Summary
Här beskriver vi benmärg explant metoden, från prov beredning till mikroskopisk glidanalys, att utvärdera förmågan hos megakaryocyter som har differentierat i sin fysiologiska miljö att bilda proplatelets.
Abstract
Det sista steget i megakaryopoiesis leder till cytoplasmiska förlängningar från mogna megakaryocyter, de så kallade proplateletsna. Mycket har lärts om proplatelet bildas med hjälp av in vitro-differentierademegakaryocyter; Det finns dock allt fler bevis för att konventionella odlingssystem inte troget rekapitulerar differentierings-/mognadsprocessen som sker inuti benmärgen. I detta manuskript presenterar vi en explantmetod som ursprungligen beskrevs 1956 av Thiéry och Bessis för att visualisera megakaryocyter som har mognat i sin ursprungliga miljö, vilket kringgår potentiella artefakter och feltolkningar. Färska benmärgar samlas in genom att spola lårbenen hos möss, skivas i 0,5 mm tvärsnitt och placeras i en inkubationskammare vid 37 °C som innehåller en fysiologisk buffert. Megakaryocyter blir gradvis synliga vid explantens periferi och observeras upp till 6 timmar under ett inverterat mikroskop kopplat till en videokamera. Med tiden ändrar megakaryocyter sin form, med vissa celler som har en sfärisk form och andra utvecklar tjocka förlängningar eller utökar många tunna proplatelets med omfattande förgrening. Både kvalitativa och kvantitativa undersökningar genomförs. Denna metod har fördelen att vara enkel, reproducerbar och snabb som många megakaryocyter är närvarande, och klassiskt hälften av dem bildar proplatelets i 6 timmar jämfört med 4 dagar för odlade mus megakaryocyter. Förutom studien av muterade möss är en intressant tillämpning av denna metod den enkla utvärderingen av farmakologiska medel på proplatelet förlängningsprocessen, utan att störa differentieringsprocessen som kan uppstå i kulturer.
Introduction
Benmärg explant tekniken utvecklades först av Thiéry och Bessis 1956 för att beskriva bildandet av råtta megakaryocyt cytoplasmic förlängningar som en första händelse i trombocyt bildandet1. Med hjälp av faskontrast och cinematographic tekniker karakteriserade dessa författare omvandlingen av mogna runda megakaryocyter till "bläckfiskliknande" trombocytogena celler med cytoplasmiska förlängningar som visar dynamiska rörelser av förlängning och sammandragning. Dessa armar blir gradvis tunnare tills de blir filiform med små svullnader längs armarna och vid spetsarna. Dessa typiska megakaryocytförlängningar, erhållna in vitro och i flytande medier, har vissa likheter med trombocyter som observerats i fast benmärg, där megakaryocyter sticker ut långa förlängningar genom sinusoidväggarna in i blodcirkulationen2,3. Upptäckten och kloningen av TPO 1994, tillåtet att skilja megakaryocyter i kultur som kan bilda proplatelet förlängningar som liknar de som beskrivs i benmärg explanter4,5,6. Megakaryocytmamognad är dock mycket mindre effektiv under odlingsförhållanden, särskilt det omfattande inre membrannätverket av benmärgsmogna megakaryocyter är underutvecklat i odlade megakaryocyter, vilket hindrar studier om mekanismerna för trombocytbiogenes7,8.
Vi beskriver här benmärg explant modellen, baserat på Thiéry och Bessis, att följa i realtid proplatelet bildandet av mus megakaryocyter, som har full mognad i sin inhemska miljö, vilket kringgår möjliga in vitro artefakter och feltolkningar. Resultat erhållna i vilda vuxna möss presenteras för att illustrera megakaryocytens förmåga att förlänga proplatelets, deras morfologi och komplexiteten hos proplatelets. Vi introducerar också en snabb kvantifieringsstrategi för kvalitetsvalidering för att säkerställa datanoggrannhet och robusthet under megakaryocytinspelningsprocessen. Protokollet som presenteras här är den senaste versionen av metoden som publicerades som ett bokkapitel tidigare9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med europeiska standarder 2010/63/EU och CREMEAS Committee on the Ethics of Animal Experiments vid universitetet i Strasbourg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Beredning av reagenser
- Förbered reagenser enligt beskrivningen i tabell 1.
- Lös upp varje pulver separat för buljongen I. Se till att preparatets osmolaritet är högre än 295 mOsm/L. Denna lösning kan förvaras vid 4 °C i ett år.
- För tyridens buffertberedning, gör lösningen enligt beskrivningen i tabell 1, justera volymen till 100 ml med destillerat vatten och tillsätt 0,1 g vattenfri D (+) sackaros. Justera till pH 7,3 med 1 N HCl efter behov och osmolariteten till 295 mOsm/L. För att förhindra bakterietillväxt, tillsätt penicillin G vid 10 U/ml slutlig koncentration och streptomycinsulfat vid 0, 29 mg/ml slutlig koncentration. Filtrera den slutliga lösningen genom 0,22 μm porer.
2. Förberedelse av den experimentella uppsättningen
- På experimentdagen värmer du Tyrlidens buffert vid 37 °C och slår på mikroskopets värmekammare för att få temperaturen till 37 °C.
- Förbered alla nödvändiga verktyg, såsom en timer, inkubationskammare, 5 ml sprutor, 21 G, tång, rakblad, Pasteur pipetter, glasrutschbanor och 15 ml centrifugrör(figur 1A).
3. Isolering av musbenet märg
- Avliva C57BL/6 möss i åldern 8-12 veckor genom CO2 kvävning och livmoderhalscancer förskjutning. Detta bör göras snabbt av en kompetent och kvalificerad person.
- För att undvika mikrobiell förorening, blötlägg muskroppen i 70% (v/v) etanol innan du tar bort lårbenen. Använd instrument desinficerade i 70% etanol för dissekering. Samla de två lårbenen och rengör dem genom att ta bort eventuell vidhäftande vävnad. Efter snabb nedsänkning i etanol, placera dem i 15 ml centrifugrör som innehåller 2 mL Tyrodes buffert.
- Skär bort epifyserna med ett vasst rakblad och spola benmärgen med en 5 ml spruta fylld med 2 ml Tyrdodes buffert. För att uppnå detta, inför en 21 G nål i lårbenets öppning (på knäsidan) och tryck långsamt på kolven för att hämta en intakt märgcylinder (figur 1B, C). Håll märgsamlingssessionen så kort som möjligt (under 10 min).
4. Benmärgssektion och placering i inkubationskammaren
- Använd en 3 ml plastpipetter för att försiktigt och försiktigt överföra den intakta benmärgen till en glasrutschbana. Det är viktigt att proverna täcks med buffert för att förhindra uttorkning (figur 1D).
OBS: Undvik flödesreflöde för att minimera saxar som kan dissociera vävnaden. - Skär av ändarna på märgen som kan ha komprimerats vid spolningen under ett stereomikroscope (10x). Skär sedan tvärgående sektioner med ett vasst rakblad. Sektionerna bör vara tillräckligt tunna för att möjliggöra en detaljerad observation, men se till att megakaryocyter inte skadas av komprimering (vanligtvis tjocklek runt 0,5 mm) (figur 1E, F).
OBS: Sektionerna är tillverkade med ett vasst rakblad och under en förstoringsglas för att justera tjockleken till ca 0,5 mm. Endast sektionerna med enhetlig tjocklek är valda. Denna procedur är inte komplicerad men dess standardisering kräver viss erfarenhet. - Samla 10 sektioner i 1 ml-rör som innehåller Tyrlids buffert (figur 1G)med hjälp av en plastpipetter .
- Överför försiktigt sektionerna till en inkubationskammare med en diameter av 13 mm (figur 1H).
- Aspirera bufferten och justera volymen till 30 μL av Tyredes buffert kompletterad med 5 % musserum.
OBS: Det är i detta skede som farmakologiska medel kan läggas till för att utvärdera deras inverkan på proplateletbildning. - Placera sektionerna på avstånd. Försegla den självhäftande kammaren med ett täckglas av dimensionen 22 x 55 mm. Luta täcket medan du fastnar för att undvika bildandet av luftbubblor (figur 1I).
- Placera kammaren i värmekammaren vid 37 °C. Från och med nu startas kronometern (T= 0 h). Experimentet pågår i 6 timmar vid 37 °C (T= 6 h).
5. Realtidsobservation av märgexplanter
- Använd ett inverterat faskontrastmikroskop (40x lins för förstoring) kopplat till en videokamera för att observera benmärgsexplanterna. Låt cellerna inkubera i 30 minuter innan observationen påbörjas. Under observation är det nödvändigt att justera fokus eftersom megakaryocyter rör sig.
OBS: Andra observationslägen är möjliga (t.ex. DIC, fluorescens med möss vars megakaryocyter uttrycker en endogen fluorescerande markör), men faskontrastmikroskopi är optimal för att tydligt visualisera de långa och tunna megakaryocytförlängningarna, vilket möjliggör exakt kvantifiering. Efter 30 min migrerar märgcellerna gradvis till explantens periferi och bildar en monoskikt. Efter 1 h inkubation kan megakaryocyter identifieras genom sin stora storlek och polylobulated atomkärnor (figur 1J, K). Efter 3 timmars inkubation ökar antalet megakaryocyter och vissa har långa förlängningar. - Gör videor för att spela in omvandlingen av megakaryocyterna.
6. Kvantifiering av de proplateletförlängande megakaryocyterna
- Rita en karta för att lokalisera varje sektion i inkubationskammaren (figur 1K).
- Efter 1 h, identifiera de synliga megakaryocyterna (dvs. jätte polylobulated celler) på varje sektions periferi och plotta deras positioner på ritningen. Upprepa denna procedur efter 3 och 6 h.
OBS: På grundval av ritningen kan varje megakaryocyt enkelt lokaliseras över tiden och utvecklingen av deras morfologi analyseras (t.ex. storlek, deformation, proplatelet förlängning, etc.). En annan möjlighet är användningen av en specifik navigationsprogramvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvalitativa resultat. I början av experimentet komprimeras alla celler i benmärgssektionen. Det tar 30 minuter för cellerna att bli tydligt synliga i explanternas periferi. Megakaryocyterna känns sedan igen av sin stora storlek och deras utveckling kan sedan studeras med tiden (storlek, form, dynamik, proplateletförlängning och trombocytfrisättning) (figur 2A). Små megakaryocyter har en diameter mellan 20 och 30 μm och deras kärnor polylobuleras medan mogna runda megakaryocyter är större (> 30 μm i diameter) med en förstorad cytoplasma. Några mörka megakaryocyter kan observeras (figur 2C). Dessa representerar döda celler vars andel inte bör överstiga 0,5%. En andel som är högre än det här värdet indikerar ett provberedningsproblem. Kärnans morfologi kan enkelt visualiseras genom att variera fokus.
Kvantitativa resultat. Megakaryocyter räknas manuellt enligt beskrivningen i 6.2. och klassificeras enligt deras morfologi vid 3 h och 6 h efter tätning av inkubationskammaren. Figur 2A sammanfattar de fyra viktiga megakaryocytklasserna: (1) små MKs, (2) stora MKs, (3) MKs med tjocka förlängningar, (4) MKs med tunna, långsträckta och förgrerade förlängningar. Dessa senare är de typiska proplateletbildande megakaryocyterna, med de framträdande egenskaperna hos svullnader längs proplateletsna och närvaron av brytningsknoppar vid deras extremiteter. Med hjälp av kartläggning (figur 1K) kan deras utveckling följas över tid. Resultaten uttrycks i procent av varje klass vid varje observationstid. Klassiskt förlänger hälften av de megakaryocyter som är synliga i periferin proplatelets vid 6 timmar för benmärg av vild typ C57BL/6 mus(figur 2B).
Det är möjligt att följa ödet för runda MKs genom att fånga sekventiella bilder över tid för att avbilda hur de bildar proplatelets (Video 1). Intressant nog, när MKs med tjocka förlängningar övervakades under en period av 3 h, observerades det att de tjocka förlängningarna antingen kunde lossna från cellkroppen och grena till proplatelets eller dra sig tillbaka för att reformera stora runda MKs.
| Reagenser | H2O | ||||
| Lager I* | 16 g | 0,4 g | 2 g | 0.116 g | |
| NaCl | KCL | NaHCO3 | NaH2PO4, | till 100 ml | |
| (2,73 M) | (53,6 mM) | (238 mM) | (8,6 mM) | ||
| Lager II | 2.033 g MgCl2.6H2O (0,1 M) | ||||
| Lager III | 2,19 g CaCl2.6H2O (0,1 M) | till 100 ml | |||
| HEPES lager** | 119 g HEPES* (0,5 M) | till 1 L | |||
| Tyrlidens buffert*** | 5 ml Lager I | 1 ml Lager II | 2 ml Lager III | 1 mL HEPES Lager | 1.8 mL albumin Lager |
Tabell 1: Beredning av Tyrlidens buffert. Varje lagerlösning anges i tabellens första kolumn. Kompositionen samt mängden reagens (ges i gram) som krävs för varje lagerlösning anges per rad. Katalognumret och företaget för varje reagens anges i tabellen över väsentliga förnödenheter.
Figur 1: Fotografiska framställningar av provberedningsmetoden för benmärgsexplant. (B)En 21-gauge sprutmonterad nål sätts in i benet. C)Benmärgen spolas in i ett rör som innehåller Tyrodes buffert. ( D) Benmärgen deponeras sedan försiktigt på en glasrutschbana. ( E) Benmärgens extremiteter är avskurna. (F) Märgcylindern skärs i tio 0,5 mm tjocka sektioner. (G-H) De tio sektionerna överförs till en inkubationskammare och observeras vid 37 °C med hjälp av ett inverterat mikroskop. (I)Representativt foto av en inkubationskammare som innehåller de tio sektionerna av benmärgen. (J) Perifera celler migrerar för att bilda ett lager där megakaryocyterna blir synliga. k) Exempel på ritning som illustrerar de tio explantsektionerna i inkubationskammaren samt placeringen av de megakaryocyter (X blå märke) som har migrerat ut ur vävnaden för varje sektion. Pilen visar en megakaryocyt i periferin. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Morfologiskt klassificering av megakaryocyter i explanter över tiden. (A) Megakaryocyter klassificeras som "små", "stora", med "tjock förlängning" eller "proplateletförlängning". Stänger: 50 μm (B) Andelen megakaryocyter i varje klass bestämdes vid 1 h, 3 h och 6 h för totalt 1 468 megakaryocyter, vilket visar att andelen "små" och "sfäriska" megakaryocyter minskar med tiden medan andelen megakaryocyter som förlänger proplatelets ökar (n=6 möss). Vanligtvis observeras mellan 8,3 och 11,5 megakaryocyter per avsnitt i explanterna efter 3 timmar. Felfältet motsvarar standardfelet för medelvärdet för varje prov. (C) Representativ bild av en mörk megakaryocyt. Bar: 50 μm (D) Representativ bild av en megakaryocyt med icke-muskulös myosin II-A märkt med ett grönt fluorescerande protein. Bar: 50 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Timelapse-video som visar en MK som förlänger proplatelets. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en enkel och billig in vitro-metod för att utvärdera effektiviteten hos megakaryocyter för att utöka proplatelets som har vuxit i benmärgen. Benmärg explant modellen för musen har fyra huvudsakliga fördelar. För det första krävs inga avancerade tekniska färdigheter. För det andra är den tid som behövs för att erhålla megakaryocytförlängande proplatelets ganska kort, bara 6 timmar för explantmetoden, jämfört med minst 4 dagar för en konventionell odlingsmetod som börjar från musprogenitorer. För det tredje, med tanke på att endast en liten mängd vävnad behövs och att de erhållna resultaten är reproducerbara, minskar det antalet möss som behövs till ett minimum (vanligtvis 6 möss per experimentellt tillstånd), vilket gör dessa experiment ekonomiskt och etiskt effektiva. Slutligen, men viktigast av allt, ligger styrkan i denna metod i användningen av megakaryocyter som har utvecklats fullt ut i sin naturliga miljö, vilket kan visa sig ovärderligt för att avslöja fenotyper som kan maskeras in vitro av potentiella artefakter av kulturförhållandena. Detta har tidigare dokumenterats hos möss med megakaryocytbegränsad MYH9-inaktivering där motsatta resultat har hittats på proplateletbildning in vitro (ökad bildning)10 och in vivo (minskad formation) differentierade megakaryocyter11. Dessa paradoxala resultat har förklarats av kravet på myosin IIA för normal megakaryocytdifferentiering i en begränsningsmiljö, medan myosin IIA är dispenserbar för megakaryocytdifferentiering i flytande kultur7.
En intressant tillämpning av benmärgsexplantmodellen är möjligheten att studera effekterna av genetiska mutationer eller brister hos transgena möss och/eller farmakologiska medel uteslutande på trombocytförlängningsprocessen, utan att störa differentieringsprocessen som i fallet med in vitro-kultur12. Den idealiska situationen är att använda benmärgen i ett lårben som ett behandlat prov och dess motsvarighet som kontroll. Dessutom underlättar användningen av transgena möss som möjliggör spontan fluorescens i megakaryocyterna visualiseringen av trombocytförlängningsprocessen. För att visualisera fluorescerande megakaryocyter kan en möjlighet vara att lägga till fluorescensmärkta antikroppar mot specifika megakaryocytmarkörer i kulturkammaren. En annan möjlighet kan vara användningen av genetiskt konstruerade musmodeller som uttrycker ett fluorescerande protein, antingen specifikt i den megakaryocytiska härstamningen som möss med CD41-märkt YFP som redan rapporterats i litteraturen13, eller i alla celler som möss där GFP är kopplad till N-ändstationen av icke-muskulös myosin II-A14 som illustreras i figur 2D.
Denna explantmetod ger därför både kvalitativ och kvantitativ information för en bättre förståelse av trombocytbildning i deras naturliga miljö. Anmärkningsvärt, även om denna metod är enkel och snabb är den fortfarande ett komplement till de studier som utförs med klassisk flytande kultur. Var och en ger separat kunskap enligt stadierna av spridning, mognad, förlängning av trombocyter och trombocytfrisättning som man vill studera. Till exempel, om explantmetoden ger information om kapaciteten att förlänga proplatelets av megakaryocyter som har vuxit i ett fysiologiskt sammanhang, ger in vitro-kulturen information om vikten av benmärgsmikromiljön, såsom effekten av cellförhärligande7 eller extracellulärt matrisberoende15. Således gör in vitro megakaryocytkulturer det möjligt att modulera mikromiljöns parametrar när det gäller styvhet och självhäftande proteiner7,16. Se artikeln "Megakaryocytkultur i tredimensionell metylcellulosabaserad hydrogel för att förbättra cellmognad och studera effekten av styvhet och inneslutning" av J. Boscher et al., presenterad i detta nummer för mer information.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert för tekniskt stöd. Detta arbete har fått stöd av ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 och ANR-18-CE14-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
