Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kunstig intelligens tilgange til vurdering af primære cilier

Published: May 1, 2021 doi: 10.3791/62521
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 2Nikon Instruments Inc., 3Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University, 4Center for Diabetes and Metabolic Diseases, Indiana University School of Medicine

Summary

Brugen af kunstig intelligens (Ai) til at analysere billeder er ved at opstå som en kraftfuld, mindre forudindtaget og hurtig tilgang sammenlignet med almindeligt anvendte metoder. Her trænede vi Ai til at genkende en cellulær organelle, primær cilier, og analysere egenskaber som længde og farvning intensitet i en streng og reproducerbar måde.

Abstract

Cilia er mikrotubule baseret cellulære vedhæng, der fungerer som signalering centre for en mangfoldighed af signalering veje i mange pattedyr celletyper. Cilia længde er meget bevaret, stramt reguleret, og varierer mellem forskellige celletyper og væv og har været involveret i direkte at påvirke deres signalkapacitet. For eksempel har cilia vist sig at ændre deres længder som reaktion på aktivering af ciliary G protein-koblede receptorer. Men nøjagtigt og reproducerbar måling af længden af talrige cilier er en tidskrævende og arbejdskrævende procedure. Nuværende tilgange er også fejl og bias tilbøjelige. Kunstig intelligens (Ai) programmer kan udnyttes til at overvinde mange af disse udfordringer på grund af kapaciteter, der tillader assimilering, manipulation og optimering af omfattende datasæt. Her viser vi, at et Ai-modul kan trænes til at genkende cilier i billeder fra både in vivo- og in vitro-prøver. Efter at have brugt den uddannede Ai til at identificere cilier, er vi i stand til at designe og hurtigt udnytte applikationer, der analyserer hundredvis af cilier i en enkelt prøve for længde, fluorescensintensitet og co-lokalisering. Denne upartiske tilgang øgede vores tillid og stringens, når vi sammenligner prøver fra forskellige primære neuronale preps in vitro såvel som på tværs af forskellige hjerneområder inden for et dyr og mellem dyr. Desuden kan denne teknik bruges til pålideligt at analysere cilia dynamik fra enhver celletype og væv i en high-throughput måde på tværs af flere prøver og behandlingsgrupper. I sidste ende vil Ai-baserede tilgange sandsynligvis blive standard, da de fleste områder bevæger sig i retning af mindre partiske og mere reproducerbare tilgange til billedopsamling og -analyse.

Introduction

Primære cilia er sensoriske organeller, der stikker ud fra de fleste pattedyrscelletyper1,2,3,4. De er generelt ensomme vedhæng, der er afgørende for koordinering af forskellige cellesignaleringsveje ved at integrere ekstracellulære signaler5,6,7. Primær cilier spiller vigtige roller under embryonal udvikling og voksen væv homøostase, og afbrydelse af deres funktion eller morfologi er forbundet med flere genetiske lidelser, som kollektivt kaldes ciliopatier. På grund af cilias næsten allestedsnærværende karakter er ciliopatier forbundet med en bred vifte af kliniske funktioner, der kan påvirke alle organsystemer8,9,10,11,12. I dyremodeller af ciliopatier manifesterer tab af ciliary-struktur eller signalkapacitet sig i flere klinisk relevante fænotyper, herunder hyperfagirelateret fedme3,13,14,15. I mange modelsystemer har ændringer i cilierlængden vist sig at påvirke deres signalkapacitet og funktioner16,17,18,19. Der er dog flere tidskrævende og tekniske udfordringer forbundet med nøjagtigt og reproducerbar vurdering af cilier længde og sammensætning.

Det voksne pattedyrs centralnervesystem (CNS) er en biologisk kontekst, der har udgjort en udfordring for at forstå cilia morfologi og funktion. Mens det ser ud til, at neuroner og celler i hele CNS besidder cilier, på grund af de begrænsede værktøjer og evner til at observere og analysere disse cilier en forståelse af deres funktioner forbliver undvigende20. For eksempel, den prototypiske cilia markør, acetyleret α-tubulin, ikke mærke neuronal cilia20. Vanskeligheden ved at studere disse cilier blev delvist løst med opdagelsen af flere G protein-koblede receptorer (GPCR), signalmaskiner og membran tilknyttede proteiner, der er beriget på membranen af neuronal cilia21,22. Alle disse enkle grundlæggende observationer antyder vigtigheden og mangfoldigheden af CNS-cilier, som hidtil synes uden sidestykke af andre væv. For eksempel kan variation i cilier længde og GPCR lokalisering observeres i hele hjernen, med længder i visse neuronale kerner er forskellige sammenlignet med andre kerner19,23. Tilsvarende viser deres GPCR-indhold og signalmaskiner kompliment mangfoldighed baseret på neuroanatomisk placering og neuronal type2,24,25,26,27,28,29. Disse enkle observationer viser, at pattedyr CNS cilia længde og sammensætning er stramt reguleret, ligesom i model organismer, som Chlamydomonas reinhardtii, men virkningen af disse længde forskelle på cilier funktion, signalering og i sidste ende adfærd er fortsat uklart16,30,31,32.

Nøjagtig måling af cilia længde og sammensætning viser sig at være en teknisk udfordring tilbøjelige til brugerfejl og uigenkaldelighed. I øjeblikket cilier in vivo og in vitro er oftest identificeret ved hjælp af immunofluorescent tilgange, mærkning ciliary proteiner eller cilia-beriget fluorescerende reporter alleler33,34,35. Længden af disse fluorescerende mærkede cilier måles derefter fra et 2-dimensionelt (2D) billede ved hjælp af linjemålingsværktøjer i billedanalyseprogrammer som ImageJ36. Denne proces er ikke kun kedelig og arbejdskrævende, men også tilbøjelig til bias og fejl. De samme forhindringer opstår ved måling af cilia intensiteter, som hjælper med at indikere ændringer i cilier struktur37. For at minimere uoverensstemmelserne i disse typer billedanalyser bliver programmer til kunstig intelligens (Ai) mere udbredte og overkommelige muligheder38.

Ai er udviklingen af computersystemer, der bruger fordelen ved computeralgoritmer og programmering til at udføre opgaver, der normalt ville kræve menneskelig intelligens39. Ai-enheder lærer at opfatte tilbagevendende mønstre, parametre og egenskaber og træffe foranstaltninger for at maksimere oddsene for at skabe vellykkede resultater. Ai er alsidig og kan trænes til at genkende specifikke objekter eller strukturer af interesse, såsom cilier, og derefter programmeres til at køre en række analyser på de identificerede objekter. Derfor kan komplekse billeddata hurtigt og reproducerbar genereres af Ai38. Automatisering og Ai-analyse af optagne billeder vil øge effektiviteten og samtidig begrænse eventuelle menneskelige fejl og bias39. Etablering af en Ai-baseret metode til cilia-identifikation skaber en ensartet måde for alle forskergrupper at analysere og fortolke cilia-data på.

Her bruger vi et Ai-modul til at identificere cilier både in vivo og in vitro på 2D-billeder. Ved hjælp af et sæt prøvebilleder trænes Ai'en til at identificere cilier. Når træningen er færdig, bruges den udpegede Ai til at anvende en binær maske over Ai-identificeret cilier i et billede. De binære filer, der anvendes af Ai er modificerbare, hvis det er nødvendigt, for at sikre, at alle cilier i billederne er korrekt identificeret og ikke-specifik identifikation er elimineret. Efter at have udnyttet Ai til at identificere cilier, specialbygget generelle analyse (GA) programmer bruges til at udføre forskellige analyser såsom måling cilier længde og fluorescens intensitet. De indsamlede data eksporteres til en tabel, der let kan læses, fortolkes og bruges til statistiske analyser (Figur 1). Brugen af automatiseret teknologi og Ai til at identificere cilier og opnå specifikke målinger mellem eksperimentelle grupper vil støtte i fremtidige undersøgelser med henblik på at forstå virkningen af CNS cilia funktion og morfologi på celle-celle kommunikation og adfærd.

Protocol

1. Erhverve rå billeder

  1. Fix og immunlabel prøver efter behov20.
    1. Billede cilia ved hjælp af en konfokal mikroskop på maksimal bit dybde ved hjælp af den samme pixel størrelse med Nyquist opløsning.
    2. Eksporter billeder som .tif-filer (monokromt billedformat).
      BEMÆRK: Denne protokol skitserer, hvordan du bruger Ai-modulet specifikt i NIS Elements-software. Hvis billeder blev anskaffet som .nd2-filer, er det ikke nødvendigt at eksportere billeder som .tif filer, og brugeren kan gå direkte til trin 2.3. Hvis billeder blev anskaffet på et andet system, kan en NIS Elements-licens købes separat, og .tif filer kan konverteres som beskrevet i de næste trin.

2. Træn Ai for at identificere cilier

  1. Åbn træningsdatasættet.
    1. Vælg ca. 50 eksempelbilleder med mindst étcilium pr. ramme for at træne softwaren og kopiere dem i en enkelt mappe. Denne mappe bruges til at styre softwaren, når du åbner billederne. Åbn disse 50 rammer i et enkelt ND2-dokument med mindst étcilium pr. billede. Vælg Fil > Importer/eksporter > Opret ND-fil fra filsekvens.
    2. Vælg den mappe, der indeholder træningsdatasættet. Dette åbner listen over filer i midten af dialogvinduet. Definer manuelt organiseringen af filerne ved hjælp af mindst én indstilling i rullemenuen ovenfor. Indstillingerne er multipoint (for flere maksimale projektion filer), Z-serien (for en z stack billede), tid (for en time-lapse billede), og bølgelængde (for filer fra flere kanaler).
    3. Angiv de tilsvarende numeriske værdier under hver valgt indstilling. Vælg Ingen, hvor indstillingerne ikke er markeret. Klik på Konverter for at åbne ND-dokumentet.
  2. Kalibrer billeder.
    1. Angiv pixelstørrelsen i nederste venstre hjørne af billedet: Højreklik på Ikke-kalibreret > Kalibrer dokument > Pixelstørrelse.
  3. Identificer cilier.
    1. Håndidentificer cilieren ved præcist at spore individuelle ciliarystrukturer på alle de åbnede rammer ved hjælp af enten AutoDetect eller Draw Object på den binære værktøjslinje. Dette vil trække binære masker på objekter af interesse. Disse binære filer vil tjene som eksempelobjekter til træning af softwaren til at identificere cilier om pixelbaserede egenskaber i fremtidig eksperimentel billedanalyse. Vælg Vis > analysekontrolelementer > binær værktøjslinje > tegneobjekt.
      BEMÆRK: Fjern enhver ramme, der ikke har nogen binære filer, da softwaren ikke vil begynde at træne, medmindre den er i stand til at registrere binære filer på alle de åbnede rammer.
  4. Træn ai.
    1. Begynd at træne softwaren. Dette vil åbne toget Segment.ai boks. Vælg NIS.ai > Train Segment.ai.
    2. Vælg den kildekanal, der skal bruges til træning, i feltet Tog Segment.ai. Hvis filer fra flere kanaler er åbne, skal du kun vælge én kanal som kildekanal. Vælg derefter de relevante jord sandhed binære filer til at træne Ai. Endelig vælge antallet af iterationer er nødvendige for at træne Ai afhængigt af størrelsen og fordelingen af binære filer.
      BEMÆRK: Hvis binære filer let kan detekteres fra omgivelserne og er godt fordelt i hele billedet, kan softwaren have brug for mindre end 1000 gentagelser for at blive uddannet til at identificere billederne. Hvis billederne har et lavt signal-til-støj-forhold, er det ideelt at køre mindst 1000 gentagelser under træning for at gøre det muligt for Ai at identificere cilier i testprøver med høj tillid.
    3. Vælg destinationsmappen for at gemme den uddannede Ai-fil (.sai), og klik på Træn for at træne softwaren. Softwaren vil nu fortsætte med at træne sig selv for at identificere cilier baseret på de sporede binære filer. Denne proces tager flere timer.
      BEMÆRK: Når du træner, viser softwaren en graf, der viser træningstab. Grafen vil i første omgang vise en spike før tilspidsning til ideelt omkring 1% tab, hvor det plateauer for resten af uddannelsen. Gem grafen som fremtidig reference ved at markere afkrydsningsfeltet Gem graf screenshot på toget Segment.ai boksen (Supplerende figur 1).
    4. Hvis yderligere raffinement til uddannelsen er påkrævet, derefter fortsætte uddannelsen på samme datasæt. Alternativt kan du træne på et nyt datasæt med nøjagtig de samme parametre. Det er ikke tilrådeligt at træne en allerede uddannet Ai på et nyt datasæt med forskellige parametre eller forskellige genstande af interesse. Vælg Segment.ai > Fortsæt træningen på > Vælg uddannet ai-fil.

3. Identificer cilier ved hjælp af uddannet Ai

  1. Åbn det eksperimentelle datasæt.
    1. Åbn de eksperimentelle confocal billeder af cilier i softwaren ved at konvertere prøven .tif filer til .nd2 filer, svarende til trin 2.1. Vælg Fil > Importer/eksporter > Opret ND-fil fra filsekvens.
      BEMÆRK: Billederne skal være af samme pixelstørrelse som dem, der bruges til træning af Ai. Hvis billederne allerede er i ND2-format, skal du gå til trin 3.3.
  2. Kalibrer billeder.
    1. Angiv pixelstørrelsen i nederste venstre hjørne af billedet. Højreklik på Ikke-kalibreret > Kalibrer dokument > pixelstørrelse.
  3. Kør den trænede Ai på de åbnede filer.
    1. Begynd at identificere cilier ved hjælp af Ai. Softwaren vil nu trække binære filer på cilier baseret på den uddannelse, den modtog i det foregående trin. Denne proces vil tage et par sekunder. Vælg NIS.ai > Segment.ai.
      BEMÆRK: Softwaren vil bede om at vælge kanalen, hvis flere kanaler er åbne. Kanaler er opført ved deres respektive navne her. Hvis ikke, markeres feltet med navnet 'Mono' automatisk.
  4. Tjek billeder for fejlidentificerede binære filer.
    1. Når Ai har identificeret cilier og tegnede binære filer, skal du kontrollere billederne for eventuelle fejlagtigt identificerede objekter. Hvis det ønskes, skal du manuelt slette fejlidentificerede binære filer. Vælg Vis > analysekontrolelementer > binær værktøjslinje > Slet objekt.

4. Måling af cilier længde og intensitet

  1. Opret en ny generel analyse 3 (GA3) opskrift.
    1. Nu, hvor cilier er blevet identificeret og segmenteret, fortsætte med at analysere forskellige parametre for cilier såsom længder og intensiteter ved hjælp af GA3 værktøj. Dette åbner et nyt vindue med et tomt mellemrum i midten, hvor analysen defineres. Vælg Billede > ny GA3-opskrift.
  2. Vælg de binære filer, der skal analyseres.
    1. Da cilier allerede er segmenteret ved hjælp af Segment.ai, vil GA3 automatisk registrere de binære filer korrekt mærket i henhold til Ai og omfatte noden. Vælg'Binære filer > automatisk Detect_AI' eller 'Binære filer > Tegn Object_AI'.
  3. Vælg de kanaler, der kræves til analyse. GA3 registrerer også automatisk kanalerne på billederne og viser deres faner under Kanaler.
  4. Fjern objekter, der rører rammens kant.
    1. Da Ai vil segmentere alle cilier som objekter i rammen, vil det også opdage ufuldstændige cilier langs kanterne af rammen. Disse objekter kan enten fjernes manuelt i trin 3.4, eller de kan fjernes automatisk i GA3. Vælg Binær behandling > Fjerne objekter > Berøring af kanter.
  5. Vælg parametre, der skal måles cilia.
    1. Træk og slip parametrene for atmåle,f.eks. Forbind noderne med den relevante binære node (forbindelse A) og kanalnoder (forbindelse B). Hold markøren over nodeforbindelsen for et værktøjstip for at vise, hvilken forbindelse noden tilhører. Vælg Måling > objektstørrelse > længde og måling > objektintensitet > Sum Obj-intensitet.
      BEMÆRK: Noden Længde opretter kun forbindelse til den binære node, mens Sum Obj Intensity opretter forbindelse til både den binære og kanalnoder.
  6. Tilføj målingerne i en enkelt tabel.
    1. Kombiner alle målingerne i en enkelt outputtabel ved at trække og slippe noden Tilføj kolonne til analyseplandiagrammet, og forbind den med målenoder, Længde og Sum Obj Intensity. Vælg datastyring > basic > tilføj kolonne.
  7. Mål cilier.
    1. Mål cilier ved at klikke på Kør. Denne proces tager et par øjeblikke at måle alle de cilier i de eksperimentelle billeder. Længderne og intensiteterne vises i et nyt vindue analyseresultater.
      BEMÆRK: Tabellen kan undertiden indeholde data fra masker, som Ai genkendte som cilier, men som var for små til at blive opdaget af det menneskelige øje og elimineret i trin 3.4. Disse objekter kan fjernes fra datasættet ved hjælp af et filter før statistisk analyse. Her blev der anvendt et filter på 1 μm til in vitro cilia-længdemålinger i figur 2 og 2 μm for in vivo cilia. Dette kan gøres, før du eksporterer data ved hjælp af nedenstående vej. Vinduet Analyseresultater > Definer filter > Angiv værdi > brugsfilter.
  8. Eksporter data til statistisk analyse.

5. Colocalization undersøgelser

BEMÆRK: Colocalization analyse kan indgå i den samme GA3 opskrift, der anvendes til målinger af cilier længde og intensitet analyse. Hvis du bruger den samme opskrift, skal du åbne filer som beskrevet nedenfor og måle længder og intensiteter af begge kanaler sammen med colocalization-koefficienterne i samme analysepipeline.

  1. Åbn det eksperimentelle datasæt.
    1. Åbn de eksperimentelle confocal billeder af cilier i softwaren ved at konvertere prøven .tif filer til .nd2 filer. Vælg Fil > Importer/eksporter > Opret ND-fil fra filsekvens.
    2. I pop op-vinduet skal du vælge de 16-bit dybde monokrome filer fra alle kanaler af interesse fra vinduesstifinderen, der er placeret i den første kolonne i pop op-vinduet. Vælg Multipoint- eller Z-serie i den første rullemenu, og angiv en værdi, der svarer til det samlede antal billeder eller stakke.
    3. Vælg Bølgelængde i den anden rulleliste, og skift værdien til det samlede antal kanaler i mappen. Softwaren låser automatisk op for et Wavelength-valgvindue, der er placeret nederst til højre i pop op-vinduet. Brug rullemenuen Farve til at vælge farven på hver kanal. Giv hver kanal et andet navn under kolonnen Navn. Når alle oplysninger er opdateret, skal du klikke på Konverter. Softwaren genererer automatisk en Alle billedfil overlejret med alle de enkelte billeder fra alle de valgte kanaler.
  2. Kalibrer billeder.
    1. Angiv pixelstørrelsen i nederste venstre hjørne af billedet. Højreklik på Ikke-kalibreret > Kalibrer dokument > pixelstørrelse.
  3. Kør den trænede Ai på den første kanal.
    1. Begynd at identificere cilier på en af de åbne kanaler (f.eks ACIII; Figur 5A) ved hjælp af Ai. Softwaren vil nu trække binære filer på ACIII mærket cilier baseret på den uddannelse, den har modtaget for denne kanal. Denne proces vil tage et par sekunder. Vælg NIS.ai > Segment.ai > Kildekanaler > ACIII.
  4. Kør den trænede Ai på den anden kanal.
    1. Begynd at identificere cilier på den anden åbnede kanal (f.eks MCHR1; Figur 5B) ved hjælp af Ai. Softwaren vil nu trække binære filer på MCHR1 mærket cilier baseret på den uddannelse, den har modtaget for denne kanal. Denne proces vil tage et øjeblik. Vælg NIS.ai > Segment.ai > Kildekanaler > MCHR1.
  5. Tjek billeder for fejlidentificerede binære filer.
    1. Når Ai har identificeret cilier og tegnede binære filer, skal du kontrollere billederne for eventuelle fejlidentificerede objekter. Slet eventuelle fejlidentificerede binære filer manuelt, hvis det er nødvendigt. Vælg Vis > analysekontrolelementer > binær værktøjslinje > Slet objekt.
  6. Opret ny GA3 opskrift.
    1. Nu, hvor cilia er blevet identificeret og segmenteret, gå videre til colocalization analyse ved hjælp af GA3 værktøj. Dette åbner et nyt vindue med et tomt mellemrum i midten, hvor analysen defineres. Der genereres et vindue med alle identificerede binære filer og kanaler. Kontroller, at alle ønskede kanaler og binære filer, der kræves til analyse, er til stede og valgt. Vælg Billede > ny GA3-opskrift.
  7. Fjern objekter, der rører rammens kant.
    1. Da Ai vil segmentere alle cilia-lignende objekter i rammen, vil det også opdage ufuldstændige cilier langs rammens kanter. Disse objekter kan enten fjernes manuelt i trin 5.5, eller de kan fjernes automatisk i GA3. Vælg Binær behandling > Fjerne objekter > Berøring af kanter.
  8. Konfigurer colocalization-stien i GA3.
    1. Hvis du vil måle overlapningen af de to kanaler i cilier, skal du bruge Manders koefficientkorrelation. Træk og slip Manders Koefficient noden i det tomme rum i GA3 opskrift og forbinde den til de relevante binære og kanaler. Her forbinder 'forbindelse A' med ACIII binære, 'forbindelse B' med MCHR1-kanalen og 'forbindelse C' med ACIII-kanalen for at bestemme overlapningen af MCHR1 inden for ACIII-binær. Vælg måling > objektforholdsmetri > Manders-koefficient.
      BEMÆRK: Softwaren giver mulighed for at måle colocalization ved hjælp af Pearson Coefficient Korrelation ved hjælp af de samme trin som beskrevet i denne protokol40.
  9. Tilføj målingerne i en enkelt tabel.
    1. Kombiner alle målingerne i en enkelt outputtabel. Vælg datastyring > basic > tilføj kolonne.
  10. Mål colocalization.
    1. Mål cilier ved at klikke på Kør. Denne proces tager et par øjeblikke at måle alle de cilier i de eksperimentelle billeder. Dataene vises i et nyt vindue til analyseresultater.
  11. Eksporter data til statistisk analyse.

Representative Results

Uddannelse Ai til at identificere cilier
Måling og vurdering af cilia strukturelle længde og sammensætning kan være en kedelig, tidskrævende, og fejlbehæftet proces. Her bruger vi Ai til nøjagtig segmentering af cilier fra en stor pulje af billeder og analyserer deres længder og intensiteter med et analyseværktøj (Figur 1). Alle Ai-tilgange kræver træningstrin for deres gennemførelse. Vi etablerede en træningspipeline til at genkende cilier, som blev udført ved manuelt at anvende binære masker på ciliary strukturer. Disse oplysninger bruges derefter til at træne Ai baseret på pixelegenskaber under de anvendte binære filer. Som en generel retningslinje involverer træningen softwaren, der gennemgår flere gentagelser, ca. 1000, og betragtes som optimal, hvis træningstabet eller fejlprocenten er mindre end 1%. Antallet af gentagelser og fejl i træningsprocessen kan dog variere afhængigt af de eksempelbilleder, der bruges til træning. For eksempel, efter vores træningssessioner ved hjælp af in vitro neuronal cilia billeder, fejlprocenten var 1,378% sammenlignet med 3,36% for in vivo hjerne sektion billeder (Supplerende figur 1). Når træningen er afsluttet, kan Ai derefter bruges til at segmentere cilier fra eksperimentelle billeder inden for få sekunder, og de resulterende binære masker bruges til måling af strukturelle parametre. Dette eliminerer behovet for at segmentere objekter ved hjælp af den traditionelle metode til intensitetstærskeling, som kan være vanskelig i billeder med høj baggrundsstøj, eller når objekter er tæt på hinanden. Ai reducerer også risikoen for fejl og bias ved at anvende den samme algoritme på tværs af alle billeder, uanset bruger.

Måling af cilierlængde ved hjælp af GA3
Cilia længde er stramt reguleret og er forbundet med funktionelle virkninger på ciliary signalering16,19. Her målte vi cilierlængder ved hjælp af en analysepipeline inden for NIS Elements software kaldet General Analysis 3 eller GA3. GA3 hjælper med at kombinere flere værktøjer i en enkelt arbejdsproces for at opbygge tilpassede rutiner for hvert eksperiment. Vi begyndte med at måle cilier længder i en celle linje. Cilia på musens indre medullære opsamlingskanal (IMCD-3) celler blev immunmærket med acetyleret tubulin og afbildet ved hjælp af et konfokalt mikroskop. Vi målte cilierlængder ved hjælp af GA3 efter segmentering med segment.ai (supplerende figur 3A). Mens acetyleret α-tubulin fortrinsvis findes i det primære cilium, findes det også i andre mikrotubule rige regioner som cytoskeleton samt den cytokintiske bro. Den trænede Ai korrekt identificeret cilier i billedet, men ikke andre ikke-ciliary, acetyleret tubulin positive strukturer. Cilia på IMCD-celler varierede fra 0,5 μm til 4,5 μm med en gennemsnitlig længde på 1,8 ± 0,04 μm (Figur 2A). Vi testede derefter Ai's evne til at måle cilierlængder i primære neuronale kulturer. Vi dyrkede neuroner fra hypothalamus og hippocampus af neonatale mus i 10 dage og immunmærkede dem med cilia-markøren adenylatcyclase III (ACIII)21,41. Ved analyse af neuronale kulturer fandt vi det nyttigt at anvende et filter, før vi statistisk analyserede længderne. På grund af et lavere signal til støjforhold blev der identificeret flere objekter mindre end 1 μm, som ikke var cilier. Derfor filtrerede vi dataene for at eliminere objekter, der var mindre end 1 μm i længden for at sikre, at kun cilier blev analyseret. I dyrkede hypothalamus neuroner varierede cilierlængderne fra 2 μm til 7 μm med en gennemsnitlig længde på 3,8 ± 0,19 μm (Figur 2B). Interessant nok var kultiverede hippocampale neuronale cilia længere med en gennemsnitlig længde på 6,73 ±0,15μm (Figur 2C). Det er blevet rapporteret, at forskellige neuronale kerner i hypothalamus viser forskellige cilia længder, og at disse cilier ændre deres længder som reaktion på fysiologiske ændringer i en kerne specifik måde19,23. Derfor har vi også mærket hypothalamus hjerne sektioner fra voksne mandlige C57BL/6J mus med ACIII og afbildet arcuate kerne (ARC) og paraventrikulær kerne (PVN). Ved hjælp af GA3 til at måle cilier længder, bemærkede vi, at in vivo hypothalamic cilia syntes længere end in vitro ciilia. Hypothalamus cilia in vivo varierer fra 1 μm til ca. 15 μm (Figur 3). Der var ingen signifikante forskelle mellem længden af cilier i PVN (5,54 ± 0,0,42 μm) og dem i ARC (6,16 ± 0,27 μm) (figur 3C)23. På samme måde viser cilia i cornu ammonis (CA1) i hippocampus et snævrere længdeområde fra 1 μm til 10 μm med en gennemsnitlig længde på 5,28 ± 0,33 μm (Figur 3). I overensstemmelse med tidligere offentliggjorte undersøgelser viste vores analyse ved hjælp af Ai og GA3-værktøjer, at cilier fra forskellige hjerneområder viser mangfoldighed i længde19,23. Desuden er vi ved hjælp af denne Ai-tilgang i stand til hurtigt at vurdere et stort antal cilier.

Måling af cilier sammensætning ved hjælp af GA3
Det primære cilium er et signalknudepunkt for mangeveje,der udnytter forskellige typer proteiner til at udføre unikke funktioner som motorproteiner, intraflagellar transportproteiner og GPCR'er for at nævne nogle få3,24,42,43. Opretholdelse af de passende niveauer af disse proteiner i cilium er vigtigt for korrekt funktion og ofte synes celle sammenhæng afhængig. Fluorescerende mærkning af disse proteiner har ikke kun gjort det muligt for os at visualisere dem, men også kvantificere deres intensitet som et mål for mængden af det mærkede protein i det relativt lille rum20. Derfor forsøgte vi at bestemme intensiteten af en ciliary GPCR, Melanin Koncentrere hormonreceptor 1 (MCHR1), in vivo i både ARC og PVN af hypothalamus af voksne hanmus24,44. Ved hjælp af Ai og GA3 målte vi længden af MCHR1 positive cilier sammen med intensiteter for at sikre, at de objekter, der tælles, var cilier (supplerende figur 3A). Vi eliminerede objekter efter analyse, der var mindre end 2 μm i længden og analyserede intensiteten af de resterende binære masker. Interessant nok fandt vi, at intensiteten af ciliary MCHR1 i PVN er betydeligt højere end i ARC, der indikerer en stærkere tilstedeværelse af ciliary MCHR1 i PVN (figur 4). Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme betydningen af ciliary MCHR1 i disse neuronale kredsløb. Vi målte også intensiteten af ciliary MCHR1 i primære kultiverede neuroner af hypothalamus og hippocampus. Cilia fra begge kulturer udviser en bred fordeling af MCHR1-intensiteter, der tyder på tilstedeværelsen af heterogene neuronale populationer (supplerende figur 2). Således, ved hjælp af sofistikerede analytiske værktøjer som Ai og GA3 giver mulighed for evaluering af cilier heterogenitet inden for samme væv eller mellem flere væv. Det bliver interessant at se, om andre neuronale GPCRs viser lignende forskelle i deres lokalisering inden for neuroner af samme væv, og om dette ændrer sig som reaktion på fysiologiske ændringer.

Colocalization
Mens måling af fluorescensintensiteter inden for et komplet billedfelt kan give et indtryk af protein, giver det ikke oplysninger såsom rumlig fordeling eller nærhed til andre nærliggende proteiner og cellulære strukturer. Her målte vi overlapningen af MCHR1 med ACIII som en ciliermarkør ved at plotte intensiteten af MCHR1 mod ACIII for hver binær maske (Figur 5). Grafen viser, at størstedelen af cilier er positive for både, ACIII og MCHR1, selv om nogle cilier viser stærkere udtryk for den ene kanal frem for den anden. Desuden er der nogle cilier, der viser tilstedeværelsen af enten ACIII eller MCHR1, som det fremgår af de punkter, der ligger direkte på henholdsvis x-aksen og y-aksen. For at kvantificere denne overlapning målte vi Manders overlapningskoefficient og sammenlignede omfanget af MCHR1-ekspression i neuronal cilier af ARC og PVN40. Interessant nok viste vores analyse, at der var en betydelig stigning i PVN's koefficienter (0,6382 ± 0,0151) end i ARC (0,5430 ± 0,0181) (Figur 5C). Dette er i overensstemmelse med vores tidligere data, hvor vi observerede højere MCHR1 intensiteter i PVN sammenlignet med ARC (Figur 4). Disse data tyder på, at ligesom cilier længde, udtrykket mønster af MCHR1 i ciliary rummet varierer i forskellige regioner af hjernen. Ved hjælp af den samme analyse pipeline, vil det være muligt at afgøre, om andre ciliary GPCRs såsom Neuropeptid Y Receptor Type 2 (NPY2R) og Somatostatin Receptor Type 3 (SSTR3) viser lignende mængder af mangfoldighed.

Måling af intensitetsprofil langs cilium
Når cilier er blevet identificeret ved hjælp af segment.ai, ga3 opskriften kan ændres for at kombinere cilier analyse med identifikation af andre strukturer af interesse i billedet. For eksempel er mærkning med basale kropsmarkører nyttig til identifikation af cilier polaritet. For at gøre denne analyse, vi afbildet hypothalamic hjerne sektioner fra P0 mus, der udtrykker ARL13B-mCherry og Centrin2-GFP og afbildet ARC og PVN34. Her blev cilier identificeret ved hjælp af Ai som før, men nu indeholder den modificerede GA3-opskrift identifikation af Centrin2-GFP, et centriolarprotein, der findes i bunden af cilier (supplerende figur 3B). Ved mærkning Centrin2-GFP kan bunden af cilier skelnes fra spidsen af ARL13B-mCherry positive cilier (Figur 6A). Derefter, i stedet for at måle intensiteten i hele cilier, vi er i stand til at måle ændringer i ARL13B intensitet langs længden af cilia (Figur 6B). Vi kan også sammenligne forskelle i intensiteten af ARL13B mellem de proksimale ender og distale ender af cilier. For at gøre dette delte vi ciliumlængden i 1-mikron skraldespande, der startede fra bunden og udpegede den første mikronbeholder som den proksimale ende og den sidste mikronbeholder som den distale ende. Vores analyse viste, at der er betydeligt mere ARL13B til stede tættere på basen end spidsen af cilium i både ARC og PVN, og dette er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte undersøgelser i human chondrocytter45 (Figur 6C). I denne type analyse analyseres kun cilier, der er forbundet med Centrin2-GFP-mærkning, i stedet for at anvende et længdefilter for at udelukke små ikke-ciliære objekter fra analyse. Dette kan være en fordel i situationer, hvor genetiske mutationer gør meget korte cilier, eller hvis ændringer i cilier subdomains som overgangszonen eller spidsen har været impliceret. Identifikation af cilier ved hjælp af Ai og GA3 analyse er meget tilpasningsdygtig og kan skræddersys til at passe til en række komplekse forskningsspørgsmål.

Figure 1
Figur 1. Arbejdsgang til måling af cilierlængde og intensitet ved hjælp af Ai. (A) For at træne ai'en tegnes binære filer rundt om de genstande af interesse (cilier) på de rå træningsbilleder. Ved hjælp af de tegnede binære filer trænes Segment Ai til at genkende cilierens form- og pixelintensiteter. (B) Dernæst anvendes det uddannede segment Ai på rå eksperimentelle billeder. Det trækker binære filer på objekter, det genkender som cilier. Disse binære filer kan raffineres for at sikre, at alle og kun cilier bliver analyseret. (C) En GA3 program er konstrueret til at analysere intensiteten og længden af objekter anerkendt af Ai. (D) Posterne importeres til en tabel i softwaren. Denne tabel kan derefter eksporteres til yderligere analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. In vitro cilia længdemålinger. Repræsentative billeder af cilier i (A) IMCD-celler (grøn, acetyleret tubulin) (B) primære hypothalamuskulturer (grøn, ACIII) og(C)hippocampale kulturer (grøn, ACIII). En uddannet Ai blev brugt til at genkende cilier som vist i den binære maske (magenta) og derefter GA3 blev brugt til at måle cilier længde. Fordelingen af cilier længde er afbildet som procentdel af cilier i 0,5 eller 1,0-mikron skraldespande. * angiver cytokinetiske bro korrekt ikke anerkendt af Ai. n=225 cilia i IMCD-celler fra 3 gentagelser, 54 cilier i hypothalamus og 139 cilia i hippocampale kulturer fra 3 dyr. Skalastænger 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. In vivo cilia længdemålinger. (A) Repræsentative billeder af cilier (grøn, ACIII) i ARC, PVN, og CA1 af voksne mus hjerne sektioner. (B) En uddannet Ai i NIS Elements blev brugt til at genkende cilier som vist i den binære maske (magenta) og derefter GA3 blev brugt til at måle cilier længde. (C) Fordelingen af cilierlængde er afbildet som procentdel af cilier i en-mikron skraldespande. n= 68 cilier i ARC, 36 i PVN og 29 i CA1 fra 3 dyr. Skalastænger 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Ai assisteret cilia farvning intensitet målinger af hypothalamus neuronal cilier. (A) Repræsentative billeder af cilier (MCHR1, rød) i ARC og PVN af voksne mus hjerne sektioner. En uddannet Ai i NIS Elements blev brugt til at genkende cilier som vist i den binære maske (cyan) og derefter GA3 blev brugt til at måle intensiteten af MCHR1 farvning i cilier. (B) MCHR1 - intensiteterne er afbildet som gennemsnitlige ± S.E.M. Hver prik repræsenterer etcilium. * p < 0,05, Student's t-test. (C) Fordelingen af MCHR1-intensiteten er afbildet som procentdel af cilier i beholdere på 0,2 x 107 vilkårlige enheder (A.U.). n= 53 cilier i ARC, 78 i PVN fra 3 dyr. Skalastænger 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Ai bistået cilia colocalization analyse. (A, B) Repræsentative billeder af cilier i henholdsvis ARC og PVN. Cilier er mærket med ACIII (grøn) og MCHR1 (rød). En uddannet Ai i NIS Elements blev brugt til at genkende cilier som vist i den binære maske (magenta for ACIII mærket cilia, cyan til MCHR1 mærket cilier). GA3 blev brugt til at genkende cilier, der indeholdt både ACIII og MCHR1. (C) Manders overlap coefficient (MOC) værdier er afbildet som gennemsnit ± S.E.M. Hver prik repræsenterer etcilium. * p < 0,05, Student's t-test. (D) Scatter plot af MCHR1 intensitet vs ACIII intensitet i ARC og PVN. Hver prik repræsenterer etcilium. n= 72 cilier i ARC, 47 i PVN fra 3 dyr. Skalastænger 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Cilia og basal kropsanalyse. (A) Repræsentative billeder af cilier (rød, ARL13B-mCherry) og basal krop markør (grøn, Centrin2-GFP) i ARC og PVN af P0 mus. En uddannet Ai blev brugt til at genkende cilier som vist i den binære maske (cyan). Den binære maske til basal krop (magenta) blev trukket ved for tærskeling i GA3 opskrift. (B) Repræsentativ linjescanningsintensitet for etcilium. (C) ARL13B intensiteter i de proksimale og dystre ender af Ai identificeret cilia afbildet som gennemsnit ± S.E.M. De proksimale og distale ender defineres som regionen inden for henholdsvis den første 1 μm længde og de sidste 1 μm længde fra bunden afcilium. Hver prik repræsenterer etcilium. * p < 0,05. n = 6 cilia i ARC fra 2 dyr og 21 cilia i PVN fra 3 dyr. Skalastænger 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1. Ai uddannelse tab grafer. (A, B) Grafer, der viser træningstab af segment.ai på henholdsvis neuronal cilia in vitro og in vivo. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2. Ai Assisted Cilia farvning intensitet målinger af in vitro neuronal cilia. (A, B) Repræsentative billeder af cilier (MCHR1, rød) i henholdsvis primære hypothalamus og hippocampale kulturer. En uddannet Ai i NIS Elements blev brugt til at genkende cilier som vist i den binære maske (cyan) og derefter GA3 blev brugt til at måle intensiteten af MCHR1 farvning i cilier. Fordeling af MCHR1 intensitet er afbildet som procentdel af cilier i 1000 A.U. skraldespande til hypothalamus og 2000 A. U. skraldespande til hippocampal kulturer. n= 30 cilier i hypothalamus og 106 cilia i hippocampale kulturer fra 3 dyr. Skala barer 10 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3. Generel analyse 3 opskrifter til cilier analyse. (A) Simpel generel analyse (GA3) opskrift til måling af cilier længde, intensitet og Mander koefficient. (B) Kompleks GA3 opskrift til måling af intensitet langs længden af cilium ved hjælp af en markør for basal krop. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Længde- og intensitetsmålinger er almindelige måder, hvorpå primær cilier analyseres, men der er ikke en standardiseret konventionel metode, der anvendes i marken. Identifikation og kvantificering af primær cilier ved hjælp af software som ImageJ er tidskrævende og tilbøjelig til at brugeren bias og fejl. Dette gør det vanskeligt præcist at analysere store datasæt. Her viser vi, at ved hjælp af et Ai-program kan overvinde mange af disse udfordringer, der gør høj gennemløbsanalyse af primær cilier opnåelig. Heri beskriver vi proceduren for træning af et Ai-baseret program til at genkende primær cilier og skitsere de trin, der kræves for at analysere længde og intensitet.

Mens den indledende træning af Ai til at genkende cilier kræver betydelig tid fra brugeren, når den er afsluttet, kan den bruges på ethvert datasæt, der er erhvervet med de samme parametre. Den binære maske, der genereres af Ai, kan ændres, så eventuelle fejl kan rettes. Fejl i cilia-identifikationen skal dog signalere brugeren, at Ai'en skal trænes yderligere med yderligere billeder. En stor fordel ved denne metode er, at Ai kan trænes til at genkende cilier i forskellige prøvetyper i både 2D og 3D. Tidligere analysemetoder, der genereres i laboratorier, har forskelligebegrænsninger,herunder krav om manuel tærskelværdi for identifikation og problemer med at identificere cilier, der er afbildet fra vævssektioner, hvor celletætheden er høj36,46,47. Disse metoder er også specialiseret til cilia analyse, mens analyse ved hjælp af NIS Elements software kan evaluere flere aspekter af billederne samtidigt. Fordi Ai beskrevet her er en del af NIS Elements softwarepakke, billeder erhvervet ved hjælp af et Nikon mikroskop kan let fortsættes igennem til analyse. Billedbehandling med Nikon er dog ikke påkrævet for at bruge denne metode. Uanset det hentede raw datafilformat kan ".tif" filer åbnes af NIS Elements, der kan bruges i Ai.

Denne Ai-applikation inden for NIS Elements er bredt tilgængelig og muligvis allerede en del af billedanalysesoftware i brug af laboratorier, der studerer primær cilier. Med udbredelsen af Ai-teknologi ekspanderende, andre billedbehandling software kan udvide deres analysemuligheder til at omfatte en lignende Ai modul. Anvendelse ai analyse til cilier identifikation kan bruges til flere forskellige aspekter af cilier analyse. Mens vi skitserede metoder til nogle få enkle analyser som længde (figur 2 og 3), intensitet (Figur 4) og colocalization (Figur 5) mere sofistikeret analyse kan føjes til GA3 analyse workflow som i figur 6. I stedet for at måle intensiteten af et fuldstændigtcilium kan forskelle i intensitet inden for et underområde af etcilium f.eks. være af interesse i at vurdere sub-ciliary lokalisering. Forskelle i intensitet i en subregion af et cilium kan indikere, at proteinet akkumuleres ved spidsen eller bunden afciliet, såsom hvordan Gli-proteiner beriges ved spidsen af cilia48. Derudover kan denne Ai-applikation bruges til let at identificere forskelle mellem genotyper eller behandlingsgrupper. Mens vores laboratorium primært bruger denne metode til at analysere cilia afbildet fra hjerne sektioner eller neuronale kulturer, det kan anvendes til billeder erhvervet fra forskellige cellelinjer eller andre vævstyper. Den fleksibilitet af prøvetype, som denne applikation kan anvendes på, gør denne analysemetode værdifuld for mange forskellige grupper, der studerer primær cilier eller enhver diskret organelle, der vurderes, såsom mitokondrier, kerne eller ER.

Disclosures

Medforfatter Wesley Lewis er ansat i Nikon. Der er ingen finansielle oplysninger.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 til NFB og American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 til RB. Vi takker Rich Gruskin General Manager for Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft og Teresa Mastracci for indsigtsfulde kommentarer til manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM Intel Corporation W-2123 Processor used for running NIS Elements.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Inc. - Ai and GA3 software
Quadro RTX 4000 Graphics card NVIDIA Corporation Quadro RTX 4000
Windows 10 Professional 64-bit Microsoft Inc. - Operating system used for running NIS Elements
Workstation HP Development Company, L.P. HP Z4G4 Workstation used for running NIS Elements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., et al. Ciliary gene RPGRIP1L is required for hypothalamic arcuate neuron development. JCI Insight. 4 (3), (2019).
  2. Siljee, J. E., et al. Subcellular localization of MC4R with ADCY3 at neuronal primary cilia underlies a common pathway for genetic predisposition to obesity. Nature Genetics. 50 (2), 180-185 (2018).
  3. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Current Biology. 17 (18), 1586-1594 (2007).
  4. Berbari, N. F., O'Connor, A. K., Haycraft, C. J., Yoder, B. K. The primary cilium as a complex signaling center. Current Biology. 19 (13), 526-535 (2009).
  5. Walz, G. Role of primary cilia in non-dividing and post-mitotic cells. Cell Tissue Research. 369 (1), 11-25 (2017).
  6. Nachury, M. V., Mick, D. U. Establishing and regulating the composition of cilia for signal transduction. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (7), 389-405 (2019).
  7. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  8. Engle, S. E., Bansal, R., Antonellis, P. J., Berbari, N. F. Cilia signaling and obesity. Seminars in Cell and Developmental Biology. , (2020).
  9. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
  10. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatric Nephrology. 26 (7), Berlin, Germany. 1039-1056 (2011).
  11. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. New England Journal of Medicine. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  12. Vaisse, C., Reiter, J. F., Berbari, N. F. Cilia and Obesity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), (2017).
  13. Berbari, N. F., et al. Leptin resistance is a secondary consequence of the obesity in ciliopathy mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), 7796-7801 (2013).
  14. Jacobs, D. T., et al. Dysfunction of intraflagellar transport-A causes hyperphagia-induced obesity and metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 789-798 (2016).
  15. Arsov, T., et al. Fat aussie--a new Alström syndrome mouse showing a critical role for ALMS1 in obesity, diabetes, and spermatogenesis. Molecular Endocrinology. 20 (7), 1610-1622 (2006).
  16. Tam, L. W., Ranum, P. T., Lefebvre, P. A. CDKL5 regulates flagellar length and localizes to the base of the flagella in Chlamydomonas. Molecular Biology of the Cell. 24 (5), 588-600 (2013).
  17. Rajagopalan, V., Subramanian, A., Wilkes, D. E., Pennock, D. G., Asai, D. J. Dynein-2 affects the regulation of ciliary length but is not required for ciliogenesis in Tetrahymena thermophila. Molecular Biology of the Cell. 20 (2), 708-720 (2009).
  18. Bengs, F., Scholz, A., Kuhn, D., Wiese, M. LmxMPK9, a mitogen-activated protein kinase homologue affects flagellar length in Leishmania mexicana. Molecular Microbiology. 55 (5), 1606-1615 (2005).
  19. Han, Y. M., et al. Leptin-promoted cilia assembly is critical for normal energy balance. Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2193-2197 (2014).
  20. Caspary, T., Marazziti, D., Berbari, N. F. Cilia: Methods and Protocols. Satir, P., Tvorup Christensen, S. , Springer. New York. 203-214 (2016).
  21. Bishop, G. A., Berbari, N. F., Lewis, J., Mykytyn, K. Type III adenylyl cyclase localizes to primary cilia throughout the adult mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 505 (5), 562-571 (2007).
  22. Domire, J. S., Mykytyn, K. Markers for neuronal cilia. Methods in Cell Biology. 91, 111-121 (2009).
  23. Sun, J. S., et al. Ventromedial hypothalamic primary cilia control energy and skeletal homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), (2021).
  24. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
  25. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Research. 872 (1-2), 271-275 (2000).
  26. Domire, J. S., et al. Dopamine receptor 1 localizes to neuronal cilia in a dynamic process that requires the Bardet-Biedl syndrome proteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (17), 2951-2960 (2011).
  27. Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89 (3), 909-926 (1999).
  28. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), 10335-10340 (2014).
  29. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  30. Berman, S. A., Wilson, N. F., Haas, N. A., Lefebvre, P. A. A novel MAP kinase regulates flagellar length in Chlamydomonas. Current Biology. 13 (13), 1145-1149 (2003).
  31. Nguyen, R. L., Tam, L. W., Lefebvre, P. A. The LF1 gene of Chlamydomonas reinhardtii encodes a novel protein required for flagellar length control. Genetics. 169 (3), 1415-1424 (2005).
  32. Tam, L. W., Wilson, N. F., Lefebvre, P. A. A CDK-related kinase regulates the length and assembly of flagella in Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 176 (6), 819-829 (2007).
  33. O'Connor, A. K., et al. An inducible CiliaGFP mouse model for in vivo visualization and analysis of cilia in live tissue. Cilia. 2 (1), 8 (2013).
  34. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (2), 113-122 (2015).
  35. Delling, M., et al. Primary cilia are not calcium-responsive mechanosensors. Nature. 531 (7596), 656-660 (2016).
  36. Saggese, T., Young, A. A., Huang, C., Braeckmans, K., McGlashan, S. R. Development of a method for the measurement of primary cilia length in 3D. Cilia. 1 (1), 11 (2012).
  37. Kobayashi, Y., Hamamoto, A., Saito, Y. Analysis of ciliary status via G-protein-coupled receptors localized on primary cilia. Microscopy. 69 (5), 277-285 (2020).
  38. Zhou, L. Q., et al. Artificial intelligence in medical imaging of the liver. World Journal of Gastroenterology. 25 (6), 672-682 (2019).
  39. Naugler, C., Church, D. L. Automation and artificial intelligence in the clinical laboratory. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 56 (2), 98-110 (2019).
  40. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  41. Bansal, R., et al. Hedgehog Pathway Activation Alters Ciliary Signaling in Primary Hypothalamic Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 266 (2019).
  42. Jin, H., et al. The conserved Bardet-Biedl syndrome proteins assemble a coat that traffics membrane proteins to cilia. Cell. 141 (7), 1208-1219 (2010).
  43. Liew, G. M., et al. The intraflagellar transport protein IFT27 promotes BBSome exit from cilia through the GTPase ARL6/BBS3. Developmental Cell. 31 (3), 265-278 (2014).
  44. Engle, S. E., et al. A CreER Mouse to Study Melanin Concentrating Hormone Signaling in the Developing Brain. Genesis. , (2018).
  45. Thorpe, S. D., et al. Reduced primary cilia length and altered Arl13b expression are associated with deregulated chondrocyte Hedgehog signaling in alkaptonuria. Journal of Cellular Physiology. 232 (9), 2407-2417 (2017).
  46. Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8, 1 (2019).
  47. Dummer, A., Poelma, C., DeRuiter, M. C., Goumans, M. J., Hierck, B. P. Measuring the primary cilium length: improved method for unbiased high-throughput analysis. Cilia. 5, 7 (2016).
  48. Haycraft, C. J., et al. Gli2 and Gli3 localize to cilia and require the intraflagellar transport protein polaris for processing and function. PLoS Genetics. 1 (4), 53 (2005).

Tags

Biologi udgave 171
Kunstig intelligens tilgange til vurdering af primære cilier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T.… More

Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T. K., Brewer, K. M., Lewis, W. R., Berbari, N. F. Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia. J. Vis. Exp. (171), e62521, doi:10.3791/62521 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter