Summary
هنا، ونحن بالتفصيل طريقة explant نخاع العظم، من إعداد العينة لتحليل الشريحة المجهرية، لتقييم قدرة megakaryocytes التي تمايزت في بيئتها الفسيولوجية لتشكيل الصفائح.
Abstract
المرحلة الأخيرة من megakaryopoiesis يؤدي إلى ملحقات السيتوبلازمية من megakaryocytes ناضجة، ما يسمى proplatelets. وقد تم تعلم الكثير عن تشكيل البربليتليت باستخدام في المختبر- megakaryocytes المتمايزة؛ ومع ذلك ، هناك أدلة متزايدة على أن نظم الثقافة التقليدية لا تلخص بأمانة عملية التمايز / النضج التي تأخذ أماكن داخل نخاع العظام. في هذه المخطوطة، نقدم طريقة تفسيرية وصفها في البداية في عام 1956 من قبل ثيري وسيس لتصور الخلايا الضخمة التي نضجت في بيئتها الأصلية، وبالتالي التحايل على القطع الأثرية المحتملة والتفسيرات الخاطئة. يتم جمع نخاع العظم الطازج عن طريق مسح عظم الفخذ من الفئران، وشرائح إلى أقسام عرضية 0.5 ملم، ووضعها في غرفة حضانة في 37 درجة مئوية تحتوي على عازل الفسيولوجية. تصبح الخلايا الضخمة مرئية تدريجيا في المحيط المكشوف ويتم ملاحظتها حتى 6 ساعات تحت مجهر مقلوب إلى جانب كاميرا فيديو. مع مرور الوقت ، تغير الخلايا الضخمة شكلها ، مع بعض الخلايا التي لها شكل كروي والبعض الآخر تطوير ملحقات سميكة أو تمديد العديد من الصفائح الرفيعة مع تفريع واسع النطاق. وتجرى تحقيقات نوعية وكمية على السواء. هذه الطريقة لديها ميزة كونها بسيطة، استنساخها، وبسرعة كما megakaryocytes عديدة موجودة، وكلاسيكيا نصفها شكل proplatelets في 6 ساعات مقارنة مع 4 أيام لmegakaryocytes الماوس المثقف. بالإضافة إلى دراسة الفئران المتحولة ، فإن التطبيق المثير للاهتمام لهذه الطريقة هو التقييم المباشر للعوامل الدوائية على عملية تمديد الصفائح الدموية ، دون التدخل في عملية التمايز التي قد تحدث في الثقافات.
Introduction
تم تطوير تقنية explant نخاع العظم لأول مرة من قبل ثيري واسيس في عام 1956 لوصف تشكيل ملحقات السيتوبلازمية megakaryocyte الفئران كحدث أولي في تشكيل الصفائح الدموية1. باستخدام النقيض من المرحلة والتقنيات السينمائية ، وصف هؤلاء المؤلفون تحويل الخلايا الضخمة المستديرة الناضجة إلى خلايا خثارية "تشبه الحبار" مع ملحقات السيتوبلازمية التي تظهر حركات ديناميكية للاستطالة والانكماش. تصبح هذه الأسلحة أرق تدريجيا حتى تصبح شكل خيوط مع تورمات صغيرة على طول الذراعين وعلى النصائح. هذه الاستطالات megakaryocyte نموذجية، التي تم الحصول عليها في المختبر وفي وسائل الإعلام السائلة، لديها بعض أوجه التشابه مع الصفائح الدموية لوحظ في نخاع العظام الثابتة، حيث megakaryocytes تبرز امتدادات طويلة من خلال الجدران sinusoid في الدورة الدموية2،3. اكتشاف والاستنساخ من TPO في عام 1994، سمح للتمييز بين megakaryocytes في الثقافة قادرة على تشكيل ملحقات proplatelet تشبه تلك الموصوفة في نخاع العظم explants4،5،6. ومع ذلك ، فإن نضوج megakaryocyte أقل كفاءة بكثير في ظروف الثقافة ، ولا سيما شبكة الأغشية الداخلية الواسعة من خلايا العظم الضخمة الناضجة المتخلفة في الخلايا الضخمة المستزرعة ، مما يعيق الدراسات على آليات التكوين الحيوي للصفائح الدموية7،8.
نحن بالتفصيل هنا نموذج explant نخاع العظم، استنادا إلى ثيري واسيس، لمتابعة في الوقت الحقيقي تشكيل proplatelet من الخلايا العملاقة الماوس، والتي نضجت تماما في بيئتها الأصلية، وبالتالي التحايل على القطع الأثرية في المختبر ممكن وسوء التفسير. يتم تقديم النتائج التي تم الحصول عليها في الفئران البالغة البرية لتوضيح قدرة الخلايا العملاقة على تمديد الصفائح ، ومورفولوجياها وتعقيد الصفائح. كما نقدم استراتيجية قياس سريع للتحقق من الجودة لضمان دقة البيانات ومتانتها خلال عملية تسجيل الخلايا الضخمة. البروتوكول المعروض هنا هو أحدث إصدار من الأسلوب المنشور كفصل كتاب سابقا9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمعايير الأوروبية 2010/63/EU ولجنة CREMEAS المعنية بأخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة لجامعة ستراسبورغ (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. إعداد الكواشف
- إعداد الكواشف كما هو موضح في الجدول 1.
- للسهم I، حل كل مسحوق على حدة. تأكد من أن osmolarity من إعداد أعلى من 295 mOsm / L. يمكن تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية لمدة عام واحد.
- لإعداد العازلة التيرود، وجعل الحل كما هو موضح في الجدول 1،وضبط حجم إلى 100 مل مع الماء المقطر وإضافة 0.1 غرام D اللامائية (+) السكروز. ضبط إلى درجة الحموضة 7.3 باستخدام 1 N HCl حسب الحاجة و osmolarity إلى 295 mOsm/L. لمنع نمو البكتيريا، أضف البنسلين G بتركيز نهائي 10 U/mL وكبريتات الستريبتومايسين عند تركيز نهائي 0.29 ملغم/مل. تصفية الحل النهائي من خلال المسام 0.22 ميكرومتر.
2. إعداد الإعداد التجريبي
- في يوم التجربة، قم بتسخين المخزن المؤقت للتيرود عند 37 درجة مئوية، ثم قم بتشغيل غرفة تسخين المجهر لرفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد جميع الأدوات اللازمة، مثل جهاز توقيت، غرف الحضانة، 5 مسيل للمحاقن، 21 G، ملقط، شفرة الحلاقة، ماصة باستور، الشرائح الزجاجية، و15 مل أنبوب الطرد المركزي (الشكل 1A).
3. عزل نخاع عظم الفأر
- القتل الرحيم C57BL/6 الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا عن طريق الاختناق CO2 وخلع عنق الرحم. وينبغي أن يتم ذلك بسرعة من قبل شخص مؤهل ومؤهل.
- لتجنب التلوث الميكروبي، انقع جسم الفأر في الإيثانول بنسبة 70٪ (v/v) قبل إزالة عظم الفخذ. استخدام أدوات تطهيرها في الإيثانول 70٪ للتشريح. جمع عظم الفخذين وتنظيفها عن طريق إزالة أي الأنسجة الملتصقة. بعد الغمر السريع في الإيثانول، وضعها في أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على العازلة 2 مل ترود.
- قطع epiphyses باستخدام شفرة حلاقة حادة وتدفق نخاع العظام باستخدام حقنة 5 مل مليئة 2 مل Tyrdode العازلة. لتحقيق ذلك، أدخل إبرة 21 G في فتح عظم الفخذ (على جانب الركبة) واضغط ببطء المكبس لاسترداد اسطوانة نخاع سليمة (الشكل 1B، C). حافظ على جلسة جمع النخاع قصيرة قدر الإمكان (أقل من 10 دقائق).
4. قسم نخاع العظم ووضعها في غرفة الحضانة
- استخدام ماصة بلاستيكية 3 مل لنقل بعناية وبلطف نخاع العظام سليمة على شريحة زجاجية. من المهم أن يتم تغطية العينات مع العازلة لمنع تجفيف (الشكل 1D).
ملاحظة: تجنب تدفق إعادة التدفق لتقليل المقصات التي يمكن أن ينفصم الأنسجة. - تحت مجسم (10x)، قطع نهايات النخاع التي قد تكون مضغوطة في وقت تدفق. ثم قطع المقاطع العرضية مع شفرة حلاقة حادة. يجب أن تكون المقاطع رقيقة بما يكفي للسماح بمراقبة مفصلة ولكن تأكد من عدم تلف الخلايا الضخمة بسبب الضغط (سمك عادة حوالي 0.5 مم) (الشكل 1E، F).
ملاحظة: يتم إجراء المقاطع مع شفرة حلاقة حادة وتحت مكبر لضبط سمكها إلى حوالي 0.5 ملم. يتم تحديد فقط أقسام سمك موحد. هذا الإجراء ليس معقدا ولكن توحيده يتطلب بعض الخبرة. - باستخدام ماصة بلاستيكية، وجمع 10 أقسام في أنبوب 1 مل تحتوي على العازلة التيرود(الشكل 1G).
- نقل بعناية أقسام إلى غرفة حضانة بقطر 13 ملم (الشكل 1H).
- يستنشق المخزن المؤقت وضبط حجم إلى 30 ميكرولتر من العازلة التيرود تكملها مع 5 ٪ مصل الماوس.
ملاحظة: في هذه المرحلة يمكن إضافة عوامل دوائية لتقييم تأثيرها على تكوين البربليتليه. - ضع المقاطع على مسافة. ختم غرفة ذاتية اللصق مع غطاء من البعد 22 × 55 ملم. المنحدر غطاء بينما التمسك لتجنب تشكيل فقاعات الهواء (الشكل 1I).
- ضع الغرفة في غرفة التدفئة عند 37 درجة مئوية. من هذه اللحظة، يتم بدء الكرونومتر (T = 0 ساعة). تعمل التجربة لمدة 6 ساعة عند 37 درجة مئوية (T = 6 ساعة).
5. المراقبة في الوقت الحقيقي من explants النخاع
- استخدام المجهر النقيض المرحلة مقلوب (عدسة 40x للتكبير) إلى جانب كاميرا فيديو لمراقبة explants نخاع العظم. دع الخلايا تحتضن لمدة 30 دقيقة قبل بدء الملاحظة. أثناء المراقبة ، من الضروري ضبط التركيز لأن الخلايا الضخمة تتحرك.
ملاحظة: أوضاع مراقبة أخرى ممكنة (على سبيل المثال، DIC، الفلورسينس باستخدام الفئران التي تعبر خلاياها الضخمة عن علامة فلورية داخلية)، ولكن المجهر التبايني للمرحلة هو الأمثل لتصور ملحقات megakaryocyte الطويلة والرقيقة بوضوح، مما يسمح بالتحديد الكمي الدقيق. بعد 30 دقيقة ، تهاجر خلايا النخاع تدريجيا إلى محيط الإكسبلانت ، وتشكل طبقة أحادية. بعد 1 ساعة من الحضانة ، يمكن تحديد الخلايا الضخمة بحجمها الكبير ونوى متعددة الأضلاع(الشكل 1J، K). بعد 3 ساعة من الحضانة ، يزداد عدد الخلايا الضخمة وبعضها له امتدادات طويلة. - جعل أشرطة الفيديو لتسجيل التحول من الخلايا الضخمة.
6. القياس الكمي للخلايا الضخمة الممتدة من الصفيحات
- رسم خريطة لترجمة كل قسم في غرفة الحضانة (الشكل 1K).
- بعد ساعة واحدة، حدد الخلايا الضخمة المرئية (أي الخلايا العملاقة متعددة الأضلاع) على محيط كل قسم ورسم مواقعها على الرسم. كرر هذا الإجراء بعد 3 و 6 ساعة.
ملاحظة: على أساس الرسم، يمكن تحديد موقع كل megakaryocyte بسهولة مع مرور الوقت وتطور مورفولوجيا تحليلها (على سبيل المثال، حجم، تشوه، تمديد اللوحة، الخ). وثمة احتمال آخر هو استخدام برنامج ملاحة محدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النتائج النوعية. في بداية التجربة، يتم ضغط جميع الخلايا في قسم نخاع العظم. يستغرق 30 دقيقة للخلايا لتصبح مرئية بوضوح على هامش explants. ثم يمكن التعرف على الخلايا الضخمة من خلال حجمها الكبير ويمكن بعد ذلك دراسة تطورها مع مرور الوقت (الحجم والشكل والديناميكية وتمديد الصفائح الدموية وإطلاق الصفائح الدموية) (الشكل 2A). يبلغ قطر الخلايا الضخمة الصغيرة ما بين 20 و30 ميكرومترا ويتم تعدد لوية نواتها في حين أن الخلايا الضخمة المستديرة الناضجة أكبر (قطرها > 30 ميكرومتر) مع سيتوبلازم موسع. ويمكن ملاحظة عدد قليل من megakaryocytes الظلام (الشكل 2C). وتمثل هذه الخلايا الميتة التي لا ينبغي أن تتجاوز نسبتها 0.5 في المائة. نسبة أعلى من هذه القيمة تشير إلى مشكلة إعداد عينة. يمكن تصور مورفولوجيا النواة بسهولة عن طريق تغيير التركيز.
النتائج الكمية. يتم حساب الخلايا الضخمة يدويا كما هو موضح في 6.2. وتصنيفها وفقا لمورفولوجيا في 3 ساعة و 6 ساعة بعد ختم غرفة الحضانة. يلخص الشكل 2A فئات الخلايا الضخمة الأساسية الأربعة: (1) MKs صغيرة ، (2) MKs كبيرة ، (3) MKs مع ملحقات سميكة ، (4) MKs مع امتدادات رقيقة وممدودة وممشوقة. هذه هي في وقت لاحق نموذجية proplatelet تشكيل megakaryocytes، مع خصائص بارزة من تورمات على طول الصفائح الدموية ووجود براعم الانكسار في أطرافها. بمساعدة رسم الخرائط (الشكل 1K) ، يمكن متابعة تطورها مع مرور الوقت. يتم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من كل فئة في كل وقت مراقبة. كلاسيكيا، نصف megakaryocytes مرئية في محيط تمديد الصفائح في 6 ساعات للبرية نوع C57BL/6 نخاع عظم الماوس (الشكل 2B).
فمن الممكن لمتابعة مصير MKs الجولة عن طريق التقاط الصور المتتابعة مع مرور الوقت لصورة كيف أنها تشكل proplatelets (فيديو 1). ومن المثير للاهتمام، عندما تم رصد MKs مع ملحقات سميكة على مدى فترة 3 ساعة، لوحظ أن ملحقات سميكة يمكن أن تنفصل إما من جسم الخلية وتتفرع إلى الصفائح أو التراجع لإصلاح MKs جولة كبيرة.
| الكواشف | H2O | ||||
| الأسهم I* | 16 غرام | 0.4 غرام | 2 غرام | 0.116 غرام | |
| ناكل | KCL | ناهكو3 | NaH2PO4, | إلى 100 مل | |
| (2.73 متر) | (53.6 متر في اليوم) | (238 متر في اليوم) | (8.6 متر في اليوم) | ||
| الأسهم الثانية | 2.033 غرام مجمكل2.6H2O (0.1 م) | ||||
| الأسهم الثالثة | 2.19 غرام من الكاكل2.6H2O (0.1 م) | إلى 100 مل | |||
| أسهم HEPES** | 119 غرام HEPES* (0.5M) | إلى 1 لتر | |||
| تايرود العازلة *** | 5 مل من المخزون I | 1 مل من الأسهم الثانية | 2 مل من الأسهم الثالثة | 1 مل من أسهم HEPES | 1.8 مل الألبومين الأسهم |
الجدول 1: إعداد المخزن المؤقت للتيرود. يشار إلى كل حل المخزون في العمود الأول من الجدول. يتم الإشارة إلى التركيب وكذلك كمية الكاشف (المعطاة بالجرام) المطلوبة لكل محلول مخزون في الصف الواحد. يتم إعطاء رقم الكتالوج وشركة كل كاشف في جدول الإمدادات الأساسية.
الشكل 1: تمثيلات فوتوغرافية لطريقة إعداد العينة للنخاع العظمي explant. (أ) الإعداد التجريبي المطلوب لإعداد نخاع العظم. (ب) يتم إدخال إبرة مثبتة على حقنة قياس 21 في العظام. (ج) يتم مسح نخاع العظم في أنبوب يحتوي على العازلة التيرود. (د)ثم يودع نخاع العظم بلطف على شريحة زجاجية. (ه) يتم قطع أطراف نخاع العظم. (F) يتم قطع أسطوانة النخاع إلى عشرة أقسام سميكة 0.5 مم. (G-H) يتم نقل الأقسام العشرة إلى غرفة حضانة ومراقبتها عند 37 درجة مئوية باستخدام مجهر مقلوب. صورةتمثيلية لغرفة حضانة تحتوي على عشرة أقسام من نخاع العظم. (J)الخلايا الطرفية تهاجر لتشكيل طبقة تصبح فيها الخلايا الضخمة مرئية. (ك)مثال رسم يوضح أقسام explant العشرة في غرفة الحضانة وكذلك موقع الخلايا الضخمة (علامة زرقاء X) التي هاجرت من الأنسجة لكل قسم. يظهر السهم كريات الدم الضخمة في المحيط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصنيف مورفولوجي للخلايا العملاقة في explants مع مرور الوقت. (أ) يتم تصنيف Megakaryocytes بأنها "صغيرة" ، "كبيرة" ، مع "تمديد سميك" أو "تمديد proplatelet". القضبان: تم تحديد 50 ميكرومتر(ب)نسبة الخلايا العملاقة في كل فئة عند 1 ساعة و3 ح و6 ح لما مجموعه 1468 خلية عملاقة، مما يدل على أن نسبة الخلايا الضخمة "الصغيرة" و"الكروية" تنخفض مع مرور الوقت، في حين أن نسبة الخلايا الضخمة التي توسع الزيادات في اللوحات (n=6 الفئران). عادة، في explants من فأر WT بعد 3 ساعة، لوحظ بين 8.3 و 11.5 megakaryocytes لكل قسم. يتوافق شريط الخطأ مع الخطأ القياسي للمؤسط لكل عينة. (ج) صورة تمثيلية لخلايا عملاقة داكنة. شريط: 50 ميكرومتر(D)صورة تمثيلية من megakaryocyte مع الميوزين غير العضلي II-A المسمى مع بروتين الفلورسنت الأخضر. شريط: 50 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: فيديو الفاصل الزمني يظهر MK تمديد proplatelets. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نحن نصف طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة في المختبر لتقييم كفاءة الخلايا الضخمة لتوسيع الصفائح التي نمت في نخاع العظام. نموذج نخاع العظم explant للفأر لديه أربع مزايا رئيسية. أولا، لا توجد مهارات تقنية متقدمة مطلوبة. ثانيا، الوقت اللازم للحصول على صفائح عملاقة تمتد كريات الدم قصيرة جدا، فقط 6 ساعات لطريقة explant، مقارنة مع ما لا يقل عن 4 أيام لطريقة الثقافة التقليدية بدءا من السلف الماوس. ثالثا، نظرا إلى أن هناك حاجة إلى كمية صغيرة فقط من الأنسجة وأن النتائج التي تم الحصول عليها قابلة للاستنساخ، فإنه يقلل من عدد الفئران اللازمة إلى الحد الأدنى (عادة 6 فئران لكل حالة تجريبية)، مما يجعل هذه التجارب فعالة اقتصاديا وأخلاقيا. وأخيرا ، ولكن الأهم من ذلك ، تكمن قوة هذه الطريقة في استخدام الخلايا الضخمة التي تطورت بشكل كامل في بيئتها الطبيعية ، والتي قد تكون لا تقدر بثمن في الكشف عن الأنماط الظاهرية التي يمكن إخفائهم في المختبر من قبل القطع الأثرية المحتملة لظروف الثقافة. وقد تم توثيق هذا سابقا في الفئران مع تعطيل MYH9 megakaryocyte المقيدة حيث تم العثور على نتائج متعارضة على تشكيل البربليت في المختبر (زيادة تشكيل)10 وفي الجسم الحي (انخفاض تشكيل) megakaryocytes متمايزة11. وقد تم تفسير هذه النتائج المتناقضة من خلال شرط من IIA myosin لتمايز megakaryocyte العادية في بيئة القيود، في حين أن IIA myosin يمكن الاستغناء عنها لتمايز megakaryocyte في الثقافة السائلة7.
تطبيق مثير للاهتمام لنموذج استئصال نخاع العظم هو إمكانية دراسة تأثير الطفرات الجينية أو أوجه القصور في الفئران المعدلة وراثيا و / أو العوامل الدوائية حصرا على عملية تمديد الصفائح الدموية ، دون التدخل في عملية التفريق كما هو الحال في الثقافة المختبرية12. الوضع المثالي هو استخدام نخاع العظم من عظم الفخذ كعينة تعامل ونظيره كسيطرة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تسمح بالفلورسينس التلقائي في الخلايا الضخمة يسهل تصور عملية تمديد الصفائح الدموية. لتصور الخلايا العملاقة الفلورية، يمكن أن يكون أحد الاحتمالات هو إضافة أجسام مضادة تحمل علامة الفلورسينس ضد علامات محددة للخلايا الضخمة في غرفة الثقافة. ويمكن أن يكون هناك احتمال آخر هو استخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين الفلورسنت، إما على وجه التحديد في النسب megakaryocytic مثل الفئران مع YFP CD41 المسمى ذكرت بالفعل في الأدب13،أو في جميع الخلايا مثل الفئران حيث يرتبط GFP إلى N-terminus من الميوزين غير العضلي II-A14 كما هو موضح في الشكل 2D.
ولذلك، توفر طريقة الزرع هذه معلومات نوعية وكمية لفهم أفضل لتكوين الصفائح الدموية في بيئتها الطبيعية. الجدير بالذكر، على الرغم من أن هذه الطريقة بسيطة وسريعة فإنه لا يزال مكملا للدراسات التي أجريت باستخدام الثقافة السائلة الكلاسيكية. كل واحد يجلب معرفة منفصلة وفقا لمراحل الانتشار والنضج وتمديد الصفائح الدموية وإطلاق الصفائح الدموية التي يرغب المرء في دراستها. على سبيل المثال، عندما يعطي الأسلوب explant معلومات عن قدرة تمديد البروبليت من قبل megakaryocytes التي نمت في سياق الفسيولوجية، في الثقافة المختبرية يوفر معلومات عن أهمية البيئة الدقيقة نخاع العظم مثل تأثير خلية تخلص7 أو التبعية مصفوفة خارج الخلية15. وهكذا، في الثقافات megakaryocyte المختبر تجعل من الممكن لتعديل المعلمات من البيئة الدقيقة من حيث صلابة والبروتينات اللاصقة7،16. يرجى الرجوع إلى مقال "Megakaryocyte الثقافة في هيدروجيل ثلاثي الأبعاد القائم على ميثيلسليلوز لتحسين نضوج الخلايا ودراسة تأثير تصلب والحبس" من قبل J. Boscher وآخرون، التي قدمت في هذه المسألة لمزيد من المعلومات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا جان إيف رينكل وجولي بوشر وباتريشيا لاوفر ومونيك فرويند وكيتي كنيز - هيبرت على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل من قبل ANR (وكالة الوطنية للريشة) منح ANR-17-CE14-0001-01 و ANR-18-CE14-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
