफर *** | 5 एमएल स्टॉक I | 1 एमएल स्टॉक II | 2 एमएल स्टॉक III | 1 एमएल हेप्स स्टॉक | 1.8 एमएल एल्बुमिन स्टॉक |
तालिका 1: टायरोड के बफर की तैयारी। प्रत्येक स्टॉक समाधान तालिका के पहले कॉलम में इंगित किया गया है। प्रत्येक स्टॉक समाधान के लिए आवश्यक अभिवाक (ग्राम में दिए गए) की संरचना के साथ-साथ प्रति पंक्ति इंगित की जाती है। प्रत्येक रिएजेंट की सूची संख्या और कंपनी आवश्यक आपूर्ति की तालिका में दी गई है।
चित्र 1:बोन मैरो एक्सप्लांट के लिए नमूना तैयार करने की विधि का फोटोग्राफिक अभ्यावेदन। (ए)बोन मैरो तैयार करने के लिए आवश्यक प्रायोगिक सेटअप। (ख)हड्डी में 21 गेज की सिरिंज पर चढ़कर सुई डाली जाती है। (ग)बोन मैरो को टायरोड के बफर वाली ट्यूब में फ्लश किया जाता है । (घ)बोन मैरो को फिर धीरे-धीरे एक ग्लास स्लाइड पर जमा किया जाता है। (ई)बोन मैरो के हाथ-पैर काट दिए जाते हैं। (एफ)मज्जा सिलेंडर को दस 05 मिमी मोटी धाराओं में काटा जाता है। (जी-एच) दस वर्गों को एक इनक्यूबेशन कक्ष में स्थानांतरित कर दिया जाता है और उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर मनाया जाता है। (I)बोन मैरो के दस खंडों वाले इनक्यूबेशन कक्ष की प्रतिनिधि फोटो । (जम्मू)पेरिफेरल कोशिकाएं एक परत बनाने के लिए माइग्रेट होती हैं जिसमें मेगाकारियोसाइट्स दिखाई देते हैं । (K)इनक्यूबेशन कक्ष में दस एक्सप्लांट अनुभागों के साथ-साथ मेगाकारियोसाइट्स (एक्स ब्लू मार्क) के स्थान को चित्रित करने का उदाहरण है जो प्रत्येक खंड के लिए ऊतक से बाहर चले गए हैं। तीर परिधि में एक मेगाकार्योसाइट दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2:समय के साथ एक्सप्लांट में मेगाकारियोसाइट्स का रूपात्मक वर्गीकरण। (ए)मेगाकारियोसाइट्स को "मोटी विस्तार" या "प्रोपलेट-विस्तार" के साथ "छोटा", "बड़ा", के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। बार: प्रत्येक कक्षा में मेगाकारियोसाइट्स का 50 माइक्रोन(बी)अनुपात कुल 1,468 मेगाकारियोसाइट्स के लिए 1 घंटे, 3 एच और 6 एच पर निर्धारित किया गया था, जिसमें यह दर्शाया गया था कि "छोटे" और "गोलाकार" मेगाकारियोसाइट्स का अनुपात समय के साथ कम हो जाता है, जबकि समानांतर रूप से, मेगाकारियोसाइट्स का अनुपात प्रोपलेटलेट बढ़ जाता है (n=6 चूहों) का विस्तार करता है। आमतौर पर, 3 घंटे के बाद डब्ल्यूटी माउस के एक्सप्लांट में, 8.3 और 11.5 मेगाकारियोसाइट्स के बीच प्रति अनुभाग मनाया जाता है। त्रुटि बार प्रत्येक नमूने के लिए मतलब के मानक त्रुटि से मेल खाती है। (ग)एक अंधेरे मेगाकारियोसाइट की प्रतिनिधि छवि। बार: 50 माइक्रोन(डी)गैर-मस्कुलर मायोसिन II-ए के साथ एक मेगाकार्योसाइट की प्रतिनिधि छवि हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल की गई। बार: 50 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 1: समय-चूक वीडियो एक एमके विस्तार प्रोपलेट्स दिखा रहा है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यहां हम बोन मैरो में बड़े हुए प्रोपलेट्स का विस्तार करने के लिए मेगाकारियोसाइट्स की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल और कम लागत वाली इन विट्रो विधि का वर्णन करते हैं। माउस के लिए बोन मैरो एक्सप्लांट मॉडल के चार मुख्य फायदे हैं। सबसे पहले, कोई उन्नत तकनीकी कौशल की आवश्यकता नहीं है। दूसरा, मेगाकारियोसाइट-विस्तार प्रोपलेटलेट प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय काफी कम है, एक्सप्लांट विधि के लिए केवल 6 घंटे, माउस जनक से शुरू होने वाली पारंपरिक संस्कृति विधि के लिए न्यूनतम 4 दिनों की तुलना में। तीसरा, यह देखते हुए कि केवल ऊतक की एक छोटी राशि की आवश्यकता होती है और प्राप्त परिणाम प्रजनन योग्य होते हैं, यह न्यूनतम (आमतौर पर 6 चूहों प्रति प्रयोगात्मक स्थिति) के लिए आवश्यक चूहों की संख्या को कम करता है, जिससे ये प्रयोग आर्थिक और नैतिकता की दृष्टि से कुशल होते हैं। अंत में, लेकिन महत्वपूर्ण बात, इस विधि की ताकत मेगाकार्योसाइट्स के उपयोग में निहित है जो पूरी तरह से उनके प्राकृतिक वातावरण में विकसित हुए हैं, जो फेनोटाइप को प्रकट करने में अमूल्य साबित हो सकते हैं जो संस्कृति की स्थितियों की संभावित कलाकृतियों द्वारा विट्रो में नकाबपोश हो सकते हैं। यह पहले मेगाकार्योसाइट-प्रतिबंधित MYH9 निष्क्रियता के साथ चूहों में प्रलेखित किया गया है जहां इन विट्रो (बढ़ी हुईगठन) 10 में प्रोपलेट फॉर्मेशन पर और वीवो (कम गठन) विभेदित मेगाकारियोसाइट्स11में विरोध परिणाम पाए गए हैं। इन विरोधाभासी परिणामों को एक बाधा वातावरण में सामान्य मेगाकार्योसाइट भेदभाव के लिए मायोसिन आईआईए की आवश्यकता से समझाया गया है, जबकि मायोसिन आईआईए तरल संस्कृति में मेगाकार्योसाइट भेदभाव के लिए अपरिहार्य है7।
बोन मैरो एक्सप्लांट मॉडल का एक दिलचस्प अनुप्रयोग आनुवंशिक उत्परिवर्तन या ट्रांसजेनिक चूहों में कमियों और/या औषधीय एजेंटों के विशेष रूप से प्लेटलेट विस्तार प्रक्रिया पर, इन विट्रो संस्कृति12के मामले में भेदभाव प्रक्रिया में हस्तक्षेप किए बिना अध्ययन करने की संभावना है । आदर्श स्थिति एक इलाज नमूने और नियंत्रण के रूप में अपने समकक्ष के रूप में एक फीमर के अस्थि मज्जा का उपयोग करने के लिए है । इसके अलावा, मेगाकारियोसाइट्स में सहज फ्लोरेसेंस की अनुमति देने वाले ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग प्लेटलेट विस्तार प्रक्रिया के दृश्य की सुविधा प्रदान करता है। फ्लोरोसेंट मेगाकारियोसाइट्स की कल्पना करने के लिए, संस्कृति कक्ष में विशिष्ट मेगाकारियोसाइट मार्कर के खिलाफ फ्लोरेसेंस-लेबल वाले एंटीबॉडी को जोड़ने की एक संभावना हो सकती है। एक और संभावना आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल का उपयोग हो सकता है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है, या तो विशेष रूप से मेगाकारियोसाइटिक वंश में जैसे सीडी 41-लेबल वाले वाईएफपी के साथ चूहों में पहले से ही साहित्य13में रिपोर्ट किया गया है, या चूहों जैसे सभी कोशिकाओं में जहां जीएफपी गैर-पेशी मायोसिन II-ए14 के एन-टर्मिनस से जुड़ा हुआ है जैसा कि चित्र 2 डीमें दर्शाया गया है।
इसलिए, यह एक्सप्लांट विधि उनके प्राकृतिक वातावरण में प्लेटलेट गठन की बेहतर समझ के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक दोनों जानकारी प्रदान करती है। उल्लेखनीय है, हालांकि यह विधि सरल है और तेजी से यह शास्त्रीय तरल संस्कृति का उपयोग करके किए गए अध्ययनों के पूरक बनी हुई है। प्रत्येक व्यक्ति प्रसार, परिपक्वता, प्लेटलेट्स के विस्तार और प्लेटलेट रिलीज के चरणों के अनुसार अलग ज्ञान लाता है जो कोई अध्ययन करना चाहता है। उदाहरण के लिए, जहां एक्सप्लांट विधि एक शारीरिक संदर्भ में विकसित हुए मेगाकारियोसाइट्स द्वारा प्रोपलेट्स के विस्तार की क्षमता के बारे में जानकारी देती है, इन विट्रो संस्कृति बोन मैरो माइक्रोएनवायरमेंट के महत्व जैसे सेल रिडिसिटी7 या एक्सेलैल्युलर मैट्रिक्स निर्भरता15के प्रभाव के बारे में जानकारी प्रदान करती है। इस प्रकार, इन विट्रो मेगाकार्योसाइट संस्कृतियां कठोरता और चिपकने वाले प्रोटीन7,16के संदर्भ में माइक्रोएनवायरमेंट के मापदंडों को मिलाना संभव बनाती हैं। कृपया लेख "तीन आयामी मिथाइलसेलुलोस आधारित हाइड्रोगेल में मेगाकार्योसाइट संस्कृति का उल्लेख सेल परिपक्वता में सुधार और कठोरता और कारावास के प्रभाव का अध्ययन" जे Boscher एट अल द्वारा, अधिक जानकारी के लिए इस मुद्दे में प्रस्तुत किया ।
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Disclosures
लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।
Acknowledgments
लेखक तकनीकी सहायता के लिए जीन-येव्स रिंकेल, जूली बोशर, पेट्रीसिया लैफर, मोनिक फ्रायंड, केट्टी Knez-Hippert का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को एएनआर (एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे) ग्रांट एएनआर-17-सीई14-0001-01 और एएनआर-18-सीई14-0037 ने सपोर्ट किया है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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