Summary
여기서, 우리는 골수 각질 방법을 자세히, 샘플 준비에서 현미경 슬라이드 분석에, 프로 플라츠판을 형성하는 그들의 생리 환경에서 분화 한 메가 카요 세포의 능력을 평가하기 위해.
Abstract
메가카요포이시스의 마지막 단계는 성숙한 거대 카르요세포, 소위 프로플라츠에서 세포질 확장으로 이어집니다. 체외에서 -분화 된 메가 카요세포를 사용하여 프로 플라츠판 형성에대해 많은 것을 배웠습니다. 그러나, 기존의 문화 시스템이 골수 내부의 장소를 취하는 분화 / 성숙 과정을 충실하게 재구성하지 않는다는 증거가 증가하고 있다. 이 원고에서는 1956년 티에리와 베시스가 원래 설명한 절묘한 방법을 제시하여 자신의 토착 환경에서 성숙한 거대 카르요세포들을 시각화하여 잠재적인 유물과 오해를 우회합니다. 신선한 골새끼는 마우스의 대퇴골을 플러시하여 수집되고, 0.5mm 단면으로 슬라이스하고, 생리적 완충액을 함유하는 37°C의 인큐베이션 챔버에 배치된다. 메가카요세포는 축출 주변에서 점진적으로 볼 수 있게 되고 비디오 카메라에 결합된 반전된 현미경으로 최대 6시간까지 관찰됩니다. 시간이 지남에 따라, 메가 카요 세포는 구형 형태를 가지고 다른 두꺼운 확장을 개발하거나 광범위한 분기와 많은 얇은 proplatelet을 확장, 모양을 변경합니다. 정성적 및 정량적 조사가 모두 수행됩니다. 이 방법은 수많은 거대 카르요세포가 존재하므로 간단하고 재현 가능하며 빠르며, 그 중 절반은 배양 마우스 메가카요세포에 대한 4일에 비해 6시간 만에 프로플라틀렛을 형성한다는 장점이 있다. 돌연변이 마우스의 연구 외에도, 이 방법의 흥미로운 적용은 배양에서 발생할 수 있는 분화 과정을 방해하지 않고, 프로플라틀 확장 과정에 대한 약리학제제의 간단한 평가이다.
Introduction
골수 각질 기술은 1956년 티에리와 베시스에 의해 처음 개발되어 혈소판 형성1의초기 이벤트로서 쥐 메가카요세포 세포질 확장의 형성을 기술하였다. 위상 대비 및 촬영 기술을 사용하여, 이 저자는 신장과 수축의 동적 움직임을 보여주는 세포질 확장과 "오징어 같은"혈전 세포로 성숙한 둥근 메가 카요세포의 변환을 특징으로. 이 팔은 팔을 따라 그리고 끝에서 작은 붓기와 filiform될 때까지 점진적으로 얇아집니다. 시험관 및 액체 매체에서 얻어진 이러한 전형적인 메가카요세포 신장은 고정형 골수에서 관찰된 혈소판과 일정한 유사성을 가지며, 여기서 거대 카르요퀴트는 혈중 벽으로 시누치성 벽을 통해 긴 연장을 돌출하여 혈액 순환2,3로돌출된다. 1994년 TPO의 발견 및 복제는 골수 에 기재된 것과 유사한 프로플라틀 확장을 형성할 수 있는 배양에서 메가카르요사이클을 구별할 수 있게4,5,6. 그러나, 메가카요세포 성숙은 배양 조건에서 훨씬 덜 효율적이며, 특히 골수 성숙 메가카요세포의 광범위한 내부 멤브레인 네트워크는 배양 된 메가 카요사이클로 저개발되어 혈소판 생물 발생7,8의메커니즘에 대한 연구를 방해한다.
우리는 여기에 Thiéry와 Bessis에 따라 골수 박멸 모델을 자세히 설명, 마우스 메가 카요 사이클의 실시간 proplatelet 형성에 따라, 이는 완전히 자신의 네이티브 환경에서 성숙한, 따라서 체외 유물과 오해에서 가능한 우회. 야생 형 성인 마우스에서 얻은 결과는 프로 플라틀릿, 그들의 형태 및 프로 플라츠의 복잡성을 확장하는 메가 카요사이클의 능력을 설명하기 위해 제시된다. 또한 메가카요세포 기록 과정에서 데이터 정확성과 견고성을 보장하기 위해 품질 검증을 위한 신속한 정량화 전략을 도입했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 이전에 책 장9로출판된 방법의 최신 버전입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 실험은 유럽 표준 2010/63/EU및 스트라스부르 대학의 동물 실험 윤리에 대한 CREMEAS 위원회 (코미테 레지오날 데티크 앙 마티에르 디에리포앙 마티에르 데테리션 애니멀 스트라스부르)에 따라 수행되었습니다.
1. 시약 준비
- 표 1에설명된 대로 시약을 준비한다.
- 스톡 I의 경우 각 분말을 별도로 녹입니다. 준비의 진동이 295 mOsm / L보다 높은지 확인하십시오. 이 용액은 1 년 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
- Tyrode의 버퍼 준비를 위해 표 1에설명된 대로 솔루션을 만들고 증류수로 100mL로 볼륨을 조정하고 0.1g 의 무수D(+) 자당을 추가합니다. 필요에 따라 1 N HCl을 사용하여 pH 7.3에 적응하고 295 mOsm / L로 진동합니다. 세균성 성장을 방지하기 위해, 페니실린 G를 추가 10 U/mL 최종 농도 및 연쇄절제술 황산염 0.29 mg/mL 최종 농도. 0.22 μm 모공을 통해 최종 솔루션을 필터링합니다.
2. 실험 설정 준비
- 실험 당일, 37°C에서 티로드의 완충액을 따뜻하게 하고 현미경의 가열 챔버를 켜서 온도를 37°C로 끌어올립니다.
- 타이머, 인큐베이션 챔버, 5mL 주사기, 21G, 집게, 면도날, 파스퇴르 파이펫, 유리 슬라이드 및 15mL 원심분리관(그림1A)과같은 필요한 모든 도구를 준비합니다.
3. 마우스 골수의 격리
- CO2 질식 및 자궁 경부 탈구에 의해 8-12 주 세 C57BL/6 마우스를 안락사. 이것은 유능하고 자격을 갖춘 사람에 의해 신속하게 수행해야합니다.
- 미생물 오염을 방지하기 위해 대퇴골을 제거하기 전에 마우스 몸을 70 % (v /v) 에탄올에 담가 둡니다. 해부에 대해 70% 에탄올에 감염된 기기를 사용하십시오. 두 대퇴골을 수집하고 부착 조직을 제거하여 청소하십시오. 에탄올에 빠르게 침지한 후, 2mL 티로드의 버퍼를 포함하는 15mL 원심분리기 튜브에 넣습니다.
- 날카로운 면도날을 사용하여 표피를 자르고 2mL Tyrdode의 버퍼로 채워진 5mL 주사기를 사용하여 골수를 플러시합니다. 이를 위해 21G 바늘을 대퇴골(무릎 쪽)의 개구부로 도입하고 플런저를 천천히 눌러 그대로 골수 실린더(도1B,C)를회수한다. 골수 수집 세션을 가능한 한 짧게 유지하십시오(10분 미만).
4. 골수 단면 및 인큐베이션 챔버에 배치
- 3mL 플라스틱 파이펫을 사용하여 그대로 있는 골수를 유리 슬라이드에 조심스럽게 옮기십시오. 샘플이 건조를 방지하기 위해 버퍼로 덮여있는 것이 중요합니다(그림 1D).
참고: 조직을 해리시킬 수 있는 가위를 최소화하기 위해 흐름 리플로우를 피하십시오. - 스테레오 현미경 (10x)에서, 플러시 시 압축 되었을 수 있습니다 골수의 끝을 잘라. 그런 다음 날카로운 면도날로 트랜스버라클 섹션을 잘라냅니다. 섹션은 상세한 관찰을 허용하지만 메가 카요 세포가 압축 (일반적으로 0.5mm 주위 두께)에 의해 손상되지 않도록 충분히 얇아야한다(그림 1E,F).
참고: 단면은 날카로운 면도날과 돋보기 아래로 제작되어 두께를 약 0.5mm로 조정합니다. 균일한 두께의 섹션만 선택됩니다. 이 절차는 복잡하지 않지만 표준화에는 약간의 경험이 필요합니다. - 플라스틱 파이펫을 사용하여 티로드의버퍼(그림 1G)가들어 있는 1mL 튜브에 10개의 섹션을 수집합니다.
- 직경 13mm(도1H)의인큐베이션 챔버로 섹션을 조심스럽게 옮겨주세요.
- 버퍼를 흡인하고 5 % 마우스 혈청으로 보충 된 Tyrode의 버퍼의 30 μL로 볼륨을 조정합니다.
참고: 이 단계에서 약리학 제가 첨가하여 프로플라틀형성에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. - 섹션을 멀리 배치합니다. 차원 22 x 55mm의 커버슬립으로 자체 접착제 챔버를 밀봉하십시오. 기포의 형성을 피하기 위해 고집하면서 커버 슬립을 경사(도 1I).
- 챔버를 37°C의 가열 챔버에 놓습니다. 이 순간부터 크로노미터가 시작됩니다(T= 0h). 실험은 37°C(T= 6h)에서 6시간 동안 실행됩니다.
5. 골수 의 실시간 관찰
- 골수 경전을 관찰하기 위해 비디오 카메라에 결합된 반전된 위상 대비 현미경(배율용 40x 렌즈)을 사용합니다. 관찰을 시작하기 전에 세포가 30 분 동안 배양하게하십시오. 관찰하는 동안 메가 카요세포가 움직이기 때문에 초점을 조정해야합니다.
참고: 다른 관찰 모드는 (예를 들어, DIC, 메가카요세포가 내인성 형광 마커를 표현하는 마우스를 이용한 형광)이 가능하지만, 위상 조영 현미경 검사는 길고 얇은 메가카요세포 확장을 명확하게 시각화하는 것이 최적입니다. 30분 후, 골수 세포는 점차 적으로 항층층을 형성하여 병자의 주변으로 이동합니다. 1h의 배양 후, 메가카요세포는 큰 크기와 폴리로부트핵(도1J,K)으로식별될 수 있다. 인큐베이션의 3 시간 후, 메가 카요세포의 수는 증가하고 일부는 긴 확장을 가지고있다. - 메가카르요세포의 변신을 녹화하기 위해 동영상을 만드세요.
6. 프로플라츠판 확장 메가카요세포의 정량화
- 인큐베이션챔버(도 1K)의각 섹션을 지역화하기 위해 맵을 그립니다.
- 1h 후 각 섹션의 주변에 보이는 메가카요세포(즉, 거대한 폴리로부트 셀)를 식별하고 도면에 위치를 플롯합니다. 3 및 6 시간 후에이 절차를 반복하십시오.
참고: 도면에 기초하여, 각 메가카요세포는 시간이 지남에 따라 쉽게 위치할 수 있으며, 분석된 형태의 진화(예: 크기, 변형, 프로플래틀렛 연장 등). 또 다른 가능성은 특정 탐색 소프트웨어의 사용입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
질적 결과. 실험의 시작 부분에서, 모든 세포는 골수 단면도에서 압축됩니다. 세포가 각성의 주변에서 명확하게 보이려면 30분이 걸립니다. 메가카요세포는 큰 크기로 인식될 수 있으며, 그 진화는 시간이 지남에 따라 연구될 수 있다(크기, 모양, 동적, 프로혈소판 연장 및 혈소판 방출)(그림2A). 작은 거대 카르요세포는 직경 20에서 30 μm 사이이며, 성숙한 둥근 메가카요세포는 확대된 세포질로 더 큽니다(직경 > 30μm). 몇 가지 어두운 메가카요세포가 관찰될 수있다(도 2C). 이들은 0.5%를 초과해서는 안 되는 죽은 세포를 나타냅니다. 이 값보다 높은 비율은 샘플 준비 문제를 나타냅니다. 핵의 형태는 초점을 변화시킴으로써 쉽게 시각화될 수 있다.
정량적 결과. 메가카요세포는 6.2에 설명된 대로 수동으로 계산됩니다. 인큐베이션 챔버의 밀봉 후 3 h 및 6 h에서 자신의 형태에 따라 분류. 도 2A는 4개의 필수 메가카요사이클 클래스를 요약합니다: (1) 작은 MK, (2) 큰 MK, (3) 두꺼운 확장이 있는 MK, (4) 얇고 길어지고, 확장된 확장이 있는 MKs. 이들은 나중에 전형적인 프롬판 형성 메가karyocytes, proplatelets를 따라 팽윤의 눈에 띄는 특성및 그들의 사지에 굴절싹의 존재. 매핑(그림 1K)의도움으로 시간이 지남에 따라 진화를 따를 수 있습니다. 결과는 각 관측 시간에 각 클래스의 백분율로 표시됩니다. 고전적으로, 주변에서 보이는 메가카요세포의 절반은 야생형 C57BL/6 마우스 골수(그림2B)의경우 6시간에서 프로플라틀을 연장한다.
시간이 지남에 따라 순차적인 이미지를 캡처하여 프로플라틀렛을 형성하는 방법을 이미지하여 라운드 MK의 운명을 따를 수있습니다(비디오 1). 흥미롭게도, 두꺼운 연장을 가진 MK가 3h의 기간 동안 감시될 때, 두꺼운 확장이 세포 체에서 분리되고 장혈소판으로 분기하거나 큰 둥근 MK를 개혁하기 위하여 철회할 수 있었다는 것을 관찰되었습니다.
| 시약 | H2O | ||||
| 스톡 I* | 16 g | 0.4 g | 2 g | 0.116 g | |
| 나Cl | KCL | 나에코3 | NaH2PO4, | ~ 100mL | |
| (2.73 M) | (53.6mM) | (238mM) | (8.6mM) | ||
| 스톡 II | 2.033 g MgCl2.6H2O (0.1 M) | ||||
| 주식 III | 2.19 g CaCl2.6H2O (0.1 M) | ~ 100mL | |||
| 헤페스 스톡** | 119 g HEPES* (0.5M) | ~ 1 L | |||
| 티로드의 버퍼*** | 5 mL 스톡 I | 1 mL 스톡 II | 2 mL 스톡 III | 1 mL HEPES 주식 | 1.8 mL 알부민 스톡 |
표 1: 타이로드 버퍼 준비. 각 스톡 솔루션은 테이블의 첫 번째 열에 표시됩니다. 각 스톡 솔루션에 필요한 시약(그램으로 제공)의 양뿐만 아니라 조성물은 행당 표시됩니다. 카탈로그 번호와 각 시약의 회사는 필수 공급의 테이블에 제공됩니다.
도 1: 골수 절제를 위한 샘플 제제 방법의 사진 표현. (A)골수 제제에 필요한 실험용 설정. (B)21 게이지 주사기 장착 바늘이 뼈에 삽입됩니다. (C)골수는 티로드의 완충제가 들어 있는 튜브로 플러시된다. (D)골수는 유리 슬라이드에 부드럽게 증착됩니다. (E)골수의 사지가 잘려나갑니다.(F)골수 실린더는 10000mm 두께의 부분으로 절단된다. (G-H) 10개의 단면은 인큐베이션 챔버로 옮겨지고 반전된 현미경을 사용하여 37°C에서 관찰된다. (I)골수의 10개의 부분을 포함하는 잠복실의 대표적인 사진. (J)말초 세포가 이동하여 메가카요세포가 보이는 층을 형성한다. (K)각 섹션에 대한 조직에서 마이그레이션한 메가카르요세포(X 블루 마크)의 위치뿐만 아니라 인큐베이션 챔버내 10개의 절제섹션을 설명하는 도면의 예. 화살표는 주변에 메가 카요사이클을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시간이 지남에 따라 각종에서 메가 카요세포의 형태학적 분류. (A)메가카요세포는 "작은", "큰", "두꺼운 확장" 또는 "프롬플래츠 연장"으로 분류됩니다. 바: 50 μm(B)각 클래스의 메가카르요세포 비율은 총 1,468메가카르요세포에 대해 1시간, 3시간 및 6h로 결정되었으며, "작은" 및 "구형" 메가카요사이클의 비율이 시간이 지남에 따라 감소하는 반면, 병렬로, 거대 카르요세포의 비율이 증가(nmice=6). 전형적으로, 3시간 후 WT 마우스의 각축에서, 섹션당 8.3과 11.5메가카르요세포사이를 관찰한다. 오류 표시줄은 각 샘플에 대한 평균의 표준 오류에 해당합니다. (C)어두운 메가카요시테의 대표적인 이미지. Bar: 50 μm(D)녹색 형광 단백질로 표시된 비근육 myosin II-A가 있는 메가카요세포의 대표적인 이미지. 바: 50 μm이 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: MK 확장 프로플라츠를 보여주는 타임랩스 비디오. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에서 우리는 골수에서 성장한 프로혈소를 확장하기 위하여 거대 karyocytes의 효율성을 평가하는 간단하고 저렴한 체외 방법을 기술합니다. 마우스에 대한 골수 각질 모델은 네 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 고급 기술 기술이 필요하지 않습니다. 둘째, 메가카요세포-연장 프로플라틀을 얻는 데 필요한 시간은 매우 짧고, 절제 방법에 대해서만 6시간밖에 되지 않는데, 이는 마우스 전조자로부터 시작되는 종래의 배양 방법에 대한 최소 4일에 비해 이다. 셋째, 소량의 조직만이 필요하며 얻어진 결과가 재현가능하다는 점을 감안할 때, 최소(보통 실험 조건당 6마우스)에 필요한 마우스의 수를 감소시켜 이러한 실험을 경제적이고 윤리적으로 효율적으로 만듭니다. 마지막으로, 그러나 중요한 것은, 이 방법의 힘은 그들의 자연 환경에서 완전히 발전한 거대 카르요세포의 사용에 있습니다, 문화 조건의 잠재적인 유물에 의해 시험관에서 가려질 수 있는 표현형을 드러내는 귀중한 증명할 수 있는. 이것은 이전에 생체 외에서 프로플라틀 형성에서 반대 결과가 발견된 메가 카요세포 제한 MYH9 비활성화를 가진 마우스에서 문서화되었습니다 (증가 된 형성)10 및 생체 내에서 (감소 된 형성) 분화 메가 카요세포11. 이러한 역설적 결과는 제약 환경에서 정상적인 거대 카르요세포 분화에 대한 myosin IIA의 요구 사항에 의해 설명되었으며, myosin IIA는 액체배양7에서메가카요세포 분화에 분배할 수 있다.
골수 박멸 모델의 흥미로운 적용은 체외배양(12)의경우와 같이 분화 과정을 방해하지 않고 혈소판 연장 과정에만 유전적 돌연변이 또는 결핍의 영향을 연구할 수 있다. 이상적인 상황은 처리 된 샘플과 대조물로 한 대퇴골의 골수를 사용하는 것입니다. 또한, 메가카요세포에서 자발적인 형광을 허용하는 형질전환 마우스의 사용은 혈소판 연장 과정의 시각화를 용이하게 한다. 형광 메가카요사이클을 시각화하기 위해 배양실에서 특정 거대 핵생물 마커에 형광 라벨이 부착된 항체를 첨가할 가능성이 있다. 또 다른 가능성은 형광 단백질을 표현하는 유전자 조작 마우스 모델의 사용일 수 있으며, 특히 CD41 라벨YFP를 가진 마우스와 같은 메가카르요세포 계보에서 이미 문헌13에보고된 마우스와 같은 거대 세포 계보, 또는 GFP가 비근육 myosinII-A14의 N-종향체에 연결되는 마우스와 같은 모든 세포에서 2D를도시한 바와 같이.
따라서 이 절제 방법은 자연 환경에서 혈소판 형성을 더 잘 이해하기 위해 질적 및 정량적 정보를 모두 제공합니다. 주목할만한,이 방법은 간단하고 빠르지만 고전적인 액체 문화를 사용하여 수행 된 연구에 보완 남아있다. 각각은 증식의 단계에 따라 별도의 지식을 제공합니다, 성숙, 혈소판의 확장과 혈소판 방출 하나는 공부하고자합니다. 예를 들어, 상기 외래 방법이 생리학적 맥락에서 성장한 거대 카르요세포에 의한 프로플라넷의 확장 능력에 대한 정보를 제공하는 경우, 체외 배양은 세포 리디지7 또는 세포외 매트릭스종속성(15)의충격과 같은 골수 마이크로환경의 중요성에 대한 정보를 제공한다. 따라서, 체외 거대 카르요세포 배양은 강성 및 접착제 단백질7,16의관점에서 미세 환경의 파라미터를 조절할 수 있게 한다. J. Boscher 등에서 "세포 성숙을 개선하고 강성과 감금의 영향을 연구하기 위해 3차원 메틸셀룰로오스 기반 하이드로겔의 메가카요세포 배양"을 참고하여 자세한 내용을 제시하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자들은 장 이브 린켈, 줄리 보셔, 패트리샤 래퍼, 모니크 프룬드, 케티 크네즈-히퍼트에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 ANR (기관 국가 드 라 Recherche) 그랜트 ANR-17-CE14-0001-01 및 ANR-18-CE14-0037에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
