Summary
Hier beschreiben wir die Knochenmark-Explantationsmethode, von der Probenvorbereitung bis zur mikroskopischen Objektträgeranalyse, um die Fähigkeit von Megakaryozyten, die sich in ihrer physiologischen Umgebung differenziert haben, zu bewerten, Proplatelette zu bilden.
Abstract
Das letzte Stadium der Megakaryopoese führt zu zytoplasmatischen Erweiterungen aus reifen Megakaryozyten, den sogenannten Proplaten. Es wurde viel über die Proplatbildung unter Verwendung von in vitro-differenziertenMegakaryozyten gelernt; Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass herkömmliche Kultursysteme den Differenzierungs- / Reifungsprozess, der im Knochenmark stattfindet, nicht getreu rekapitulieren. In diesem Manuskript stellen wir eine explantierte Methode vor, die ursprünglich 1956 von Thiéry und Bessis beschrieben wurde, um Megakaryozyten zu visualisieren, die in ihrer natürlichen Umgebung gereift sind, wodurch potenzielle Artefakte und Fehlinterpretationen umgangen werden. Frische Knochenmarke werden durch Spülen der Oberschenkelknochen von Mäusen gesammelt, in 0,5 mm Querschnitte geschnitten und in eine Inkubationskammer bei 37 °C gegeben, die einen physiologischen Puffer enthält. Megakaryozyten werden allmählich an der explantaten Peripherie sichtbar und werden bis zu 6 Stunden unter einem inversen Mikroskop in Verbindung mit einer Videokamera beobachtet. Im Laufe der Zeit ändern Megakaryozyten ihre Form, wobei einige Zellen eine kugelförmige Form haben und andere dicke Erweiterungen entwickeln oder viele dünne Proplateletten mit ausgedehnter Verzweigung verlängern. Es werden sowohl qualitative als auch quantitative Untersuchungen durchgeführt. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie einfach, reproduzierbar und schnell ist, da zahlreiche Megakaryozyten vorhanden sind, und klassischerweise bildet die Hälfte von ihnen Proplatelette in 6 Stunden im Vergleich zu 4 Tagen für kultivierte Maus-Megakaryozyten. Neben der Untersuchung von mutierten Mäusen ist eine interessante Anwendung dieser Methode die einfache Bewertung der pharmakologischen Wirkstoffe auf dem Proplatlet-Erweiterungsprozess, ohne den Differenzierungsprozess, der in Kulturen auftreten kann, zu stören.
Introduction
Die Knochenmark-Explantationstechnik wurde erstmals 1956 von Thiéry und Bessis entwickelt, um die Bildung von zytoplasmatischen Erweiterungen von Megakaryozyten bei Ratten als erstes Ereignis bei der Thrombozytenbildung zu beschreiben1. Mit Hilfe von Phasenkontrast und kinematografischen Techniken charakterisierten diese Autoren die Umwandlung reifer runder Megakaryozyten in "tintenfischartige" thrombozytogene Zellen mit zytoplasmatischen Erweiterungen, die dynamische Bewegungen der Dehnung und Kontraktion zeigen. Diese Arme werden zunehmend dünner, bis sie mit kleinen Schwellungen entlang der Arme und an den Spitzen filiform werden. Diese typischen Megakaryozytendehnungen, die in vitro und in flüssigen Medien erhalten werden, weisen bestimmte Ähnlichkeiten mit Blutplättchen auf, die im festsitzenden Knochenmark beobachtet wurden, wo Megakaryozyten lange Ausdehnungen durch die Sinuswände in den Blutkreislauf ragen2,3. Die Entdeckung und Klonierung von TPO im Jahr 1994 ermöglichte es, Megakaryozyten in Kultur zu differenzieren, die in der Lage sind, Proplatleterweiterungen zu bilden, die denen ähneln, die in den Knochenmark-Explantaten4,5,6beschrieben sind. Die Megakaryozytenreifung ist jedoch unter Kulturbedingungen weit weniger effizient, insbesondere das ausgedehnte interne Membrannetzwerk von knochenmarkgereiften Megakaryozyten ist in kultivierten Megakaryozyten unterentwickelt, was Studien über die Mechanismen der Thrombozytenbiogenese behindert7,8.
Wir beschreiben hier das Knochenmark-Explantatmodell, das auf Thiéry und Bessis basiert, um in Echtzeit die Proplatletbildung von Maus-Megakaryozyten zu verfolgen, die in ihrer nativen Umgebung vollständig gereift sind und so mögliche In-vitro-Artefakte und Fehlinterpretationen umgehen. Ergebnisse, die an erwachsenen Wildtyp-Mäusen gewonnen wurden, werden vorgestellt, um die Fähigkeit von Megakaryozyten zur Erweiterung von Proplaten, ihre Morphologie und die Komplexität von Proplaten zu veranschaulichen. Wir führen auch eine schnelle Quantifizierungsstrategie für die Qualitätsvalidierung ein, um die Genauigkeit und Robustheit der Daten während des Megakaryozyten-Aufzeichnungsprozesses sicherzustellen. Das hier vorgestellte Protokoll ist die neueste Version der Methode, die als Buch kapitel zuvor9veröffentlicht wurde.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Normen 2010/63/EU und dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) durchgeführt.
1. Herstellung von Reagenzien
- Reagenzien wie in Tabelle 1beschrieben vorbereiten.
- Für die Brühe I jedes Pulver separat auflösen. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität der Zubereitung höher als 295 mOsm/L ist. Diese Lösung kann bei 4 °C für ein Jahr gelagert werden.
- Für die Tyrode-Puffervorbereitung die Lösung wie in Tabelle 1beschrieben herstellen, das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml einstellen und 0,1 g wasserfreie D (+)-Saccharose zugeben. Stellen Sie bei Bedarf mit 1 N HCl auf pH 7,3 und die Osmolarität auf 295 mOsm/L ein. Um das Bakterienwachstum zu verhindern, fügen Sie Penicillin G in 10 U / ml Endkonzentration und Streptomycinsulfat in 0,29 mg / ml Endkonzentration hinzu. Die endgültige Lösung wird durch Poren von 0,22 μm filtriert.
2. Vorbereitung des Versuchsaufbaus
- Erwärmen Sie am Tag des Experiments den Tyrode-Puffer auf 37 ° C und schalten Sie die Heizkammer des Mikroskops ein, um die Temperatur auf 37 ° C zu bringen.
- Bereiten Sie alle notwendigen Werkzeuge vor, wie z. B. einen Timer, Inkubationskammern, 5-ml-Spritzen, 21 G, eine Pinzette, eine Rasierklinge, Pasteurpipetten, Glasobjektträger und ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen (Abbildung 1A).
3. Isolierung des Knochenmarks der Maus
- Euthanasie C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen durch CO 2-Erstickung und zervikale Luxation. Dies sollte schnell von einer kompetenten und qualifizierten Person erledigt werden.
- Um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden, tränken Sie den Mauskörper in 70% (v / v) Ethanol, bevor Sie die Femuren entfernen. Verwenden Sie instrumente, die in 70% Ethanol desinfiziert sind, für die Dissektion. Sammeln Sie die beiden Femuren und reinigen Sie sie, indem Sie anhaftendes Gewebe entfernen. Nach schnellem Eintauchen in Ethanol werden sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 2 ml Tyrode-Puffer gegeben.
- Schneiden Sie die Epiphysen mit einer scharfen Rasierklinge weg und spülen Sie das Knochenmark mit einer 5 ml Spritze, die mit 2 ml Tyrode-Puffer gefüllt ist. Um dies zu erreichen, führen Sie eine 21 G Nadel in die Öffnung des Femurs (auf der Knieseite) ein und drücken Sie langsam auf den Kolben, um einen intakten Markzylinder zu entnehmen (Abbildung 1B,C). Halten Sie die Knochenmarkentnahme so kurz wie möglich (unter 10 Min.).
4. Schneiden des Knochenmarks und Einsetzen in die Inkubationskammer
- Verwenden Sie eine 3 ml Kunststoffpipette, um das intakte Knochenmark vorsichtig und vorsichtig auf einen Glasobjektträger zu übertragen. Es ist wichtig, dass die Proben mit Puffer bedeckt sind, um ein Austrocknen zu verhindern (Abbildung 1D).
HINWEIS: Vermeiden Sie Flow-Reflow, um Scheren zu minimieren, die das Gewebe dissoziieren könnten. - Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop (10x) die Enden des Knochenmarks ab, die zum Zeitpunkt der Spülung möglicherweise komprimiert wurden. Dann schneiden Sie Querabschnitte mit einer scharfen Rasierklinge. Abschnitte sollten dünn genug sein, um eine detaillierte Beobachtung zu ermöglichen, aber sicherstellen, dass Megakaryozyten nicht durch Kompression beschädigt werden (normalerweise Dicke um 0,5 mm)(Abbildung 1E,F).
HINWEIS: Die Abschnitte werden mit einer scharfen Rasierklinge und unter einer Lupe hergestellt, um ihre Dicke auf etwa 0,5 mm einzustellen. Es werden nur die Abschnitte mit gleichmäßiger Dicke ausgewählt. Dieses Verfahren ist nicht kompliziert, aber seine Standardisierung erfordert einige Erfahrung. - Sammeln Sie mit einer Kunststoffpipette 10 Abschnitte in einem 1-ml-Röhrchen, das Tyrodes Puffer enthält (Abbildung 1G).
- Vorsichtig werden die Abschnitte in eine Inkubationskammer mit einem Durchmesser von 13 mm überführt (Abbildung 1H).
- Aspirieren Sie den Puffer und stellen Sie das Volumen auf 30 μL des Tyrode-Puffers ein, der mit 5 % Mausserum ergänzt wird.
HINWEIS: In diesem Stadium können pharmakologische Wirkstoffe hinzugefügt werden, um ihren Einfluss auf die Proplatletbildung zu bewerten. - Positionieren Sie die Abschnitte im Abstand. Versiegeln Sie die Selbstklebekammer mit einem Deckglas im Format 22 x 55 mm. Neigen Sie den Deckstab beim Kleben an, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden (Abbildung 1I).
- Stellen Sie die Kammer bei 37 °C in die Heizkammer. Ab diesem Moment wird der Chronometer gestartet (T= 0 h). Das Experiment läuft 6 h bei 37 °C (T= 6 h).
5. Echtzeitbeobachtung von Knochenmark-Explantaten
- Verwenden Sie ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop (40-fache Linse zur Vergrößerung), das mit einer Videokamera gekoppelt ist, um die Knochenmark-Explantate zu beobachten. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang inkubieren, bevor Sie mit der Beobachtung beginnen. Während der Beobachtung ist es notwendig, den Fokus anzupassen, da sich Megakaryozyten bewegen.
HINWEIS: Andere Beobachtungsmodi sind möglich (z. B. DIC, Fluoreszenz mit Mäusen, deren Megakaryozyten einen endogenen fluoreszierenden Marker exprimieren), aber die Phasenkontrastmikroskopie ist optimal, um die langen und dünnen Megakaryozytenerweiterungen klar sichtbar zu machen, was eine präzise Quantifizierung ermöglicht. Nach 30 min wandern die Markzellen allmählich an die Peripherie der Explant und bilden eine Monoschicht. Nach 1 h Inkubation können Megakaryozyten durch ihre große Größe und polylobulierte Kerne identifiziert werden (Abbildung 1J, K). Nach 3 h Inkubation nimmt die Anzahl der Megakaryozyten zu und einige haben lange Verlängerungen. - Machen Sie Videos, um die Transformation der Megakaryozyten aufzuzeichnen.
6. Quantifizierung der Proplatlet-verlängernden Megakaryozyten
- Zeichnen Sie eine Karte, um jeden Abschnitt in der Inkubationskammer zu lokalisieren (Abbildung 1K).
- Identifizieren Sie nach 1 h die sichtbaren Megakaryozyten (dh riesige polylobulierte Zellen) an der Peripherie jedes Abschnitts und zeichnen Sie ihre Positionen auf der Zeichnung auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach 3 und 6 Stunden.
HINWEIS: Auf der Grundlage der Zeichnung kann jeder Megakaryozyt im Laufe der Zeit leicht lokalisiert und die Entwicklung seiner Morphologie analysiert werden (z. B. Größe, Verformung, Proplatenerweiterung usw.). Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung einer speziellen Navigationssoftware.
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Representative Results
Qualitative Ergebnisse. Zu Beginn des Experiments werden alle Zellen im Knochenmarkabschnitt verdichtet. Es dauert 30 Minuten, bis die Zellen an der Peripherie der Explantate deutlich sichtbar werden. Die Megakaryozyten sind dann an ihrer Größe erkennbar und ihre Entwicklung kann dann im Laufe der Zeit untersucht werden (Größe, Form, Dynamik, Proplatletverlängerung und Thrombozytenfreisetzung) (Abbildung 2A). Kleine Megakaryozyten haben einen Durchmesser zwischen 20 und 30 μm und ihre Kerne sind polylobuliert, während reife runde Megakaryozyten größer sind (> 30 μm Durchmesser) mit einem vergrößerten Zytoplasma. Einige dunkle Megakaryozyten können beobachtet werden (Abbildung 2C). Dabei handelt es sich um abgestorbene Zellen, deren Anteil 0,5% nicht überschreiten sollte. Ein höherer Anteil als dieser Wert weist auf ein Problem bei der Probenvorbereitung hin. Die Morphologie des Kerns kann durch Variation des Fokus leicht visualisiert werden.
Quantitative Ergebnisse. Megakaryozyten werden manuell gezählt, wie in 6.2 beschrieben. und nach ihrer Morphologie bei 3 h und 6 h nach Versiegelung der Inkubationskammer klassifiziert. Abbildung 2A fasst die vier essentiellen Megakaryozytenklassen zusammen: (1) kleine MKs, (2) große MKs, (3) MKs mit dicken Erweiterungen, (4) MKs mit dünnen, länglichen und verzweigten Erweiterungen. Dies sind später die typischen Proplatlet-bildenden Megakaryozyten, mit den prominenten Eigenschaften von Schwellungen entlang der Proplatelets und dem Vorhandensein von refraktiven Knospen an ihren Extremitäten. Mit Hilfe der Kartierung (Abbildung 1K) kann ihre Entwicklung im Laufe der Zeit verfolgt werden. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz jeder Klasse zu jedem Beobachtungszeitpunkt ausgedrückt. Klassischerweise verlängert die Hälfte der an der Peripherie sichtbaren Megakaryozyten die Proplate nach 6 Stunden für das Wildtyp-C57BL/6-Mausknochenmark (Abbildung 2B).
Es ist möglich, das Schicksal von runden MKs zu verfolgen, indem man im Laufe der Zeit sequenzielle Bilder aufnimmt, um abzubilden, wie sie Proplatelets bilden (Video 1). Interessanterweise wurde beobachtet, wenn MKs mit dicken Extensions über einen Zeitraum von 3 h überwacht wurden, dass sich die dicken Extensions entweder vom Zellkörper lösen und sich in Proplatelets verzweigen oder zurückziehen konnten, um große runde MKs zu reformieren.
| Reagenzien | H2O | ||||
| Lager I* | 16 Gramm | 0,4 g | 2 g | 0,116 g | |
| NaCl | KCL | NaHCO3 | NaH2PO4, | bis 100 mL | |
| (2,73 m) | (53,6 mM) | (238 mM) | (8,6 mM) | ||
| Bestand II | 2,033 gMgCl2,6H2O (0,1 M) | ||||
| Bestand III | 2,19 g CaCl2.6H2O (0,1 M) | bis 100 mL | |||
| HEPES Aktie** | 119 g HEPES* (0,5 M) | bis 1 L | |||
| Tyrodes Puffer*** | 5 ml Lager I | 1 ml Lager II | 2 ml Lager III | 1 ml HEPES-Schaft | 1,8 ml Albumin Stock |
Tabelle 1: Vorbereitung des Tyrode-Puffers. Jede Stammlösung ist in der ersten Spalte der Tabelle angegeben. Die Zusammensetzung sowie die Menge des Reagenzes (angegeben in Gramm), die für jede Stammlösung benötigt wird, wird pro Reihe angegeben. Die Katalognummer und das Unternehmen jedes Reagenzes sind in der Tabelle der wesentlichen Vorräte angegeben.
Abbildung 1: Fotografische Darstellungen des Probenvorbereitungsverfahrens für die Knochenmarkexplantate. (A) Für die Knochenmarkpräparation erforderlicher Versuchsaufbau. (B) Eine 21-Gauge-Spritzennadel wird in den Knochen eingeführt. (C) Das Knochenmark wird in ein Röhrchen gespült, das Tyrodes Puffer enthält. (D) Das Knochenmark wird dann vorsichtig auf einem Glasobjektträger abgelagert. (E) Die Extremitäten des Knochenmarks werden abgeschnitten. (F) Der Knochenmarkzylinder wird in zehn 0,5 mm dicke Abschnitte geschnitten. (G-H) Die zehn Schnitte werden in eine Inkubationskammer überführt und bei 37 °C mit einem inversen Mikroskop beobachtet. I) Repräsentatives Foto einer Inkubationskammer mit den zehn Knochenmarkabschnitten. (J) Periphere Zellen wandern zu einer Schicht, in der die Megakaryozyten sichtbar werden. (K) Beispiel für eine Zeichnung, die die zehn Explantatabschnitte in der Inkubationskammer sowie die Lage der Megakaryozyten (X blaue Markierung), die aus dem Gewebe gewandert sind, für jeden Abschnitt veranschaulicht. Der Pfeil zeigt einen Megakaryozyten an der Peripherie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Morphologische Klassifikation von Megakaryozyten in Explantaten im Laufe der Zeit. (A) Megakaryozyten werden als "klein", "groß", mit "dicker Ausdehnung" oder "proplatletverlängernd" klassifiziert. Balken: 50 μm (B) Der Anteil der Megakaryozyten in jeder Klasse wurde bei 1 h, 3 h und 6 h für insgesamt 1.468 Megakaryozyten bestimmt, was zeigt, dass der Anteil der "kleinen" und "sphärischen" Megakaryozyten mit der Zeit abnimmt, während parallel dazu der Anteil der Megakaryozyten, die Proplatelets verlängern, zunimmt (n= 6 Mäuse). Typischerweise werden in den Explantaten einer WT-Maus nach 3 h zwischen 8,3 und 11,5 Megakaryozyten pro Abschnitt beobachtet. Der Fehlerbalken entspricht dem Standardfehler des Mittelwerts für jede Stichprobe. (C) Repräsentatives Bild eines dunklen Megakaryozyten. Bar: 50 μm (D) Repräsentatives Bild eines Megakaryozyten mit nicht-muskulärem Myosin II-A, das mit einem grün fluoreszierenden Protein markiert ist. Balken: 50 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Zeitraffer-Video, das einen MK zeigt, der Proplatelets verlängert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige In-vitro-Methode zur Bewertung der Effizienz von Megakaryozyten zur Erweiterung von Proplaten, die im Knochenmark gewachsen sind. Das Knochenmark-Explantat-Modell für Die Maus hat vier Hauptvorteile. Erstens sind keine fortgeschrittenen technischen Fähigkeiten erforderlich. Zweitens ist die Zeit, die benötigt wird, um Megakaryozyten-verlängernde Proplatelets zu erhalten, ziemlich kurz, nur 6 Stunden für die Explantat-Methode, verglichen mit einem Minimum von 4 Tagen für eine konventionelle Kulturmethode, die von Maus-Vorläufern ausgeht. Drittens, da nur eine kleine Menge an Gewebe benötigt wird und die erzielten Ergebnisse reproduzierbar sind, reduziert es die Anzahl der benötigten Mäuse auf ein Minimum (normalerweise 6 Mäuse pro experimenteller Bedingung), was diese Experimente wirtschaftlich und ethisch effizient macht. Schließlich, aber wichtig, liegt die Stärke dieser Methode in der Verwendung von Megakaryozyten, die sich in ihrer natürlichen Umgebung vollständig entwickelt haben, was sich als unschätzbar wertvoll erweisen kann, um Phänotypen aufzudecken, die in vitro durch potenzielle Artefakte der Kulturbedingungen maskiert werden könnten. Dies wurde zuvor bei Mäusen mit Megakaryozyten-eingeschränkter MYH9-Inaktivierung dokumentiert, wo gegensätzliche Ergebnisse zur Proplatletbildung in in vitro (erhöhte Bildung)10 und in vivo (verminderte Bildung) differenzierten Megakaryozyten gefunden wurden11. Diese paradoxen Ergebnisse wurden durch die Anforderung von Myosin IIA für die normale Megakaryozytendifferenzierung in einer Constraint-Umgebung erklärt, während Myosin IIA für die Megakaryozytendifferenzierung in Flüssigkultur entbehrlich ist7.
Eine interessante Anwendung des Knochenmark-Explantatmodells ist die Möglichkeit, den Einfluss genetischer Mutationen oder Defizite bei transgenen Mäusen und/oder pharmakologischen Wirkstoffen ausschließlich auf den Thrombozytenverlängerungsprozess zu untersuchen, ohne den Differenzierungsprozess wie bei der In-vitro-Kultur zu stören12. Die ideale Situation besteht darin, das Knochenmark eines Femurs als behandelte Probe und sein Gegenstück als Kontrolle zu verwenden. Darüber hinaus erleichtert die Verwendung von transgenen Mäusen, die spontane Fluoreszenz in den Megakaryozyten ermöglichen, die Visualisierung des Thrombozytenverlängerungsprozesses. Um fluoreszierende Megakaryozyten sichtbar zu machen, könnte eine Möglichkeit darin bestehen, fluoreszenzmarkierte Antikörper gegen spezifische Megakaryozytenmarker in der Kulturkammer hinzuzufügen. Eine andere Möglichkeit könnte die Verwendung von gentechnisch veränderten Mausmodellen sein, die ein fluoreszierendes Protein exprimieren, entweder spezifisch in der megakaryozytären Linie wie Mäusen mit CD41-markiertem YFP, die bereits in der Literatur berichtetwurden 13, oder in allen Zellen wie Mäusen, bei denen GFP mit dem N-Terminus von nicht-muskulärem Myosin II-A14 verbunden ist, wie in Abbildung 2Ddargestellt.
Diese Explantatmethode liefert daher sowohl qualitative als auch quantitative Informationen für ein besseres Verständnis der Thrombozytenbildung in ihrer natürlichen Umgebung. Bemerkenswert, obwohl diese Methode einfach und schnell ist, bleibt sie komplementär zu den Studien, die mit klassischer Flüssigkultur durchgeführt wurden. Jeder bringt separates Wissen nach den Stadien der Proliferation, Reifung, Erweiterung der Blutplättchen und Thrombozytenfreisetzung, die man studieren möchte. Wenn beispielsweise die Explantatmethode Informationen über die Kapazität der Erweiterung von Proplaten durch Megakaryozyten liefert, die in einem physiologischen Kontext gewachsen sind, liefert die In-vitro-Kultur Informationen über die Bedeutung der Mikroumgebung des Knochenmarks, wie z. B. den Einfluss der Zelllarveilität7 oder der extrazellulären Matrixabhängigkeit15. So ermöglichen es in vitro Megakaryozytenkulturen, die Parameter der Mikroumgebung in Bezug auf Steifigkeit und adhäsive Proteine zu modulieren7,16. Weitere Informationen finden Sie im Artikel "Megakaryocyte culture in three-dimensional methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement" von J. Boscher et al., der in dieser Ausgabe vorgestellt wurde.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 und ANR-18-CE14-0037 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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