Summary
Qui, descriviamo in dettaglio il metodo di espianto del midollo osseo, dalla preparazione del campione all'analisi microscopica del vetrino, per valutare la capacità dei megacariociti che si sono differenziati nel loro ambiente fisiologico di formare proplatelet.
Abstract
L'ultimo stadio della megacariopoiesi porta a estensioni citoplasmatiche da megacariociti maturi, i cosiddetti proplatelets. Molto è stato appreso sulla formazione di proplatelet utilizzando megacariociti differenziati in vitro; tuttavia, vi è una crescente evidenza che i sistemi di coltura convenzionali non ricapitolano fedelmente il processo di differenziazione / maturazione che avviene all'interno del midollo osseo. In questo manoscritto, presentiamo un metodo di espianto inizialmente descritto nel 1956 da Thiéry e Bessis per visualizzare i megacariociti che sono maturati nel loro ambiente nativo, aggirando così potenziali artefatti e interpretazioni errate. I midollo osseo fresco vengono raccolti lavando i femori dei topi, tagliati in sezioni trasversali di 0,5 mm e posti in una camera di incubazione a 37 °C contenente un tampone fisiologico. I megacariociti diventano gradualmente visibili alla periferia dell'espianto e vengono osservati fino a 6 ore sotto un microscopio invertito accoppiato a una videocamera. Nel corso del tempo, i megacariociti cambiano forma, con alcune cellule che hanno una forma sferica e altre che sviluppano estensioni spesse o estendono molte proplatelet sottili con un'ampia ramificazione. Vengono effettuate indagini sia qualitative che quantitative. Questo metodo ha il vantaggio di essere semplice, riproducibile e veloce in quanto sono presenti numerosi megacariociti, e classicamente la metà di essi forma proplatelet in 6 ore rispetto ai 4 giorni per i megacariociti di topo in coltura. Oltre allo studio dei topi mutanti, un'applicazione interessante di questo metodo è la semplice valutazione degli agenti farmacologici sul processo di estensione del proplatelet, senza interferire con il processo di differenziazione che può verificarsi nelle colture.
Introduction
La tecnica di espianto del midollo osseo è stata sviluppata per la prima volta da Thiéry e Bessis nel 1956 per descrivere la formazione di estensioni citoplasmatiche dei megacariociti di ratto come un evento iniziale nella formazione piastrinica1. Utilizzando il contrasto di fase e le tecniche cinematografiche, questi autori hanno caratterizzato la trasformazione di megacariociti rotondi maturi in cellule trombocitogeniche "simili a calamari" con estensioni citoplasmatiche che mostrano movimenti dinamici di allungamento e contrazione. Queste braccia diventano progressivamente più sottili fino a diventare filiformi con piccoli gonfiori lungo le braccia e sulle punte. Questi tipici allungamenti dei megacariociti, ottenuti in vitro e in mezzi liquidi, hanno alcune somiglianze con le piastrine osservate nel midollo osseo fisso, dove i megacariociti sporgono lunghe estensioni attraverso le pareti sinusoidi nella circolazione sanguigna2,3. La scoperta e la clonazione del TPO nel 1994, ha permesso di differenziare i megacariociti in coltura in grado di formare estensioni di proplatelet simili a quelle descritte negli espianti di midollo osseo4,5,6. Tuttavia, la maturazione dei megacariociti è molto meno efficiente in condizioni di coltura, in particolare la vasta rete di membrane interne di megacariociti maturi del midollo osseo è sottosviluppata nei megacariociti in coltura, ostacolando gli studi sui meccanismi della biogenesi piastrinica7,8.
Descriviamo qui il modello di espianto del midollo osseo, basato su Thiéry e Bessis, per seguire in tempo reale la formazione di proplatelet di megacariociti di topo, che sono completamente maturati nel loro ambiente nativo, aggirando così possibili artefatti in vitro e interpretazioni errate. I risultati ottenuti in topi adulti wild-type sono presentati per illustrare la capacità dei megacariociti di estendere i proplatelet, la loro morfologia e la complessità dei proplatelet. Introduciamo anche una strategia di quantificazione rapida per la convalida della qualità per garantire l'accuratezza e la robustezza dei dati durante il processo di registrazione dei megacariociti. Il protocollo qui presentato è la versione più recente del metodo pubblicato come libro capitolo precedentemente9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme europee 2010/63/UE e il Comitato CREMEAS per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Preparazione dei reagenti
- Preparare i reagenti come descritto nella Tabella 1.
- Per lo Stock I, sciogliere ogni polvere separatamente. Assicurarsi che l'osmolarità del preparato sia superiore a 295 mOsm/L. Questa soluzione può essere conservata a 4 °C per un anno.
- Per la preparazione del tampone di Tyrode, preparare la soluzione come descritto nella Tabella 1, regolare il volume a 100 ml con acqua distillata e aggiungere 0,1 g di saccarosio D (+) anidro. Regolare a pH 7,3 utilizzando 1 N HCl secondo necessità e l'osmolarità a 295 mOsm/L. Per prevenire la crescita batterica, aggiungere la penicillina G alla concentrazione finale di 10 U/mL e la streptomicina solfato alla concentrazione finale di 0,29 mg/mL. Filtrare la soluzione finale attraverso pori da 0,22 μm.
2. Preparazione dell'allestimento sperimentale
- Il giorno dell'esperimento, riscaldare il tampone di Tyrode a 37 °C e accendere la camera di riscaldamento del microscopio per portare la temperatura a 37 °C.
- Preparare tutti gli strumenti necessari, come timer, camere di incubazione, siringhe da 5 mL, 21 G, pinna, lama di rasoio, pipette Pasteur, vetrini e tubo centrifuga da 15 ml (Figura 1A).
3. Isolamento del midollo osseo del topo
- Eutanasia di topi C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane per asfissia di CO2 e lussazione cervicale. Questo dovrebbe essere fatto rapidamente da una persona competente e qualificata.
- Per evitare la contaminazione microbica, immergere il corpo del topo in etanolo al 70% (v / v) prima di rimuovere i femori. Utilizzare strumenti disinfettati al 70% in etanolo per la dissezione. Raccogliere i due femori e pulirli rimuovendo qualsiasi tessuto aderente. Dopo una rapida immersione in etanolo, metterli in un tubo centrifugo da 15 mL contenente 2 mL di tampone tyrode.
- Tagliare via le epifisi usando una lama affilata e lavare il midollo osseo usando una siringa da 5 mL riempita con tampone di Tyrdode da 2 mL. Per raggiungere questo obiettivo, introdurre un ago da 21 G nell'apertura del femore (sul lato del ginocchio) e premere lentamente lo stantuffo per recuperare un cilindro del midollo intatto (Figura 1B,C). Mantenere la sessione di raccolta del midollo il più breve possibile (meno di 10 minuti).
4. Sezionamento del midollo osseo e posizionamento nella camera di incubazione
- Utilizzare una pipetta di plastica da 3 ml per trasferire con cura e delicatezza il midollo osseo intatto su un vetrino. È importante che i campioni siano coperti con tampone per evitare l'essiccazione (Figura 1D).
NOTA: evitare il riflusso del flusso per ridurre al minimo le cesoie che potrebbero dissociare il tessuto. - Sotto uno stereomicroscopio (10x), tagliare le estremità del midollo che potrebbero essere state compresse al momento del risciacquo. Quindi tagliare sezioni trasversali con una lama di rasoio affilata. Le sezioni dovrebbero essere abbastanza sottili da consentire un'osservazione dettagliata, ma garantire che i megacariociti non siano danneggiati dalla compressione (di solito spessore intorno a 0,5 mm) (Figura 1E, F).
NOTA: Le sezioni sono realizzate con una lama di rasoio affilata e sotto una lente d'ingrandimento per regolare il loro spessore a circa 0,5 mm. Vengono selezionate solo le sezioni di spessore uniforme. Questa procedura non è complicata ma la sua standardizzazione richiede una certa esperienza. - Utilizzando una pipetta di plastica, raccogliere 10 sezioni in 1 mL di tubo contenente il buffer di Tyrode (Figura 1G).
- Trasferire con cura le sezioni in una camera di incubazione con un diametro di 13 mm (Figura 1H).
- Aspirare il tampone e regolare il volume a 30 μL del tampone di Tyrode integrato con il 5 % di siero di topo.
NOTA: È in questa fase che possono essere aggiunti agenti farmacologici per valutare il loro impatto sulla formazione di proplatelet. - Posizionate le sezioni a distanza. Sigillare la camera autoadesiva con un coperchio di dimensioni 22 x 55 mm. Inclinare il coperchio mentre si attacca per evitare la formazione di bolle d'aria (Figura 1I).
- Posizionare la camera nella camera di riscaldamento a 37 °C. Da questo momento, il cronometro viene avviato (T = 0 h). L'esperimento dura 6 ore a 37 °C (T= 6 h).
5. Osservazione in tempo reale degli espianti del midollo
- Utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertita (obiettivo 40x per l'ingrandimento) accoppiato a una videocamera per osservare gli espianti del midollo osseo. Lasciare incubare le cellule per 30 minuti prima di iniziare l'osservazione. Durante l'osservazione, è necessario regolare la messa a fuoco perché i megacariociti si muovono.
NOTA: Sono possibili altre modalità di osservazione (ad esempio, DIC, fluorescenza utilizzando topi i cui megacariociti esprimono un marcatore fluorescente endogeno), ma la microscopia a contrasto di fase è ottimale per visualizzare chiaramente le estensioni dei megacariociti lunghi e sottili, consentendo una quantificazione precisa. Dopo 30 minuti, le cellule del midollo migrano gradualmente verso la periferia dell'impianto, formando un monostrato. Dopo 1 ora di incubazione, i megacariociti possono essere identificati dalle loro grandi dimensioni e dai nuclei polilobulati (Figura 1J, K). Dopo 3 ore di incubazione, il numero di megacariociti aumenta e alcuni hanno lunghe estensioni. - Realizza video per registrare la trasformazione dei megacariociti.
6. Quantificazione dei megacariociti che estendono la proplateleta
- Disegnare una mappa per localizzare ogni sezione nella camera di incubazione (Figura 1K).
- Dopo 1 ora, identificare i megacariociti visibili (cioè cellule polilobulate giganti) alla periferia di ogni sezione e tracciare le loro posizioni sul disegno. Ripetere questa procedura dopo 3 e 6 ore.
NOTA: Sulla base del disegno, ogni megacariocita può essere facilmente localizzato nel tempo e analizzata l'evoluzione della loro morfologia (es. dimensioni, deformazione, estensione del proplatelet, ecc.). Un'altra possibilità è l'utilizzo di uno specifico software di navigazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Risultati qualitativi. All'inizio dell'esperimento, tutte le cellule vengono compattate nella sezione del midollo osseo. Ci vogliono 30 minuti perché le cellule diventino chiaramente visibili alla periferia degli espianti. I megacariociti sono quindi riconoscibili per le loro grandi dimensioni e la loro evoluzione può quindi essere studiata nel tempo (dimensioni, forma, dinamica, estensione del proplatelet e rilascio piastrinico) (Figura 2A). I piccoli megacariociti hanno un diametro compreso tra 20 e 30 μm e i loro nuclei sono polilobulati mentre i megacariociti rotondi maturi sono più grandi (> 30 μm di diametro) con un citoplasma allargato. Si possono osservare alcuni megacariociti scuri (Figura 2C). Questi rappresentano cellule morte la cui proporzione non deve superare lo 0,5%. Una proporzione superiore a questo valore indica un problema di preparazione del campione. La morfologia del nucleo può essere facilmente visualizzata variando la messa a fuoco.
Risultati quantitativi. I megacariociti sono contati manualmente come descritto al punto 6.2. e classificati in base alla loro morfologia a 3 h e 6 h dopo la sigillatura della camera di incubazione. La Figura 2A riassume le quattro classi essenziali di megacariociti: (1) piccoli PK, (2) GRANDI NK, (3) PK con estensioni spesse, (4) PK con estensioni sottili, allungate e ramificate. Questi in seguito sono i tipici megacariociti che formano proplatelet, con le caratteristiche prominenti di gonfiori lungo i proplatelet e la presenza di gemme refrattive alle loro estremità. Con l'aiuto della mappatura (Figura 1K), la loro evoluzione può essere seguita nel tempo. I risultati sono espressi come percentuale di ogni classe in ogni momento di osservazione. Classicamente, la metà dei megacariociti visibili alla periferia estende le propilature a 6 ore per il midollo osseo di topo C57BL/6 wild-type (Figura 2B).
È possibile seguire il destino degli MM rotondi catturando immagini sequenziali nel tempo per immaginare come formano i proplatelet (Video 1). È interessante notare che, quando i PK con estensioni spesse sono stati monitorati per un periodo di 3 ore, è stato osservato che le estensioni spesse potevano staccarsi dal corpo cellulare e ramificarsi in proplatelet o ritrarsi per riformare grandi MM rotondi.
| Reagenti | H2O | ||||
| Stock I* | 16 g | 0,4 g | 2 g | 0,116 g | |
| NaCl | KCL | NaHCO3 · | NaH2PO4, | fino a 100 ml | |
| (2,73 m) | (53,6 mM) | (238 mM) | (8,6 mM) | ||
| Stock II | 2,033 g MgCl2.6H2O (0.1 M) | ||||
| Stock III | 2,19 g cacl2,6H2O (0,1 m) | fino a 100 ml | |||
| Stock HEPES** | 119 g HEPES* (0,5 M) | fino a 1 L | |||
| Buffer di Tyrode*** | 5 ml Stock I | 1 mL Stock II | 2 ml Stock III | 1 mL di stock HEPES | 1,8 ml di albumina Stock |
Tabella 1: Preparazione del buffer di Tyrode. Ogni soluzione stock è indicata nella prima colonna della tabella. La composizione e la quantità di reagente (indicata in grammi) richiesta per ciascuna soluzione stock sono indicate per riga. Il numero di catalogo e la società di ciascun reagente sono indicati nella tabella delle forniture essenziali.
Figura 1: Rappresentazioni fotografiche del metodo di preparazione del campione per l'espianto di midollo osseo. (A) Configurazione sperimentale necessaria per la preparazione del midollo osseo. (B) Un ago montato su siringa calibro 21 viene inserito nell'osso. (C) Il midollo osseo viene lavato in un tubo contenente il tampone di Tyrode. (D) Il midollo osseo viene quindi delicatamente depositato su un vetrino. (E) Le estremità del midollo osseo sono tagliate. (F) Il cilindro del midollo viene tagliato in dieci sezioni spesse 0,5 mm. (G-H) Le dieci sezioni vengono trasferite in una camera di incubazione e osservate a 37 °C utilizzando un microscopio invertito. (I) Foto rappresentativa di una camera di incubazione contenente le dieci sezioni di midollo osseo. (J) Le cellule periferiche migrano per formare uno strato in cui i megacariociti diventano visibili. (K) Esempio di disegno che illustra le dieci sezioni di espianto nella camera di incubazione e la posizione dei megacariociti (X segno blu) che sono migrati fuori dal tessuto per ciascuna sezione. La freccia mostra un megacariocita alla periferia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Classificazione morfologica dei megacariociti negli espianti nel tempo. (A) I megacariociti sono classificati come "piccoli", "grandi", con "estensione spessa" o "estensione del proplatelet". Barre: 50 μm (B) La proporzione di megacariociti in ciascuna classe è stata determinata a 1 h, 3 h e 6 h per un totale di 1.468 megacariociti, dimostrando che la proporzione di megacariociti "piccoli" e "sferici" diminuisce con il tempo mentre, in parallelo, aumenta la proporzione di megacariociti che estendono proplatelet (n=6 topi). Tipicamente, negli espianti di un topo WT dopo 3 ore, si osservano tra 8,3 e 11,5 megacariociti per sezione. La barra di errore corrisponde all'errore standard della media per ciascun campione. (C) Immagine rappresentativa di un megacariocita scuro. Bar: 50 μm (D) Immagine rappresentativa di un megacariocita con miosina II-A non muscolare etichettato con una proteina fluorescente verde. Bar: 50 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Video time-lapse che mostra un MK che estende i proplatelet. Clicca qui per scaricare questo video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui descriviamo un metodo in vitro semplice e a basso costo per valutare l'efficienza dei megacariociti per estendere i proplatelet che sono cresciuti nel midollo osseo. Il modello di espianto del midollo osseo per il topo ha quattro vantaggi principali. In primo luogo, non sono richieste competenze tecniche avanzate. In secondo luogo, il tempo necessario per ottenere proplatelet che estendono i megacariociti è piuttosto breve, solo 6 ore per il metodo di espianto, rispetto a un minimo di 4 giorni per un metodo di coltura convenzionale a partire da progenitori di topo. In terzo luogo, dato che è necessaria solo una piccola quantità di tessuto e che i risultati ottenuti sono riproducibili, riduce al minimo il numero di topi necessari (di solito 6 topi per condizione sperimentale), rendendo questi esperimenti economicamente ed eticamente efficienti. Infine, ma soprattutto, la forza di questo metodo risiede nell'uso di megacariociti che si sono pienamente sviluppati nel loro ambiente naturale, che possono rivelarsi preziosi nel rivelare fenotipi che potrebbero essere mascherati in vitro da potenziali artefatti delle condizioni di coltura. Questo è stato precedentemente documentato in topi con inattivazione MYH9 limitata ai megacariociti in cui sono stati trovati risultati opposti sulla formazione di proplatelet in vitro (aumento della formazione)10 e in vivo (diminuzione della formazione) megacariociti differenziati11. Questi risultati paradossali sono stati spiegati dal requisito della miosina IIA per la normale differenziazione dei megacariociti in un ambiente a vincoli, mentre la miosina IIA è indispensabile per la differenziazione dei megacariociti in coltura liquida7.
Un'interessante applicazione del modello di espianto del midollo osseo è la possibilità di studiare l'impatto di mutazioni o carenze genetiche in topi transgenici e/o agenti farmacologici esclusivamente sul processo di estensione piastrinica, senza interferire con il processo di differenziazione come nel caso della coltura in vitro12. La situazione ideale è quella di utilizzare il midollo osseo di un femore come campione trattato e la sua controparte come controllo. Inoltre, l'uso di topi transgenici che consentono la fluorescenza spontanea nei megacariociti facilita la visualizzazione del processo di estensione piastrinica. Per visualizzare i megacariociti fluorescenti, una possibilità potrebbe essere quella di aggiungere anticorpi marcati con fluorescenza contro specifici marcatori di megacariociti nella camera di coltura. Un'altra possibilità potrebbe essere l'uso di modelli murini geneticamente modificati che esprimono una proteina fluorescente, sia specificamente nel lignaggio megacariocitico come topi con YFP marcato con CD41 già riportati in letteratura13, o in tutte le cellule come i topi in cui la GFP è legata al N-terminus della miosina non muscolare II-A14 come illustrato nella Figura 2D.
Questo metodo di espianto, quindi, fornisce informazioni sia qualitative che quantitative per una migliore comprensione della formazione piastrinica nel loro ambiente naturale. Degno di nota, sebbene questo metodo sia semplice e veloce, rimane complementare agli studi eseguiti utilizzando la cultura liquida classica. Ognuno porta conoscenze separate in base alle fasi di proliferazione, maturazione, estensione delle piastrine e rilascio piastrinico che si desidera studiare. Ad esempio, laddove il metodo di espianto fornisce informazioni sulla capacità di estensione dei proplatelet da parte di megacariociti cresciuti in un contesto fisiologico, la coltura in vitro fornisce informazioni sull'importanza del microambiente del midollo osseo come l'impatto della ridigità cellulare7 o la dipendenza dalla matrice extracellulare15. Pertanto, le colture di megacariociti in vitro consentono di modulare i parametri del microambiente in termini di rigidità e proteine adesive7,16. Si prega di fare riferimento all'articolo "Megakaryocyte culture in three-dimensional methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturazion and study the impact of stiffness and confinement" di J. Boscher et al., presentato in questo numero per ulteriori informazioni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 e ANR-18-CE14-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
