Summary
Burada, fizyolojik ortamlarında farklılaşmış megakaryositlerin proplatlet oluşturma yeteneğini değerlendirmek için numune hazırlamadan mikroskobik slayt analizine kadar kemik iliği eksplant yöntemini detaylandırıyoruz.
Abstract
Megakaryopoezisin son aşaması, proplateletler olarak adlandırılan olgun megakaryositlerden sitoplazmik uzantılara yol açar. In vitro-farklılaştırılmışmegakaryositler kullanılarak proplatlet oluşumu hakkında çok şey öğrenilmiştir; bununla birlikte, geleneksel kültür sistemlerinin kemik iliğinin içinde gerçekleşen farklılaşma/olgunlaşma sürecini sadık bir şekilde geri almadığına dair artan bir kanıt vardır. Bu yazıda, thiéry ve Bessis tarafından 1956 yılında, kendi çevrelerinde olgunlaşmış megakaryositleri görselleştirmek, böylece potansiyel eserleri ve yanlış yorumlamaları atlatmak için açık bir yöntem sunuyoruz. Taze kemik ilikleri, farelerin uyluklarının yıkanmasıyla toplanır, 0,5 mm kesitler halinde dilimlenir ve fizyolojik tampon içeren 37 °C'de bir kuluçka odasına yerleştirilir. Megakaryositler eksiz çevrede yavaş yavaş görünür hale gelir ve bir video kameraya bağlı ters bir mikroskop altında 6 saate kadar gözlenir. Zamanla, megakaryositler şekillerini değiştirir, bazı hücreler küresel bir forma sahip ve diğerleri kalın uzantılar geliştirir veya birçok ince proplatlet geniş dallanma ile genişletir. Hem nitel hem de nicel araştırmalar yapılmaktadır. Bu yöntem, çok sayıda megakaryosit mevcut olduğu için basit, tekrarlanabilir ve hızlı olma avantajına sahiptir ve klasik olarak yarısı, kültürlü fare megakaryositleri için 4 güne kıyasla 6 saatte proplatelet oluşturur. Mutant farelerin çalışmasına ek olarak, bu yöntemin ilginç bir uygulaması, farmakolojik ajanların kültürlerde oluşabilecek farklılaşma sürecine müdahale etmeden proplatelet uzatma işlemi üzerinde basit bir şekilde değerlendirilmesidir.
Introduction
Kemik iliği eksplant tekniği ilk olarak 1956 yılında Thiéry ve Bessis tarafından trombosit oluşumunda ilk olay olarak sıçan megakaryosit sitoplazmik uzantılarının oluşumunu tanımlamak için geliştirilmiştir1. Faz kontrastı ve sinematografik teknikleri kullanan bu yazarlar, olgun yuvarlak megakaryositlerin dinamik uzama ve daralma hareketlerini gösteren sitoplazmik uzantılı "kalamar benzeri" trombositojenik hücrelere dönüşümünü karakterize ettiler. Bu kollar, kollar boyunca ve uçlarda küçük şişliklerle filiform olana kadar giderek daha ince hale gelir. İn vitro ve sıvı ortamda elde edilen bu tipik megakaryosit uzamaları, megakaryositlerin sinüzoid duvarlardan kan dolaşımına uzun uzantılar gösterdiği sabit kemik iliğinde gözlenen trombositlerle belirli benzerliklere sahiptir2,3. 1994 yılında TPO'nun keşfi ve klonlaması, kemik iliği eksplantlarında açıklananlara benzeyen proplatelet uzantıları oluşturabilen kültürdeki megakaryositlerin ayırt edilmesine izin verildi4,5,6. Bununla birlikte, megakaryosit olgunlaşması kültür koşullarında çok daha az verimlidir, özellikle kemik iliği olgunlaşmış megakaryositlerin geniş iç zar ağı kültürlü megakaryositlerde az gelişmiştir, trombosit biyogenez mekanizmaları üzerindeki çalışmaları engeller7,8.
Thiéry ve Bessis'e dayanan kemik iliği eksplant modelini, kendi ortamlarında tamamen olgunlaşmış fare megakaryositlerinin gerçek zamanlı proplatlet oluşumunda takip etmek, böylece olası in vitro eserleri ve yanlış yorumlamaları atlatmak için detaylandırırız. Vahşi tip yetişkin farelerde elde edilen sonuçlar, megakaryositlerin proplateletleri genişletme yeteneğini, morfolojilerini ve proplateletlerin karmaşıklığını göstermek için sunulmuştur. Ayrıca megakaryosit kayıt sürecinde veri doğruluğu ve sağlamlığı sağlamak için kalite doğrulaması için hızlı bir niceleme stratejisi sunuyoruz. Burada sunulan protokol, daha önce kitap bölümü olarak yayınlanan yöntemin en son sürümüdür9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Avrupa standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi 2010/63/EU ve CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Reaktiflerin hazırlanması
- Tablo 1'de açıklandığı gibi reaktifleri hazırlayın.
- Stok I için her tozu ayrı ayrı çözün. Preparatın osmolaritesinin 295 mOsm/L'den yüksek olduğundan emin olun. Bu çözelti bir yıl boyunca 4 °C'de saklanabilir.
- Tyrode'un tampon hazırlığı için, çözeltiyi Tablo 1'deaçıklandığı gibi yapın, hacmi damıtılmış su ile 100 mL'ye ayarlayın ve 0,1 g susuz D (+) sakkaroz ekleyin. Gerektiğinde 1 N HCl ve osmolarite kullanarak pH 7.3'e 295 mOsm/L'ye ayarlayın. Bakteri üremesini önlemek için 10 U/mL son konsantrasyonda penisilin G ve 0,29 mg/mL son konsantrasyonda streptomisin sülfat ekleyin. Son çözeltiyi 0,22 μm gözeneklerle filtreleyin.
2. Deneysel kurulumun hazırlanması
- Deney günü, Tirodun tamponu 37 ° C'de ısıtın ve sıcaklığı 37 ° C'ye getirmek için mikroskobun ısıtma odasını açın.
- Zamanlayıcı, kuluçka odaları, 5 mL şırıng, 21 G, forseps, jilet, Pasteur pipetler, cam kaydıraklar ve 15 mL santrifüj tüpü gibi gerekli tüm araçları hazırlayın(Şekil 1A).
3. Fare kemik iliğinin izolasyonu
- Co2 boğulma ve servikal çıkık ile 8-12 haftalık C57BL/6 fareleri ötenazi. Bu, yetkin ve nitelikli bir kişi tarafından hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
- Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için, uyluk kemiğini çıkarmadan önce fare gövdesini% 70 (v / v) etanol içine batırın. Diseksiyon için% 70 etanolde dezenfekte edilmiş aletler kullanın. İki uyluk kemiğini toplayın ve herhangi bir yapışık dokuyu çıkararak temizleyin. Etanolde hızlı daldırmadan sonra, 2 mL Tyrode tamponu içeren 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Keskin bir jilet kullanarak epifizleri kesin ve 2 mL Tyrdode tamponu ile dolu 5 mL şırınna kullanarak kemik iliğini yıkayın. Bunu başarmak için, uyluk kemiğinin açıklığı içine 21 G'lik bir iğne takın (diz tarafında) ve sağlam bir ilik silindiri almak için pistona yavaşça basın (Şekil 1B, C). İlik toplama seansını mümkün olduğunca kısa tutun (10 dakikanın altında).
4. Kemik iliği kesiti ve inkübasyon odasına yerleştirilmesi
- Sağlam kemik iliğini dikkatlice ve hafifçe cam bir kaydırağa aktarmak için 3 mL plastik pipet kullanın. Kurumasını önlemek için numunelerin tamponla kaplanması önemlidir (Şekil 1D).
NOT: Dokuyu ayrıştırabilecek kesmeleri en aza indirmek için akış yeniden akışından kaçının. - Stereomikroskop (10x) altında, yıkama sırasında sıkıştırılmış olabilecek iliğin uçlarını kesin. Daha sonra keskin bir jiletle transversal bölümleri kesin. Bölümler ayrıntılı bir gözleme izin vermek için yeterince ince olmalı, ancak megakaryositlerin sıkıştırmadan zarar görmemesini sağlamalıdır (genellikle 0,5 mm civarında kalınlık) (Şekil 1E,F).
NOT: Bölümler keskin bir jiletle ve kalınlıklarını yaklaşık 0,5 mm'ye ayarlamak için bir büyüteç altında yapılır. Sadece tekdüze kalınlıkta bölümler seçilir. Bu prosedür karmaşık değildir, ancak standardizasyonu biraz deneyim gerektirir. - Plastik bir pipet kullanarak, Tirode tamponu içeren 1 mL tüpe 10 bölüm toplayın (Şekil 1G).
- Bölümleri dikkatlice 13 mm çapında bir kuluçka odasına aktarın(Şekil 1H).
- Tamponu epire edin ve hacmi % 5 fare serumu ile desteklenmiş 30 μL Tyrode tamponu olarak ayarlayın.
NOT: Bu aşamada farmakolojik ajanlar eklenerek proplatlet oluşumu üzerindeki etkileri değerlendirilebilir. - Bölümleri mesafeye yerleştirin. Kendinden yapışkanlı hazneyi 22 x 55 mm boyutunda bir kapakla kapatın. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için yapışırken kapak sapını eğimli hale(Şekil 1I).
- Odayı 37 °C'de ısıtma odasına yerleştirin. Şu andan itibaren kronometre başlatılır (T= 0 h). Deney 37 °C'de (T= 6 h) 6 saat çalışır.
5. İlik eksplantlarının gerçek zamanlı gözlemi
- Kemik iliğinin eksplantlarını gözlemlemek için bir video kameraya bağlı ters faz kontrast mikroskobu (büyütme için 40x lens) kullanın. Gözleme başlamadan önce hücrelerin 30 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Gözlemlerken, odağı ayarlamak gerekir, çünkü megakaryositler hareket eder.
NOT: Diğer gözlem modları mümkündür (örneğin, megakaryositleri endojen bir floresan işaretleyiciyi ifade eden fareler kullanılarak DIC, floresan), ancak faz kontrastı mikroskopisi, uzun ve ince megakaryosit uzantılarını net bir şekilde görselleştirmek için en uygun olanıdır ve kesin niceleme sağlar. 30 dakika sonra, ilik hücreleri yavaş yavaş eksizyonun çevresine göç ederek bir monolayer oluşturur. 1 saat inkübasyondan sonra, megakaryositler büyük boyutları ve polilobulated çekirdekleri ile tanımlanabilir (Şekil 1J,K). 3 saat inkübasyondan sonra, megakaryositlerin sayısı artar ve bazılarının uzun uzantıları vardır. - Megakaryositlerin dönüşümlerini kaydetmek için videolar yapın.
6. Proplatelet uzatan megakaryositlerin nicelleştirilmesi
- Kuluçka odasındaki her bölümü yerelleştirmek için bir harita çizin (Şekil 1K).
- 1 saat sonra, her bölümün çevresindeki görünür megakaryositleri (yani dev polilobulated hücreleri) tanımlayın ve çizimdeki konumlarını çizin. Bu işlemi 3 ve 6 saat sonra tekrarlayın.
NOT: Çizime dayanarak, her megakaryosit zaman içinde kolayca bulunabilir ve morfolojilerinin evrimi analiz edilebilir (ör. boyut, deformasyon, proplatlet uzantısı vb.). Başka bir olasılık, belirli bir navigasyon yazılımının kullanılmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nitel sonuçlar. Deneyin başında tüm hücreler kemik iliği bölümünde sıkıştırılıyor. Hücrelerin eksplantların çevresinde net bir şekilde görünür hale gelmesi 30 dakika sürer. Megakaryositler daha sonra büyük boyutlarıyla tanınabilir ve evrimleri zamanla incelenebilir (boyut, şekil, dinamik, proplatlet uzantısı ve trombosit salınımı) (Şekil 2A). Küçük megakaryositlerin çapı 20 ila 30 μm arasındadır ve çekirdekleri polilobulated iken olgun yuvarlak megakaryositler genişlemiş sitoplazma ile daha büyüktür (> 30 μm çapında). Birkaç koyu megakaryosit gözlenebilir (Şekil 2C). Bunlar, oranı% 0,5'i geçmemesi gereken ölü hücreleri temsil eder. Bu değerden daha yüksek bir oran, örnek bir hazırlık sorununu gösterir. Çekirdeğin morfolojisi, odak değiştirilerek kolayca görselleştirilebilir.
Nicel sonuçlar. Megakaryositler 6.2'de açıklandığı gibi manuel olarak sayılır. ve inkübasyon odasının sızdırmazlığı sonrasında 3 saat 6 saat olarak morfolojilerine göre sınıflandırılır. Şekil 2A dört temel megakaryosit sınıfını özetler: (1) küçük MK'ler, (2) büyük MK'ler, (3) kalın uzantılı MK'ler, (4) ince, uzun ve ramified uzantılı MK'ler. Bunlar daha sonra tipik proplatelet oluşturan megakaryositlerdir, proplatletler boyunca şişliklerin belirgin özellikleri ve ekstremitelerinde kırılma tomurcuklarının varlığı ile. Haritalama yardımıyla (Şekil 1K), evrimleri zamanla takip edilebilir. Sonuçlar, her gözlem zamanında her sınıfın yüzdesi olarak ifade edilir. Klasik olarak, çevrede görülebilen megakaryositlerin yarısı, vahşi tip C57BL/ 6 fare kemik iliği için 6 saatte proplateletleri uzatır (Şekil 2B).
Proplateletleri nasıl oluşturduklarını görmek için zaman içinde sıralı görüntüler yakalayarak yuvarlak MK'lerin kaderini takip etmek mümkündür (Video 1). İlginçtir ki, kalın uzantılı MK'ler 3 saat boyunca izlendiğinde, kalın uzantıların hücre gövdesinden ayrılabileceği ve proplateletlere dallanabileceği veya büyük yuvarlak MK'leri reforme etmek için geri çekebileceği gözlenmiştir.
| Reaktif | H2O | ||||
| Stok I* | 16 g | 0,4 g | 2 g | 0.116 g | |
| NaCl | KARTAL | NaHCO3 | NaH2PO4, | 100 mL'ye kadar | |
| (2,73 M) | (53,6 mM) | (238 mM) | (8,6 mM) | ||
| Hisse Senedi II | 2.033 g MgCl2.6H2O (0.1 M) | ||||
| Hisse Senedi III | 2,19 g CaCl2,6H2O (0,1 M) | 100 mL'ye kadar | |||
| HEPES Stok** | 119 g HEPES* (0,5 M) | 1 L'ye | |||
| Tyrode'un Tamponu*** | 5 mL Stok I | 1 mL Stok II | 2 mL Stok III | 1 mL HEPES Stok | 1.8 mL albümin Stok |
Tablo 1: Tirozit tamponunun hazırlanması. Her stok çözümü tablonun ilk sütununda belirtilir. Kompozisyonun yanı sıra her stok çözeltisi için gereken reaktif miktarı (gram olarak verilir) satır başına belirtilir. Katalog numarası ve her reaktifin şirketi temel sarf malzemeleri tablosunda verilmiştir.
Şekil 1: Kemik iliği eksplantı için örnek hazırlama yönteminin fotoğrafik gösterimleri. (A) Kemik iliği hazırlığı için deneysel kurulum gereklidir. (B) Kemiğe 21 kalibrelik şırıngaya monte iğne sokulur. (C) Kemik iliği Tirode tamponu içeren bir tüpe yıkanır. (D) Kemik iliği daha sonra hafifçe cam bir kaydırağa biriktirilir. (E) Kemik iliğinin ekstremiteleri kesilir. (F) İlik silindiri on 0,5 mm kalınlığında bölümlere kesilir. (G-H) On bölüm bir kuluçka odasına aktarılır ve ters bir mikroskop kullanılarak 37 °C'de gözlemlenir. (I) Kemik iliğinin on bölümünü içeren bir kuluçka odasının temsili fotoğrafı. (J) Periferik hücreler, megakaryositlerin görünür hale geldiği bir katman oluşturmak için taşınır. (K) Kuluçka odasındaki on eksplant bölümün yanı sıra her bölüm için dokudan göç eden megakaryositlerin (X mavi işareti) yerini gösteren çizim örneği. Ok, çevrede bir megakaryosit gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Megakaryositlerin zaman içinde eksplantlarda morfolojik sınıflandırılması. (A) Megakaryositler "kalın uzantılı" veya "proplatelet uzatmalı" ile "küçük", "büyük" olarak sınıflandırılır. Çubuklar: 50 μm (B) Her sınıftaki megakaryositlerin oranı 1 saat olarak belirlenmiştir, Toplam 1.468 megakaryosit için 3 saat ve 6 saat, "küçük" ve "küresel" megakaryositlerin oranının zamanla azaldığını gösterirken, paralel olarak proplateletleri uzatan megakaryositlerin oranı artar (n=6 fare). Tipik olarak, 3 saat sonra bir WT faresinin eksplantlarında, bölüm başına 8,3 ila 11,5 megakaryosit gözlenir. Hata çubuğu, her örnek için ortalamanın standart hatasına karşılık gelir. (C) Koyu bir megakaryosit temsili görüntü. Bar: 50 μm(D) Yeşil floresan protein ile etiketlenmiş kas dışı miyosin II-A ile bir megakaryosit temsili görüntüsü. Çubuk: 50 μm Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Proplateletleri genişleten bir MK gösteren hızlandırılmış video. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, kemik iliğinde yetişen proplateletleri genişletmek için megakaryositlerin verimliliğini değerlendirmek için basit ve düşük maliyetli bir in vitro yöntemi açıklıyoruz. Fare için kemik iliği eksplant modelinin dört ana avantajı vardır. İlk olarak, gelişmiş teknik becerilere gerek yoktur. İkincisi, megakaryosit uzatıcı proplateletler elde etmek için gereken süre oldukça kısadır, eksplant yöntemi için sadece 6 saattir, fare atalarından başlayan geleneksel bir kültür yöntemi için en az 4 gün. Üçüncüsü, sadece az miktarda dokuya ihtiyaç duyulduğu ve elde edilen sonuçların tekrarlanabilir olduğu göz önüne alındığında, ihtiyaç duyulan fare sayısını minimuma indirir (deneysel durum başına genellikle 6 fare), bu deneyleri ekonomik ve etik olarak verimli hale getirir. Son olarak, ancak daha da önemlisi, bu yöntemin gücü, doğal ortamlarında tamamen gelişmiş olan megakaryositlerin kullanılmasında yatmaktadır, bu da kültür koşullarının potansiyel eserleri tarafından in vitro olarak maskelenebilecek fenotiplerin ortaya konmasında paha biçilmez olabilir. Bu daha önce, in vitro (artmış formasyon)10 ve in vivo (azalmış formasyon) farklılaştırılmış megakaryositlerde proplatlet oluşumunda karşıt sonuçların bulunduğu megakaryosit kısıtlı MYH9 inaktivasyonu olan farelerde belgelenmiştir11. Bu paradoksal sonuçlar, kısıtlama ortamında normal megakaryosit farklılaşması için miyosin IIA gereksinimi ile açıklanmıştır, miyosin IIA ise sıvı kültüründe megakaryosit farklılaşması için dağıtılabilir7.
Kemik iliği eksplant modelinin ilginç bir uygulaması, transgenik farelerdeki ve/veya farmakolojik ajanlardaki genetik mutasyonların veya eksikliklerin sadece trombosit uzatma sürecine etkisini, in vitro kültürde olduğu gibi farklılaşma sürecine müdahale etmeden inceleme imkanıdır12. İdeal durum, bir uyluk kemiğinin kemik iliğini tedavi edilen bir örnek ve muadili kontrol olarak kullanmaktır. Ek olarak, megakaryositlerde spontan floresan sağlayan transgenik farelerin kullanımı trombosit uzatma işleminin görselleştirilmesini kolaylaştırır. Floresan megakaryositleri görselleştirmek için, kültür odasına belirli megakaryosit belirteçlerine karşı floresan etiketli antikorlar eklemek bir olasılık olabilir. Başka bir olasılık, özellikle literatür 13'te bildirilen CD41 etiketli YFP'li fareler gibi megakaryositik soyda veya Şekil 2D'degösterildiği gibi GFP'nin kas dışı miyosin II-A14'ün N-terminusuna bağlı olduğu fareler gibi tüm hücrelerde floresan bir proteini ifade eden genetik olarak tasarlanmış fare modellerinin kullanılması olabilir.
Bu eksplant yöntemi, doğal ortamlarında trombosit oluşumunun daha iyi anlaşılması için hem nitel hem de nicel bilgi sağlar. Dikkat çekici, bu yöntem basit ve hızlı olmasına rağmen klasik sıvı kültürü kullanılarak yapılan çalışmaların tamamlayıcısı olmaya devam etmektedir. Her biri çoğalma, olgunlaşma, trombositlerin uzatılması ve çalışmak istediği trombosit salınım aşamalarına göre ayrı bilgi getirir. Örneğin, explant yönteminin proplateletlerin fizyolojik bağlamda yetişen megakaryositler tarafından uzatılma kapasitesi hakkında bilgi verdiği durumlarda, in vitro kültürü hücre ridigity7 veya hücre dışı matris bağımlılığının etkisi gibi kemik iliği mikroçevresinin önemi hakkında bilgi sağlar15. Böylece, in vitro megakaryosit kültürleri mikroçevrim parametrelerini sertlik ve yapışkan proteinler açısından modüle etmeyi mümkün klar7,16. Daha fazla bilgi için bu konuda sunulan J. Boscher ve ark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması ilan değil.
Acknowledgments
Yazarlar jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert'e teknik yardım için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 ve ANR-18-CE14-0037 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
