Summary
Hücrelerin üç boyutlu ortamının davranışlarında, olgunlaşmalarında ve/veya farklılaşmalarında önemli bir rol oynayabileceği artık kabul ediliyor. Bu protokol, fiziksel çevreleme ve mekanik kısıtlamaların megakaryositler üzerindeki etkisini incelemek için tasarlanmış üç boyutlu bir hücre kültürü modelini açıklar.
Abstract
Hem hapsetmeye hem de mekanik kısıtlamalara yol açan 3D ortam, hücre davranışının önemli bir belirleyicisi olarak giderek daha fazla tanınmaktadır. 3D kültürü böylece in vivo durumuna daha iyi yaklaşmak için geliştirilmiştir. Megakaryositler kemik iliğindeki (BM) hematopoetik kök ve progenitör hücrelerden (HSPC) farklılık sağlar. BM, kemiğin içinde kapalı olarak vücudun en yumuşak dokularından biridir. Kemik hücre ölçeğinde zayıf genişletilebilir, megakaryositler birlikte zayıf bir sertliğe ve yüksek hapsetmeye maruz kalır. Bu protokol, fare soyu negatif (Lin-) HSPC'lerin immün manyetik sıralama ile kurtarılması ve metilselülozdan oluşan bir 3D ortamda olgun megakaryositlere farklılaşması için bir yöntem sunar. Metilselüloz megakaryositlere karşı reaktif değildir ve sertliği normal kemik iliğine ayarlanabilir veya patolojik fibrotik iliği taklit etmek için arttırılabilir. Daha fazla hücre analizi için megakaryositleri kurtarma işlemi de protokolde ayrıntılı olarak yer uzamaktadır. Proplatelet uzantısı 3D milieu içinde önlenmiş olsa da, megakaryositlerin sıvı ortamda nasıl yeniden sulandırılacağı ve proplateletleri uzatma kapasitelerinin nasıl ölçülmesi aşağıda açıklanmıştır. 3D hidrojelde yetişen megakaryositler, sıvı bir milieu'da yetişenlere kıyasla proplatlet oluşturma kapasitesi daha yüksektir. Bu 3B kültür, i) ataları daha yüksek olgunlaşma durumuna ulaşan megakaryositlere doğru ayırt etmeye, ii) in vivo olarak gözlemlenebilen ancak klasik sıvı kültürlerinde fark edilmeyen fenotipleri yeniden toplamaya ve iii) 3D bir ortamın sağladığı mekanik ipuçlarının neden olduğu transdüksiyon yollarını incelemeye izin verir.
Introduction
Vücuttaki hücreler karmaşık bir 3D mikroçevrimi yaşarlar ve komşu hücreler ve çevresindeki matris 1,2,3nedeniyle dokudan sertlik ve hapsetme de dahil olmak üzere kimyasal ve mekanofizik ipuçları arasındaki etkileşime tabi tutulurlar. Sertlik ve hapsetmenin hücre davranışı için önemi sadece son yıllarda kabul edilmiştir. 2006 yılında, Engler ve ark. 4'ün ufuk açıcı çalışması, mekanik ortamın hücre farklılaşması için önemini vurgulamıştır. Yazarlar, hücre substrat sertliğindeki varyasyonun kök hücrelerin çeşitli farklılaşma soylarına doğru yönlendirilmesinde neden olduğunu göstermiştir. O zamandan beri, mekanik ipuçlarının hücre kaderi ve davranışı üzerindeki etkisi giderek daha fazla tanındı ve incelendi. Organizmanın en yumuşak dokularından biri olmasına rağmen, kemik iliği kemiğin içinde sınırlı olan 3D yapısal bir organizasyona sahiptir. İlik sertliği, teknik olarak tam olarak ölçülmek zor olsa da, 15 ila 300 Pa 5,6arasında olduğu tahmin edilmektedir. Stroma içinde, hücreler birbirine sıkıca hapsedilir. Ek olarak, çoğu kan dolaşımına girmek için sinüzoid damarlara doğru göç ediyor. Bu koşullar, bu kuvvetlere uyum sağlamak zorunda olan bitişik hücreler üzerinde ek mekanik kısıtlamalar oluşturur. Mekanik ipuçları, megakaryosit farklılaşması ve proplatlet oluşumu üzerindeki sonuçları yeni araştırılmış önemli bir parametreyi temsil eder. Megakaryositler geleneksel sıvı kültüründe in vitroyu ayırt edebilse de, kısmen3D ortamdan mekanik ipuçlarının olmaması nedeniyle vivo olarak gözlenen olgunlaşma derecesine ulaşmazlar 7. Hidrojel gömülü büyüyen progenitors sıvı milieu eksik 3D mekanik ipuçları getiriyor.
Hidrojeller, hematolojik alanda birkaç on yıldır yaygın olarak kullanılmaktadır, özellikle hematolojik progenitörleri ölçmek için kolonide test oluşturan hücreleri yetiştirmek için. Bununla birlikte, bu tür hidrojeller, 3D mekanik ortamın hematopoetik hücrelerin olgunlaşması ve farklılaşması üzerindeki biyolojik etkisini araştırmak için nadiren kullanılmıştır. Son birkaç yıldır laboratuvarımız metilselüloz bazlı bir hidrojel kullanarak bir 3D kültür modeli geliştirmiştir 8. Bu tepkisel olmayan fiziksel jel, yerel megakaryosit ortamının fiziksel kısıtlamalarını taklit etmek için yararlı bir araçtır. Selülozdan hidroksil kalıntılarının (-OH) metoksit grupları (-OCH3)ile değiştirilmesi ile elde edilir. Hem metil ikame derecesi hem de metilselüloz konsantrasyonu, jöle olduktan sonra hidrojel sertliğini belirler. Bu tekniğin gelişim aşamasında, 30 ila 60 Pa aralığındaki bir Young modülünün megakaryosit büyümesi için en uygun jel sertliği olduğu gösterilmiştir 9.
Aşağıdaki protokol, 3D metilselüloz hidrojelde fare megakaryositik atalarını yetiştirme yöntemini açıklar. Standart sıvı kültürü ile karşılaştırıldığında, bu hidrojel kültürün megakaryosit poliploidizasyon derecesini artırdığı, olgunlaşmayı ve hücre içi organizasyonu iyileştirdiği ve sıvı bir ortamda yeniden yaşamdan geçirildikten sonra yayılımları uzatmak için megakaryositlerin kapasitesini artırdığı gösterilmiştir 9. Bu makale, fare kemik iliği Lin− hücrelerinin izolasyonu ve 3D kültür için metilselüloz hidrojel içine gömülmesi protokolünü ve ayrıca proplatlet üretme kapasitelerinin nicelleştirilmesini ve daha fazla analiz için hücrelerin geri kazanımını ayrıntılı olarak açıklamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak yapılmalıdır. Videoda görüntülenen tüm protokoller, Avrupa yasalarına ve Etablissement Français du Sang (EFS) İnceleme Kurulu'nun tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Bu protokolün ilk sürümü ilk olarak 2018 yılında Moleküler Biyoloji yöntemleri 8.
NOT: Şekil 1, tüm sürecin şematik bir görünümünü sunar. Bu işlem 1) kemik diseksiyonu, ilik alımı ve ilik hücrelerinin mekanik izolasyonu, 2) soyu negatif (Lin-) hücrelerin manyetik olarak sıralanması, 3) sıvı veya metilselüloz hidrojelde tohumlama ve 4) sıvı ortamda proplatelet oluşumunun incelenmesi için 3D jelde yetiştirilen megakaryositlerin yeniden tohumlanmasıdır.
1. Yetişkin farelerden kemik toplama
NOT: Bu bölümde mikrobiyal kontaminasyonun en aza indirilmesi önemlidir.
- Toplam penisilin-streptomisin-glutamin (PSG) antibiyotik karışımının %1'ini içeren Dulbecco Modifiye Eagle's Medium (DMEM) ile kemik toplama için 15 mL'lik bir tüp hazırlayın (penisilin 10000 U/mL, streptomisin 100000 μg/mL ve L-glutamin 29.2 mg/mL).
NOT: Kullanılan tüm fareler aynı genotipe sahipse, tüm kemikleri aynı tüpte 1 mL DMEM - PSG% 1 fare sayısı içeren bir havuza edin. Antibiyotikler, kemik örneklemesi sırasında olası bakterilerin çoğalmasını önlemek için önemlidir. - 50 mL'lik bir tüpü kemik dezenfeksiyonu için% 70 etanol ve işlem sırasında durulama aletleri için bir tane daha doldurun. Sterilize diseksiyon aletleri kullanın.
- İsofluran inhalasyonunu (%4) kullanarak fareleri uyuşturun ve fareleri ötenazi yapmak için hızla servikal çıkık işlemine geçin. Mikrobiyal kontaminasyonu dezenfekte etmek ve önlemek için vücudu hızla% 70 etanol içine daldırın.
- Kaval kemiğini ve uyluk kemiğini hızla parçalara ayrıştırın.
- Neşter kullanarak, tibia için ayak bileği yan ucunun ve uyluk kemiği için kalça yan ucunun epifizlerini kesin.
- Kemikleri %1 PSG içeren DMEM ortamına batırmadan önce %70 etanolde bir saniye için daldır.
2. İlik ayrışması ve Lin hücrelerinin izolasyonu
NOT: Protokolün bu kısmı laminer akış başlığı altında gerçekleştirilir. Bir kültür için, tüm kuyular aynı deneyin bir parçasıdır ve bağımsız biyolojik kopyalar olarak kabul edilemez. Tüm farelerden gelen hücreler, tüm kuyuların homojenliğini sağlamak ve olası bireyler arası değişkenliği ortadan kaldırırken birbirleriyle karşılaştırabilmek için bir araya getirilir. Bağımsız biyolojik çoğalmalar için kültür tekrarlanmalıdır.
- Kemikleri bir Petri kabına yerleştirin ve potansiyel kirleticileri gidermek için steril Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) iki kez yükseltin.
- DMEM - 50 mL tüpte % 1 PSG hazırlayın.
NOT: Deney için kullanılan fare başına 2 mL DMEM - %1 PSG sağlayın. - 21 kalibrelik bir iğne ile donatılmış 5 mL şırıngayı DMEM - % 1 PSG ile doldurun.
- Kemiği perip uçlarıyla tutarak, diz yan ucunda sadece iğnenin eğimini tanıtın.
NOT: Diz tarafı epifizi diseksiyondan bozulmadan kalmalı ve merkezinde iğnenin sokulması için küçük bir boşluk bırakılmalıdır. Kalan epifiz, yıkama sırasında iğneye bağlı kemiği koruyacaktır. İliği ezebileceği ve zarar verebileceği için kemikteki eğimden daha fazlasını tanıtmamaya dikkat edin. - İliği 50 mL'lik bir tüpe boşaltmak için şırınna pistonuna hızlı bir şekilde bastırın.
NOT: Sıçramaları önlemek ve iliğin yıkanmasını ve serbestleşmesini kolaylaştırmak için kemiğin serbest ucunu DMEM-% 1 PSG'ye batırılmış tüp duvarına yerleştirin. Pratikte, iliği kemikten çıkarmak için genellikle 500 μL ile 1 mL arasında bir hacim yeterlidir. İlik tamamen dışarı atıldığında kemik beyazlaşmıştır. İliğin kalan bazı kırmızı renklerle değerlendirildiği gibi diyofizden tamamen atılmamış olması durumunda, floşun taze ortamla tekrarlanması mümkündür. - 2.4. ve 2.5. tüm kemikler için, 5 mL şırıncı DMEM ile yeniden doldurulması - gerekirse% 1 PSG.
- Yıkanmış ilik içeren ortamın toplam hacmini yuvarlak tabanlı 10 mL tüplere aktarmak için 21-gauge iğne ile aynı 5 mL şırıngayı kullanın.
NOT: Yuvarlak tabanlı 10 mL'lik bir tüpe geçmek kesinlikle gerekli değildir, ancak aşağıdaki ayrışma adımlarına devam etmeyi kolaylaştırır. Bulaşma riskinden şüphelenilirse şırınga ve/veya iğneyi değiştirmekten çekinmeyin. - Orta ve ilik hücrelerini 21 kalibrelik bir iğneden art arda iki kez, 23 kalibrelik bir iğneden üç kez ve bir kez de 25 kalibrelik bir iğneden aspirasyon yaparak ve dışarı atarak hücre ayrışması işlemine devam edin.
NOT: Hücreler için zararlı olabileceğinden hava kabarcıklarından kaçının. - Süspansiyonu 15 mL tüplere aktarın.
- Ölü hücreleri dışlamak için trypan mavisi varlığında otomatik bir hücre sayacı veya hücre odası kullanarak hücre numarasını ölçün ve uygulanabilirliği kontrol edin.
- 15 mL tüpleri 300 x g'da 7 dakika santrifüj edin. 1 mL transfer pipet kullanarak, dikkatlice pipet dışarı ve süpernatant atın.
- Fare hematopoetik hücre izolasyon kiti kullanarak negatif immünmanyetik sıralama ile kök ve progenitör hücreleri izole edin.
NOT: Bu hücre sıralamanın amacı, tüm seçim antikorları (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) için negatif olan hücreleri almak ve bu nedenle megakaryositik olandan başka bir farklılaşma soyunda olan hücreleri ortadan kaldırmaktır. - Kit talimatlarını izleyerek, hücresel peleti taze hazırlanmış M ortamına (fetal sığır serumunun (FBS) son hacminin % 2'sine sahip PBS), EDTA 1 mM) 1 ×10 8 hücre/mL konsantrasyona yeniden uygulayın ve süspansiyonu yuvarlak tabanlı 5 mL polistiren tüplerde maksimum 2 mL hacme dağıtın.
- Polistiren tüplere ekleyin: 50 μL/ mL konsantrasyonda normal sıçan serumu ve biyotinillenmiş antikor karışımı (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) konsantrasyonda mL başına 50 μL karışım ve tüpleri hafifçe sallayarak homojenize edin.
NOT: Bu antikorlar, megakaryositik yol dışında zaten bir farklılaşma yoluna girmiş hücrelere bağlanır. - Tüpleri 15 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatır.
- 75 μL/mL konsantrasyonda streptavidin kaplı manyetik boncuklar ekleyin ve tüpleri hafifçe sallayarak homojenize edin.
- 10 dakika boyunca buzda tekrar kuluçkaya yaslanın.
- Gerekirse, M m orta ile tüp başına 2,5 mL'lik son hacme ayarlayın.
- Kapağı olmadan, bir mıknatısın içine yerleştirmeden hemen önce tüpü hafifçe sallayarak süspansiyonu homojenize edin ve üç dakika bekleyin.
NOT: Zaten bir farklılaşma yoluna girmiş ve manyetik boncuklarla kaplanmış hücreler mıknatısın içindeki tüpün duvarında tutulacaktır. - Tüp içeriğini yeni bir yuvarlak tabanlı 5 mL polistiren tüpe aktarmak için mıknatısı ve tüpü ters çevirin.
NOT: Aktarma için tüpü mıknatıstan almayın; mıknatısı hala tüp içindeyken ters çevirerek yapılır. Sabit bir hareket kullanın ve tüpü sallamayın. - istenmeyen manyetik etiketli hücreler içeren ilk tüpü atın ve yenisini kapağı olmadan üç dakika daha mıknatısa yerleştirin.
- Adım 2.20'de olduğu gibi, izole edilmiş Lin− hücrelerini yeni bir 15 mL tüpe aktarın.
NOT: Önceki adımlar için birkaç adet 5 mL polistiren tüp kullanılmışsa, tüm hücreleri aynı 15 mL tüpte biriktirin. Hücre tasnif edildikten sonra kurtarılan hücreler hematopoetik kök hücreler ve progenitörlerdir. Megakaryopoezis 10'unana fizyolojik regülatörü olan trombopoietin (TPO) varlığı, hücre farklılığını megakaryositik hücre hattına yönlendirecektir. - Adım 2.10'daki gibi Lin− hücre sayısını ve canlılığını ölçün.
- 1 x 106 uygulanabilir hücreye sahip olmak için santrifüje gerekli hücre süspansiyon hacmini hesaplayın x Kuyu Sayısı, Kuyu Sayısı durum başına tohumlanan kuyu sayısıdır.
- 7 dakika boyunca 300 x g'da uygun hücre süspansiyonu ve santrifüj hacmi ile her koşula bir tüp hazırlayın.
- Sıvı kültürler için, süpernatantı atın ve hücre peletini tam kültür ortamında yeniden biriktirin (DMEM, PSG son hacmin % 1'i, FBS son hacmin% 10'u, hirudin 100 U / mL, TPO 50 ng / mL) 2 × 106 uygulanabilir hücre / mL 'nin son konsantrasyonuna ulaşmak için (500 μL kuyusu başına 1 ×10 6 hücreye eşittir). Hücreleri %5 CO2'nin altında 37 °C'de kuluçkaya yatırın. (= kültürün 0. günü)
NOT: Metilselüloz kültürleri için bir sonraki paragrafa bakın Örnek olarak, bir kuyu için tam kültür ortamı hazırlamak, 435 μL DMEM, %10 final için 50 μL %100 FBS, %1 final için %100 PSG 5 μL, 100 U/mL finali için 10 000 U/mL'nin 5 μL'si ve 50 ng/mL finali için 5 μL 5 μg/mL TPO kullanın. 4 kuyulu veya 24 kuyulu kültür plakaları tipik olarak kullanılır, çünkü kuyu çapları kuyu başına gereken 500 μL için uygundur.
3. Metilselüloz hidrojel içine hücre gömme
NOT: Aşağıdaki protokolde, hidrojel hücre kültürünün tek bir kuyuyu elde etme, ihtiyaç duyulan kuyu sayısına uyum sağlama yönteminin açıklanmış olduğunu lütfen unutmayın.
- Oda sıcaklığında% 3 metilselüloz stok çözeltisinin 1 mL aliquots'unu çözün. Şırınna kaplama için bir ayrı ekstra metilselüloz aliquot hazırlayın.
NOT: %3 konsantrasyonda, metilselüloz oda sıcaklığında (20-25 °C) sıvı kalır. - Ekstra aliquot'tan 1 mL metilselüloz çekerek metilselüloz ile 18 kalibrelik bir iğne ile donatılmış 1 mL Luer kilit şırıngasını kapleyin. Metilselülozu tamamen at.
NOT: Bu kaplama adımı, 3.3. - Aynı şırınga ve iğne ile ancak yeni bir metilselüloz aliquot kullanarak, uygun metilselüloz hacmini çizin (Şekil 2A).
NOT: Kuyu başına 500 μL'lik son hacimde%2 metilselülozun son konsantrasyonuna ulaşmak için% 3 metilselülozun 333 μL'si gereklidir. - İğneyi dikkatlice çıkarın. Sterilize edilmiş önseçimler kullanarak, şırınd ucuna bir Luer kilit konektörü vidalayın (Şekil 2B-C).
- İki şırınnayı birbirine bağlamak için Luer kilit konektörüne ikinci, kaplamasız, 1 mL Luer kilit şırıngını takın (Şekil 2D).
NOT: Bu ikinci şırınnayı kaplamaya gerek yoktur. - Metilselüloz hacmini iki şırınna ( Şekil2E) arasında eşit olarak dağıtın ve 3.11.
- Konsantre DMEM kültür ortamını, her bileşik için sıvı kültür ortamından biriyle aynı konsantrasyonu elde etmek için son metilselüloz hacminde (adım 3.11) elde etmek üzere hazırlayın (PSG son hacmin% 1'i, FBS son hacmin% 10'u, hirudin 100 U / mL, TPO 50 ng / mL).
- 1 × 10 6 hücreli son kuyu başına167 μL konsantre kültür ortamı hazırlayın. Bu ortam hacmi,% 2'lik nihai bir metilselüloz konsantrasyonu elde etmek için hesaplanır. Kuyudaki toplam hacim 500 μL (konsantre kültür ortamında 167 μL hücre süspansiyonu + 333 μL metilselüloz) olacak ve tüm bileşenler sıvı kuyularındakiyle aynı konsantrasyona sahip olacaktır.
- Örnek olarak, bir kuyu için tam kültür ortamı hazırlamak, 102 μL DMEM, %10 final için 50 μL %100 FBS, %1 final için %100 PSG 5 μL, 100 U/mL finali için 10 000 U/mL 5 μL ve 50 ng/mL final için 5 μL 5 μg/mL TPO kullanın. Hücreleri yeniden kullanmak için kullanılan 167 μL'lik bir hacim verir ve 333 μL metilselüloz ilavesiyle son hacim 500 μL olacaktır.
- Santrifüjleme adımı 2.26'yı tamamladıktan sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini konsantre kültür ortamında 167 μL başına 1 ×10 6 hücre oranında yeniden biriktirin.
- Şırınnaları geri alın ve birini konektörden çıkarın.
- Hücre süspansiyonunun pipet 167 μL'si.
- Hücre süspansiyonunu doğrudan şırınna konektörüne ekleyin (Şekil 2F), hava kabarcıklarını tanıtmamaya dikkat edin.
NOT: Hücre süspansiyonu eklerken, hücre süspansiyonu için biraz yer kazanmak için şırınna pistonu aynı anda yavaşça çekin. - Vida ipliğinde herhangi bir süspansiyon kaybetmeden iki şırınnayı(Şekil 2G)dikkatlice yeniden bağlayın.
NOT: Yeniden bağlanmadan önce, konektörü yarı boş bırakmak için pistonu çizin ve süspansiyon taşmadan ikinci şırınnanın bağlanması için yeterli alan bırakın. - Metilselüloz ortamını hücre süspansiyonu ile iki şırıng arasında on ileri geri piston hareketi ile yavaşça homojenize edin (Şekil 2H).
- Toplam ses seviyesini bir şırınna çizin ve iki şırınnanın bağlantısını kesin ve bağlayıcıyı boş olanda bırakın.
- Şırındının içeriğini 4 kuyulu bir tabağa boşaltın (Şekil 2I).
- Hücreleri %5 CO2 altında 37 °C'de kuluçkaya yatırın (= kültürün 0. günü).
NOT: Bir çift şırınna ile iki metilselüloz kuyusu hazırlamak mümkündür. 2 x106 hücreye sahip olmak için metilselüloz hacmini ve hücre süspansiyonunun hacmini iki artırın. 3.13. adım tamamlandıktan sonra. her birinde 500 μL olması için hacmi iki şırınna arasında eşit olarak dağıtın. Bunların bağlantısını kesin ve bir kültür kuyusunda bağlayıcı olmadan olanı boşaltın. Birimi bağlayıcıyı tutandan diğerine aktarmak için şırınnaları yeniden bağlayın. Şırınnaları çıkarın, 500 μL'ye sahip olan konektör takılı olmamalıdır ve hücreleri ikinci bir kültür kuyusunda tohumlamamalıdır. %3 metilselüloz, Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium'unda (IMDM) stok çözümü olarak satın alınırken, konsantre hücreler DMEM'de askıya alınır. Karşılaştırmalı testler başlangıçta, bu karışık ortamın, özellikle% 100 DMEM'deki sıvı kültürüne kıyasla, deneyin sonucu üzerinde hiçbir etkisi olmadığından emin olmak için yapılmıştır.
4. Proplatelet Analizi için Hücre Resüspensyonu
NOT: Proplatelet oluşturma kapasitesinin analizi, sıvı ve metilselüloz yetiştirilen megakaryositler arasında karşılaştırılabilir koşullar altında yapılmalıdır. Metilselüloz hidrojel tarafından uygulanan fiziksel kısıtlamalar proplatelet uzantısını inhibe eder. Bu nedenle, metilselülozla yetiştirilen hücreler, proplateletleri uzatmalarına izin vermek için kültürün 3. Metilselüloz hidrojel, sıvı ortam ilavesi üzerine kolayca seyreltilen fiziksel bir hidrojeldir. Daha da önemlisi, resüspenzyon ve santrifüjlenmeden kaynaklanan eserlerden kaçınmak için, kontrol sıvısı orta durumundaki hücrelerin metilselüloz tarafından yetiştirilen hücrelerle aynı anda tedavi edilmesi gerekir. Deneyin şematik gösterimine bakın (Şekil 1).
- Her kuyunun yeniden dürtülmesi için 15 mL'lik bir tüpte 37 °C'de önceden ısıtılmış 10 mL DMEM - %1 PSG hazırlayın.
- DMEM'in 10 mL'sinde her kuyudaki hücreleri dikkatlice yeniden biriktirin - % 1 PSG.
NOT: Metilselülozu tamamen seyreltmek için birkaç yukarı ve aşağı hareketi hafifçe yapın. Sıvı kuyular için kuyunun dibinde biriken tüm hücreleri topladığından emin olun. - Tüpleri 300 × g'da 5 dakika santrifüj edin.
- Bu arada tam kültür ortamı hazırlayın (DMEM, PSG son hacmin% 1'i, FBS son hacmin% 10'u, hirudin 100 U / mL, TPO 50 ng / mL).
NOT: Bu adımda her kuyu yarı yarıya seyreltilmek üzere alınır, bu nedenle kuyu başına 1 mL tam kültür ortamı hazırlayın. - Süpernatant atın ve hücre peletini her tüp için 1 mL kültür ortamında yeniden dirildi.
- 4 veya 24 kuyulu bir plakada kuyu başına 500 μL hücre süspansiyonu yeniden sıralandı ve % 5 CO2'ninaltında 37 °C'de kuluçkaya yatırıldı.
NOT: Bir ilk kuyudan, yinelenen proplatelet görselleştirme için 2 kuyu elde edin. Bu yinelemeler aynı örnekten kaynaklandığından, bağımsız yinelemeler olarak kabul edilemeyeceklerini lütfen unutmayın. - Yeniden yapılanmadan 24 saat sonra,× kültürün 4.
NOT: Hücreler kuyunun merkezinde gruplanma eğilimindedir, proplatelet görselleştirme ve nicelemeyi zorlaştırabileceğinden sahada çok fazla hücre olmadığından emin olun. Alan başına en az 5 megakaryosit yakaladığından emin olun. - Her görüntüde proplateletleri genişleten megakaryositlerin ve megakaryositlerin toplam sayısını sayın ve proplateletleri genişleten megakaryositlerin oranını hesaplayın.
NOT: Nicelik otomatik değildir; hücre sayımının el ile gerçekleştiriliyor. Sayım, sayıldıkları gibi işaretlemek için hücrelere tıklamak için ImageJ'in hücre sayma eklentisinin kullanılmasıyla kolaylaştırılabilir. Kuyu başına elde edilen 10 alan ve yinelenen kuyular, durum başına yaklaşık 150-300 megakaryosit temsil eder.
5. Gelecekteki analizler için hücre sabitleme ve alma
DİkKAT: Bu protokol, koruyucu ekipman giyerek duman kaputu altında ele alınması gereken fiksatifler kullanır.
NOT: Amaç, hücrelere uygulanan jel kısıtlamalarını tamamen sabitlenine kadar sağlam tutmaktır. Bu nedenle ve kullanılan fiksatif ne olursa olsun, jeli bozmadan metilselülozun üstündeki kuyuya eklenmelidir. Aynı protokol sıvı kültürlere de uygulanır.
- Jeli bozmadan metilselülozun üzerine tohumlu hacme eşit bir fiksatif çözelti hacmi (bu protokolde 500 μL) ekleyin. Kullanılan fiksatife göre uygun süreyi bekleyin (en az 10 dk).
NOT: Jel rengindeki hızlı bir değişiklikle ortaya çıkan jel boyunca sabit difüzyon çok hızlı olmalıdır (pembeden sarı-turuncu tona). Elektron mikroskopi analizi için glutaraldhehit (cacodylate tamponunda %5, kuyu başına 500 μL) kullanılırken, paraformaldehit (DPBS'de %8, kuyu başına 500 μL) genellikle immünoplabeling için kullanılır. - Bir P1000 pipet kullanarak, metilselülozu homojen bir şekilde seyreltmek için fiksatif ve jel ile birkaç yukarı ve aşağı pipetleme yapın.
- Aynı pipet ve ucu kullanarak, kuyudaki tüm hacmi 10 mL DPBS içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve homojenize edin.
- Karışımı 7 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
NOT: Tüm metilselülozu ortadan kaldırmak için ikinci bir yıkama adımı gerekebilir - Süpernatantı atın ve megakaryosit peletini istenen analize göre uygun ortamda yeniden atın (immünoplabeling, akış sitometrisi9,elektron mikroskopisi ...) (elektron mikroskopisi için ayrıca bu JoVE sayısında "İletim elektron mikroskopisi kullanılarak megakaryopoezin ana adımlarınınyerinde araştırılması" kağıt yöntemine bakın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak elde edilen veriler ilk olarak 2016 yılındaBlood'da yayınlanmıştır 9.
Protokole göre, hücreler sıvı veya metilselüloz hidrojel ortamda tohumlandı. Sıvı ortamdaki hücrelerin tümü kuyunun dibinde, sert plastik yüzeyle temas halinde ve bazen diğer hücrelerle çökeltilmiştir. Buna karşılık, metilselüloz hidrojel içine gömülü hücreler jelde homojen bir şekilde dağıtılır ve komşu hücrelerden izole edilir (Şekil 3A). Son konsantrasyonda % 2'lik bir son konsantrasyonda metilselüloz jel, sıvı kültürüne kıyasla ortalama megakaryosit çapını biraz arttırır (Şekil 3B), daha yüksek bildirilen ploidy9'auygun olarak . Buna karşılık, metilselüloz konsantrasyonunu% 0,5 oranında artırmak, daha küçük bir ortalama çapın gösterdiği gibi megakaryosit farklılaşmasına zarar verir (Şekil 3B).
Sıvı kültüründe farklılaşmış megakaryositler ile kemik iliği içinde in vivo olarak farklılaştırılmış olanlar arasında megakaryosit ultrayapısında gözle görülür bir fark gözlenir. Olgun megakaryositlerin karakteristik bir özelliği, gelecekteki trombositlerin zarı için bir rezervuar görevi gören karmaşık bir intrasitoplazmik membran ağı olan DMS 'dir (Sınır Membran Sistemi). Olgun megakaryositlerde DMS, sitoplazmanın çoğunu kaplayan iç içe geçmiş membran levhaları oluşturmak için düzenler. İletim elektron mikroskopisi (TEM) ile, sitoplazmik bölgeleri yakından uygulanmış ve tanımlanmış gibi görünmektedirler(Şekil 3C üst paneli) (TEM prosedürü için, aynı JOVE Sayısında "İletim elektron mikroskopisi kullanılarak megakaryopoezisin ana adımlarınınyerinde keşfi" kağıt yöntemine bakın). Sıvı kültüründe, DMS membranları çoğunlukla sitoplazmik bölgelerin sınırlandırılmamış küçük yuvarlak, oval veya uzun veziküllerinin görünümüne sahiptir(Şekil 3C orta panel). Bunun aksine, % 2 metilselüloz kültürü, DMS'nin organizasyonunu megakaryositlerin çoğunda, situ olana benzeyen sitoplazmik bölgeleri yakından yatıştıran ve sınırlayan membranlarla teşvik eder(Şekil 3C alt panel). Bu sonuç, %2 metilselüloz hidrojel kültürünün, çevre ortamının mekanik kısıtlamaları nedeniyle daha iyi megakaryosit farklılaşmasına izin verdiğini göstermektedir.
3. günde sıvı ortama hücre transferlerinden sonra, megakaryositler 4 saat 9'dansonra proplatletleri uzatmaya başlar. Şekil 4, sıvı milieu'da resüspensyondan sonra 24 saat uzatılmış proplateletlere sahip megakaryositlerin oranının nicelliğini göstermektedir. Parlak alan mikroskopisi ve 20 × amaç kullanılarak kuyu başına rastgele on görüntü elde edildi (Şekil 4A). Niceleme, Fiji 'deki (ImageJ) hücre sayacı eklentisi kullanılarak kör ve manuel olarak gerçekleştirildi (Şekil 4B). Bunlar birincil hücre kültürleri olduğundan, deneyler arası değişkenlik vardır, ancak protokol sağlam kalır ve iyi bir tekrarlanabilirlik sunar. Sıvı kültür öncesi durumda, proplatelet oranı% 10 ila% 20 arasında olmalıdır, bu oran hidrojel kültür öncesi için iki katına çıkar.
Şekil 1. Tüm sürecin şematik gösterimi. Kemikler parçalanır, ilik dışarı dökilir ve hücreler mekanik olarak ayrıştırılır. İlgi çekici kök ve progenitör hücreler (Lin-hücreleri) immünmanyetik negatif sıralama prosedürü ile izole edilir ve sıvı veya hidrojel ortamda tohumlanır (gün 0). Kültürün 3. gününde (toplamda 4 günlük bir süreyi temsil eden), her iki koşul da ayrı taze sıvı kültürü milieu içinde yeniden sınıflandırılıyor. Bu ikinci kültleme adımı, kültürün 3. gününden 4. gününe kadar gerçekleştirilir. Proplateletleri genişleten MK'lerin oranı kültürün 4. Görsel netlik için, bir hücre kuyu başına şematize edilir. Mavi daire, çekirdeği mor olan tek bir hücreyi tasvir ediyor. Son adımda, her iki MK da proplatelet ile temsil edilir. Proplatelet oluşturan MK'lerin oranı sıvı veya metilselüloz pre-kültüre bağlı olarak değişir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Metilselüloz hidrojel içine hücre gömme. Şırınd duvarını önceden kaplayarak, (A) uygun metilselüloz hacmini çizin; (B, C) iğneyi çıkarın ve şırıngaya bir konektör vidalayın; (D) metilselülozu konektörün yarısına itin ve ikinci bir şırınna takın; (E) metilselülozu iki şırınna arasında eşit olarak dağıtın ve bağlantıyı kesin; (F) hücre süspansiyonu konektörünü taşıyan şırındıya ekleyin; (G) iki şırınna yeniden bağlayın; (H) tüm hacmi bir şırıngdan diğerine birkaç kez iterek homojenize edin; (I) tüm hacmi bir kültür yemeğine atarak hücreleri tohumlayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Kültür durumuna göre megakaryosit özellikleri. (A)Kültürün 3. gününde megakaryositlerin sıvı (sol panel) veya %2 metilselüloz hidrojel ortamda (sağ panel) temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm (B) Sıvı ortamda veya% 2 veya% 2,5 metilselüloz hidrojelde yetişen megakaryositlerin ortalama çapı. Sonuçlar, 3 bağımsız kültürde ortalama ± SD olarak ifade edilir ve toplam en az 100 megakaryosit incelenir. *, P<0.05, ***P < 0.0001, Bonferroni'nin çoklu karşılaştırma testi ile varyansın (ANOVA) 1 yönlü analizini kullanarak. (grafik Aguilar ve ark. 2016'dan uyarlanmıştır) (C) Şematik görünüm (solda) ve murine megakaryositlerin temsili elektronik mikroskopi görüntüleri (ortada); sağ paneller, beyaz karelerden görünümleri kapatın (orta elektronik mikroskopi görüntüleri için ölçek çubuğu = 5 μm ve yakın görünümler için 2 μm). Üst paneller yerinde megakaryositlerdir, orta sıvı kültüründe in vitro olarak yetiştirilen megakaryositleri temsil eder ve alt paneller 3D metilselüloz hidrojelde yetişen megakaryositlerdir. Bu veriler ilk olarak Blood Journal, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_95'de yayımlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Proplatelet nicelemenin temsili sonuçları. (A) kültürün 4. Hücreler sıvı(sol)veya% 2 metilselüloz hidrojel ortamda(sağda)üç gün inkübe edildi ve ardından sıvı ortamda bir gün resüspensyon yapıldı. Siyah oklar, proplateletleri genişleten megakaryositleri gösterir. (Ölçek çubuğu = 50 μm). (B) Proplatelet oluşumunun temsili niceleme verileri. Proplatlet oluşumu, daha önce 0 günden 3. güne kadar sıvı veya% 2 metilselüloz hidrojel ortamda önceden kültürlenmiş megakaryositler için 4. Sonuçlar, proplateletleri genişleten megakaryositlerin %'si (ortalama ± SD) olarak ifade edilir ve 3 bağımsız deneyden meydana gelir ve durum başına toplam megakaryosit sayısı >750 (t-test, p = 0.0023). Proplateletleri uzatan megakaryositlerin ortalama oranı sıvı halde% 16 ve metilselüloz hidrojel pre-kültür için% 39'dur. Bu sonuç, sıvı duruma kıyasla proplatlet oluşumunu artıran hidrojel pre-kültürünün daha önce gösterilen ve yayınlanan etkisine karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önceki on yılda, mekanobiyoloji biyolojinin birçok alanına giderek daha fazla ilgi uyandırmıştır. Hücreleri çevreleyen mekanik ortamın davranışlarında rol oynadığı yaygın olarak kabul edilir ve megakaryositlerin hücre dışı mekanik ipuçlarını nasıl algıladığını ve yanıt verdiğini incelemenin önemini vurgular. Kemik iliği dokusunun sertliğini doğru bir şekilde ölçmek zordur in situ11, özellikle hematopoetik kırmızı iliği büyük memelilerde trabeküler kemiklerin içinde yer aldığı için düşünürsek, diafizden daha kolay erişilebilen ilik esas olarak adipozitlerden oluşur (sarı ilik)12. Diafizin esasen kırmızı ilik içerdiği farelerden izole edilmiş bir ilik durumunda, başka bir konu, kemikten çıkarıldıktan sonra dokunun yapışkan kalmamasıdır. Bununla birlikte, Shin ve işbirlikçileri atomik kuvvet mikroskopisi kullanarak fare diyofiz iliği sertliğini ölçmeyi başardılar ve iliği en yumuşak dokular arasına yerleştiren Eiliği = 0.3 ± 0.1 kPa değerini buldular6.
Burada açıklanan prosedürün ilgisi, sıvı ortamdaki megakaryosit davranışını hidrojeldekiyle karşılaştırmaktır. Sıvı milieu'da, hücrelerin hepsi kuyunun dibinde, sert plastik yüzeyle temas halinde ve bazen diğer hücrelerle çökeltilmiş. Buna karşılık, metilselüloz hidrojel içine gömülü hücreler jelde homojen bir şekilde dağıtılır ve diğer hücrelerden tamamen izole edilir (Şekil 3A). Bu nedenle, yan yana iletişim hariç, hapsetme tarafından sağlanan mekanik ipuçlarına gönderilirler. Parakrin stimülasyon tamamen dışlanamaz. Bununla birlikte, metilselüloz hidrojel içine gömülü hücreler kemik iliğindeki durumun aksine birbirlerinden uzaktır ve böylece salgılanan maddelerin komşu hücrelere ulaşması durumunda çok seyreltilebileceklerini varsayabiliriz.
Yöntemin kurulumu kolaydır ve belirli beceriler gerektirmez. Metilselüloz, polimer zincirleri kurvalent olmayan çapraz bağlar oluşturan fiziksel bir jeldir. Düşük sıcaklıkta sıvı olmak, sıcaklığı arttırırken jöleler (jelin mekanik özelliklerinin karakterizasyonu hakkında daha fazla bilgi için lütfen Aguilar ve ark. 20169'daki makaleye bakın). Bu jel durumu, ister jel ister canlı hücre olarak sabitlenmiş olsun, hücrelerin kolay bir şekilde geri kazanılmasını sağlayan sulu çözeltideki seyreltme sonrasında kolayca tersine çevrilebilir.
Burada kritik bir faktör hidrojel sertliğidir. Hidrojel konsantrasyonundaki küçük bir değişiklik bile milieu sertliği ve dolayısıyla megakaryosit olgunlaşması üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceğinden, uygun metilselüloz hacmi çok hassas bir şekilde dağıtılmalıdır. Örneğin, daha önce metilselüloz konsantrasyonu% 2'den% 2,5'e çıkarmanın jel sertliğini (Young modülü) 10 kat artırdığı gösterilmiştir. Olası bir tuzak, metilselülozun hücrelerle tohumlandıktan sonra her deneysel kuyudaki hassas reolojik özelliklerini doğrulamak için kolay bir kalite kontrolü olmamasıdır. Bununla birlikte, doğru bir jel konsantrasyonu hakkında güven verecek temel bir kriter, hidrojel içindeki megakaryositlerin, sıvı ortamdakine kabaca benzer büyüklükleri tarafından yansıtıldığı gibi uygun olgunlaşmasıdır. Ortalama çaplarındaki bir azalma, %2,5 metilselüloz ile sertliği arttırırken meydana gelenlere benzer kusurlu bir farklılaşmayı yansıtabilir (Şekil 3B).
Yöntemin bir başka sınırlaması, hidrojelden hücre geri kazanımının klasik kültürden daha fazla zaman almasıdır, çünkü önce santrifüjlemeden önce jeli seyreltmek gerekir. Metilselülozun tamamen çıkarılması gerekiyorsa, örneğin daha fazla batı lekesi veya RNA izolasyon prosedürü için hücre lysate elde etmek için, proteinlerde veya RNA'da (protein defosforilasyonu, RNA bozulması...) değişiklikler meydana gelebilecek ek bir yıkama adımı gerekebilir.
Yordamda dikkate alınması gereken kritik bir nokta, her koşulda eşit olması gereken hücre sayısıdır. Bu, sıvı kültüründe, hücrelerin kuyunun dibinde tortulanma eğiliminde olduğu ve bazıları hidrojel süspansiyondaki hücreler için durum böyle olmayan plastik yüzeye yapıştığı için önemsiz değildir. Bir tuzak, sıvı durumdaki hücrelerin eksik toplanmasıdır, bu da 3. günde sıvı ortamda süspansiyondan sonra "sıvı" ve "hidrojel" durumu arasında farklı bir hücre içeriği ile sonuçlanır. Böyle bir fark, nihai verilerde tutarsızlıklara yol açabilir. Denetim noktası olarak, hücreleri yeniden göndermeden önce bu aşamada bir hücre sayısı yapılabilir. Özellikle megakaryositler gibi daha büyük hücreler için uygun olduğu için nageotte hemositometre kullanarak manuel olarak yapılması tercih edilir.
Herhangi bir birincil hücre kültürüne gelince, olası bir kontaminasyon riski vardır. Kontaminasyon, metilselüloz kültür öncesi durumunda alışılmadık derecede düşük bir proplatelet oranına en olası açıklamadır, çünkü küçük bir kontaminasyonun tespiti sıvı ortamdan daha zor görünmektedir. Bu nedenle, proplatelet nicelemesine kadar fark edilmeden gidebilir ve yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. özellikle şırınnaların ve konektörlerin çok sayıda ve kesin manipülasyonunu gerektiren metilselüloz hücre kapsülleme sırasında iyi laboratuvar uygulamalarına kesinlikle uyulmalıdır. Megakaryosit canlılığı, 3.
Genel olarak, burada sağlanan protokol, klasik sıvı kültürü ile metilselüloz hidrojel kullanan bir 3D kültürü arasında karşılaştırma için bir in vitro modeli tanımlamaktadır. Not olarak, bu kültür protokolü fare birincil Lin- hücreleri için tanımlanmıştır ve henüz insan hücrelerine uyarlanmış değildir. Bu 3D model, mekanik ortamın megakaryosit davranışı ve olgunlaşması üzerindeki etkisini araştırmak için yararlı bir araçtır9. İlaçların megakaryosit davranışı / olgunlaşması ve proplatlet oluşumu üzerindeki etkisini incelemek için kültüre (jel üzerinde bile) bileşikler eklemek de mümkündür. Son olarak, hücrelerin kemik iliğinde karşılaşabileceği mekanik kısıtlamaları yeniden üreterek, bu kültür sistemi, daha önce Myh9 nakavt megakaryositleri9, 13,14için gösterdiği gibi klasik sıvı kültürlerinde gözlemlenemeyen anormal fenotiplerin araştırılmasına izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, laboratuvarda bu tekniği geliştiren Fabien Pertuy ve Alicia Aguilar'ın yanı sıra metilselüloz hidrojelinin viskoelastik özelliklerini karakterize eden Dominique Collin'e (Institut Charles Sadron - Strazburg) teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) ve bir ARN hibesi (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics) tarafından desteklendi. Julie Boscher, Fondation pour la Recherche Médicale'den (FRM hibe numarası FDT2020120104222) bir alıcıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K.
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R.
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
