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Bioengineering

Fabbricazione di un inchiostro biomateriale di agarosio incorporato in nanocellulosa cristallina per la coltura di mastociti derivati dal midollo osseo

Published: May 11, 2021 doi: 10.3791/62519
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Nanotechnology Research Center, National Research Council Canada, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

Summary

Questo protocollo evidenzia un metodo per valutare rapidamente la biocompatibilità di un inchiostro biomateriale idrogel composito di nanocellulosa cristallina (CNC)/agarosio con mastociti derivati dal midollo osseo di topo in termini di vitalità cellulare ed espressione fenotipica dei recettori della superficie cellulare, Kit (CD117) e recettore IgE ad alta affinità (FcεRI).

Abstract

La bioprinting tridimensionale (3D) utilizza compositi a base di idrogel (o inchiostri di biomateriali) che si depositano in un modello, formando un substrato su cui vengono depositate le cellule. Poiché molti inchiostri di biomateriali possono essere potenzialmente citotossici per le cellule primarie, è necessario determinare la biocompatibilità di questi compositi idrogel prima del loro utilizzo in costosi processi di ingegneria tissutale 3D. Alcuni metodi di coltura 3D, tra cui il bioprinting, richiedono che le cellule siano incorporate in una matrice 3D, rendendo difficile estrarre e analizzare le cellule per i cambiamenti nella vitalità e nell'espressione dei biomarcatori senza provocare danni meccanici. Questo protocollo descrive come prova di concetto, un metodo per valutare la biocompatibilità di un composito di agarosio incorporato nella nanocellulosa cristallina (CNC), fabbricato in un sistema di coltura a 24 pozzetti, con mastociti derivati dal midollo osseo di topo (BMMC) utilizzando saggi citometrici a flusso per la vitalità cellulare e l'espressione di biomarcatori.

Dopo 18 ore di esposizione alla matrice CNC/agarosio/D-mannitolo, la vitalità del BMMC è rimasta inalterata misurata dalla permeabilità allo ioduro di propidio (PI). Tuttavia, le BMMC coltivate sul substrato CNC/agarosio/D-mannitolo sembravano aumentare leggermente la loro espressione del recettore IgE ad alta affinità (FcεRI) e del recettore del fattore delle cellule staminali (Kit; CD117), anche se questo non sembra dipendere dalla quantità di CNC nel composito bioink. La fattibilità dei BMMC è stata anche valutata a seguito di un'esposizione a intervalli di idrogel fabbricati da un inchiostro di biomateriale commerciale composto da nanocellulosa fibrillare (FNC) e alginato di sodio utilizzando un bioprinter di estrusione 3D. Per un periodo di 6-48 ore, i substrati FNC/alginato non hanno influenzato negativamente la vitalità delle BMMC come determinato mediante citometria a flusso e saggi di microtitolazione (XTT e lattato deidrogenasi). Questo protocollo descrive un metodo efficiente per esaminare rapidamente la compatibilità biochimica degli inchiostri biomateriali candidati per la loro utilità come scaffold 3D per la semina post-stampa con i mastociti.

Introduction

Il recente interesse per i sistemi di coltura 3D e il bioprinting 3D ha focalizzato l'attenzione su idrogel e compositi idrogel. Questi compositi fungono da biomimetica viscosa ma porosa e possono essere composti fino al 99% di contenuto di acqua in peso, che è paragonabile ai tessuti biologici1,2,3. Queste caratteristiche dei compositi idrogel consentono quindi la crescita delle cellule senza influire sulla loro vitalità e funzione. Uno di questi compositi è la nanocellulosa cristallina (CNC), che è stata utilizzata come materiale di rinforzo nei compositi idrogel, negli scaffold cellulari nello sviluppo di impianti di biomateriali e nelle colture cellulari bidimensionali (2D) e 3D in vitro4,5. Per la maggior parte, le matrici composte da CNC non sono apertamente citotossiche per le cellule epiteliali corneali umane6, le cellule epiteliali intestinali7, le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano8 o le cellule neuronali9. Tuttavia, l'attività metabolica e la proliferazione delle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano diminuiscono in correlazione con l'aumento della viscosità dei compositi nanocellulosici a base di legno, suggerendo che la composizione della matrice deve essere attentamente testata per i suoi effetti deleteri sulle funzioni cellulari8.

Allo stesso modo, il CNC può indurre risposte infiammatorie nei macrofagi dopo l'internalizzazione, che potrebbero avere gravi conseguenze nei sistemi di coltura cellulare immunitaria 3D10,11. In effetti, ci sono pochissimi dati disponibili su come il CNC può influenzare altre risposte delle cellule immunitarie, in particolare le risposte infiammatorie allergiche che vengono avviate dai mastociti. I mastociti sono leucociti granulati che esprimono il recettore delle IgE ad alta affinità, FceRI, responsabile dell'attivazione delle risposte infiammatorie agli allergeni. La loro proliferazione e differenziazione dipendono dal fattore delle cellule staminali (SCF), che lega il recettore della tirosina, Kit. I mastociti sono derivati da cellule progenitrici del midollo osseo che entrano in circolazione e successivamente migrano perifericamente per disperdersi ubiquitariamente in tutti i tessuti umani12. Poiché i mastociti funzionano in un ambiente tissutale 3D, sono un candidato immunocellulare ideale per lo studio dei processi immunologici in modelli tissutali 3D in vitro. Tuttavia, ad oggi, non esiste un modello di tessuto 3D in vitro praticabile contenente mastociti.

A causa della natura altamente sensibile dei mastociti e della loro propensione a suscitare risposte pro-infiammatorie a stimoli esterni, è necessaria un'attenta considerazione dei costituenti della matrice 3D e del metodo di bioprinting per introdurre i mastociti nello scaffold 3D, come discusso ulteriormente. I costrutti tissutali possono essere biofabbricati da due grandi categorie di biomateriali, vale a dire, bioink e inchiostri biomateriali. La distinzione sta nel fatto che i bioink sono compositi di idrogel carichi di cellule, mentre gli inchiostri di biomateriali sono compositi di idrogel privi di cellule, come definito da Groll et al.13,14. Quindi, i costrutti 3D stampati con bioink contengono cellule pre-incorporate all'interno della matrice idrogel, mentre i costrutti 3D stampati con inchiostri biomateriali devono essere seminati con cellule post-stampa. La biofabbricazione di scaffold di coltura da bioink / inchiostri biomateriali a base di idrogel viene eseguita più comunemente utilizzando bioprinter 3D di estrusione, che estrudono l'inchiostro bioink / biomateriale attraverso un ugello su microscala sotto pressione tramite un pistone pneumatico o meccanico14. Le biostampanti di estrusione fabbricano scaffold 3D depositando il bioink in modelli di sezione trasversale 2D che sono impilati sequenzialmente l'uno sull'altro in un approccio "bottom-up".

Per essere compatibile con la bioprinting per estrusione, l'inchiostro bioink/biomateriale a base di idrogel deve possedere proprietà tissotropiche (diradamento del taglio), per cui i polimeri idrogel costituenti dell'inchiostro bioink/biomateriale fluiscono come un fluido attraverso un ugello a microcanale quando sottoposti a sforzo di taglio, ma ritornano a uno stato viscoso e gelatinoso dopo la rimozione dello stress di taglio15 . A causa del loro elevato contenuto di acqua, i polimeri di bioink a base di idrogel / inchiostri biomateriali devono essere reticolati, fisicamente o covalentemente, per mantenere l'architettura e l'integrità strutturale della struttura biostampata 3D. Nel caso di bioink carichi di cellule, le cellule sono direttamente sottoposte a sollecitazioni chimiche durante il processo di reticolazione. Il processo di estrusione delle cellule incapsulate all'interno della matrice di idrogel bioink sottopone anche le cellule a stress di taglio, che può portare a una ridotta vitalità e / o morte cellulare. Una volta che il modello tissutale 3D è stato biostampato, è difficile discriminare tra i livelli di citotossicità suscitati dalla matrice idrogel stessa e i processi di estrusione e reticolazione, rispettivamente. Ciò è particolarmente impegnativo nel contesto di scaffold 3D in cui le cellule sono pre-incorporate all'interno della matrice di idrogel, rendendo così difficile rimuovere le cellule per le analisi successive, il che sarebbe dannoso per la vitalità dei mastociti.

Un approccio più delicato alla generazione di costrutti tissutali 3D contenenti mastociti comporta la semina delle cellule in scaffold 3D a inchiostro biomateriale poroso prestampato da una sospensione di coltura cellulare, che sfrutta la capacità innata dei mastociti di migrare dalla circolazione ai tessuti periferici. I vantaggi di questo approccio di semina cellulare sono duplici: (i) i mastociti non sono sottoposti a sollecitazioni di taglio e chimiche dai processi di estrusione e reticolazione, rispettivamente, e (ii) le cellule possono essere facilmente rimosse dall'impalcatura 3D dopo l'esposizione mediante lavaggio delicato per l'analisi senza influire negativamente sulla loro vitalità. L'ulteriore vantaggio di seminare e analizzare la vitalità cellulare dei mastociti su scaffold di idrogel porosi biostampati in 3D rispetto ai dischi di idrogel 2D è che gli scaffold di idrogel biostampati in 3D ricapitolano le caratteristiche topografiche su microscala dei tessuti in vivo , che non sono presenti nei dischi idrogel planari 2D alla rinfusa. Questo approccio è un approccio adatto, rapido ed economico per determinare gli effetti citotossici potenzialmente catastrofici delle matrici di idrogel bioink candidate sui mastociti, così come su altre cellule immunologiche, prima di investire in costosi esperimenti di ingegneria tissutale 3D.

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Protocol

NOTA: Questo protocollo è composto da cinque sezioni: (1) isolamento del midollo osseo di topo e differenziazione dei mastociti derivati dal midollo osseo del topo (BMMC), (2) fabbricazione di substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo in un sistema a 24 pozzetti e coltura di BMMC sui substrati, (3) rimozione di BMMC dai substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo e analisi della vitalità e dell'espressione del biomarcatore mediante citometria a flusso, (4) Bioprinting 3D di scaffold di idrogel da un inchiostro di biomateriale composito di nanocellulosa fibrillare (FNC)/alginato di sodio disponibile in commercio e (5) coltura di BMMC su scaffold di idrogel FNC/alginato di sodio e analisi della vitalità mediante test di microtitolazione a flusso, XTT e lattato deidrogenasi (LDH).

1. Generazione della cultura BMMC

NOTA: I topi sono stati eutanasizzati per asfissia di CO2 in seguito all'anestesia con isoflurano. La tibia e il femore sono stati isolati e l'intero midollo osseo è stato raccolto. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida e le politiche del Canadian Council on Animal Care con l'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali di Health Science per l'Università di Alberta.

  1. Preparare il terreno di coltura RPMI-1640 completo aggiungendo gli integratori elencati nella Tabella 1 alle concentrazioni finali indicate. Regolare il pH del mezzo a 7,4-7,6 utilizzando NaOH, sterilizzare con filtro utilizzando un filtro monouso con tappo di bottiglia (dimensione dei pori di 0,2 μm) e conservare a 4 °C al buio per un massimo di 2 mesi.
  2. Ottenere femori dai topi in conformità con i protocolli e le procedure del Comitato per la cura degli animali dell'Università locale.
    NOTA: In questo studio, i femori sono stati isolati da topi C57BL/6, ma qualsiasi ceppo può essere utilizzato se è rilevante per lo studio.
  3. Usando le forbici, rimuovere la pelle e il muscolo dall'articolazione dell'anca, quindi tirare delicatamente il femore ruotando leggermente fuori dalla presa dell'anca (Figura 1). Fai attenzione a non rompere la testa del femore. Tagliare la tibia dal femore alla fabella mediale usando le forbici. Rimuovere la zampa tagliando appena sopra il calcagno e scartare.
  4. Usando un bisturi, rimuovere la pelle e la cartilagine dai pezzi di femore e tibia. Usando le forbici, fai un taglio netto su ciascuna estremità del femore e della tibia, esponendo il midollo osseo rosso all'interno. Se necessario, rimuovere il perone a questo punto, ma si noti che può aiutare nella manipolazione della tibia durante il rossore del midollo osseo.
  5. Preparare un ago da 26 G con una siringa luer-lock da 5 ml e riempire con circa 5 mL di supporto completo preparato come descritto sopra.
    NOTA: A questo punto, RPMI incompleto senza gli additivi può essere utilizzato anche per risparmiare sui reagenti.
  6. Tenendo il femore o la tibia con una pinza, inserire l'ago in un'estremità dell'osso e premere delicatamente la siringa. Tenere l'osso su un tubo conico sterile da 50 ml e iniettare delicatamente circa 5 ml di mezzo nell'osso, applicando una certa pressione. Osserva i pezzi di midollo osseo cadere dall'altra estremità dell'osso come sottili nastri rossi e nel tubo conico.
  7. Abbassare gli aspirati e risospenderli in un mezzo completo o trasferirli direttamente in un pallone sterile di coltura tissutale T175 cm2 contenente 50 ml di terreno completo RPMI-1640. Mantenere gli aspirati in mezzo completo RPMI-1640 con interleuchina ricombinante (IL)-3 del topo da 30 ng/mL.
  8. Dopo 1 giorno, osservare le colture al microscopio ottico. La coltura sarà composta da una popolazione eterogenea di cellule di varie forme e dimensioni e pezzi ancora più grandi di midollo osseo. Alimentare le colture cellulari aggiungendo 15 mL di terreno fresco ogni 3-5 giorni utilizzando il mezzo RPMI-1640 completo come descritto sopra e garantire che la densità cellulare non superi mai 1 × 106 celle / mL. Una volta alla settimana, far girare le celle a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente, risospendere in un mezzo RPMI-1640 fresco completo e dividere 1:4 in 50 ml di terreno in palloni freschi T175.
  9. Dopo 4 settimane, determinare la purezza cellulare misurando l'espressione superficiale dei recettori CD117 (Kit) e FceRI mediante citometria a flusso come descritto di seguito (paragrafo 3.2).
    NOTA: Dopo 4 settimane, il 99% delle cellule deve essere doppiamente positivo per CD117 (Kit) e FcεRI.
  10. A 4 settimane in poi, mantenere i BMMC con 20 ng / mL di IL-3 in mezzo COMPLETO RPMI-1640. A circa 6 settimane, le cellule smetteranno di dividersi e non avranno più bisogno di scissione. Nutrire le colture ogni 3-5 giorni, pellettizzare le celle mediante centrifugazione una volta alla settimana e risospese in un mezzo RPMI-1640 fresco e completo.

2. Fabbricazione dei substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo e coltura BMMC

  1. In un flacone di vetro, aggiungere 0,2 g di agarosio in polvere alla soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (2% p/v) a un volume finale di 10 ml e far bollire per 1 minuto a 100 °C per sciogliere.
  2. Sciogliere 2,5 g di polvere CNC in PBS ad un volume finale di 10 ml per preparare una miscela al 25% p/v.
  3. Sciogliere 2 g di polvere CNC in PBS a un volume finale di 10 ml per preparare una miscela di 20% p / v e diluire in serie la miscela 20% p / v per preparare miscele CNC 10, 5 e 2% w / v.
  4. Riscaldare le miscele CNC a 25, 20, 10, 5 e 2% p/v a 37 °C per 10 minuti (Figura 2A).
  5. Aggiungere 0,46 g di D-mannitolo alla soluzione calda di agarosio (4,6% p/v) e sciogliere.
  6. Mescolare le miscele CNC-PBS preriscaldate a 25, 20, 10, 5 e 2% p/v con la soluzione calda di agarosio/D-mannitolo in tubi conici separati con un rapporto 1:1 per ottenere concentrazioni CNC finali di 12,5, 10, 5, 2,5 e 1% p/v nelle miscele di idrogel.
  7. Lavorando rapidamente, aggiungere 500 μL/pozzetto delle soluzioni di cui sopra preparate nel passaggio 2.6 in quadruplicata a una piastra di coltura a 24 pozzetti e lasciare riposare per 30 minuti a temperatura ambiente per facilitare la polimerizzazione (Figura 2B).
  8. Sovrapporre con attenzione 1000 μL della sospensione BMMC ad una densità di 1,1 × 106 celle/ml sopra i substrati di idrogel con un micropipettor ed evitare di toccare il gel con la punta della pipetta in quanto ciò danneggerebbe la superficie del gel e genererebbe particelle.
  9. Incubare i BMMC sui substrati idrogel in un incubatore sterile (5% CO2, atmosfera umidificata) a 37 °C per 18 ore.

3. Analisi citometriche a flusso

  1. Analisi citometrica a flusso della vitalità bmMC tramite esclusione PI
    1. Rimuovere con attenzione il terreno di coltura contenente BMMC dalla parte superiore del CNC / agarosio / D-mannitolo, evitando il gel, e trasferire le cellule in un tubo di microfuga da 1,5 ml.
    2. Lavare i BMMC due volte con PBS (pH 7,4) contenente 0,5% p/v di albumina sierica bovina a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e risospendere in 180 μL di PBS-0,5% p/v BSA ad una densità finale di 1,5 × 106 cellule/ml. Trasferire le celle su una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti.
      NOTA: sterilizzare due volte tutte le soluzioni BSA PBS-0,5% p/v utilizzando un filtro a siringa da 0,2 μm e conservare a 4 °C.
    3. Aggiungere 20 μL di PBS-0,5% p/v BSA, o 10x PI (100 μg/mL) preparati in PBS-0,5% p/v BSA, alle cellule ad una concentrazione finale di 10 μg/mL, e incubare per 1 ora a 4 °C o 15 min a temperatura ambiente al buio. Acquisire dati di fluorescenza utilizzando un citometro a flusso dotato di laser agli ioni Argon (488-514 nm) e filtro passa-banda per consentire il rilevamento dell'emissione di fluorescenza a 578 nm. Acquisire 20.000 eventi per campione ad una portata di 30 μL/min a temperatura ambiente. Analizzare i dati come descritto di seguito (sezioni 3.2.7-3.2.10).
  2. Analisi citometrica a flusso di BMMC per l'espressione del recettore di superficie Kit (CD117) e FcεRI
    1. Rimuovere con attenzione il terreno di coltura contenente BMMC dalla parte superiore del CNC / agarosio / D-mannitolo, evitando il gel, e trasferire le cellule in un tubo di microfuga da 1,5 ml.
    2. Lavare i BMMC due volte con PBS filtrato-0,5% BSA a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e risospese in 180 μL di PBS contenente 0,5% p/v BSA (1,5 × 106 celle/ml). Trasferire le celle risospese su una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti.
    3. Aggiungere 20 μL di 10x soluzioni di lavoro anticorpali alle cellule per ottenere una concentrazione finale di 0,06 μg/mL di CD117 (c-Kit)-ficoeritrina (PE) e 0,06 μg/mL di FcεRIα-allophycocyanin (APC), rispettivamente.
      NOTA: Le soluzioni di lavoro anticorpali 10x devono essere preparate in PBS-0,5% p/v BSA sterilizzato con filtro.
    4. Aggiungere 20 μL di soluzioni di lavoro di controllo isotipo 10x contenenti ratto IgG2b κ isotype control-PE o Armenian hamster IgG isotype control-APC per separare i pozzetti contenenti cellule che non sono state colorate con nessuno dei coniugati anticorpo-fluoroforo nel passaggio 3.2.3.
      NOTA: I controlli isotipici, il controllo dell'isotipo IgG2b κ del ratto-PE e il criceto armeno IgG isotipo control-APC servono a controllare l'attaccamento non specifico degli anticorpi al BMMC. Poiché i BMMC non esprimono alti livelli di FcR, raramente viene rilevata un'elevata fluorescenza di fondo con anticorpi di controllo dell'isotipo. Preparare le soluzioni di lavoro di controllo isotipo 10x in PBS-0,5% con filtro-v BSA.
    5. Incubare la piastra a fondo tondo a 96 pozzetti per 1 ora a 4 °C al buio.
    6. Lavare le celle aggiungendo 200 μL di tampone BSA fresco allo 0,5% p/v in ciascun pozzetto e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio. Rimuovere con attenzione il surnatante senza toccare il pellet cellulare; lasciare dietro di sé un surnatante per garantire che il pellet cellulare rimanga indisturbato.
    7. Dopo il lavaggio, risospese le cellule in 100 μL di BSA allo 0,5% p/v, 0,05% p/v di azide di sodio in PBS (pH 7,4) che è stato filtrato sterile due volte con un filtro a siringa da 0,2 μm. Acquisire i dati di fluorescenza nei canali del rivelatore PE e APC utilizzando un citometro a flusso, come descritto sopra nel passaggio 3.1.3.
    8. Analizza i dati utilizzando un software in grado di visualizzare e analizzare i file di dati citometrici a flusso con estensione ".fcs".
    9. Iniziare l'analisi tracciando lo scatter in avanti (FSC) lungo l'asse x e lo scatter laterale (SSC) lungo l'asse y e il gate per la popolazione cellulare conservata con un intervallo FSC di log10 1.5-5.0 e un intervallo SSC di log10 0.75-3.25 nelle celle non trattate e non macchiate come mostrato nella Figura 3A(i),(ii).
      NOTA: questo serve a garantire che i detriti cellulari con bassi valori FSC e SSC vengano eliminati dall'analisi. I mastociti sono normalmente cellule molto granulari (SSC elevate) e grandi (FSC elevato) rispetto ad altri tipi di cellule immunologiche, come monociti e linfociti.
    10. Successivamente, generare dot plot FSC vs SSC e profili istogrammi di campioni non trattati che sono stati colorati con i controlli del colorante, degli anticorpi o dell'isotipo e ottenere l'intensità media di fluorescenza (MFI) nei canali PE o APC in base allo spettro di emissione dello specifico coniugato anticorpo-fluoroforo o colorante utilizzato. Applicare lo stesso insieme di cancelli e parametri a tutti i campioni BMMC incubati con diversi substrati CNC/agarosio/D-mannitolo e colorati con i corrispondenti controlli isotipici, anticorpi o coloranti; ottenere LE IFM.
      NOTA: Essenzialmente, i dot plot FSC vs SSC dei campioni colorati non trattati dovrebbero essere indistinguibili dai campioni non trattati/non macchiati, ottenuti nella fase 3.2.9, per garantire che la procedura di colorazione non alteri la dimensione della cella (misurata da FSC) o la granularità (misurata da SSC) (Figura 3A(i),(ii)).
    11. Calcola le IFM medie e l'errore standard di media (SEM) per ciascun campione da 4 esperimenti indipendenti seguiti dalla generazione di grafici utilizzando un pacchetto software di analisi statistica.
    12. Preparare le sovrapposizioni di istogrammi nel software di analisi dei dati citometrici a flusso (Figura 3B, 4A(ii),B(ii)).

4.3D Bioprinting di substrati di idrogel di alginato di FNC/sodio

NOTA: La biostampante 3D utilizzata in questo studio è un sistema di estrusione pneumatica dotato di due testine di stampa indipendenti a temperatura controllata. L'inchiostro del biomateriale utilizzato per la biostampa 3D degli scaffold idrogel è formulato con (a) nanocellulosa fibrillare altamente idrata (FNC), che è morfologicamente simile al collagene, (b) alginato di sodio e (c) D-mannitolo. Viene fornito come sospensione sterile di idrogel in cartucce da 3 ml a cui possono essere collegati ugelli sterili per bioprinting conico luer-lock (22, 25 o 27 G).

  1. Utilizzare questo protocollo con le testine di stampa e il piano di stampa a temperatura ambiente, dove la temperatura ambiente è di 20-25 °C.
  2. Conservare le cartucce d'inchiostro del biomateriale a 4 °C per mantenere la stabilità del composito idrogel. Prima di iniziare la bioprinting 3D, rimuovere una cartuccia (3 ml) dal frigorifero e lasciarla equilibrare a temperatura ambiente.
  3. Installazione di una cartuccia Bioink sulla BIOPRINTER 3D INKREDIBLE+
    1. Rimuovere i tappi terminali blu dalla cartuccia d'inchiostro biomateriale da 3 ml (Figura 5B(i)) e apporre un ugello di bioprinting conico sterile da 22 G (blu) all'estremità luer-lock della cartuccia Bioink.
      NOTA: è essenziale apporre l'ugello di bioprinting conico desiderato sulla cartuccia bioink prima di installare la cartuccia ed eseguire le successive fasi di calibrazione, poiché in caso contrario si verificherà una calibrazione impropria dell'asse z della bioprinter 3D.
    2. Collegare il tubo di alimentazione della pressione dell'aria per la testina di stampa 1 (PH1, a sinistra) all'estremità opposta della cartuccia e inserire la cartuccia con l'ugello di bioprinting conico collegato nello slot verticale di PH1 (Figura 5A(ii)).
    3. Posizionare saldamente la cartuccia in PH1 con l'ugello conico per bioprinting che si estende sotto la testina di stampa. Stringere la vite su PH1 in senso orario fino a quando non si stringe il dito per bloccare la cartuccia Bioink in posizione. Si noti che la bioprinting 3D può essere eseguita con PH2 lasciato vuoto.
  4. Calibrazione degli assi x-y-z della biostampante 3D
    1. Accendi la bioprinter 3D e avvia il software bioprinter su un PC collegato alla bioprinter 3D tramite un cavo USB 2.0.
    2. Nel software, fare clic sul pulsante CONNECT per sincronizzare il software con la bioprinter 3D.
      NOTA: la sincronizzazione ha esito positivo quando le luci a diodi a emissione di luce ultravioletta della testina di stampa si accendono e si spengono e la ventola del filtro HEPA si spegne e si riaccende. Il software deve essere sincronizzato con la biostampante 3D prima di homing gli assi della bioprinter e la calibrazione del punto di partenza, come indicato nei passaggi successivi.
    3. Osservare quattro opzioni nel menu di controllo principale della biostampante 3D: (i) PREPARE BIOPRINT, (ii) BIOPRINT, (iii) UTILITIES MENU e (iv) STATUS SCREEN. Selezionare l'opzione PREPARA BIOPRINT , quindi scorrere verso il basso fino a selezionare l'opzione HOME AXES .
      NOTA: la biostampante 3D sposterà quindi l'assieme della testina di stampa all'indietro e verso sinistra per calibrare rispettivamente gli assi y e x. Successivamente, con le testine di stampa in pausa nella posizione all'estrema sinistra, la bioprinter solleverà il piano di stampa fino a quando l'interruttore di calibrazione dell'asse z (situato sul piano di stampa) entrerà in contatto con l'ugello di bioprinting conico installato sulla testina di stampa 1
    4. Dopo aver calibrato correttamente gli assi x-y-z , osservare il leggero abbassamento del piano di stampa e il trasferimento delle testine di stampa sopra il punto centrale del piano di stampa (Figura 5A(i)).
  5. Punto di partenza calibrazione della bioprinter per bioprinting in lastre a 24 pozzetti
    1. Rimuovere una piastra di coltura sterile a 24 pozzetti dal suo involucro di plastica sigillato e contrassegnare un punto di nel punto centrale del pozzo D1 sul lato inferiore della piastra con un pennarello permanente. Rimuovere il coperchio della lastra e posizionare la lastra di coltura a 24 pozzetti sul piano di stampa con il pozzetto D1 situato nell'angolo anteriore sinistro del piano di stampa.
    2. Nel menu di controllo principale, selezionare MENU UTILITÀ , quindi SPOSTARE ASSE. Spostare le testine di stampa con incrementi di 1 mm lungo gli assi x e y fino a quando l'ugello di bioprinting conico di PH1 è direttamente sopra il punto contrassegnato sotto il pozzo D1. Se necessario, regolare la posizione dell'ugello di bioprinting conico sul punto spostando le testine di stampa con incrementi di 0,1 mm.
    3. Registrare le coordinate x e y dell'ugello di bioprinting conico quando si trova direttamente sopra il centro del pozzo D1, come indicato sullo schermo del pannello di controllo della bioprinter 3D.
      NOTA: Nel caso della bioprinter 3D INKREDIBLE+ utilizzata qui, le coordinate x e y sono le seguenti: x : -46,5 e y : -27,5. Queste coordinate fungono da punto di partenza al centro del pozzo D1 per la bioprinting in una piastra a 24 pozzetti.
    4. Quindi, sollevare il piano di stampa con incrementi di 1 mm fino a quando il fondo del pozzo D1 sta quasi toccando l'ugello di bioprinting conico installato nella testina di stampa 1. Se necessario, regolare il movimento del piano di stampa con incrementi di 0,1 mm (Figura 5A(ii)). Quindi, dal MENU UTILITÀ, selezionare l'opzione CALIBRAZIONE ASSE Z e selezionare e confermare ulteriormente l'opzione CALIBRAZIONE STORE Z .
    5. Tornate al menu principale e selezionate l'opzione PREPARA BIOPRINT . Scorrere verso il basso e selezionare l'opzione CALIBRATE Z .
      NOTA: la biostampante 3D ora abbasserà il piano di stampa dopo aver eseguito correttamente la calibrazione dell'asse z (Figura 5A (iii)).
  6. Aggiornamento del file G-code della piastra a 24 pozzetti con le coordinate corrette del punto di partenza
    1. Aprire il file del codice geometrico della piastra a 24 pozzetti fornito (codice G) nel software bioprinter (file supplementare 1).
      NOTA: questo file G-code a 24 pozzetti codifica la stampa di costrutti rettilinei a 2 strati 5 x 5 x 1 mm in ciascun pozzetto (Figura 5C(i),(iii)). I file G-code forniti possono essere utilizzati con qualsiasi software di bioprinting 3D.
    2. Si noti che la riga 1 del file G-code legge G0 X-50.0 Y-33.5 ; Posizione centrale del pozzo D1. Aggiornare le coordinate x e y sulla riga 1 con i valori ottenuti nel passaggio 4.5.3, cioè la riga 1 dovrebbe ora leggere G0 X-46.5 Y-27.5 ; Posizione centrale del pozzo D1. Salvare il file con un nuovo nome.
      NOTA: questa procedura serve a calibrare il file G-code in modo che la stampa inizi al centro del pozzo D1 in base alle coordinate x,y dello specifico bioprinter 3D utilizzato. Questo approccio può essere utilizzato per calibrare il file G-code della lastra a 24 pozzetti per la stampa con qualsiasi bioprinter 3D di estrusione. Ai fini di questo studio, è stata stampata solo la metà sinistra della piastra a 24 pozzetti, cioè i pozzetti A1-3, B1-3, C1-3 e D1-3. Viene inoltre fornito un file di codice G separato che codifica la stampa di costrutti rettilinei a 2 strati 5 x 5 x 1 mm in una griglia 3 x 4 (File supplementare 2, Figura 5C(ii)).
  7. Regolazione della pressione di estrusione per testina di stampa 1 (PH1)
    1. Assicurarsi che la pompa pneumatica sia strettamente collegata alla porta di aspirazione dell'aria posteriore della biostampante 3D INKREDIBLE+ e accendere la pompa pneumatica.
    2. Estrarre la manopola di controllo in avanti situata sul lato destro della bioprinter 3D INKREDIBLE+.
      NOTA: la manopola di controllo anteriore regola la pressione per PH1, mentre la manopola di controllo posteriore regola la pressione per PH2.
    3. Osservare i manometri digitali per PH1 e PH2 situati sulla parte anteriore della bioprinter leggere ciascuno vicino a 0 kPa. Ruotare lentamente la manopola di controllo in avanti in senso orario fino a quando la pressione indicata sul manometro sinistro per PH1 raggiunge i 12 kPa (Figura 5A(iii)).
    4. Posizionare una carta velina piegata o un pezzo di pellicola impermeabile e sigillante sotto l'ugello di stampa della cartuccia installata, facendo attenzione a non toccare l'ugello di stampa.
    5. Dal menu di controllo principale sulla biostampante 3D, selezionare PREPARA BIOPRINT.
    6. Passare a e selezionare ATTIVA PH1. Si noti che l'inchiostro del biomateriale inizia ad estrudersi dall'ugello di stampa. Se necessario, aumentare la pressione di estrusione ruotando la manopola di controllo in senso orario fino a quando l'inchiostro del biomateriale non viene estruso in un filamento continuo e registrare la nuova impostazione della pressione. Lavorare rapidamente per evitare lo spreco di inchiostro biomateriale.
    7. Selezionare SPEGNI PH1 per interrompere l'estrusione dell'inchiostro del biomateriale, rimuovere la carta velina o il film contenente l'inchiostro del biomateriale estruso dal piano di stampa e chiudere lo sportello della biostampante.
      NOTA: la biostampatrice 3D accenderà automaticamente l'alimentazione della pressione dell'aria a PH1 durante la stampa come indicato dal file G-code.
  8. Bioprinting 3D di substrati di idrogel rettilineo in formato lastra a 24 pozzetti
    1. Dal menu di controllo principale sulla biostampante 3D, selezionare MENU UTILITÀ. Passare a e selezionare DISABLE SD PRINT, che consentirà al software bioprinter di trasmettere file G-code alla bioprinter 3D per la stampa.
    2. Fare clic sul pulsante LOAD nel software bioprinter e selezionare il file G-code della piastra a 24 pozzetti aggiornato salvato nel passaggio 4.6.2.
    3. Nel pannello di controllo a destra del software, selezionare la scheda ANTEPRIMA STAMPA e fare clic sul pulsante STAMPA per iniziare la biostampa nel pozzo D1.
      NOTA: se si utilizza il file G-code della piastra del pozzo a griglia 3 x 4, la bioprinting terminerà nel pozzo A3 della piastra a 24 pozzetti (Figura 5C (ii), D), anziché nel pozzo A6 se viene stampata una lastra completa a 24 pozzetti.
    4. Al termine della bioprinting dei costrutti rettilinei, coprire la piastra a 24 pozzetti con il coperchio e spostarla in un armadio di biosicurezza di classe II.
    5. Immergere ogni costrutto rettilineo in due gocce di soluzione sterile di CaCl2 da 50 mM (Figura 5B(ii)) e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
      NOTA: Questo serve a reticolare ionicamente le catene polimeriche alginate con gli ioni Ca2+ e consentire ai costrutti rettilinei di mantenere la loro integrità strutturale.
    6. Aspirare accuratamente la soluzione di CaCl2 da ciascun costrutto e risciacquare una volta in 1 mL di 1x PBS (pH 7,4) per rimuovere l'eccesso di CaCl2 (Figura 5D).
    7. Per prevenire la disidratazione dei costrutti idrogel bioprinted, mantenere i costrutti rettilinei bioprinted 3D in PBS 1x fresco fino a quando i BMMC non sono pronti per essere seminati sui costrutti (Figura 5D).

5. Incubazione di BMMC su scaffold rettilinei bioprinted 3D e test di fattibilità

  1. Incubazione di BMMC su scaffold in idrogel rettilineo biostampato in 3D
    1. Aliquote di semi di BMMC sugli scaffold rettilinei biostampati in 3D in triplice copia per quattro diverse durate, ad esempio 6, 18, 24 e 48 ore, in modo che tutti i trattamenti terminano contemporaneamente. Utilizzare BMMC seminati in pozzetti vuoti in triplice copia per la stessa durata dei controlli non trattati.
    2. Trasferire asetticamente le BMMC da un matraccio di coltura T175 cm2 a un tubo conico sterile da 50 ml e pellettizzare le BMMC a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    3. Sostituire il pellet in 50 mL di mezzo RPMI fresco completo contenente 20 ng/mL di IL-3 e calcolare la densità delle cellule vive contando un'aliquota di BMMC colorati di tripano blu utilizzando un emacitometro.
    4. Sulla base della densità cellulare calcolata nella fase 5.1.3, preparare un'aliquota di 6 mL della sospensione BMMC ad una densità finale di 1 × 106 celle/mL.
    5. Per la configurazione di incubazione di 48 ore, aspirare PBS dai pozzetti A1-3 contenenti gli scaffold in idrogel rettilineo biostampato in 3D e pipettare 1 mL di sospensione BMMC (1 × 106 celle / mL) in ciascun pozzetto. Inoltre, pipettare 1 mL di BMMC (1 × 106 celle / mL) sospensione in pozzetti A4-6 senza costrutti bioprinted per servire come controllo non trattato. Incubare i restanti pozzetti contenenti scaffold bioprinted (B1-3, C1-3, D1-3) in RPMI senza additivi per prevenire la disidratazione fino al momento opportuno per la semina con BMMC per le durate di trattamento di 24, 18 e 6 ore. Riempire i pozzetti senza scaffold bioprinted (B4-6, C4-6, D4-6) con 1 mL di PBS fino al raggiungimento del tempo appropriato per la semina con i BMMC per i time point di 24, 18 e 6 h.
    6. Incubare la piastra a 24 pozzetti a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 .
    7. Per la configurazione di incubazione di 24 ore, aspirare il terreno di coltura preesistente / tampone dai pozzetti B1-6 e seminare 1 mL di sospensione BMMC (1 × 106 cellule / mL) in questi pozzetti. Restituire la piastra all'incubatrice.
    8. Per la configurazione di incubazione di 18 ore, aspirare il terreno di coltura preesistente / tampone dai pozzetti C1-6 e seminare 1 mL di sospensione BMMC (1 × 106 cellule / mL) in questi pozzetti. Restituire la piastra all'incubatrice.
    9. Per la configurazione di incubazione di 6 ore, aspirare il terreno di coltura preesistente / tampone dai pozzetti D1-6 e seminare 1 mL di bmMC (1 × 106 cellule / mL) in questi pozzetti. Restituire la piastra all'incubatrice.
    10. Per la terminazione dell'incubazione, erogare campioni da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti per (i) colorazione PI e analisi mediante citometria a flusso, (ii) saggio di vitalità cellulare XTT e (iii) saggio di rilascio di LDH. Pertanto, assicurarsi che una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti e i necessari tubi di microfuga da 1,5 ml siano etichettati con largo anticipo rispetto al punto finale dell'incubazione.
  2. Campionamento cellulare per il saggio metabolico XTT
    1. Sospendere completamente i BMMC nel terreno di coltura all'interno di ciascun pozzo, facendo attenzione a non danneggiare e frammentare gli scaffold in idrogel biostampati in 3D.
    2. Trasferire asetticamente 40 μL della sospensione omogenea BMMC da ciascun pozzo a tubi di microfugazione sterili da 1,5 mL contenenti 760 μL di mezzo RPMI fresco completo (volume finale = 800 μL) e vortice brevemente per miscelare.
    3. Erogare 100 μL delle sospensioni BMMC diluite in triplice copia in una piastra microtitolata a fondo piatto a 96 pozzetti adatta per registrare le misurazioni dell'assorbanza (vedere la Tabella dei materiali) su uno spettrofotometro a micropiastre.
    4. Erogare 50 μL di soluzione di lavoro XTT a ciascun pozzo contenente la sospensione cellulare BMMC utilizzando una micropipetta multicanale.
      NOTA: Preparare la soluzione di lavoro XTT mescolando 5 mL di reagente XTT con 100 μL di reagente di accoppiamento elettronico. Scongelare questi componenti da -20 °C in un bagno d'acqua a 37 °C immediatamente prima dell'uso.
    5. Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 per 24 ore.
    6. Alla fine dell'incubazione, rimuovere la piastra a 96 pozzetti dall'incubatore e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Registrare i valori di assorbanza su uno spettrofotometro a micropiastre a 450 nm con sottrazione di fondo a 650 nm.
  3. Campionamento di surnanti per il test della lattato deidrogenasi (LDH)
    1. Trasferire le restanti sospensioni BMMC (960 μL) da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti ai tubi del microfugo e pellettizzare le celle a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. Pipettare tre aliquote da 100 μL del surnatante di coltura cellulare da ciascun tubo di microfuga in una piastra a fondo piatto a microtitolazione da 96 pozzetti. Eliminare i supernatanti rimanenti da ciascun tubo di microfuga e trattenere i pellet BMMC per un'ulteriore colorazione con PI nei paragrafi 5.4.1-5.4.8.
    3. Pipettare 50 μL della soluzione di lavoro LDH in ogni aliquota di 100 μL di surnatante.
      NOTA: fare riferimento al file supplementare 3 per la preparazione dei reagenti per il dosaggio LDH.
    4. Incubare per 1 ora al buio a temperatura ambiente.
    5. Pipettare 50 μL di acido acetico 1 M a ciascun pozzetto per fermare la reazione.
    6. Registrare i valori di assorbanza su uno spettrofotometro a micropiastre a 490 nm con sottrazione di fondo a 680 nm.
  4. Analisi citometrica a flusso della vitalità del BMMC tramite esclusione dello ioduro di propidio (PI)
    1. Sostituire i pellet BMMC in un buffer di lavaggio a flusso (PBS [pH 7,4] contenente 0,5% p/v BSA) e pellettizzare le celle a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio con il tampone di lavaggio a flusso.
    3. Risospesare ogni pellet BMMC in 400 μL di tampone di lavaggio a flusso.
      NOTA: Ci saranno 24 campioni BMMC risospesi in totale: 12 campioni BMMC incubati su substrati idrogel bioprinted (4 punti temporali in triplice) e 12 campioni BMMC incubati in pozzi senza costrutti bioprinted (4 punti temporali in triplice).
    4. In una piastra di microtitolazione a fondo tondo a 96 pozzetti, pipetta 20 μL di tampone di lavaggio a flusso nei pozzetti A1-12 e B1-12. Nella stessa piastra di microtitolazione, pipettare 20 μL di soluzione di colorazione 10x PI (100 μg/mL PI nel tampone di lavaggio a flusso) nei pozzetti C1-12 e D1-12.
    5. Erogare 180 μL dei 12 campioni BMMC incubati su substrati di idrogel biostampati nei pozzetti A1-12 (un campione per pozzetto). Erogare 180 μL dei 12 campioni BMMC incubati senza substrati di idrogel biostampati nei pozzetti B1-12 (un campione per pozzetto). Utilizzare i campioni BMMC erogati nei pozzetti A1-12 e B1-12 come controlli non macchiati per ogni condizione di trattamento (24 controlli in totale).
    6. Erogare 180 μL dei 12 campioni BMMC incubati su costrutti bioprinted nei pozzetti C1-12 (un campione per pozzetto). Erogare 180 μL dei 12 campioni BMMC incubati senza costrutti bioprinted nei pozzetti D1-12 (un campione per pozzetto).
      NOTA: I campioni BMMC nei pozzetti C1-12 e D1-12 saranno colorati ad una concentrazione finale effettiva di PI di 10 μg/mL (24 campioni colorati in totale).
    7. Incubare la piastra per 1 ora a 4 °C o 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
    8. Alla fine del periodo di incubazione, analizzare i campioni direttamente dalla piastra del microtitolato su un citometro a flusso come precedentemente descritto nella sezione 3.1.

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Representative Results

Una delle caratteristiche più cruciali di un inchiostro biomateriale di successo o di un substrato di coltura è quella della biocompatibilità. In primo luogo, il substrato non deve indurre la morte cellulare. Esistono diversi metodi citometrici a microtitolazione e a flusso per quantificare la vitalità cellulare e la necrosi; tuttavia, questi metodi non sono suscettibili di analizzare le cellule incorporate all'interno di una matrice di idrogel. In questo protocollo, la limitazione di cui sopra viene aggirata seminando i BMMC sul substrato idrogel o sull'impalcatura biostampata. Dopo uno specifico periodo di incubazione (6-48 ore in questo studio), i BMMC vengono facilmente raccolti mediante micropipettaggio senza la necessità di interruzioni meccaniche o idrolisi del substrato dell'idrogel o dell'impalcatura biostampata, che altrimenti causerebbe danni fisici alle cellule. La vitalità dei BMMC viene quindi rapidamente analizzata utilizzando il metodo di permeabilità PI tramite citometria a flusso. Pi è un colorante impermeabile alla membrana che viene escluso dalle cellule vitali con membrane cellulari intatte e fluoresce solo dopo l'intercalazione tra le coppie di basi di DNA16.

Pertanto, solo le cellule con membrane cellulari compromesse sono permeabili al PI e, quindi, fluoresceranno. L'analisi di permeabilità PI non ha dimostrato cambiamenti nella vitalità del BMMC quando vengono coltivati sul substrato CNC/agarosio/D-mannitolo. Infatti, nessuna delle concentrazioni CNC testate (fino al 12,5% p/v) ha suscitato effetti avversi sulla vitalità del BMMC rispetto ai BMMC coltivati in assenza dei substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo (Figura 3B,C). È anche fondamentale che il bioink o il substrato di coltura non alteri la morfologia delle cellule. Sulla base dei grafici FSC vs SSC citometrici a flusso, il substrato di idrogel con la più alta concentrazione CNC (12,5% p/v) non ha alterato la dimensione nativa (FSC) o la granularità (SSC) delle BMMC rispetto alle BMMC coltivate in assenza dei substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo (Figura 3A(i), (ii)).

Un'altra caratteristica importante di un inchiostro biomateriale o di un substrato di coltura è che deve possedere la capacità di mantenere la differenziazione e il fenotipo delle cellule che supporta. Due dei biomarcatori più quintessenziali dei mastociti sono il recettore IgE ad alta affinità, FcεRI, che facilita le risposte BMMC agli antigeni e il recettore del fattore delle cellule staminali, Kit (CD117), che è necessario per la sopravvivenza e la differenziazione dei mastociti. I mastociti maturi sono definiti dall'espressione di questi due recettori di superficie, e affinché un substrato bioink li mantenga in coltura, non deve modificare significativamente l'espressione di questi due recettori. Il substrato CNC/agarosio/D-mannitolo sembrava aumentare l'espressione di FcεRI e Kit a concentrazioni CNC ≥ 2,5% (Figura 4A(iii),B(iii)). È interessante notare che gli elevati livelli di espressione di FcεRI e Kit sono rimasti relativamente coerenti tra il 2,5% e il 12,5% di CNC, il che è indicativo di un effetto plateau e suggerisce un effetto che non dipende dalla concentrazione di CNC, ma da qualche altro parametro del composito idrogel.

Gli scaffold di inchiostro biomateriale idrogel biostampato in 3D generati in questo studio sono costituiti da nanocellulosa fibrillare (FNC), invece di nanocellulosa cristallina, e alginato di sodio come gelatiere, invece di agarosio. La nanocellulosa fibrillare presenta caratteristiche topografiche distinte su scala nanometrica rispetto a CNC17 che, oltre all'architettura su microscala dei substrati bioink dell'idrogel FNC biostampati in 3D, potrebbero potenzialmente influenzare la redditività dei BMMC. A seguito della bioprinting 3D e della reticolazione ionica degli scaffold bioink FNC/alginato/D-mannitolo (Figura 6), i BMMC sono stati coltivati da soli o sugli scaffold di idrogel biostampati in 3D per 6, 18, 24 e 48 ore, rispettivamente, al fine di valutare i cambiamenti dinamici nella vitalità delle BMMC in risposta alle impalcature FNC/alginato/D-mannitolo, se presente, per lunghi periodi di tempo. Il test XTT ha indicato che l'attività metabolica dei BMMC coltivati sugli scaffold di idrogel biostampati in 3D è rimasta relativamente coerente a ~ 100% in tutti i punti temporali testati rispetto ai BMC coltivati da soli (Figura 7A). La lisi delle cellule provoca il rilascio di LDH nel terreno di coltura cellulare, che il test LDH rileva in funzione della sua attività enzimatica ossidativa.

I BMMC coltivati sugli scaffold di idrogel bioprinted 3D hanno mostrato un graduale aumento dipendente dal tempo del rilascio di LDH rispetto ai BMMC coltivati da soli; tuttavia, questa tendenza ha avuto una deviazione standard non significativa inferiore al 9% (figura 7B). La colorazione PI dei BMMC coltivati sugli scaffold in idrogel biostampati in 3D non ha rivelato cambiamenti significativi nella vitalità rispetto ai BMMC coltivati da soli in ogni punto temporale (Figura 7C). In particolare, l'IFM delle BMMC colorate di PI coltivate sugli scaffold di idrogel biostampati in 3D è rimasta relativamente coerente (PI-MFI di 7000) in tutti i punti temporali ed è stata simile alle BMMC coltivate sui substrati CNC / agarosio / D-mannitolo, che hanno mostrato un PI-MFI coerente di 7000 in tutte le concentrazioni CNC (2,5-12,5%). Collettivamente, questi dati dimostrano che gli scaffold FNC/alginato/D-mannitolo idrogel non influenzano negativamente la vitalità dei BMMC.

Figure 1
Figura 1: Anatomia della gamba del topo, raffigurante la tibia e il femore da cui è isolato il midollo osseo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Preparazione del substrato di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo. (A) Schema del protocollo di preparazione del substrato di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo. (B) I preparati CNC/agarosio/D-mannitolo (0, 1, 2,5, 5, 10 e 12,5% (p/v) CNC in PBS/agarosio/D-mannitolo) sono stati caricati su una piastra a 24 pozzetti in quadruplicato come illustrato. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; CNC = nanocellulosa cristallina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Analisi citometrica a flusso della vitalità del BMMC tramite esclusione dello ioduro di propidio a seguito di incubazione su substrati CNC/agarosio/D-mannitolo. I BMMC sono stati rimossi dai substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo, lavati due volte, risospesi in PBS-0,5% p/v BSA, colorati con PI per 1 ora a 4 °C e analizzati mediante citometria a flusso (n=4). Sono state acquisite un totale di 20.000 celle per campione, incluso il rilevamento dell'emissione di fluorescenza PI nel canale PE. L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando un software di analisi della citometria a flusso. (A) Analisi a punto a dispersione diretta (asse x) contro diffusione laterale (asse y) della popolazione cellulare totale da (i) BMMC di controllo non trattato (0% CNC/agarosio/D-mannitolo) e (ii) BMMC coltivate su 12,5% CNC/agarosio/D-mannitolo, raffiguranti la popolazione cellulare gated utilizzata per l'analisi dei dati. (B) Profilo di sovrapposizione istogramma di cellule chiuse (non macchiate o colorate con PI), da BMMC di controllo non trattate (0% CNC/agarosio/D-mannitolo) e BMMC coltivate al 12,5% CNC/agarosio/D-mannitolo. (C) I BMMC sono stati coltivati su diversi substrati CNC/agarosio/D-mannitolo (1-12,5% (p/v) CNC) per 18 ore e la vitalità cellulare è stata determinata mediante analisi citometrica a flusso di cellule colorate pi. Rappresentazione grafica di IFM PI per BMMC incubate su diversi substrati CNC/agarosio/D-mannitolo (1-12,5% (p/v) CNC) rispetto ai BMMC non trattati e macchiati con PI. Abbreviazioni: BMMC = mastociti derivati dal midollo osseo; CNC = nanocellulosa cristallina; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; BSA = albumina sierica bovina; PI = ioduro di propidio; PE = ficoeritrina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Analisi citometrica a flusso dell'espressione del recettore della superficie cellulare FcεRI e Kit (CD117). I BMMC sono stati coltivati in assenza o presenza di substrati CNC/ agarosio / D-mannitolo per 18 ore, rimossi e analizzati per l'espressione del recettore. I dati sono rappresentativi di 4 repliche. Dot plot a dispersione diretta (asse x) contro scatter laterale (asse y) della popolazione cellulare totale nel campione BMMC non trattato (0% CNC/agarosio/D-mannitolo), colorato con (A)(i) l'anticorpo di controllo isotipo-APC o (B)(i) l'anticorpo-PE di controllo dell'isotipo e la popolazione cellulare chiusa utilizzata per l'analisi dei dati. Profili sovrapposti di istogramma di BMMC gated (colorati con anticorpo di controllo dell'isotipo o (A)(ii) anticorpo anti-FcεRI-APC o (B)(ii) anticorpo anti-Kit-PE), incubati da soli (0% CNC/agarosio/D-mannitolo) o su substrati CNC/agarosio/D-mannitolo al 12,5%. I BMMC sono stati coltivati per 18 ore su diversi substrati CNC/agarosio/D-mannitolo (1-12,5% (p/v) CNC) seguiti rispettivamente dall'analisi dell'espressione del recettore di superficie FcεRI e Kit tramite citometria a flusso (n=4). Rappresentazione grafica di IFM di BMMC colorate con (A)(iii) anticorpi anti-FcεRI-APC o (B)(iii) anti-Kit-PE, rispettivamente, a seguito di coltura su diversi substrati CNC/agarosio/D-mannitolo (1-12,5% (w/v) CNC) rispetto a cellule non trattate (0% CNC) e colorate in modo simile. Abbreviazioni: CNC = nanocellulosa cristallina; APC = allococianina; PE = ficoeritrina; BMMC = mastociti derivati dal midollo osseo; IFM = intensità medie di fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Apparecchiature e materiali di consumo 3D bioprinter necessari per bioprint 5 x 5 x 1 mm Scaffold di idrogel bioink rettilineo a 2 strati in un formato di piastra a 24 pozzetti. (A) (i) Un bioprinter 3D a estrusione pneumatica con la posizione di assemblaggio della testina di stampa nella sua posizione di riposo al termine dell'homing dei suoi assi x-y-z . (A) (ii) Punto di partenza calibrazione della testina di stampa 1 con una cartuccia bioink installata e posizionamento dell'ugello di stampa direttamente sopra il centro del pozzo D1 nelle dimensioni x-y-z . (A) (iii) Posizione di PH1 dopo la calibrazione dell'asse z e la pressione di estrusione di PH1 impostata su 12 kPa. B) i) Cartuccia Bioink (3 mL) contenente nfc/alginato/D-mannitolo biomateriale ink. B) (ii) Distributore di gocce di soluzione reticolante CaCl2 da 50 mM. C) (i) Rappresentazione schematica di un layout di stampa da un file G-code che codifica la stampa di 5 x 5 x 1 mm 2 strati di impalcature di idrogel bioink rettilineo a 2 strati in tutti i pozzetti di una lastra a 24 pozzetti. C) (ii) Rappresentazione schematica di un layout di stampa da un file di codice G che codifica la stampa di 5 x 5 x 1 mm 2 strati di scaffold di idrogel bioink rettilinei solo nei pozzi A1-3, B1-3, C1-3 e D1-3 di una lastra a 24 pozzetti. C) (iii) Vista espansa del modello di impalcatura di idrogel bioink rettilineo a 2 strati 5 x 5 x 1 mm nel programma di affettamento, Slic3r. (D) Vista dall'alto di veri e propri scaffold in idrogel bioink 3D bioiprinted 5 x 5 x 1 mm a 2 strati in un formato di piastra a 24 pozzetti immerso in PBS. Abbreviazioni: 3D = tridimensionale; PH1 = testina di stampa 1; NFC = cellulosa nanofibrillare; G-code = codice geometrico; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Diagramma schematico che illustra il flusso di lavoro del bioprinting 3D e della coltura BMMC su scaffold di idrogel FNC / alginato / D-mannitolo. Bioprinting 3D di scaffold di idrogel con bioink FNC / Alginato / D-mannitolo da un file G-code che codifica un modello di griglia a 2 strati 5 x 5 x 1 mm, reticolazione degli scaffold di idrogel con CaCl2 e coltura di BMMC sui costrutti di idrogel FNC / Alginato / D-mannitolo reticolati. Abbreviazioni: 3D = tridimensionale; 2D = bidimensionale; G-code = codice geometrico; FNC = nanocellulosa fibrillare; BMMC = mastociti derivati dal midollo osseo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Saggi citometrici a flusso (PI) e microtiteri (XTT e LDH) di vitalità BMMC dopo incubazione su scaffold FNC/alginato/D-mannitolo. (A) Dati del saggio metabolico di proliferazione cellulare (XTT) per BMMC coltivati su substrati bioink FNC/Alginato/D-mannitolo per 6, 18, 24 e 48 ore, rispettivamente. I valori sono presentati come percentuale dei dati metabolici XTT per le BMC coltivate da sole per 6, 18, 24 e 48 ore, rispettivamente. Le barre di errore indicano la deviazione standard (n=3). (B) Dati del saggio di rilascio dell'enzima LDH per BMMC coltivati su scaffold bioink FNC/Alginato/D-mannitolo per 6, 18, 24 e 48 ore, rispettivamente. I valori sono presentati come cambiamenti di piega rispetto all'enzima LDH rilasciato da BMMC coltivati da soli per 6, 18, 24 e 48 ore, rispettivamente. Le barre di errore indicano la deviazione standard (n=3). (C) Dati citometrici a flusso di BMMC colorati con PI che sono stati coltivati da soli o su scaffold bioink FNC/Alginato/D-mannitolo per 6, 18, 24 e 48 ore, rispettivamente. Le barre di errore indicano la deviazione standard (n=3). Abbreviazioni: LDH = lattato deidrogenasi; BMMC = mastociti derivati dal midollo osseo; FNC = nanocellulosa fibrillare; PI = ioduro di propidio; MFI = intensità media di fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1.1.1. Flacone da 500 mL di RPMI (HyClone, GE Healthcare, USA)
1.1.2. 4 mM L-glutammina (Gibco, Waltham Massachusetts, USA)
1.1.3. 50 mM β-mercaptoetanolo (Fisher Scientific, Hampton, New Hampshire, USA)
1.1.4. 1 mM piruvato di sodio (Gibco)
1.1.5. 100 U/mL di penicillina (Gibco)
1.1.6. 100 μg/mL di streptomicina (Gibco)
1.1.7. 0,1 mM di amminoacidi non essenziali MEM (Gibco)
1.1.8. 25 mM HEPES (Fisher)
1.1.9. FBS inattivato al calore al 10% (Gibco)
1.1.10. IL-3 ricombinante di topo da 30 ng/mL (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey, USA)

Tabella 1: Supplementi completi per supporti RPMI-1640.

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Discussion

La fabbricazione di tessuti biomimetici 3D richiede la riuscita fusione del bioink, che imita i componenti della matrice extracellulare, con i componenti cellulari per creare analoghi fisiologici dei tessuti in vivo . Ciò richiede l'uso di cellule primarie, e non di cellule trasformate, quando si fabbricano tessuti biomimetici fisiologici. Le cellule immunologiche primarie, come i mastociti, tuttavia, sono particolarmente suscettibili agli effetti citotossici e ai cambiamenti fenotipici che possono essere provocati dalla matrice bioink stessa, che è indesiderabile. Pertanto, la capacità di valutare rapidamente gli effetti dell'inchiostro biomateriale candidato sulla vitalità e sul fenotipo (espressione del recettore di superficie) dei mastociti è altamente vantaggiosa, specialmente prima della bioprinting 3D di tessuti complessi contenenti diversi tipi di cellule incorporate nella matrice del bioink, che è costosa e richiede tempo.

L'approccio di questo protocollo prevede la coltura di BMMC, un esempio di mastociti primari, sulla superficie di substrati bioink di idrogel candidati preformati (1-12,5% CNC incorporato nell'agarosio), che consente il facile recupero dei BMMC per la successiva analisi della vitalità cellulare e dell'espressione del recettore di superficie mediante citometria a flusso. L'isolamento del midollo osseo dal femore e dalla tibia del topo richiede precisione e attenzione ai dettagli a causa della fragilità e delle piccole dimensioni di queste ossa. Dopo il successo dell'isolamento e della deposizione del midollo osseo nel terreno di coltura cellulare, è essenziale mantenere la coltura cellulare con IL-3 ricombinante di topo 30 ng / mL continuamente per 4 settimane, il che garantisce una stimolazione sostenuta per differenziare le cellule progenitrici ematopoietiche in mastociti che sono doppi positivi per i recettori di superficie cellulare Kit (CD117) e FcεRI.

L'analisi citometrica a flusso dei mastociti per l'espressione superficiale dei recettori Kit (CD117) e FcεRI dovrebbe impiegare controlli anticorpali isotipici per aiutare a differenziare il segnale di fondo non specifico dai segnali specifici degli anticorpi utilizzati per colpire questi recettori, come dimostrato nella Figura 4A(ii),B(ii). È anche essenziale chiudere su una popolazione di mastociti ben definita per escludere i detriti cellulari come mostrato nella Figura 4A (i) e 4B (i), che possono anche legare gli anticorpi in modo non specifico. Il micropipettaggio delicato deve essere utilizzato quando si recuperano i BMMC dalla superficie dei substrati di idrogel bioink per ridurre le forze di taglio esercitate sulle cellule, che potrebbero danneggiare la membrana cellulare e provocare una colorazione artificialmente elevata con PI. Le BMMC colorate con PI devono essere analizzate mediante citometria a flusso immediatamente dopo la fine del periodo di incubazione della colorazione poiché il mezzo di colorazione PI, che si basa su PBS-0,5% p / v BSA, non è destinato a sostenere le cellule per lunghi periodi di tempo al di fuori del terreno di coltura cellulare. Poiché PI permea solo le cellule con membrane cellulari compromesse, è in grado di macchiare le cellule necrotiche con elevata selettività e sensibilità. Tuttavia, PI non è in grado di rilevare le cellule apoptotiche, che mantengono intatte le membrane cellulari.

Il saggio citometrico a flusso di esclusione PI descritto in questo protocollo può essere aumentato con l'isotiocianato di annexina-V-fluoresceina (FITC), che si lega specificamente al fosfolipide, la fosfatidilserina, che viene traslocata nel foglietto esterno della membrana cellulare delle cellule apoptotiche. Tuttavia, la compensazione è necessaria per tenere conto del bleed-through dell'emissione di fluorescenza di FITC nel canale del rivelatore utilizzato per acquisire l'emissione di fluorescenza da PI e viceversa. Nella preparazione della bioprinter per il bioprinting 3D dal codice G della piastra a 24 pozzetti fornito, è essenziale che la calibrazione del punto di partenza venga eseguita con precisione, in cui vengono registrate le coordinate x e y del centro del pozzo D1 e il file G-code viene aggiornato con queste coordinate x e y sulla riga 1. Se queste fasi iniziali di calibrazione non vengono eseguite in modo accurato, le testine di stampa non si sposteranno al punto di partenza corretto all'inizio della stampa. La corretta calibrazione dell'asse z è altrettanto importante in quanto in caso contrario l'ugello della testina di stampa può causare la collisione dell'ugello della testina di stampa con il piano di stampa o la lastra a 24 pozzetti all'inizio della stampa.

Il diagramma schematico del costrutto a griglia rettilinea a 2 strati 5 x 5 x 1 mm (Figura 5C(iii)), illustra la presenza di pori tra i filamenti bioink estrusi che formano il substrato. La dimensione dei pori e il diametro dei filamenti dipendono da tre parametri: (i) la velocità di corsa dell'ugello di stampa, (ii) la pressione di estrusione applicata al bioink all'interno della cartuccia e (iii) il diametro dell'ugello di stampa. I substrati Bioink con grandi diametri di filamento e pori piccoli possono essere stampati utilizzando una velocità dell'ugello di stampa più lenta, una pressione di estrusione più elevata (>12 kPa) e un ugello di stampa di diametro maggiore (22 G). Al contrario, una maggiore velocità dell'ugello di stampa, una pressione di estrusione inferiore (<12 kPa) e un ugello di stampa di diametro inferiore (27 G) si tradurranno in substrati con filamenti più fini e pori più grandi. Tuttavia, una pressione di estrusione insufficientemente elevata comporterà l'estrusione di grumi incoerenti di bioink invece di filamenti continui, il che influenzerà negativamente la qualità e l'integrità strutturale del substrato biostampato 3D.

Il bioink candidato CNC/agarosio/D-mannitolo presentato in questo protocollo subisce la gelificazione termica quando l'agarosio si raffredda a temperatura ambiente. Al contrario, il bioink commerciale utilizzato per il bioprinting 3D in questo protocollo subisce la reticolazione ionica con CaCl2 a causa dell'inclusione di alginato di sodio nella formulazione bioink. È quindi necessario immergere gli scaffold bioprinted FNC/alginato/D-mannitolo in soluzione di CaCl2 da 50 mM dopo la bioprinting per facilitare la reticolazione (gelificazione) del substrato. L'omissione della fase di reticolazione ionica con CaCl2 comporterà la dissoluzione degli scaffold FNC/alginato/D-mannitolo quando sono immersi nel terreno di coltura cellulare. Il principale limite della formulazione cnc / agarosio / D-mannitolo bioink nella sua applicazione nella bioprinting 3D reale è la temperatura di fusione eccezionalmente elevata dell'agarosio (90-95 ° C). Anche se le testine di stampa della biostampante 3D utilizzate in questo studio possono raggiungere una temperatura massima di 130 ° C, i filamenti estrusi di CNC / agarosio / D-mannitolo probabilmente si disperderanno rapidamente man mano che vengono stampati strati successivi per costruire il substrato. Questa limitazione della formulazione CNC/agarosio/D-mannitolo bioink può essere aggirata stampando il bioink CNC/agarosio/D-mannitolo direttamente su un piano stampato raffreddato per accelerare la gelificazione, oppure sostituendo l'agarosio con alginato di sodio, che può essere estruso a temperatura ambiente e subisce una rapida reticolazione ionica con 50 mM CaCl2 entro 5 minuti.

Questo protocollo offre un approccio affidabile per esaminare rapidamente ed escludere le formulazioni bioink che presentano scarsa compatibilità biochimica con cellule immunologiche sensibili, come i mastociti, che non dovrebbero essere sottoposte a bioprinting 3D a estrusione pneumatica. Inoltre, questo protocollo è conveniente in quanto richiede quantità relativamente basse di cellule per eseguire un test di screening multiplexed. Al contrario, le miscele bioink-cell pre-formulate devono essere biostampate a densità cellulari molto elevate (>107 cellule / mL), che possono rivelarsi costose e dispendiose in termini di tempo per eseguire un test di screening della biocompatibilità, specialmente quando si coltivano cellule primarie che dipendono da costosi fattori di crescita ricombinanti.

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Disclosures

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Research Council Canada e Alberta Innovates.

Acknowledgments

Ringraziamo Alberta Innovates per aver fornito il CNC e Ken Harris e Jae-Young Cho per la loro consulenza tecnica durante la preparazione della matrice CNC / agarosio / D-mannitolo. Ringraziamo anche Ben Hoffman, Heather Winchell e Nicole Diamantides per la loro consulenza tecnica e supporto con la configurazione e la calibrazione della bioprinter 3D INKREDIBLE+.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A
Acetic Acid (glacial) Sigma Aldrich AX0074-6
Agarose (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) Thermo Fisher Scientific 17-4888-82
B
b-Mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) Sigma Aldrich N0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) BD 309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in BD 305111
BioLite 24 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 930-186
BioLite 96 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 130-188
BioLite 175 cm2 Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130-191
Biosafety Cabinet Class II Microzone Corp., Canada BK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2930-100GM
C
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) Thermo Fisher Scientific 12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) CELLINK LLC IK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL CELLINK LLC CL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps CELLINK LLC CSC0103000102
CELLINK HeartWare for PC CELLINK LLC Version 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER CELLINK LLC S-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G CELLINK LLC NZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G CELLINK LLC NZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G CELLINK LLC NZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) Sigma Aldrich 11465015001
Centrifuge (Benchtop) Eppendorf 5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate Sigma Aldrich CLS3370
CO2 Incubator Binder GmbH, Germany 9040-0113
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter A00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) Fisher Scientific 44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) Thermo Fisher Scientific 17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated Thermo Fisher Scientific 12484028
FlowJo Software Becton Dickinson & Co. USA Version 10.6.2
G
GraphPad Prism GraphPad Software, LLC Version 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) VWR 15170-208
HEPES Sodium Salt Fisher Scientific BP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT) Sigma Aldrich I10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco) Thermo Fisher Scientific 25030-081
Lithium L-lactate Sigma Aldrich L2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) Sigma Aldrich M8640
Microtubes (1.7 mL clear) Axygen MCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear) Axygen MCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) Millipore ZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) Thermo Fisher Scientific 725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) Thermo Fisher Scientific 15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)  Thermo Fisher Scientific 10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific P3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) Thermo Fisher Scientific 12-4031-82
Recombinant Murine IL-3 PeproTech, Inc.  213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) GE Healthcare SH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) Fisher Scientific NC9913213
Sodium Azide, 500 g Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma Aldrich 252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) Sigma Aldrich 93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) Thermo Fisher Scientific VLBL00D0

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References

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Bioingegneria Numero 171
Fabbricazione di un inchiostro biomateriale di agarosio incorporato in nanocellulosa cristallina per la coltura di mastociti derivati dal midollo osseo
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Karamchand, L., Wagner, A., Alam, S. … More

Karamchand, L., Wagner, A., Alam, S. B., Kulka, M. Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture. J. Vis. Exp. (171), e62519, doi:10.3791/62519 (2021).

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