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Biology

प्राथमिक Cilia का आकलन करने के लिए आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस दृष्टिकोण

Published: May 1, 2021 doi: 10.3791/62521
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 2Nikon Instruments Inc., 3Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University, 4Center for Diabetes and Metabolic Diseases, Indiana University School of Medicine

Summary

छवियों का विश्लेषण करने के लिए आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस (एआई) का उपयोग आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले तरीकों की तुलना में एक शक्तिशाली, कम पक्षपातपूर्ण और तेजी से दृष्टिकोण के रूप में उभर रहा है। यहां हमने एआई को एक सेलुलर ऑर्गेनेल, प्राथमिक सिलिया को पहचानने और कठोर और प्रजनन तरीके से लंबाई और धुंधला तीव्रता जैसे गुणों का विश्लेषण करने के लिए प्रशिक्षित किया।

Abstract

सिलिया माइक्रोट्यूबुल आधारित सेलुलर उपांग हैं जो कई स्तनधारी सेल प्रकारों में सिग्नलिंग रास्तों की विविधता के लिए सिग्नलिंग केंद्रों के रूप में कार्य करते हैं। सिलिया लंबाई अत्यधिक संरक्षित, कसकर विनियमित है, और विभिन्न कोशिका प्रकारों और ऊतकों के बीच भिन्न होती है और सीधे उनकी सिग्नलिंग क्षमता को प्रभावित करने में फंसाया गया है। उदाहरण के लिए, सिलिया को सिलियरी जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स की सक्रियता के जवाब में उनकी लंबाई में परिवर्तन करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, कई सिलिया की लंबाई को सही और पुन: उत्पन्न करना एक समय लेने वाली और श्रम-गहन प्रक्रिया है। वर्तमान दृष्टिकोण भी त्रुटि और पूर्वाग्रह प्रवण हैं। आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस (एआई) कार्यक्रमों का उपयोग व्यापक डेटा सेट के आत्मसात, हेरफेर और अनुकूलन की अनुमति देने वाली क्षमताओं के कारण इनमें से कई चुनौतियों को दूर करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि वीवो और इन विट्रो नमूनों दोनों से छवियों में सिलिया को पहचानने के लिए एक एआई मॉड्यूल को प्रशिक्षित किया जा सकता है। सिलिया की पहचान करने के लिए प्रशिक्षित एआई का उपयोग करने के बाद, हम उन अनुप्रयोगों को डिजाइन और तेजी से उपयोग करने में सक्षम हैं जो लंबाई, फ्लोरेसेंस तीव्रता और सह-स्थानीयकरण के लिए एक ही नमूने में सैकड़ों सिलिया का विश्लेषण करते हैं। इस निष्पक्ष दृष्टिकोण ने हमारे आत्मविश्वास और कठोरता में वृद्धि की जब विट्रो में विभिन्न प्राथमिक न्यूरोनल प्रेप के नमूनों के साथ-साथ एक जानवर के भीतर और जानवरों के बीच विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में नमूनों की तुलना की। इसके अलावा, इस तकनीक का उपयोग कई नमूनों और उपचार समूहों में उच्च थ्रूपुट तरीके से किसी भी सेल प्रकार और ऊतक से सिलिया गतिशीलता का मज़बूती से विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। अंततः, एआई-आधारित दृष्टिकोण मानक बन जाएंगे क्योंकि अधिकांश क्षेत्र छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए कम पक्षपातपूर्ण और अधिक प्रजनन योग्य दृष्टिकोणों की ओर बढ़ते हैं।

Introduction

प्राथमिक सिलिया संवेदी ऑर्गेनेल्स होते हैं जो अधिकांश स्तनधारी कोशिका प्रकार 1 ,2,3,4से फैलते हैं । वे आम तौर पर बाहुलर संकेतों को एकीकृत करके विविध सेल सिग्नलिंग रास्तों के समन्वय के लिए महत्वपूर्ण होते हैं5,6,7. प्राथमिक सिलिया भ्रूणीय विकास और वयस्क ऊतक होमोस्टेसिस के दौरान महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते हैं, और उनके कार्य या आकृति विज्ञान का व्यवधान कई आनुवंशिक विकारों से जुड़ा हुआ है, जिन्हें सामूहिक रूप से सिलिओपैथी कहा जाता है। सिलिया की निकट सर्वव्यापी प्रकृति के कारण, सिलिओपैथी नैदानिक विशेषताओं की एक विस्तृत श्रृंखला से जुड़े हुए हैं जो सभीअंग प्रणालियों8,9,10, 11,12को प्रभावित कर सकते हैं। सिलियोपैथी के पशु मॉडलों में, सिलियरी-संरचना या सिग्नलिंग क्षमता का नुकसान हाइपरफैगिया से जुड़ेमोटापे3, 13,14,15सहित कई चिकित्सकीय प्रासंगिक फेनोटाइप में प्रकट होता है। कई मॉडल प्रणालियों में, सिलिया लंबाई में परिवर्तन उनकी संकेत क्षमता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है और16, 17,18,19कार्य करता है । हालांकि, सिलिया लंबाई और संरचना का सटीक और पुन: उपयोग से जुड़ी कई समय लेने वाली और तकनीकी चुनौतियां हैं।

वयस्क स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) एक जैविक संदर्भ है जिसने सिलिया आकृति विज्ञान और कार्य को समझने के लिए एक चुनौती पेश की है। हालांकि ऐसा लगता है कि सीएनएस भर में न्यूरॉन्स और कोशिकाओं के पास सिलिया है, सीमित उपकरणों और क्षमताओं के कारण इन सिलिया का निरीक्षण और विश्लेषण करने के लिए उनके कार्यों की समझ मायावी20बनी हुई है। उदाहरण के लिए, प्रोटोटाइप सिलिया मार्कर, एसिटिलेटेड α-ट्यूबलिन, न्यूरोनल सिलिया20को लेबल नहीं करता है। इन सिलिया का अध्ययन करने की कठिनाई को आंशिक रूप से कई जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) की खोज के साथ हल किया गया था, मशीनरी और झिल्ली से जुड़े प्रोटीन जो न्यूरोनल सिलिया21, 22की झिल्ली पर समृद्ध होते हैं। इन सभी बुनियादी टिप्पणियों के महत्व और सीएनएस cilia, जो इस प्रकार अब तक अंय ऊतकों द्वारा अद्वितीय प्रतीत होता है की विविधता पर संकेत । उदाहरण के लिए, सिलिया की लंबाई और जीपीसीआर स्थानीयकरण में भिन्नता पूरे मस्तिष्क में देखी जा सकती है, जिसमें अन्य नाभिक19,23की तुलना में कुछ न्यूरोनल नाभिक में लंबाई अलग-अलग हो रही है। इसी तरह , उनकी जीपीसीआर सामग्री और सिग्नलिंग मशीनरी की तारीफ में न्यूरोएनाटॉमिकल स्थान और न्यूरोनल टाइप 2 ,24, 25,26,27,28,29पर आधारित विविधता दिखाई देती है . इन सरल टिप्पणियों से यह प्रदर्शित होता है कि स्तनधारी सीएनएस सिलिया लंबाई और संरचना को कसकर विनियमित किया जाता है, जैसे मॉडल जीवों में, जैसे क्लैमायडोमोनास रेनहार्टी,लेकिन सिलिया फ़ंक्शन, सिग्नलिंग और अंततः व्यवहार पर इन लंबाई के अंतर का प्रभाव अस्पष्ट16,30,31,32है।

सिलिया की लंबाई और संरचना को सही ढंग से मापने से उपयोगकर्ता त्रुटि और अपरिवर्तनीयता के लिए प्रवण एक तकनीकी चुनौती साबित होती है। वर्तमान में वीवो और इन विट्रो में सिलिया को अक्सर इम्यूनोफ्लोरोसेंट दृष्टिकोणों का उपयोग करके पहचाना जाता है जो सिलियरी प्रोटीन या सिलिया-समृद्ध फ्लोरोसेंट रिपोर्टर एलील्स33,34,35लेबल करते हैं। इन फ्लोरोसेंटी टैग किए गए सिलिया की लंबाई को इमेजजे36जैसे छवि विश्लेषण कार्यक्रमों में लाइन माप उपकरणों का उपयोग करके 2-आयामी (2D) छवि से मापा जाता है। यह प्रक्रिया न केवल थकाऊ और श्रम गहन है बल्कि पूर्वाग्रह और त्रुटि से भी ग्रस्त है । सिलिया तीव्रता को मापने के दौरान ये वही बाधाएं उत्पन्न होती हैं, जो सिलिया संरचना37में परिवर्तन को इंगित करने में मदद करती हैं। छवि विश्लेषण के इन प्रकार में विसंगतियों को कम करने के लिए, आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस (एआई) कार्यक्रम अधिक प्रचलित और किफायती विकल्प38होते जा रहे हैं।

एआई कंप्यूटर सिस्टम की उन्नति है जो कंप्यूटर एल्गोरिदम और प्रोग्रामिंग के लाभ का उपयोग उन कार्यों को निष्पादित करने के लिए करता है जिन्हें आमतौर पर मानव खुफिया39की आवश्यकता होती है। एआई उपकरणों को आवर्ती पैटर्न, मापदंडों और विशेषताओं को समझने और सफल परिणाम बनाने की बाधाओं को अधिकतम करने के लिए कार्रवाई करना सिखाया जाता है। एआई बहुमुखी है और इसे विशिष्ट वस्तुओं या ब्याज की संरचनाओं, जैसे सिलिया को पहचानने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है, और फिर पहचानकी गई वस्तुओं पर विभिन्न प्रकार के विश्लेषण चलाने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है। इसलिए, एआई38द्वारा जटिल छवि डेटा तेजी से और पुन: उत्पन्न किया जा सकता है। कैप्चर की गई छवियों के स्वचालन और एआई विश्लेषण से किसी भी संभावित मानवीय त्रुटि और पूर्वाग्रह को सीमित करतेहुएप्रभावकारिता और दक्षता में वृद्धि होगी । सिलिया पहचान के लिए एक एआई आधारित पद्धति की स्थापना सभी अनुसंधान समूहों के लिए सिलिया डेटा का विश्लेषण और व्याख्या करने का एक सुसंगत तरीका बनाती है।

यहां हम 2D छवियों पर वीवो और इन विट्रो दोनों में सिलिया की पहचान करने के लिए एक एआई मॉड्यूल का उपयोग करते हैं। नमूना छवियों के एक सेट का उपयोग कर एअर इंडिया cilia की पहचान करने के लिए प्रशिक्षित किया जाता है । एक बार प्रशिक्षण पूरा हो जाने के बाद, नामित एआई का उपयोग एक छवि में एआई पहचाने गए सिलिया पर बाइनरी मास्क लगाने के लिए किया जाता है। एआई द्वारा लागू बाइनरी संशोधित कर रहे हैं, यदि आवश्यक हो, तो छवियों में सभी सिलिया को ठीक से पहचाना जाता है और गैर-विशिष्ट पहचान समाप्त हो जाती है। सिलिया की पहचान करने के लिए एआई का उपयोग करने के बाद, कस्टम-निर्मित सामान्य विश्लेषण (जीए) कार्यक्रमों का उपयोग विभिन्न विश्लेषणों जैसे सिलिया लंबाई और फ्लोरेसेस तीव्रता को मापने के लिए किया जाता है। एकत्र किए गए डेटा को एक तालिका में निर्यात किया जाता है जिसे सांख्यिकीय विश्लेषणों(चित्रा 1)के लिए आसानी से पढ़ा, व्याख्या और उपयोग किया जा सकता है। स्वचालित प्रौद्योगिकी और एअर इंडिया के उपयोग के लिए cilia की पहचान और प्रयोगात्मक समूहों के बीच विशिष्ट माप प्राप्त करने के लिए सेल सेल संचार और व्यवहार पर सीएनएस सिलिया समारोह और आकृति विज्ञान के प्रभाव को समझने के उद्देश्य से भविष्य के अध्ययनों में सहायता करेगा ।

Protocol

1. कच्चे चित्र प्राप्त करें

  1. जरूरत केअनुसार 20के रूप में फिक्स और इम्यूनोलबेल नमूने ।
    1. Nyquist संकल्प के साथ एक ही पिक्सेल आकार का उपयोग कर अधिकतम बिट गहराई पर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि सिलिया।
    2. मोनोक्रोम टैग इमेज फॉर्मेट (.tif) फ़ाइलों के रूप में निर्यात छवियां।
      नोट: यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से एनआईएस एलिमेंट्स सॉफ्टवेयर के भीतर एआई मॉड्यूल का उपयोग करने के तरीके को रेखांकित करता है। यदि छवियों को .nd2 फ़ाइलों के रूप में अधिग्रहीत किया गया था, तो .tif फ़ाइलों के रूप में छवियों का निर्यात करना आवश्यक नहीं है और उपयोगकर्ता सीधे 2.3 चरण में आगे बढ़ सकता है। यदि छवियों को एक अलग प्रणाली पर अधिग्रहीत किया गया था, एक एनआईएस तत्व लाइसेंस अलग से खरीदा जा सकता है और .tif फ़ाइलों को अगले चरणों में उल्लिखित के रूप में परिवर्तित किया जा सकता है ।

2. ट्रेन ऐ cilia की पहचान करने के लिए

  1. प्रशिक्षण डेटासेट खोलें।
    1. सॉफ्टवेयर को प्रशिक्षित करने और उन्हें एक फ़ोल्डर में कॉपी करने के लिए प्रति फ्रेम कम से कम एक सिलियम के साथ लगभग 50 नमूना छवियों का चयन करें। इस फ़ोल्डर का उपयोग छवियों को खोलते समय सॉफ्टवेयर को निर्देशित करने के लिए किया जाता है। इन 50 फ्रेम को एक ND2 दस्तावेज़ के भीतर कम से कम एक सिलियम प्रति फ्रेम के साथ खोलें। फाइल > आयात/निर्यात काचयन करें > फाइल सीक्वेंस से एनडी फाइल बनाएं ।
    2. प्रशिक्षण डेटासेट वाले फ़ोल्डर का चयन करें। इससे संवाद खिड़की के केंद्र में फाइलों की सूची खुलेगी। ऊपर ड्रॉप-डाउन मेनू में कम से कम एक विकल्प का उपयोग करके फ़ाइलों के संगठन को मैन्युअल रूप से परिभाषित करें। विकल्प मल्टीपॉइंट (कई अधिकतम प्रक्षेपण फ़ाइलों के लिए), जेड श्रृंखला (जेड स्टैक छवि के लिए), समय (समय-चूक छवि के लिए), और तरंगदैर्ध्य (कई चैनलों से फ़ाइलों के लिए) हैं।
    3. प्रत्येक चयनित विकल्प के तहत संबंधित संख्यात्मक मान दर्ज करें। जहां भी विकल्प नहीं चुने जाते हैं, वहां कोई भी चुनें। एनडी दस्तावेज़ खोलने के लिए कन्वर्ट पर क्लिक करें।
  2. छवियों को जांचना।
    1. छवि के निचले बाएं हाथ के कोने में पिक्सेल आकार दर्ज करें: दाएं क्लिक करें अनकैलिब्रेटेड > कैलिब्रेट दस्तावेज़ > पिक्सेल आकार।
  3. सिलिया की पहचान करें।
    1. बाइनरी टूलबारमें ऑटोडिटेक्ट या ड्रा ऑब्जेक्ट का उपयोग करके सभी खोले गए फ्रेम पर व्यक्तिगत सिलियरी संरचनाओं का ठीक से पता लगाकर सिलिया की पहचान करें। यह ब्याज की वस्तुओं पर बाइनरी मास्क आकर्षित करेगा। ये बाइनरी भविष्य के प्रयोगात्मक छवि विश्लेषण में पिक्सेल-आधारित विशेषताओं पर सिलिया की पहचान करने के लिए सॉफ्टवेयर को प्रशिक्षित करने के लिए नमूना वस्तुओं के रूप में काम करेंगे। व्यू > विश्लेषण नियंत्रण > बाइनरी टूलबार > ड्रा ऑब्जेक्ट का चयन करें।
      नोट: किसी भी फ्रेम को हटा दें जिसमें कोई बाइनरी नहीं है क्योंकि सॉफ्टवेयर प्रशिक्षण शुरू नहीं करेगा जब तक कि यह सभी खोले गए फ्रेम पर बाइनरी का पता लगाने में सक्षम न हो।
  4. ट्रेन ऐ।
    1. सॉफ्टवेयर प्रशिक्षण शुरू करें। इससे ट्रेन का Segment.ai बॉक्स खुल जाएगा। ट्रेन Segment.ai NIS.ai >चुनें ।
    2. ट्रेन Segment.ai बॉक्स में, प्रशिक्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले स्रोत चैनल का चयन करें। अगर कई चैनलों की फ़ाइलें खुली हैं, तो स्रोत चैनल के रूप में केवल एक चैनल का चयन करें. फिर उपयुक्त जमीनी सत्य बाइनरी का चयन करें जिस पर एआई को प्रशिक्षित करना है। अंत में बाइनरी के आकार और वितरण के आधार पर एआई को प्रशिक्षित करने के लिए आवश्यक पुनरावृत्तियों की संख्या का चयन करें।
      नोट: यदि बाइनरी आसानी से परिवेश से पता लगाया जा सकता है और अच्छी तरह से छवि भर में वितरित कर रहे हैं, सॉफ्टवेयर छवियों की पहचान करने के लिए प्रशिक्षित करने के लिए १००० से कम पुनरावृत्तियों की आवश्यकता हो सकती है । यदि छवियों में कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात है, तो एआई को उच्च आत्मविश्वास के साथ परीक्षण नमूनों में सिलिया की पहचान करने में सक्षम बनाने के लिए प्रशिक्षण के दौरान कम से १० पुनरावृत्तियों को चलाना आदर्श है ।
    3. प्रशिक्षित एआई फ़ाइल (.sai) को बचाने के लिए गंतव्य फ़ोल्डर का चयन करें और सॉफ्टवेयर को प्रशिक्षित करने के लिए ट्रेन पर क्लिक करें। सॉफ्टवेयर अब ट्रेस किए गए बाइनरी के आधार पर सिलिया की पहचान करने के लिए खुद को प्रशिक्षित करने के लिए आगे बढ़ेगा । इस प्रक्रिया में कई घंटे लगते हैं।
      नोट: प्रशिक्षण के दौरान, सॉफ्टवेयर प्रशिक्षण हानि दिखाते हुए ग्राफ प्रदर्शित करेगा। ग्राफ शुरू में आदर्श रूप से 1% नुकसान के आसपास जहां यह प्रशिक्षण के बाकी के लिए पठारों के लिए टेपरिंग से पहले एक स्पाइक दिखाएगा । ट्रेन Segment.ai बॉक्स(पूरक चित्रा 1)पर सेव ग्राफ स्क्रीनशॉट के लिए बॉक्स की जांच करके भविष्य के संदर्भ के लिए ग्राफ को सहेजें।
    4. यदि प्रशिक्षण के लिए और अधिक शोधन की आवश्यकता है, तो उसी डेटासेट पर प्रशिक्षण जारी रखें। वैकल्पिक रूप से, सटीक एक ही मापदंडों के साथ एक नए डेटासेट पर ट्रेन। विभिन्न मापदंडों या ब्याज की विभिन्न वस्तुओं के साथ एक नए डेटासेट पर पहले से ही प्रशिक्षित एआई को प्रशिक्षित करना उचित नहीं है। ट्रेन का चयन segment.ai > > चयनित प्रशिक्षित एआई फ़ाइल पर प्रशिक्षण जारी रखें।

3. प्रशिक्षित एआई का उपयोग करके सिलिया की पहचान करें

  1. प्रायोगिक डेटासेट खोलें।
    1. नमूना .tif फाइलों को चरण 2.1 के समान .nd2 फ़ाइलों में परिवर्तित करके सॉफ्टवेयर में सिलिया की प्रायोगिक कॉन्फोकल छवियों को खोलें। फाइल > आयात/निर्यात काचयन करें > फाइल सीक्वेंस से एनडी फाइल बनाएं ।
      नोट: छवियों को एअर इंडिया के प्रशिक्षण के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में एक ही पिक्सेल आकार के होना चाहिए । यदि छवियां पहले से ही ND2 प्रारूप में हैं, तो 3.3 चरण के लिए छोड़ दें।
  2. छवियों को जांचना।
    1. छवि के निचले बाएं हाथ के कोने में पिक्सेल आकार दर्ज करें। पिक्सेल साइज > सही क्लिक करें अनकैलिब्रेटेड > कैलिब्रेट डॉक्युमेंट।
  3. खोली गई फाइलों पर प्रशिक्षित एआई चलाएं।
    1. एआई का उपयोग करके सिलिया की पहचान करना शुरू करें। सॉफ्टवेयर अब पूर्व चरण में प्राप्त प्रशिक्षण के आधार पर सिलिया पर बाइनरी आकर्षित करेगा। इस प्रक्रिया में कुछ सेकंड का समय लगेगा। NIS.ai > Segment.aiका चयन करें ।
      नोट: यदि कई चैनल खुले हैं तो सॉफ्टवेयर चैनल का चयन करने का संकेत देगा। चैनल यहां अपने-अपने नाम से सूचीबद्ध हैं । यदि नहीं, तो चिह्नित बॉक्स 'मोनो' स्वचालित रूप से चुना जाएगा।
  4. गलत पहचान वाले बाइनरी के लिए छवियों की जांच करें।
    1. एक बार एअर इंडिया सिलिया की पहचान की है और बाइनरी खींचा, किसी भी गलती से पहचान की वस्तुओं के लिए छवियों की जांच करें । यदि वांछित है, तो मैन्युअल रूप से किसी भी गलत पहचान वाले बाइनरी को हटा दें। व्यू > विश्लेषण नियंत्रण > बाइनरी टूलबार > डिलीट ऑब्जेक्ट का चयन करें।

4. सिलिया लंबाई और तीव्रता को मापने

  1. एक नया सामान्य विश्लेषण 3 (GA3) नुस्खा बनाएं।
    1. अब जब सिलिया की पहचान की गई है और खंडित किया गया है, तो GA3 टूल का उपयोग करके लंबाई और तीव्रता जैसे सिलिया के विभिन्न मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें। यह केंद्र में एक खाली स्थान के साथ एक नई खिड़की खोलेगा जहां विश्लेषण को परिभाषित किया जाएगा। नई GA3 नुस्खा > छविका चयन करें।
  2. विश्लेषण करने के लिए बाइनरी का चयन करें।
    1. चूंकि सिलिया पहले से ही Segment.ai का उपयोग करके खंडित हैं, GA3 स्वचालित रूप से एआई के अनुसार लेबल किए गए बाइनरी का पता लगाएगा और इसमें नोड शामिल होगा। 'बिनरीज > ऑटो Detect_AI' या 'बाइनरी > ड्रा Object_AI' काचयन करें।
  3. विश्लेषण के लिए आवश्यक चैनलों का चयन करें। GA3 भी स्वचालित रूप से छवियों में चैनलों का पता लगाने और चैनलों के तहत अपने टैब प्रदर्शित करेगा।
  4. फ्रेम की सीमा को छूने वाली वस्तुओं को हटा दें।
    1. चूंकि एआई फ्रेम में सभी सिलिया जैसी वस्तुओं को खंडित करेगा, इसलिए यह फ्रेम के किनारों के साथ अपूर्ण सिलिया का भी पता लगाएगा। इन वस्तुओं को या तो चरण 3.4 में मैन्युअल रूप से हटाया जा सकता है या उन्हें GA3 में स्वचालित रूप से हटाया जा सकता है। बाइनरी प्रोसेसिंग का चयन करें > वस्तुओं को हटाएं > छूती सीमाएं।
  5. सिलिया को मापने के लिए मापदंडों का चयन करें।
    1. सिलिया लंबाई(लंबाई)और तीव्रता(योग ऑब्जेक्ट तीव्रता)जैसे उपाय करने के लिए मापदंडों को खींचें और छोड़ दें। नोड्स को उपयुक्त बाइनरी नोड (कनेक्शन ए) और चैनल नोड्स (कनेक्शन बी) से कनेक्ट करें। एक टूलटिप के लिए नोड कनेक्शन पर मंडराना यह दिखाने के लिए कि नोड किस कनेक्शन से संबंधित है। ऑब्जेक्ट साइज > > ऑब्जेक्ट साइज > ऑब्जेक्ट रौजे तीव्रता > मात्रा काचयन करें ।
      नोट: नोड लंबाई केवल बाइनरी नोड से जोड़ती है, जबकि योग ओब्ज तीव्रता बाइनरी और चैनल नोड्स दोनों से जोड़ती है।
  6. माप को एक ही तालिका में संलग्न करें।
    1. नोड परलेंड कॉलम को विश्लेषण प्रवाह चार्ट में खींचकर और गिराकर सभी मापों को एक ही आउटपुट टेबल में मिलाएं और इसे माप नोड्स, लंबाई और योग ओब्ज तीव्रता से जोड़ें। डेटा मैनेजमेंट > बेसिक > परिशिष्ट कॉलम का चयनकरें ।
  7. सिलिया को मापें।
    1. रन पर क्लिक करके सिलिया को मापें। इस प्रक्रिया को प्रायोगिक छवियों में सभी सिलिया को मापने के लिए कुछ क्षण लगते हैं। लंबाई और तीव्रता एक नई विश्लेषण परिणाम खिड़की में दिखाई देगा।
      नोट: तालिका में कभी-कभी मास्क से डेटा शामिल हो सकता है जिसे एआई सिलिया के रूप में पहचाना जाता है लेकिन मानव आंखों द्वारा पता लगाने और चरण 3.4 में समाप्त होने के लिए बहुत छोटे थे। सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले फ़िल्टर का उपयोग करके इन वस्तुओं को डेटा सेट से हटाया जा सकता है. यहां, वीवो सिलिया में चित्रा 2 और 2 माइक्रोन में इन विट्रो सिलिया लंबाई माप के लिए 1 माइक्रोन का एक फिल्टर इस्तेमाल किया गया था। यह नीचे दिए गए मार्ग का उपयोग करके डेटा निर्यात करने से पहले किया जा सकता है। विश्लेषण परिणाम विंडो का चयन करें > फ़िल्टर को परिभाषित > > उपयोग फ़िल्टर > मूल्य दर्ज करें.
  8. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए निर्यात डेटा।

5. कोलोकैलाइजेशन अध्ययन

नोट: कोलोकैलाइजेशन विश्लेषण को सिलिया लंबाई और तीव्रता विश्लेषण के माप के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही GA3 नुस्खा में शामिल किया जा सकता है। यदि एक ही नुस्खा का उपयोग कर रहे हैं, तो नीचे वर्णित फ़ाइलों को खोलें और एक ही विश्लेषण पाइपलाइन में कोलोकैलाइजेशन गुणांक के साथ दोनों चैनलों की लंबाई और तीव्रता को मापें।

  1. प्रायोगिक डेटासेट खोलें।
    1. नमूना .tif फाइलों को .nd2 फ़ाइलों में परिवर्तित करके सॉफ्टवेयर में सिलिया की प्रायोगिक कॉन्फोकल छवियों को खोलें। फाइल > आयात/निर्यात काचयन करें > फाइल सीक्वेंस से एनडी फाइल बनाएं ।
    2. पॉप-अप विंडो में, पॉप-अप विंडो के पहले कॉलम में स्थित विंडो एक्सप्लोरर से ब्याज के सभी चैनलों से 16-बिट गहराई मोनोक्रोम फ़ाइलों का चयन करें। पहले ड्रॉप डाउन मेनू से मल्टीपॉइंट या जेड सीरीज चुनें और क्रमशः छवियों या ढेर की कुल संख्या के अनुरूप एक मूल्य दर्ज करें।
    3. दूसरे ड्रॉप डाउन बॉक्स में, वेवलेंथ का चयन करें और फ़ोल्डर में चैनलों की कुल संख्या में मूल्य बदलें। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से पॉप-अप विंडो के नीचे दाएं छोर पर स्थित वेवलेंथ चयन विंडो को अनलॉक करेगा। प्रत्येक चैनल का रंग चुनने के लिए रंग ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग करें। नाम कॉलम के तहत प्रत्येक चैनल को अलग नाम के साथ प्रदान करें। एक बार सारी जानकारी अपडेट हो जाने के बाद कन्वर्टपर क्लिक करें । सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से सभी चयनित चैनलों से सभी व्यक्तिगत छवियों के साथ ओवरले किए गए सभी इमेज फ़ाइल उत्पन्न करेगा।
  2. छवियों को जांचना।
    1. छवि के निचले बाएं हाथ के कोने में पिक्सेल आकार दर्ज करें। पिक्सेल साइज > सही क्लिक करें अनकैलिब्रेटेड > कैलिब्रेट डॉक्युमेंट।
  3. पहले चैनल पर प्रशिक्षित एआई चलाएं।
    1. खोले गए चैनलों में से एक पर सिलिया की पहचान शुरू करें (उदाहरण के लिए, एसीआईआईआई; चित्रा 5A) एआई का उपयोग करना। सॉफ्टवेयर अब इस चैनल के लिए प्राप्त प्रशिक्षण के आधार पर ACIII लेबल Cilia पर बाइनरी आकर्षित करेगा । इस प्रक्रिया में कुछ सेकंड का समय लगेगा। ACIII > NIS.ai > Segment.ai > स्रोत चैनलों काचयन करें ।
  4. दूसरे चैनल पर प्रशिक्षित एआई चलाएं।
    1. दूसरे खोले गए चैनल पर सिलिया की पहचान शुरू करें (उदाहरण के लिए, MCHR1; चित्रा 5B) एआई का उपयोग करना। सॉफ्टवेयर अब इस चैनल के लिए प्राप्त प्रशिक्षण के आधार पर MCHR1 लेबल cilia पर बाइनरी आकर्षित करेगा । इस प्रक्रिया में कुछ पल लगेंगे। MCHR1 > NIS.ai > Segment.ai > स्रोत चैनलों काचयन करें ।
  5. गलत पहचान वाले बाइनरी के लिए छवियों की जांच करें।
    1. एक बार एअर इंडिया सिलिया की पहचान की है और बाइनरी खींचा, किसी भी गलत पहचान वस्तुओं के लिए छवियों की जांच करें । यदि आवश्यक हो तो किसी भी गलत पहचान वाले बाइनरी को मैन्युअल रूप से हटा दें। व्यू > एनालिसिस कंट्रोल्स > बाइनरी टूलबार > डिलीट ऑब्जेक्टका चयन करें।
  6. नई GA3 नुस्खा बनाएं।
    1. अब जब सिलिया की पहचान की गई है और खंडित किया गया है, तो GA3 टूल का उपयोग करके कोलोकैलाइजेशन विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें। यह केंद्र में एक खाली स्थान के साथ एक नई खिड़की खोलेगा जहां विश्लेषण को परिभाषित किया जाएगा। सभी पहचाने गए बाइनरी और चैनलों के साथ एक खिड़की उत्पन्न की जाएगी। सत्यापित करें कि विश्लेषण के लिए आवश्यक सभी वांछित चैनल और बाइनरी मौजूद हैं और उनका चयन किया गया है। नई GA3 नुस्खा > छविका चयन करें ।
  7. फ्रेम की सीमा को छूने वाली वस्तुओं को हटा दें।
    1. चूंकि एआई फ्रेम में सभी सिलिया जैसी वस्तुओं को खंडित करेगा, इसलिए यह फ्रेम के किनारों के साथ अपूर्ण सिलिया का भी पता लगाएगा। इन वस्तुओं को या तो चरण 5.5 में मैन्युअल रूप से हटाया जा सकता है या उन्हें GA3 में स्वचालित रूप से हटाया जा सकता है। बाइनरी प्रोसेसिंग का चयन करें > वस्तुओं को हटाएं > छूती सीमाएं।
  8. GA3 में कोलोकैलाइजेशन पाथवे की स्थापना करें।
    1. सिलिया के भीतर दो चैनलों के ओवरलैप को मापने के लिए, मांडर के गुणांक सहसंबंध का उपयोग करें। मैंडर्स गुणांक नोड को GA3 नुस्खा के खाली स्थान में खींचें और छोड़ दें और इसे उचित बाइनरी और चैनलों से कनेक्ट करें। यहां, 'कनेक्शन ए' एसीआईआईआई बाइनरी के भीतर एमसीएचआर 1 के ओवरलैप को निर्धारित करने के लिए एसीआईएचआर 1 चैनल के साथ एसीआईआईआई बाइनरी, 'कनेक्शन बी' और 'कनेक्शन सी' के साथ जोड़ता है। ऑब्जेक्ट रेशेमेट्री > मैंडर्स गुणांक > मापका चयन करें ।
      नोट: सॉफ्टवेयर इस प्रोटोकॉल40में वर्णित समान चरणों का उपयोग करके पियर्सन गुणांक सहसंबंध का उपयोग करके कोलोकैलाइजेशन को मापने की अनुमति देता है।
  9. माप को एक ही तालिका में संलग्न करें।
    1. सभी मापों को एक ही आउटपुट टेबल में मिलाएं। डेटा मैनेजमेंट > बेसिक > परिशिष्ट कॉलम का चयनकरें ।
  10. कोलोकैलाइजेशन को मापें।
    1. रन पर क्लिक करके सिलिया को मापें। इस प्रक्रिया को प्रायोगिक छवियों में सभी सिलिया को मापने के लिए कुछ क्षण लगते हैं। डेटा एक नई विश्लेषण परिणाम विंडो में दिखाई देगा।
  11. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए निर्यात डेटा।

Representative Results

सिलिया की पहचान करने के लिए प्रशिक्षण एअर इंडिया
सिलिया संरचनात्मक लंबाई और संरचना को मापने और उसका आकलन करना एक थकाऊ, समय लेने वाली और त्रुटि प्रवण प्रक्रिया हो सकती है। यहां, हम छवियों के एक बड़े पूल से सिलिया को सही ढंग से खंडित करने और विश्लेषण उपकरण(चित्र 1)के साथ उनकी लंबाई और तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए एआई का उपयोग करते हैं। सभी एआई दृष्टिकोणों को उनके कार्यान्वयन के लिए प्रशिक्षण चरणों की आवश्यकता होती है। हमने सिलिया को पहचानने के लिए एक प्रशिक्षण पाइपलाइन की स्थापना की, जिसे सिलियरी संरचनाओं पर मैन्युअल रूप से बाइनरी मास्क लगाने के द्वारा किया गया था। इस जानकारी का उपयोग तब लागू बाइनरी के तहत पिक्सेल विशेषताओं के आधार पर एआई को प्रशिक्षित करने के लिए किया जाता है। एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में, प्रशिक्षण में सॉफ्टवेयर शामिल है जो लगभग 1000 कई पुनरावृत्तियों से गुजर रहा है, और यदि प्रशिक्षण हानि या त्रुटि दर 1% से कम है तो इसे इष्टतम माना जाता है। हालांकि, प्रशिक्षण प्रक्रिया में पुनरावृत्तियों और त्रुटियों की संख्या प्रशिक्षण के लिए उपयोग की जाने वाली नमूना छवियों के आधार पर भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, इन विट्रो न्यूरोनल सिलिया छवियों का उपयोग करके हमारे प्रशिक्षण सत्रों के बाद, वीवो मस्तिष्क अनुभाग छवियों (पूरक चित्रा 1) में 3.36% की तुलना में त्रुटि दर1.378%थी। एक बार प्रशिक्षण पूरा हो जाने के बाद, एआई का उपयोग सेकंड के भीतर प्रायोगिक छवियों से सिलिया को खंडित करने के लिए किया जा सकता है और परिणामी बाइनरी मास्क का उपयोग संरचनात्मक मापदंडों को मापने के लिए किया जाता है। यह तीव्रता थ्रेसिंग की पारंपरिक विधि का उपयोग करके वस्तुओं को खंडित करने की आवश्यकता को समाप्त करता है जो उच्च पृष्ठभूमि शोर वाली छवियों में मुश्किल हो सकता है या जब वस्तुएं एक दूसरे के निकट होती हैं। एआई उपयोगकर्ता की परवाह किए बिना सभी छवियों में एक ही एल्गोरिदम लागू करके त्रुटि और पूर्वाग्रह की क्षमता को भी कम करता है।

GA3 का उपयोग करके सिलिया लंबाई को मापने
सिलिया की लंबाई कसकर विनियमित होती है और यह सिलियरी सिग्नलिंग16,19पर कार्यात्मक प्रभावों से जुड़ी होती है । यहां, हमने एनआईएस एलिमेंट्स सॉफ्टवेयर के भीतर एक विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग करके सिलिया लंबाई मापा जिसे जनरल एनालिसिस 3 या GA3 कहा जाता है। प्रत्येक प्रयोग के लिए अनुकूलित दिनचर्या बनाने के लिए एक ही कार्यप्रवाह में कई उपकरणों के संयोजन में GA3 एड्स। हम एक सेल लाइन में सिलिया लंबाई को मापने से शुरू हुआ । माउस इनर मेडुलरी पर सिलिया डक्ट (आईएमसीडी-3) कोशिकाओं को एसिटाइलेटेड ट्यूबुलिन के साथ इम्यूनोलेबेलेड किया गया था और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेज्ड किया गया था। हमने segment.ai(अनुपूरक चित्रा 3 ए)के साथ सेगमेंटिंग के बाद GA3 का उपयोग करके सिलिया लंबाई मापी। जबकि एसीटायलेटेड α-ट्यूबलिन को प्राथमिक सिलियम में अधिमानतः पाया जाता है, यह अन्य माइक्रोटबुले अमीर क्षेत्रों जैसे साइटोस्केलेटन के साथ-साथ साइटोकेनेटिक पुल में भी पाया जाता है। प्रशिक्षित एआई ने छवि में सिलिया की ठीक से पहचान की लेकिन अन्य गैर-सिलियरी, एसिटिलेटेड ट्यूबलिन सकारात्मक संरचनाओं को नहीं। आईएमसीडी कोशिकाओं पर सिलिया 0.5 माइक्रोन से लेकर 4.5 माइक्रोन तक 1.8 ± 0.04 माइक्रोन(चित्रा 2 ए)की औसत लंबाई के साथ था। हमने अगले प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों में सिलिया लंबाई को मापने के लिए एआई की क्षमता का परीक्षण किया। हमने 10 दिनों तक नवजात चूहों के हाइपोथैलेमस और हिप्पोकैम्पस से न्यूरॉन्स को सुसंस्कृत किया और उन्हें सिलिया मार्कर एडेनिलेट साइक्लेज़ III (एआईआईआईआई)21, 41के साथ जोड़ा। न्यूरोनल संस्कृतियों का विश्लेषण करते समय, हमने पाया कि लंबाई का सांख्यिकीय विश्लेषण करने से पहले एक फ़िल्टर लागू करना उपयोगी है। शोर अनुपात के लिए कम संकेत के कारण, 1 माइक्रोन से कम कई वस्तुओं की पहचान की गई थी जो सिलिया नहीं थीं। इसलिए, हमने यह सुनिश्चित करने के लिए कि केवल सिलिया का विश्लेषण किया गया था, लंबाई में 1 माइक्रोन से कम थी कि किसी भी वस्तु को खत्म करने के लिए डेटा फ़िल्टर किया। सुसंस्कृत हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स में, सिलिया की लंबाई 2 माइक्रोन से लेकर 7 माइक्रोन तक थी, जिसमें 3.8 ± 0.19 माइक्रोन(चित्रा 2B) कीऔसत लंबाई थी। दिलचस्प बात यह है कि सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल न्यूरोनल सिलिया 6.73 ±0.15μm(चित्रा 2C)की औसत लंबाई के साथ लंबे समय तक थे। यह सूचित किया गया है कि हाइपोथैलेमस के भीतर विभिन्न न्यूरोनल नाभिक अलग - अलग सिलिया लंबाई दिखाते हैं और ये सिलिया एक नाभिक विशिष्ट तरीके से शारीरिक परिवर्तन के प्रत्युत्तर में अपनी लंबाई बदल देते हैं19,23. इसलिए, हमने एसीआईआईआई के साथ वयस्क पुरुष C57BL/6J चूहों से हाइपोथैलेमिक मस्तिष्क वर्गों को भी लेबल किया और आर्क्यूएट न्यूक्लियस (एआरसी) और पैरावेंट्रिकुलर न्यूक्लियस (पीवीएन) को चित्रित किया। सिलिया लंबाई को मापने के लिए GA3 का उपयोग करना, हमने देखा कि वीवो हाइपोथैलेमिक सिलिया में विट्रो सिलिया की तुलना में अधिक समय तक दिखाई दिया। विशेष रूप से, वीवो में हाइपोथैलेमिक सिलिया 1 माइक्रोम से लगभग 15 माइक्रोम(चित्र 3)तक है। पीवीएन (5.54 ± 0.0.42 माइक्रोन) में सिलिया की लंबाई और एआरसी (6.16 ± 0.27 माइक्रोन)(चित्रा 3 सी)23में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। इसी तरह, हिप्पोकैम्पस के कॉर्नू अम्मोनिस (सीए1) क्षेत्र में सिलिया 5.28 ± 0.33 माइक्रोन(चित्रा 3)की औसत लंबाई के साथ 1 माइक्रोन से 10 माइक्रोन तक एक संकरा लंबाई सीमा प्रदर्शित करता है। पहले प्रकाशित अध्ययनों के अनुसार, एआई और GA3 उपकरणों का उपयोग करके हमारे विश्लेषण से पता चला है कि विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से सिलियालंबाई 19,23में विविधता दिखाता है। इसके अलावा, इस एआई दृष्टिकोण का उपयोग करके हम बड़ी संख्या में सिलिया का तेजी से आकलन करने में सक्षम हैं।

GA3 का उपयोग करके सिलिया संरचना को मापने
प्राथमिक सिलियम कई रास्तों के लिए एक संकेत केंद्र है जो विभिन्न प्रकार के प्रोटीन का उपयोग मोटर प्रोटीन, इंट्राफ्लैगलर परिवहन प्रोटीन और जीपीसीआर जैसे अनूठे कार्यों को पूरा करने के लिए कुछ3,24, 42,43का नाम देता है। सिलियम के भीतर इन प्रोटीन के उचित स्तर को बनाए रखना उचित कामकाज के लिए महत्वपूर्ण है और अक्सर सेल संदर्भ निर्भर दिखाई देता है। इन प्रोटीनों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग ने न केवल हमें उनकी कल्पना करने में सक्षम बनाया है बल्कि अपेक्षाकृत छोटे डिब्बे20के भीतर लेबल किए गए प्रोटीन की मात्रा के उपाय के रूप में उनकी तीव्रता को भी निर्धारित किया है । इसलिए, हमने वयस्क पुरुष चूहों24,44के हाइपोथैलेमस के एआरसी और पीवीएन दोनों में वीवो में एक सिलियरी जीपीसीआर, मेलेनिन ध्यान केंद्रित हार्मोन रिसेप्टर 1 (एमसीएचआर 1) की तीव्रता निर्धारित करने की मांग की। एआई और GA3 का उपयोग करके, हमने यह सुनिश्चित करने के लिए तीव्रता के साथ MCHR1 सकारात्मक सिलिया की लंबाई मापी, यह सुनिश्चित करने के लिए कि वस्तुओं की गिनती की जा रही है सिलिया(अनुपूरक चित्रा 3A)। हमने विश्लेषण के बाद की वस्तुओं को समाप्त कर दिया जो लंबाई में 2 माइक्रोन से कम थे और शेष बाइनरी मास्क की तीव्रता का विश्लेषण करते थे। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि पीवीएन में सिलियरी एमसीएचआर 1 की तीव्रता एआरसी की तुलना में काफी अधिक है जो पीवीएन(चित्रा 4)में सिलियरी एमसीएचआर 1 की मजबूत उपस्थिति का संकेत है। इन न्यूरोनल सर्किट में सिलियरी एमसीएचआर 1 के महत्व को निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता होती है। हमने हाइपोथैलेमस और हिप्पोकैम्पस के प्राथमिक सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में सिलियरी एमसीएचआर 1 की तीव्रता को भी मापा। दोनों संस्कृतियों से सिलिया एचएचआर 1 तीव्रता का एक विस्तृत वितरण प्रदर्शित करता है जो विषम न्यूरोनलआबादी (अनुपूरक चित्रा 2)की उपस्थिति का सुझाव देता है। इस प्रकार, एआई और GA3 जैसे परिष्कृत विश्लेषणात्मक उपकरणों का उपयोग करना एक ही ऊतक के भीतर या कई ऊतकों के बीच सिलिया विषमता के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। यह देखना दिलचस्प होगा कि क्या अन्य न्यूरोनल जीपीसीआर एक ही ऊतक के न्यूरॉन्स के भीतर अपने स्थानीयकरण में समान अंतर दिखाते हैं और यदि यह शारीरिक परिवर्तनों के जवाब में बदल जाता है।

कोलोकैलाइजेशन
जबकि एक पूर्ण छवि क्षेत्र के भीतर फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने प्रोटीन की छाप दे सकते हैं, यह स्थानिक वितरण या अंय आसपास के प्रोटीन और सेलुलर संरचनाओं के लिए निकटता के रूप में जानकारी प्रदान करने में विफल रहता है । यहां, हमने प्रत्येक बाइनरी मास्क(चित्रा 5)के लिए एसीआईआईआई के खिलाफ एमसीएचआर 1 की तीव्रता की साजिश रचकर एक सिलिया मार्कर के रूप में ACIII के साथ MCHR1 के ओवरलैप को मापा। ग्राफ से पता चलता है कि सिलिया के बहुमत दोनों, ACIII और MCHR1 के लिए सकारात्मक हैं, हालांकि कुछ सिलिया दूसरे पर एक चैनल की मजबूत अभिव्यक्ति दिखाते हैं । इसके अलावा, कुछ सिलिया हैं जो या तो एसीआईआईआई या एमसीएचआर 1 की उपस्थिति दिखाते हैं जैसा कि क्रमशः एक्स-एक्सिस और वाई-एक्सिस पर सीधे झूठ बोलने वाले बिंदुओं से स्पष्ट है। इस ओवरलैप की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमने मंडेर के ओवरलैप गुणांक को मापा और एआरसी और पीवीएन40के न्यूरोनल सिलिया में एमसीएचआर 1 अभिव्यक्ति की सीमा की तुलना की। दिलचस्प बात यह है कि हमारे विश्लेषण से पता चला है कि एआरसी (0.5430 ± 0.0181)(चित्रा 5C)की तुलना में पीवीएन (0.6382 ± 0.0151) के गुणांकों में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी। यह हमारे पिछले डेटा के अनुरूप है जहां हमने एआरसी(चित्र 4)की तुलना में पीवीएन में उच्च MCHR1 तीव्रता देखी। इस डेटा से पता चलता है कि सिलिया लंबाई की तरह, सिलियरी डिब्बे में MCHR1 का अभिव्यक्ति पैटर्न मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में भिन्न होता है। इसी विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग करके, यह निर्धारित करना संभव होगा कि क्या अन्य सिलियरी जीपीसीआर जैसे न्यूरोपेप्टाइड वाई रिसेप्टर टाइप 2 (NPY2R) और सोमाटोस्टैटिन रिसेप्टर टाइप 3 (SSTR3) विविधता की समान मात्रा दिखाते हैं ।

सिलियम के साथ तीव्रता प्रोफ़ाइल मापने
एक बार सिलिया segment.ai का उपयोग कर पहचान की गई है, GA3 नुस्खा छवि में ब्याज की अन्य संरचनाओं की पहचान के साथ सिलिया विश्लेषण गठबंधन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बेसल बॉडी मार्कर के साथ लेबलिंग सिलिया ध्रुवीयता की पहचान के लिए उपयोगी है। इस विश्लेषण करने के लिए, हमने पी0 चूहों से हाइपोथैलेमिक मस्तिष्क वर्गों को चित्रित किया जो ARL13B-mCherry और Centrin2-GFP व्यक्त करते हैं और एआरसी और पीवीएन34को चित्रित करते हैं। यहां, सिलिया पहले की तरह एअर इंडिया का उपयोग कर की पहचान की थी, लेकिन अब संशोधित GA3 नुस्खा Centrin2-GFP, एक सेंट्रियालर प्रोटीन सिलिया(अनुपूरक चित्रा 3B)के आधार पर पाया की पहचान भी शामिल है । Centrin2-GFP लेबलिंग करके, सिलिया के आधार ARL13B-mCherry सकारात्मक cilia(चित्रा 6A)के सुझावों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । फिर, पूरे सिलिया के भीतर तीव्रता को मापने के बजाय, हम सिलिया(चित्रा 6B)की लंबाई के साथ ARL13B तीव्रता में परिवर्तन को मापने में सक्षम हैं । हम सिलिया के समीपस्थ सिरों और डिस्टल सिरों के बीच ARL13B की तीव्रता में अंतर की तुलना भी कर सकते हैं। ऐसा करने के लिए, हमने बेस से शुरू होने वाले 1-माइक्रोन डिब्बे में सिलियम की लंबाई को विभाजित किया और पहले माइक्रोन बिन को समीपस्थ अंत और अंतिम माइक्रोन बिन को डिस्टल एंड के रूप में नामित किया। हमारे विश्लेषण से पता चला है कि एआरसी और पीवीएन दोनों में सिलियम की नोक की तुलना में आधार के करीब काफी अधिक ARL13B मौजूद है, और यह मानव chondrocytes45 (चित्रा 6C)में पहले प्रकाशित अध्ययनों के अनुरूप है। इस प्रकार के विश्लेषण में, विश्लेषण से छोटे गैर-सिलियरी वस्तुओं को बाहर करने के लिए लंबाई फिल्टर लगाने के बजाय, केवल Centrin2-GFP लेबलिंग से जुड़े सिलिया का विश्लेषण किया जाता है। यह उन स्थितियों में लाभप्रद हो सकता है जहां आनुवंशिक उत्परिवर्तन बहुत कम सिलिया प्रदान करते हैं, या यदि संक्रमण क्षेत्र या टिप जैसे सिलिया उपडोमेन में परिवर्तन को फंसाया गया है। एआई और GA3 विश्लेषण का उपयोग करके सिलिया की पहचान अत्यधिक अनुकूलनीय है और इसे विभिन्न प्रकार के जटिल शोध प्रश्नों को फिट करने के लिए तैयार किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1। एआई का उपयोग करके सिलिया की लंबाई और तीव्रता को मापने के लिए कार्यप्रवाह। (क)एआई को प्रशिक्षित करने के लिए, बाइनरीज कच्चे प्रशिक्षण छवियों पर ब्याज की वस्तुओं (सिलिया) के आसपास तैयार किए जाते हैं । तैयार बाइनरी का उपयोग करके, सेगमेंट एआई को सिलिया के आकार और पिक्सेल तीव्रता को पहचानने के लिए प्रशिक्षित किया जाता है। (ख)नेक्स्ट, प्रशिक्षित सेगमेंट एआई को कच्चे प्रायोगिक छवियों पर लागू किया जाता है। यह उन वस्तुओं पर बाइनरी खींचता है जो इसे सिलिया के रूप में पहचानती हैं। इन बाइनरी को यह सुनिश्चित करने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है कि सभी और केवल सिलिया का विश्लेषण किया जा रहा है। (ग)एआई द्वारा मान्यता प्राप्त वस्तुओं की तीव्रता और लंबाई का विश्लेषण करने के लिए एक GA3 कार्यक्रम का निर्माण किया गया है । (घ)रिकॉर्ड सॉफ्टवेयर में एक मेज में आयात कर रहे हैं । इसके बाद इस तालिका को आगे के विश्लेषण के लिए निर्यात किया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। इन विट्रो सिलिया लंबाई माप। में सिलिया के प्रतिनिधि छवियां (ए)आईएमसीडी कोशिकाओं (हरी, एसीटिलेटेड ट्यूबुलिन)(बी)प्राथमिक हाइपोथैलेमिक संस्कृतियों (ग्रीन, एआईआई) और(सी)हिप्पोकैम्पल संस्कृतियों (ग्रीन, एआईआईआईआई)। बाइनरी मास्क (मजेंटा) में दिखाए गए सिलिया को पहचानने के लिए एक प्रशिक्षित एआई का उपयोग किया गया था और फिर सीलिया लंबाई को मापने के लिए GA3 का उपयोग किया गया था। सिलिया लंबाई का वितरण 0.5 या 1.0-माइक्रोन डिब्बे में सिलिया के प्रतिशत के रूप में रीढ़ की जाती है। * साइटोकाइनेटिक पुल को एआई द्वारा ठीक से मान्यता प्राप्त नहीं इंगित करता है। n = 225 सिलिया आईएमसीडी कोशिकाओं में 3 प्रतिकृति से, हाइपोथैलेमिक में 54 सिलिया और 3 जानवरों से हिप्पोकैम्पल संस्कृतियों में 139 सिलिया। स्केल सलाखों के 10 μm . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। वीवो सिलिया लंबाई माप में। (A)वयस्क माउस मस्तिष्क वर्गों के एआरसी, पीवीएन और सीए1 में सिलिया (ग्रीन, एसीआईआईआई) की प्रतिनिधि छवियां। (ख)एनआईएस एलिमेंट्स में एक प्रशिक्षित एआई का इस्तेमाल बाइनरी मास्क (मजेंटा) में दिखाए गए सिलिया को पहचानने के लिए किया गया था और फिर सीलिया लंबाई को मापने के लिए GA3 का इस्तेमाल किया गया था । (ग)सिलिया लंबाई का वितरण एक माइक्रोन डिब्बे में सिलिया के प्रतिशत के रूप में रीढ़ की जाती है । n = एआरसी में 68 सिलिया, पीवीएन में 36 और सीए1 में 3 जानवरों से 29। स्केल सलाखों के 10 μm . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। एआई ने हाइपोथैलेमिक न्यूरोनल सिलिया के सिलिया स्टेनिंग तीव्रता माप की सहायता की। (A)वयस्क माउस मस्तिष्क वर्गों के एआरसी और पीवीएन में सिलिया (MCHR1, लाल) की प्रतिनिधि छवियां। एनआईएस तत्वों में एक प्रशिक्षित एआई का उपयोग बाइनरी मास्क (सियान) में दिखाए गए सिलिया को पहचानने के लिए किया गया था और फिर GA3 का उपयोग सिलिया में MCHR1 धुंधला की तीव्रता को मापने के लिए किया गया था। (ख)MCHR1 तीव्रता ईई.M के ± औसत के रूप में रेखांकन कर रहे हैं । प्रत्येक डॉट एक सिलियम का प्रतिनिधित्व करता है। * पी < ०.०५, छात्र टी-टेस्ट । (ग)एमसीएचआर 1 तीव्रता का वितरण 0.2 x 10 7 मनमानेढंग से इकाइयों (ए यू) के डिब्बे में सिलिया के प्रतिशत के रूप में रीढ़ की जाती है। n = एआरसी में 53 सिलिया, 3 जानवरों से पीवीएन में 78। स्केल सलाखों के 10 μm . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। एआई असिस्टेड सिलिया कोलोकैलाइजेशन एनालिसिस। (ए, बी) एआरसी और पीवीएन में क्रमशः सिलिया की प्रतिनिधि छवियां। सिलिया को एसीआईआईआई (ग्रीन) और एमसीएचआर 1 (लाल) के साथ लेबल किया गया है। एनआईएस एलिमेंट्स में एक प्रशिक्षित एआई का उपयोग बाइनरी मास्क (एसीआईआईआई लेबल वाले सिलिया के लिए मैजेंटा, MCHR1 लेबल वाले सिलिया के लिए सियान) में दिखाए गए सिलिया को पहचानने के लिए किया गया था। GA3 का उपयोग सिलिया को पहचानने के लिए किया गया था जिसमें एसीआईआईआई और एमसीएचआर 1 दोनों शामिल थे। (ग)मैंडर्स ओवरलैप गुणांक (एमओसी) मूल्यों को ईई.M ± औसत के रूप में रेखांकन किया जाता है । प्रत्येक डॉट एक सिलियम का प्रतिनिधित्व करता है। * पी < ०.०५, छात्र टी-टेस्ट । (घ)एआरसी और पीवीएन में MCHR1 तीव्रता बनाम ACIII तीव्रता का स्कैटर प्लॉट । प्रत्येक डॉट एक सिलियम का प्रतिनिधित्व करता है। n = एआरसी में 72 सिलिया, 3 जानवरों से पीवीएन में 47। स्केल सलाखों के 10 μm . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6। सिलिया और बेसल बॉडी एनालिसिस। (A)पी0 चूहों के एआरसी और पीवीएन में सिलिया (लाल, ARL13B-mCherry) और बेसल बॉडी मार्कर (ग्रीन, Centrin2-GFP) की प्रतिनिधि छवियां । बाइनरी मास्क (सियान) में दिखाए गए सिलिया को पहचानने के लिए एक प्रशिक्षित एआई का उपयोग किया गया था। बेसल बॉडी (मैजेंटा) के लिए बाइनरी मास्क GA3 नुस्खा में थ्रेसिंग द्वारा खींचा गया था। (ख)प्रतिनिधि रेखा एक सिलियम की तीव्रता को स्कैन करें । (ग)एआई के समीपस्थ और डिस्टल सिरों पर ARL13B तीव्रता की पहचान सीलिया को ई-.M ± औसत के रूप में किया जाता है । समीपस्थ और डिस्टल समाप्त होता है पहले 1 माइक्रोन लंबाई और पिछले 1 माइक्रोन लंबाई के भीतर क्षेत्र के रूप में क्रमशः सिलियम के आधार से परिभाषित कर रहे हैं । प्रत्येक डॉट एक सिलियम का प्रतिनिधित्व करता है। * पी < 0.05. n = 3 जानवरों से 2 जानवरों से एआरसी में 6 सिलिया और पीवीएन में 21 सिलिया। स्केल सलाखों के 10 μm . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 1। एआई प्रशिक्षण हानि रेखांकन। (ए, बी)रेखांकन क्रमशः न्यूरोनल सिलिया इन विट्रो और वीवो में segment.ai के प्रशिक्षण हानि दिखाते हैं । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 2। ऐ असिस्टेड सिलिया इन विट्रो न्यूरोनल सिलियाकी तीव्रता माप । (ए, बी) प्राथमिक हाइपोथैलेमिक और हिप्पोकैम्पल संस्कृतियों में सिलिया (MCHR1, लाल) की प्रतिनिधि छवियां क्रमशः। एनआईएस तत्वों में एक प्रशिक्षित एआई का उपयोग बाइनरी मास्क (सियान) में दिखाए गए सिलिया को पहचानने के लिए किया गया था और फिर GA3 का उपयोग सिलिया में MCHR1 धुंधला की तीव्रता को मापने के लिए किया गया था। MCHR1 तीव्रता का वितरण हाइपोथैलेमिक के लिए 1000 ए यू डिब्बे में सिलिया के प्रतिशत के रूप में ग्राफ किया जाता है और हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों के लिए 2000 ए यू बिन। n = हाइपोथैलेमिक में 30 सिलिया और 3 जानवरों से हिप्पोकैम्पल संस्कृतियों में 106 सिलिया। स्केल बार 10 माइक्रोन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 3। सामान्य विश्लेषण सिलिया विश्लेषण के लिए 3 व्यंजनों। (A)सिलिया लंबाई, तीव्रता और मंडेर के गुणांक की माप के लिए सरल सामान्य विश्लेषण (GA3) नुस्खा । (ख)बेसल शरीर के लिए एक मार्कर का उपयोग कर सिलियम की लंबाई के साथ तीव्रता की माप के लिए जटिल GA3 नुस्खा । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

लंबाई और तीव्रता माप सामान्य तरीके प्राथमिक सिलिया का विश्लेषण किया जाता है, हालांकि, क्षेत्र में उपयोग की जाने वाली एक मानकीकृत पारंपरिक विधि नहीं है। इमेजजे जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्राथमिक सिलिया की पहचान और मात्राकरण समय लेने वाला है और उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह और त्रुटि से ग्रस्त है। इससे बड़े डेटा सेट का सही विश्लेषण करना मुश्किल हो जाता है। यहां हम बताते हैं कि एआई कार्यक्रम का उपयोग करने से प्राथमिक सिलिया प्राप्त होने वाले उच्च थ्रूपुट विश्लेषण करने वाली इन चुनौतियों में से कई पर काबू पा सकते हैं। इसके साथ हम प्राथमिक सिलिया को पहचानने और लंबाई और तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक चरणों की रूपरेखा तैयार करने के लिए एआई-आधारित आवेदन को प्रशिक्षित करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।

जबकि सिलिया को पहचानने के लिए एआई के प्रारंभिक प्रशिक्षण के लिए उपयोगकर्ता से महत्वपूर्ण समय की आवश्यकता होती है, एक बार पूरा होने के बाद इसे एक ही मापदंडों के साथ प्राप्त किसी भी डेटा सेट पर उपयोग किया जा सकता है। एआई द्वारा उत्पन्न बाइनरी मास्क इस तरह संशोधित किया जा सकता है कि किसी भी त्रुटि को ठीक किया जा सकता है। हालांकि, सिलिया पहचान में त्रुटियों उपयोगकर्ता संकेत देना चाहिए कि एअर इंडिया के लिए आगे अतिरिक्त छवियों के साथ प्रशिक्षित करने की जरूरत है । इस विधि का एक प्रमुख लाभ यह है कि एआई को 2डी और 3डी दोनों में विभिन्न नमूना प्रकारों में सिलिया को पहचानने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है। प्रयोगशालाओं के भीतर उत्पन्न पिछले विश्लेषण विधियों में विभिन्न सीमाएं होती हैं जिनमें पहचान के लिए मैन्युअल थ्रेसहोल्डिंग की आवश्यकता होती है और ऊतक वर्गों से चित्रित सिलिया की पहचान करने वाली समस्याओं को जहां कोशिका घनत्व उच्च36,46,47है । ये विधियां सिलिया विश्लेषण के लिए भी विशेष हैं जबकि एनआईएस एलिमेंट्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण छवियों के कई पहलुओं का मूल्यांकन एक साथ कर सकता है। क्योंकि यहां वर्णित एआई एनआईएस एलिमेंट्स सॉफ्टवेयर पैकेज का हिस्सा है, निकॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त छवियों को विश्लेषण के माध्यम से आसानी से जारी रखा जा सकता है। हालांकि, इस विधि के उपयोग के लिए निकॉन के साथ इमेजिंग की आवश्यकता नहीं है। कैप्चर किए गए कच्चे डेटा फ़ाइल प्रारूप के बावजूद, एआई में उपयोग करने के लिए एनआईएस एलिमेंट्स द्वारा ".tif" फ़ाइलें खोली जा सकती हैं।

एनआईएस तत्वों के भीतर यह एआई एप्लिकेशन व्यापक रूप से उपलब्ध है और संभवतः प्राथमिक सिलिया का अध्ययन करने वाली प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का हिस्सा है। एआई प्रौद्योगिकी विस्तार की व्यापकता के साथ, अन्य इमेजिंग सॉफ्टवेयर समान एआई मॉड्यूल को शामिल करने के लिए अपने विश्लेषण विकल्पों का विस्तार कर सकते हैं। सिलिया पहचान के लिए एआई विश्लेषण लागू करने का उपयोग सिलिया विश्लेषण के कई अलग-अलग पहलुओं के लिए किया जा सकता है। जब हमने कुछ सरल विश्लेषणों जैसे लंबाई के लिए तरीके बताए जैसेकि चित्र 2 और 3, तीव्रता(चित्र 4)और कोलोकैलाइजेशन(चित्र 5)अधिक परिष्कृत विश्लेषण को चित्र 6के रूप में GA3 विश्लेषण कार्यप्रवाह में जोड़ा जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक पूर्ण सिलियम की तीव्रता को मापने के बजाय, एक सिलियम के उप-क्षेत्र के भीतर तीव्रता में अंतर उप-सिलियरी स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए रुचि हो सकती है। एक सिलियम के एक उपक्षेत्र के भीतर तीव्रता में अंतर संकेत दे सकता है प्रोटीन टिप या सिलियम के आधार पर जमते है, जैसे कैसे Gli प्रोटीन सिलिया४८की नोक पर समृद्ध कर रहे हैं । इसके अलावा, इस एआई एप्लिकेशन का उपयोग जीनोटाइप या उपचार समूहों के बीच मतभेदों को आसानी से पहचानने के लिए किया जा सकता है। जबकि हमारी प्रयोगशाला मुख्य रूप से मस्तिष्क वर्गों या न्यूरोनल संस्कृतियों से चित्रित सिलिया का विश्लेषण करने के लिए इस विधि का उपयोग करती है, इसे विभिन्न सेल लाइनों या अन्य ऊतक प्रकारों से प्राप्त छवियों पर लागू किया जा सकता है। नमूना प्रकार का लचीलापन है कि इस आवेदन पर इस्तेमाल किया जा सकता है विश्लेषण की इस विधि कई अलग प्राथमिक सिलिया या किसी भी असतत ऑर्गेनेल है कि इस तरह के माइटोकॉन्ड्रिया, नाभिक, या ईआर के रूप में मूल्यांकन किया जा रहा है अध्ययन समूहों के लिए मूल्यवान बनाता है ।

Disclosures

सह लेखक वेस्ले लुईस निकॉन के कर्मचारी हैं । कोई वित्तीय खुलासे नहीं हुए हैं।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों R01 DK114008 द्वारा एनएफबी और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन फैलोशिप ग्रांट #18PRE34020122 आरबी को वित्त पोषित किया गया था । हम पांडुलिपि पर व्यावहारिक टिप्पणियों के लिए निकॉन सॉफ्टवेयर, मेलिसा बेंटले, कोर्टनी हेक्राफ्ट और टेरेसा मास्ट्रेसी के रिच ग्रुस्किन महाप्रबंधक को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM Intel Corporation W-2123 Processor used for running NIS Elements.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Inc. - Ai and GA3 software
Quadro RTX 4000 Graphics card NVIDIA Corporation Quadro RTX 4000
Windows 10 Professional 64-bit Microsoft Inc. - Operating system used for running NIS Elements
Workstation HP Development Company, L.P. HP Z4G4 Workstation used for running NIS Elements

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जीव विज्ञान अंक 171
प्राथमिक Cilia का आकलन करने के लिए आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस दृष्टिकोण
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Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T.… More

Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T. K., Brewer, K. M., Lewis, W. R., Berbari, N. F. Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia. J. Vis. Exp. (171), e62521, doi:10.3791/62521 (2021).

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