Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kunstmatige intelligentie benaderingen voor het beoordelen van primaire trilharen

Published: May 1, 2021 doi: 10.3791/62521
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 2Nikon Instruments Inc., 3Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University, 4Center for Diabetes and Metabolic Diseases, Indiana University School of Medicine

Summary

Het gebruik van kunstmatige intelligentie (Ai) om beelden te analyseren is in opkomst als een krachtige, minder bevooroordeelde en snelle aanpak in vergelijking met veelgebruikte methoden. Hier hebben we Ai getraind om een cellulair organel, primaire trilharen te herkennen en eigenschappen zoals lengte en kleurintensiteit op een rigoureuze en reproduceerbare manier te analyseren.

Abstract

Trilharen zijn op microtubuli gebaseerde cellulaire aanhangsels die functioneren als signaleringscentra voor een verscheidenheid aan signaalroutes in veel zoogdierceltypen. De lengte van trilharen is sterk geconserveerd, strak gereguleerd en varieert tussen verschillende celtypen en weefsels en is betrokken bij het direct beïnvloeden van hun signaalcapaciteit. Van trilharen is bijvoorbeeld aangetoond dat ze hun lengte veranderen als reactie op activering van ciliaire G-eiwitgekoppelde receptoren. Het nauwkeurig en reproduceerbaar meten van de lengte van talrijke trilharen is echter een tijdrovende en arbeidsintensieve procedure. De huidige benaderingen zijn ook fout- en vooringenomenheidsgevoelig. Kunstmatige intelligentie (Ai) -programma's kunnen worden gebruikt om veel van deze uitdagingen te overwinnen vanwege mogelijkheden die assimilatie, manipulatie en optimalisatie van uitgebreide datasets mogelijk maken. Hier laten we zien dat een Ai-module getraind kan worden om trilharen te herkennen in beelden van zowel in vivo als in vitro monsters. Na het gebruik van de getrainde Ai om trilharen te identificeren, zijn we in staat om toepassingen te ontwerpen en snel te gebruiken die honderden trilharen in één monster analyseren op lengte, fluorescentie-intensiteit en co-lokalisatie. Deze onbevooroordeelde benadering verhoogde ons vertrouwen en onze strengheid bij het vergelijken van monsters van verschillende primaire neuronale preps in vitro en in verschillende hersengebieden binnen een dier en tussen dieren. Bovendien kan deze techniek worden gebruikt om de trilharendynamiek van elk celtype en weefsel betrouwbaar te analyseren op een high-throughput manier over meerdere monsters en behandelingsgroepen. Uiteindelijk zullen ai-gebaseerde benaderingen waarschijnlijk standaard worden, omdat de meeste velden evolueren naar minder bevooroordeelde en meer reproduceerbare benaderingen voor beeldacquisitie en -analyse.

Introduction

Primaire trilharen zijn sensorische organellen die uitsteken uit de meeste zoogdierceltypen1,2,3,4. Het zijn over het algemeen solitaire aanhangsels die cruciaal zijn voor het coördineren van diverse celsignaleringsroutes door extracellulairesignalen 5,6,7te integreren. Primaire trilharen spelen een belangrijke rol tijdens de embryonale ontwikkeling en de homeostase van volwassen weefsel, en verstoring van hun functie of morfologie wordt geassocieerd met verschillende genetische aandoeningen, die gezamenlijk ciliopathieën worden genoemd. Vanwege de bijna alomtegenwoordige aard van trilharen, worden ciliopathieën geassocieerd met een breed scala aan klinische kenmerken die van invloed kunnen zijn op alle orgaansystemen8,9,10,11,12. In diermodellen van ciliopathieën manifesteert verlies van ciliaire structuur of signaleringscapaciteit zich in verschillende klinisch relevante fenotypen, waaronder hyperfagie-geassocieerde obesitas3,13,14,15. In veel modelsystemen is aangetoond dat veranderingen in de lengte van trilharen van invloed zijn op hun signaleringscapaciteit en functies16,17,18,19. Er zijn echter verschillende tijdrovende en technische uitdagingen verbonden aan het nauwkeurig en reproduceerbaar beoordelen van de lengte en samenstelling van trilharen.

Het volwassen centrale zenuwstelsel van zoogdieren (CZS) is een biologische context die een uitdaging heeft gevormd voor het begrijpen van de morfologie en functie van trilharen. Hoewel het erop lijkt dat neuronen en cellen in het hele CZS trilharen bezitten, blijft vanwege de beperkte hulpmiddelen en mogelijkheden om deze trilharen te observeren en te analyseren een begrip van hun functies ongrijpbaar20. Bijvoorbeeld, de prototypische cilia marker, geacetyleerd α-tubuline, labelt geen neuronale cilia20. De moeilijkheid van het bestuderen van deze trilharen werd gedeeltelijk opgelost met de ontdekking van verschillende G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR), signaleringsmachines en membraangeassocieerde eiwitten die zijn verrijkt op het membraan van neuronale trilharen21,22. Al deze eenvoudige basiswaarnemingen wijzen op het belang en de diversiteit van CZS-trilharen, die tot nu toe ongeëvenaard lijken door andere weefsels. Variatie in trilharenlengte en GPCR-lokalisatie kan bijvoorbeeld in de hele hersenen worden waargenomen, waarbij lengtes in bepaalde neuronale kernen anders zijn in vergelijking met andere kernen19,23. Evenzo tonen hun GPCR-inhoud en signaleringsmachines diversiteit op basis van neuroanatomische locatie en neuronaal type2,24,25,26,27,28,29. Deze eenvoudige waarnemingen tonen aan dat de lengte en samenstelling van zoogdier-cilia's strak gereguleerd zijn, net als bij modelorganismen, zoals Chlamydomonas reinhardtii, maar de impact van deze lengteverschillen op de functie, signalering en uiteindelijk gedrag van trilharen blijft onduidelijk16,30,31,32.

Het nauwkeurig meten van de lengte en samenstelling van trilharen blijkt een technische uitdaging te zijn die gevoelig is voor gebruikersfouten en onherleidbaarheid. Momenteel worden trilharen in vivo en in vitro meestal geïdentificeerd met behulp van immunofluorescente benaderingen die ciliaire eiwitten of met trilharen verrijkte fluorescerende reporter-allelenlabelen 33,34,35. De lengtes van deze fluorescerend getagde trilharen worden vervolgens gemeten vanaf een 2-dimensionaal (2D) beeld met behulp van lijnmeetinstrumenten in beeldanalyseprogramma's zoals ImageJ36. Dit proces is niet alleen vervelend en arbeidsintensief, maar ook vatbaar voor vooringenomenheid en fouten. Dezelfde obstakels doen zich voor bij het meten van trilharenintensiteiten, die helpen bij het aangeven van veranderingen in de trilharenstructuur37. Om de inconsistenties in dit soort beeldanalyses te minimaliseren, worden kunstmatige intelligentie (Ai) -programma's steeds vaker voorkomende en betaalbare opties38.

Ai is de vooruitgang van computersystemen die het voordeel van computeralgoritmen en programmering gebruiken om taken uit te voeren die normaal gesproken menselijke intelligentie vereisen39. Ai-apparaten worden geleerd om terugkerende patronen, parameters en kenmerken waar te nemen en acties te ondernemen om de kans op het creëren van succesvolle resultaten te maximaliseren. Ai is veelzijdig en kan worden getraind om specifieke objecten of interessante structuren, zoals trilharen, te herkennen en vervolgens worden geprogrammeerd om een verscheidenheid aan analyses op de geïdentificeerde objecten uit te voeren. Daarom kunnen complexe beeldgegevens snel en reproduceerbaar worden gegenereerd door Ai38. Automatisering en Ai-analyse van vastgelegde beelden zullen de effectiviteit en efficiëntie verhogen en tegelijkertijd mogelijke menselijke fouten en vooringenomenheid beperken39. Het opzetten van een op Ai gebaseerde methodologie voor de identificatie van trilharen creëert een consistente manier voor alle onderzoeksgroepen om trilharengegevens te analyseren en te interpreteren.

Hier gebruiken we een Ai-module om trilharen zowel in vivo als in vitro op 2D-beelden te identificeren. Met behulp van een set voorbeeldbeelden wordt de Ai getraind om trilharen te identificeren. Zodra de training is voltooid, wordt de aangewezen Ai gebruikt om een binair masker toe te passen op Ai-geïdentificeerde trilharen in een afbeelding. De door de Ai aangebrachte binaries zijn indien nodig aanpasbaar om ervoor te zorgen dat alle trilharen in de afbeeldingen correct worden geïdentificeerd en niet-specifieke identificatie wordt geëlimineerd. Na het gebruik van de Ai om trilharen te identificeren, worden op maat gemaakte algemene analyseprogramma's (GA) gebruikt om verschillende analyses uit te voeren, zoals het meten van de lengte van de trilharen en de fluorescentie-intensiteit. De verzamelde gegevens worden geëxporteerd naar een tabel die gemakkelijk kan worden gelezen, geïnterpreteerd en gebruikt voor statistische analyses(figuur 1). Het gebruik van geautomatiseerde technologie en Ai om trilharen te identificeren en specifieke metingen tussen experimentele groepen te verkrijgen, zal helpen bij toekomstige studies die gericht zijn op het begrijpen van de impact van de Cilia-functie en morfologie van het CZS op cel-celcommunicatie en -gedrag.

Protocol

1. Raw-afbeeldingen verkrijgen

  1. Fixeer en immunolabel monsters indien nodig20.
    1. Beeld trilharen met behulp van een confocale microscoop op maximale bitdiepte met dezelfde pixelgrootte met Nyquist-resolutie.
    2. Exporteer afbeeldingen als monochrome .tif bestanden (Tagged Image Format).
      OPMERKING: In dit protocol wordt beschreven hoe u de Ai-module specifiek binnen NIS Elements-software kunt gebruiken. Als afbeeldingen zijn verkregen als .nd2-bestanden, is het exporteren van afbeeldingen als .tif bestanden niet nodig en kan de gebruiker direct doorgaan naar stap 2.3. Als installatiekopieën op een ander systeem zijn verkregen, kan een NIS Elements-licentie afzonderlijk worden aangeschaft en kunnen .tif bestanden worden geconverteerd zoals beschreven in de volgende stappen.

2. Train Ai om trilhaartjes te identificeren

  1. Open de trainingsdataset.
    1. Selecteer ongeveer 50 voorbeeldafbeeldingen met ten minste één cilium per frame om de software te trainen en kopieer ze in één map. Deze map wordt gebruikt om de software te sturen bij het openen van de afbeeldingen. Open deze 50 frames binnen één ND2-document met ten minste één cilium per frame. Selecteer Bestand > Importeren/exporteren > ND-bestand maken van bestandsvolgorde.
    2. Selecteer de map met de trainingsgegevensset. Hiermee wordt de lijst met bestanden in het midden van het dialoogvenster geopend. Definieer handmatig de organisatie van de bestanden met behulp van ten minste één optie in het vervolgkeuzemenu hierboven. De opties zijn multipoint (voor meerdere maximale projectiebestanden), Z-serie (voor een z-stackafbeelding), tijd (voor een time-lapse-afbeelding) en golflengte (voor bestanden van meerdere kanalen).
    3. Voer de bijbehorende numerieke waarden in onder elke geselecteerde optie. Selecteer Geen wanneer opties niet zijn geselecteerd. Klik op Converteren om het ND-document te openen.
  2. Kalibreer afbeeldingen.
    1. Voer de pixelgrootte in de linkerbenedenhoek van de afbeelding in: Klik met de rechtermuisknop op Niet-gekalibreerde > Document kalibreren > Pixelgrootte.
  3. Identificeer trilharen.
    1. Identificeer de trilharen met de hand door individuele ciliaire structuren op alle geopende frames nauwkeurig te traceren met behulp van AutoDetect of Draw Object in de binaire werkbalk. Dit zal binaire maskers tekenen op de objecten van belang. Deze binaire bestanden zullen dienen als voorbeeldobjecten voor het trainen van de software om trilharen op pixelgebaseerde kenmerken te identificeren in toekomstige experimentele beeldanalyse. Selecteer Besturingselementen voor > analyse weergeven > binaire werkbalk > object tekenen.
      OPMERKING: Verwijder elk frame dat geen binaire bestanden heeft, omdat de software niet begint met trainen tenzij het binaire bestanden kan detecteren op alle geopende frames.
  4. Trein Ai.
    1. Begin met het trainen van de software. Hiermee wordt de trein Segment.ai doos geopend. Selecteer NIS.ai > Train Segment.ai.
    2. Selecteer in het vak Train Segment.ai het bronkanaal dat u voor training wilt gebruiken. Als bestanden van meerdere kanalen zijn geopend, selecteert u slechts één kanaal als bronkanaal. Selecteer vervolgens de juiste grondwaarheidsdubbelstenen waarop u de Ai wilt trainen. Selecteer ten slotte het aantal iteraties dat nodig is om de Ai te trainen, afhankelijk van de grootte en verdeling van de binaire bestanden.
      OPMERKING: Als de binaire bestanden gemakkelijk detecteerbaar zijn vanuit de omgeving en goed verspreid zijn over de afbeelding, heeft de software mogelijk minder dan 1000 iteraties nodig om getraind te worden om de afbeeldingen te identificeren. Als de beelden een lage signaal-ruisverhouding hebben, is het ideaal om tijdens de training minstens 1000 iteraties uit te voeren om de Ai in staat te stellen trilharen in testmonsters met hoge betrouwbaarheid te identificeren.
    3. Selecteer de doelmap om het getrainde Ai-bestand (.sai) op te slaan en klik op Trainen om de software te trainen. De software gaat nu verder met het trainen van zichzelf om trilharen te identificeren op basis van de getraceerde binaries. Dit proces duurt enkele uren.
      OPMERKING: Tijdens het trainen geeft de software een grafiek weer met trainingsverlies. De grafiek zal in eerste instantie een piek laten zien voordat deze afbouwt tot idealiter ongeveer 1% verlies waar het plateaus voor de rest van de training. Sla de grafiek op voor toekomstig gebruik door het selectievakje Grafiekschermafbeelding opslaan in het vak Segment.ai opsteken (Aanvullende afbeelding 1).
    4. Als verdere verfijning van de training nodig is, ga dan verder met trainen op dezelfde dataset. U kunt ook trainen op een nieuwe gegevensset met exact dezelfde parameters. Het is niet aan te raden om een reeds getrainde Ai te trainen op een nieuwe dataset met verschillende parameters of verschillende objecten van belang. Selecteer Train segment.ai > Continue Training On > Selecteer Trained Ai File.

3. Identificeer trilharen met behulp van getrainde Ai

  1. Open de experimentele gegevensset.
    1. Open de experimentele confocale afbeeldingen van trilharen in de software door het voorbeeld .tif bestanden te converteren naar .nd2-bestanden, vergelijkbaar met stap 2.1. Selecteer Bestand > Importeren/exporteren > ND-bestand maken van bestandsvolgorde.
      OPMERKING: De afbeeldingen moeten dezelfde pixelgrootte hebben als die welke worden gebruikt voor het trainen van de Ai. Als de afbeeldingen al de ND2-indeling hebben, gaat u verder met stap 3.3.
  2. Kalibreer afbeeldingen.
    1. Voer de pixelgrootte in de linkerbenedenhoek van de afbeelding in. Klik met de rechtermuisknop op Niet-gekalibreerde > document kalibreer > pixelgrootte.
  3. Voer de getrainde Ai uit op de geopende bestanden.
    1. Begin met het identificeren van de trilharen met behulp van Ai. De software tekent nu binaries op de trilharen op basis van de training die het in de vorige stap heeft gekregen. Dit proces duurt enkele seconden. Selecteer NIS.ai > Segment.ai.
      OPMERKING: De software vraagt om het kanaal te selecteren als er meerdere kanalen zijn geopend. Kanalen worden hier vermeld met hun respectieve namen. Als dit niet het geval is, wordt het vakje 'Mono' automatisch geselecteerd.
  4. Controleer afbeeldingen op verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden.
    1. Zodra de Ai trilharen en getekende binaire bestanden heeft geïdentificeerd, controleert u de afbeeldingen op ten onrechte geïdentificeerde objecten. Verwijder desgewenst handmatig verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden. Selecteer Weergave > analysebesturingselementen > binaire werkbalk > Object verwijderen.

4. Meten van trilharen lengte en intensiteit

  1. Maak een nieuw ga3-recept (General Analysis 3).
    1. Nu de trilharen zijn geïdentificeerd en gesegmenteerd, gaat u verder met het analyseren van verschillende parameters van trilharen zoals lengtes en intensiteiten met behulp van GA3-tool. Dit opent een nieuw venster met een lege ruimte in het midden waar de analyse wordt gedefinieerd. Selecteer Afbeelding > nieuw GA3-recept.
  2. Selecteer de binaire bestanden die u wilt analyseren.
    1. Omdat de trilharen al zijn gesegmenteerd met behulp van Segment.ai, detecteert GA3 automatisch de binaire bestanden die op de juiste manier zijn gelabeld volgens de Ai en bevatten ze het knooppunt. Selecteer'Binaire > automatisch Detect_AI' of 'Binaire > teken Object_AI'.
  3. Selecteer de kanalen die nodig zijn voor analyse. GA3 detecteert ook automatisch de kanalen in de afbeeldingen en geeft hun tabbladen weer onder Kanalen.
  4. Verwijder objecten die de rand van het kader raken.
    1. Omdat de Ai alle trilharenachtige objecten in het frame zal segmenteren, zal het ook onvolledige trilharen langs de randen van het frame detecteren. Deze objecten kunnen handmatig worden verwijderd in stap 3.4 of ze kunnen automatisch worden verwijderd in GA3. Selecteer Binaire verwerking > Objecten verwijderen > Randen aanraken.
  5. Selecteer parameters om trilharen te meten.
    1. Sleep de parameters om te meten, zoals de lengte van de trilharen(lengte)en de intensiteiten(somobjectintensiteit). Verbind de knooppunten met het juiste binaire knooppunt (verbinding A) en kanaalknooppunten (verbinding B). Plaats de muisaanwijzer op de knooppuntverbinding voor knopinfo om aan te geven tot welke verbinding het knooppunt behoort. Selecteer Meting > objectgrootte > lengte en meting > objectintensiteit > Obj-intensiteit optellen.
      OPMERKING: De knooppuntlengte maakt alleen verbinding met het binaire knooppunt, terwijl Sum Obj Intensity verbinding maakt met zowel de binaire als de kanaalknooppunten.
  6. Voeg de metingen toe aan één tabel.
    1. Combineer alle metingen in één uitvoertabel door het knooppunt Kolom toevoegen aan het analysestroomdiagram te slepen en neer te zetten en het te verbinden met de meetknooppunten, Lengte en Som Obj-intensiteit. Selecteer Gegevensbeheer > basis > kolom toevoegen.
  7. Meet trilharen.
    1. Meet trilharen door op Uitvoerente klikken. Dit proces duurt enkele ogenblikken om alle trilharen in de experimentele beelden te meten. De lengtes en intensiteiten worden weergegeven in een nieuw venster Analyseresultaten.
      OPMERKING: De tabel kan soms gegevens bevatten van maskers die Ai herkende als trilharen, maar te klein waren om door het menselijk oog te worden gedetecteerd en geëlimineerd in stap 3.4. Deze objecten kunnen uit de gegevensset worden verwijderd met behulp van een filter voordat statistische analyse wordt uitgevoerd. Hier werd een filter van 1 μm gebruikt voor in vitro cilia lengtemetingen in figuur 2 en 2 μm voor in vivo cilia. Dit kan worden gedaan voordat gegevens worden geëxporteerd met behulp van het onderstaande pad. Selecteer venster Analyseresultaten > Filter definiëren > Waarde invoeren > Filter gebruiken.
  8. Exporteer gegevens voor statistische analyse.

5. Colocalisatie studies

OPMERKING: Colocalisatie-analyse kan worden opgenomen in hetzelfde GA3-recept dat wordt gebruikt voor metingen van trilharenlengte en intensiteitsanalyse. Als u hetzelfde recept gebruikt, opent u bestanden zoals hieronder beschreven en meet u de lengtes en intensiteiten van beide kanalen, samen met de colocalisatiecoëfficiënten in dezelfde analysepijplijn.

  1. Open de experimentele gegevensset.
    1. Open de experimentele confocale afbeeldingen van trilharen in de software door het voorbeeld .tif bestanden te converteren naar .nd2 bestanden. Selecteer Bestand > Importeren/exporteren > ND-bestand maken van bestandsvolgorde.
    2. Selecteer in het pop-upvenster de monochrome bestanden met een 16-bits diepte uit alle interessante kanalen in de vensterverkenner in de eerste kolom van het pop-upvenster. Selecteer Multipoint of Z-serie in het eerste vervolgkeuzemenu en voer een waarde in die overeenkomt met het totale aantal afbeeldingen of stapels.
    3. Selecteer in de tweede vervolgkeuzelijst Golflengte en wijzig de waarde in het totale aantal kanalen in de map. De software ontgrendelt automatisch een golflengteselectievenster rechtsonder in het pop-upvenster. Gebruik het vervolgkeuzemenu Kleur om de kleur van elk kanaal te selecteren. Geef elk kanaal een andere naam in de kolom Naam. Zodra alle informatie is bijgewerkt, klikt u op Converteren. De software genereert automatisch een alle afbeeldingsbestand bedekt met alle individuele afbeeldingen van alle geselecteerde kanalen.
  2. Kalibreer afbeeldingen.
    1. Voer de pixelgrootte in de linkerbenedenhoek van de afbeelding in. Klik met de rechtermuisknop op Niet-gekalibreerde > document kalibreer > pixelgrootte.
  3. Voer de getrainde Ai uit op het eerste kanaal.
    1. Begin met het identificeren van de trilharen op een van de geopende kanalen (bijv. ACIII; Figuur 5A) met behulp van Ai. De software tekent nu binaries op ACIII-gelabelde trilharen op basis van de training die het voor dit kanaal heeft gekregen. Dit proces duurt enkele seconden. Selecteer NIS.ai > Segment.ai > bronkanalen > ACIII.
  4. Voer de getrainde Ai uit op het tweede kanaal.
    1. Begin met het identificeren van de trilharen op het andere geopende kanaal (bijv. MCHR1; Figuur 5B) met behulp van Ai. De software tekent nu binaries op MCHR1-gelabelde trilharen op basis van de training die het voor dit kanaal heeft gekregen. Dit proces zal enkele ogenblikken duren. Selecteer NIS.ai > Segment.ai > bronkanalen > MCHR1.
  5. Controleer afbeeldingen op verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden.
    1. Zodra de Ai trilharen en getekende dubbelsterren heeft geïdentificeerd, controleert u de afbeeldingen op verkeerd geïdentificeerde objecten. Verwijder indien nodig handmatig verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden. Selecteer Weergave > analysebesturingselementen > binaire werkbalk > Object verwijderen.
  6. Maak een nieuw GA3-recept.
    1. Nu de trilharen zijn geïdentificeerd en gesegmenteerd, gaat u verder met de colocalisatieanalyse met behulp van de GA3-tool. Dit opent een nieuw venster met een lege ruimte in het midden waar de analyse wordt gedefinieerd. Er wordt een venster gegenereerd met alle geïdentificeerde binaire bestanden en kanalen. Controleer of alle gewenste kanalen en binaire bestanden die nodig zijn voor analyse aanwezig en geselecteerd zijn. Selecteer Afbeelding > nieuw GA3-recept.
  7. Verwijder objecten die de rand van het kader raken.
    1. Omdat de Ai alle trilharenachtige objecten in het frame zal segmenteren, zal het ook onvolledige trilharen langs de randen van het frame detecteren. Deze objecten kunnen handmatig worden verwijderd in stap 5.5 of ze kunnen automatisch worden verwijderd in GA3. Selecteer Binaire verwerking > Objecten verwijderen > Randen aanraken.
  8. Stel het colocalisatietraject in GA3 in.
    1. Om de overlap van de twee kanalen binnen trilharen te meten, gebruikt u Mander's Coefficient Correlation. Sleep het knooppunt Manders-coëfficiënt naar de lege ruimte van het GA3-recept en verbind het met de juiste binaire en kanalen. Hier verbindt 'verbinding A' met het ACIII-binaire, 'verbinding B' met het MCHR1-kanaal en 'verbinding C' met het ACIII-kanaal om de overlap van MCHR1 binnen ACIII-binaire te bepalen. Selecteer Meting > objectverhoudingsmetrie > Manders-coëfficiënt.
      OPMERKING: De software maakt het mogelijk om colocalisatie te meten met behulp van Pearson Coefficient Correlation met behulp van dezelfde stappen als beschreven in dit protocol40.
  9. Voeg de metingen toe aan één tabel.
    1. Combineer alle metingen in één uitvoertabel. Selecteer Gegevensbeheer > basis > kolom toevoegen.
  10. Meet colocalisatie.
    1. Meet trilharen door op Uitvoerente klikken. Dit proces duurt enkele ogenblikken om alle trilharen in de experimentele beelden te meten. De gegevens worden weergegeven in een nieuw venster analyseresultaten.
  11. Exporteer gegevens voor statistische analyse.

Representative Results

Ai trainen om trilharen te identificeren
Het meten en beoordelen van de structurele lengte en samenstelling van trilharen kan een vervelend, tijdrovend en foutgevoelig proces zijn. Hier gebruiken we Ai voor het nauwkeurig segmenteren van trilharen uit een grote pool van afbeeldingen en analyseren we hun lengtes en intensiteiten met een analysetool(figuur 1). Alle Ai-benaderingen vereisen trainingsstappen voor de implementatie ervan. We hebben een trainingspijplijn opgezet om trilharen te herkennen, die werd uitgevoerd door handmatig binaire maskers op ciliaire structuren aan te brengen. Deze informatie wordt vervolgens gebruikt om de Ai te trainen op basis van pixelkenmerken onder de toegepaste binaire bestanden. Als algemene richtlijn, de training houdt in dat de software verschillende iteraties doorloopt, ongeveer 1000, en wordt als optimaal beschouwd als het trainingsverlies of foutenpercentage minder dan 1% is. Het aantal iteraties en fouten in het trainingsproces kan echter variëren, afhankelijk van de voorbeeldafbeeldingen die voor de training worden gebruikt. Bijvoorbeeld, na onze trainingssessies met behulp van in vitro neuronale trilharenbeelden, was het foutenpercentage 1,378% vergeleken met 3,36% voor in vivo hersensectiebeelden(aanvullende figuur 1). Zodra de training is voltooid, kan Ai vervolgens worden gebruikt om trilharen binnen enkele seconden uit experimentele beelden te segmenteren en worden de resulterende binaire maskers gebruikt voor het meten van structurele parameters. Dit elimineert de noodzaak om objecten te segmenteren met behulp van de traditionele methode van intensiteitsdrempeling, wat moeilijk kan zijn in afbeeldingen met hoge achtergrondruis of wanneer objecten zich dicht bij elkaar bevinden. Ai vermindert ook de kans op fouten en vooroordelen door hetzelfde algoritme toe te passen op alle afbeeldingen, ongeacht de gebruiker.

De lengte van trilharen meten met GA3
De lengte van trilharen wordt strak gereguleerd en wordt geassocieerd met functionele effecten op ciliaire signalering16,19. Hier hebben we trilharenlengtes gemeten met behulp van een analysepijplijn binnen NIS Elements-software genaamd General Analysis 3 of GA3. GA3 helpt bij het combineren van meerdere tools in één workflow om aangepaste routines voor elk experiment te bouwen. We begonnen met het meten van trilharenlengtes in een cellijn. Trilharen op de binnenste medullaire verzamelkanaalcellen (IMCD-3) van muizen werden immunoactief gelabeld met geacetyleerde tubuline en afgebeeld met behulp van een confocale microscoop. We hebben trilharenlengtes gemeten met GA3 na segmentering met segment.ai(aanvullende figuur 3A). Terwijl geacetyleerd α-tubuline bij voorkeur wordt aangetroffen in het primaire cilium, wordt het ook aangetroffen in andere microtubulirijke regio's zoals het cytoskelet en de cytokinetische brug. De getrainde Ai identificeerde op de juiste manier trilharen in het beeld, maar niet andere niet-ciliaire, geacetyleerde tubulinepositieve structuren. Trilharen op IMCD-cellen varieerden van 0,5 μm tot 4,5 μm met een gemiddelde lengte van 1,8 ± 0,04 μm(figuur 2A). Vervolgens testten we het vermogen van Ai om trilhaarlengtes te meten in primaire neuronale culturen. We kweekten neuronen uit de hypothalamus en hippocampus van neonatale muizen gedurende 10 dagen en immunolabelden ze met de trilharenmarker adenylaat cyclase III (ACIII)21,41. Bij het analyseren van neuronale culturen vonden we het nuttig om een filter toe te passen voordat we de lengtes statistisch analyseerden. Vanwege een lagere signaal-ruisverhouding werden verschillende objecten van minder dan 1 μm geïdentificeerd die geen trilharen waren. Daarom hebben we de gegevens gefilterd om objecten te verwijderen die minder dan 1 μm lang waren om ervoor te zorgen dat alleen trilharen werden geanalyseerd. In gekweekte hypothalamische neuronen varieerden de trilharenlengtes van 2 μm tot 7 μm met een gemiddelde lengte van 3,8 ± 0,19 μm(figuur 2B). Interessant is dat gekweekte hippocampale neuronale trilharen langer waren met een gemiddelde lengte van 6,73 ±0,15μm(figuur 2C). Er is gemeld dat verschillende neuronale kernen in de hypothalamus verschillende trilharenlengten vertonen en dat deze trilharen hun lengte veranderen als reactie op fysiologische veranderingen op een kernspecifieke manier19,23. Daarom hebben we ook hypothalamische hersensecties van volwassen mannelijke C57BL / 6J-muizen met ACIII gelabeld en de arcuate nucleus (ARC) en paraventriculaire kern (PVN) in beeld gebracht. Met behulp van GA3 om de lengte van trilharen te meten, zagen we dat de in vivo hypothalamische trilharen langer leken dan in vitro trilharen. In het bijzonder variëren hypothalamische trilharen in vivo van 1 μm tot ongeveer 15 μm(figuur 3). Er waren geen significante verschillen tussen de lengte van trilharen in het PVN (5,54 ± 0,0,42 μm) en die in het ARC (6,16 ± 0,27 μm) (Figuur 3C)23. Evenzo vertonen trilharen in het cornu ammonis (CA1) -gebied van de hippocampus een smaller lengtebereik van 1 μm tot 10 μm met een gemiddelde lengte van 5,28 ± 0,33 μm (figuur 3). In overeenstemming met eerder gepubliceerde studies toonde onze analyse met behulp van Ai- en GA3-tools aan dat trilharen uit verschillende hersengebieden diversiteit in lengte vertonen19,23. Bovendien zijn we met deze Ai-aanpak in staat om snel een groot aantal trilhaartjes te beoordelen.

De samenstelling van trilharen meten met GA3
Het primaire cilium is een signaleringshub voor vele routes die verschillende soorten eiwitten gebruiken om unieke functies uit te voeren, zoals motoreiwitten, intraflagellar transporteiwitten en GPCR's om er maar een paar te noemen3,24,42,43. Het handhaven van de juiste niveaus van deze eiwitten in het cilium is belangrijk voor een goede werking en lijkt vaak afhankelijk van de celcontext. Fluorescerende etikettering van deze eiwitten heeft ons niet alleen in staat gesteld om ze te visualiseren, maar ook om hun intensiteiten te kwantificeren als een maat voor de hoeveelheid van het gelabelde eiwit binnen het relatief kleinecompartiment 20. Daarom probeerden we de intensiteiten van een ciliaire GPCR, Melanine Concentrating Hormone Receptor 1 (MCHR1), in vivo te bepalen in zowel de ARC als pvn van de hypothalamus van volwassen mannelijke muizen24,44. Met behulp van Ai en GA3 hebben we de lengtes van MCHR1-positieve trilharen gemeten, samen met intensiteiten om ervoor te zorgen dat de objecten die worden geteld trilharen waren(aanvullende figuur 3A). We elimineerden objecten na analyse die minder dan 2 μm lang waren en analyseerden intensiteiten van resterende binaire maskers. Interessant is dat we ontdekten dat de intensiteit van ciliaire MCHR1 in PVN significant hoger is dan die in ARC, wat wijst op een sterkere aanwezigheid van ciliaire MCHR1 in PVN(figuur 4). Verdere studies zijn nodig om de betekenis van ciliaire MCHR1 in deze neuronale circuits te bepalen. We maten ook de intensiteiten van ciliaire MCHR1 in primaire gekweekte neuronen van de hypothalamus en hippocampus. Trilharen uit beide culturen vertonen een brede verspreiding van MCHR1-intensiteiten die wijzen op de aanwezigheid van heterogene neuronale populaties(aanvullende figuur 2). Het gebruik van geavanceerde analytische hulpmiddelen zoals Ai en GA3 maakt het dus mogelijk om de heterogeniteit van trilharen binnen hetzelfde weefsel of tussen meerdere weefsels te evalueren. Het zal interessant zijn om te zien of andere neuronale GPCR's vergelijkbare verschillen vertonen in hun lokalisatie in neuronen van hetzelfde weefsel en of dit verandert als reactie op fysiologische veranderingen.

Colocalisatie
Hoewel het meten van fluorescentie-intensiteiten binnen een compleet beeldveld een indruk van eiwit kan geven, slaagt het er niet in om informatie te verstrekken zoals ruimtelijke verdeling of nabijheid van andere nabijgelegen eiwitten en cellulaire structuren. Hier hebben we de overlap van MCHR1 met ACIII als trilharmarker gemeten door de intensiteiten van MCHR1 uit te zetten tegen die van ACIII voor elk binair masker (Figuur 5). De grafiek laat zien dat de meerderheid van de trilharen positief is voor beide, ACIII en MCHR1, hoewel sommige trilharen een sterkere expressie van het ene kanaal boven het andere vertonen. Verder zijn er enkele trilharen die de aanwezigheid van ACIII of MCHR1 laten zien, zoals blijkt uit de punten die respectievelijk direct op de x-as en de y-as liggen. Om deze overlap te kwantificeren, hebben we de overlapcoëfficiënt van Mander gemeten en de mate van MCHR1-expressie in neuronale trilharen van de ARC en PVN40vergeleken. Interessant is dat uit onze analyse bleek dat er een significante toename was van de coëfficiënten van het PVN (0,6382 ± 0,0151) dan die in de ARC (0,5430 ± 0,0181) (figuur 5C). Dit komt overeen met onze eerdere gegevens waar we hogere MCHR1-intensiteiten in PVN waarnamen in vergelijking met ARC(figuur 4). Deze gegevens suggereren dat, net als de lengte van trilharen, het expressiepatroon van MCHR1 in het ciliaire compartiment varieert in verschillende delen van de hersenen. Met behulp van dezelfde analysepijplijn zal het mogelijk zijn om te bepalen of andere ciliaire GPCR's zoals Neuropeptide Y Receptor Type 2 (NPY2R) en Somatostatine Receptor Type 3 (SSTR3) vergelijkbare hoeveelheden diversiteit vertonen.

Meetintensiteitsprofiel langs het cilium
Zodra trilharen zijn geïdentificeerd met behulp van segment.ai, kan het GA3-recept worden gewijzigd om trilharenanalyse te combineren met identificatie van andere structuren die van belang zijn voor het beeld. Etikettering met basale lichaamsmarkers is bijvoorbeeld nuttig voor de identificatie van de polariteit van trilharen. Om deze analyse uit te voeren, hebben we hypothalamische hersensecties van P0-muizen afgebeeld die ARL13B-mCherry en Centrin2-GFP tot expressie brengen en de ARC en PVN34in beeld gebracht. Hier werden trilharen geïdentificeerd met behulp van Ai zoals voorheen, maar nu omvat het gemodificeerde GA3-recept identificatie van Centrin2-GFP, een centriolar eiwit dat wordt aangetroffen aan de basis van trilharen(aanvullende figuur 3B). Door centrin2-GFP te labelen, kan de basis van trilharen worden onderscheiden van de uiteinden van ARL13B-mCherry positieve trilharen (figuur 6A). Dan, in plaats van de intensiteit binnen de hele trilharen te meten, kunnen we veranderingen in ARL13B-intensiteit over de lengte van trilharen meten (figuur 6B). We kunnen ook verschillen in de intensiteit van ARL13B vergelijken tussen de proximale uiteinden en distale uiteinden van de trilharen. Om dit te doen, verdeelden we de ciliumlengte in bakken van 1 micron vanaf de basis en wezen we de eerste micronbak aan als het proximale uiteinde en de laatste micron-bak als het distale uiteinde. Uit onze analyse bleek dat er significant meer ARL13B dichter bij de basis aanwezig is dan de punt van het cilium in zowel ARC als PVN, en dit is consistent met eerder gepubliceerde studies bij menselijke chondrocyten45 (figuur 6C). In dit type analyse worden, in plaats van een lengtefilter toe te passen om kleine niet-ciliaire objecten uit te sluiten van analyse, alleen trilharen geanalyseerd die geassocieerd zijn met Centrin2-GFP-etikettering. Dit kan voordelig zijn in situaties waarin genetische mutaties zeer korte trilharen maken, of als veranderingen in cilia-subdomeinen zoals de overgangszone of tip betrokken zijn. Identificatie van trilharen met behulp van Ai- en GA3-analyse is zeer aanpasbaar en kan worden aangepast aan een verscheidenheid aan complexe onderzoeksvragen.

Figure 1
Figuur 1. Workflow voor het meten van trilharenlengte en -intensiteit met behulp van Ai. (A) Om de Ai te trainen, worden binaries getekend rond de objecten van belang (trilharen) op de onbewerkte trainingsbeelden. Met behulp van de getekende dubbelsterren wordt Segment Ai getraind om de vorm en pixelintensiteiten van de trilharen te herkennen. (B) Vervolgens wordt de getrainde Segment Ai toegepast op onbewerkte experimentele beelden. Het tekent dubbelsterren op objecten die het herkent als trilharen. Deze binaire bestanden kunnen worden verfijnd om ervoor te zorgen dat alle en alleen trilharen worden geanalyseerd. (C) Een GA3-programma is geconstrueerd om de intensiteit en lengte van objecten te analyseren die door de Ai worden herkend. (D) De records worden geïmporteerd in een tabel in de software. Deze tabel kan vervolgens worden geëxporteerd voor verdere analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. In vitro trilharen lengtemetingen. Representatieve beelden van trilharen in (A) IMCD-cellen (groen, geacetyleerd tubuline) (B) primaire hypothalamische culturen (groen, ACIII) en (C) hippocampusculturen (groen, ACIII). Een getrainde Ai werd gebruikt om trilharen te herkennen zoals getoond in het binaire masker (magenta) en vervolgens werd GA3 gebruikt om de lengte van trilharen te meten. De verdeling van de trilharenlengte wordt weergegeven als percentage trilharen in bakken van 0,5 of 1,0 micron. * geeft aan dat cytokinetische brug correct niet wordt herkend door Ai. n=225 trilharen in IMCD-cellen van 3 replicaties, 54 trilharen in hypothalamische en 139 trilharen in hippocampusculturen van 3 dieren. Schaalbalken 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. In vivo cilia lengtemetingen. (A) Representatieve beelden van trilharen (groen, ACIII) in de ARC, PVN en CA1 van volwassen muizen hersensecties. (B) Een getrainde Ai in NIS-elementen werd gebruikt om trilharen te herkennen zoals weergegeven in het binaire masker (magenta) en vervolgens werd GA3 gebruikt om de lengte van trilharen te meten. (C) De verdeling van de lengte van de trilharen wordt weergegeven als percentage van de trilharen in bakken van één micron. n= 68 trilharen in ARC, 36 in PVN en 29 in CA1 van 3 dieren. Schaalbalken 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4. Ai assisteerde trilharen kleuring intensiteit metingen van hypothalamische neuronale trilharen. (A) Representatieve beelden van trilharen (MCHR1, rood) in de ARC en PVN van volwassen muizen hersensecties. Een getrainde Ai in NIS-elementen werd gebruikt om trilharen te herkennen zoals weergegeven in het binaire masker (cyaan) en vervolgens werd GA3 gebruikt om de intensiteit van MCHR1-kleuring in trilharen te meten. (B) MCHR1-intensiteiten worden weergegeven als gemiddelde ± S.E.M. Elke stip vertegenwoordigt een cilium. * p < 0,05, Student's t-test. (C) Verdeling van MCHR1-intensiteit wordt weergegeven als percentage trilharen in bakken van 0,2 x 107 willekeurige eenheden (A. U.). n= 53 trilharen in ARC, 78 in PVN van 3 dieren. Schaalbalken 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5. Ai ondersteunde cilia colocalisatie analyse. (A, B) Representatieve beelden van trilharen in respectievelijk de ARC en PVN. Trilharen zijn gelabeld met ACIII (groen) en MCHR1 (rood). Een getrainde Ai in NIS-elementen werd gebruikt om trilharen te herkennen zoals weergegeven in het binaire masker (magenta voor ACIII gelabelde trilharen, cyaan voor MCHR1 gelabelde trilharen). GA3 werd gebruikt om trilharen te herkennen die zowel ACIII als MCHR1 bevatten. (C) Manders overlap coëfficiënt (MOC) waarden worden weergegeven als gemiddelde ± S.E.M. Elke stip vertegenwoordigt een cilium. * p < 0,05, Student's t-test. (D) Scatter plot van MCHR1 intensiteit vs. ACIII intensiteit in ARC en PVN. Elke stip vertegenwoordigt een cilium. n= 72 trilharen in ARC, 47 in PVN van 3 dieren. Schaalbalken 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6. Trilharen en basale lichaamsanalyse. (A) Representatieve beelden van trilharen (rood, ARL13B-mCherry) en basale lichaamsmarker (groen, Centrin2-GFP) in de ARC en PVN van P0-muizen. Een getrainde Ai werd gebruikt om trilharen te herkennen zoals weergegeven in het binaire masker (cyaan). Het binaire masker voor basaal lichaam (magenta) werd getekend door drempeling in GA3 recept. (B) Representatieve lijnscanintensiteit van een cilium. (C)ARL13B-intensiteiten aan de proximale en distale uiteinden van Ai geïdentificeerde trilharen weergegeven als gemiddelde ± S.E.M. De proximale en distale uiteinden worden gedefinieerd als het gebied binnen respectievelijk de eerste 1 μm lengte en de laatste 1 μm lengte vanaf de basis van het cilium. Elke stip vertegenwoordigt een cilium. * p < 0,05. n = 6 trilharen in ARC van 2 dieren en 21 trilharen in PVN van 3 dieren. Schaalbalken 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1. Ai trainingsverlies grafieken. (A, B) Grafieken die trainingsverlies van segment.ai op neuronale trilharen in vitro en in vivo laten zien. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2. Ai Assisted Cilia kleuring intensiteit metingen van in vitro neuronale cilia. (A, B) Representatieve beelden van trilharen (MCHR1, rood) in respectievelijk primaire hypothalamische en hippocampusculturen. Een getrainde Ai in NIS-elementen werd gebruikt om trilharen te herkennen zoals weergegeven in het binaire masker (cyaan) en vervolgens werd GA3 gebruikt om de intensiteit van MCHR1-kleuring in trilharen te meten. De verdeling van de MCHR1-intensiteit wordt weergegeven als percentage trilharen in 1000 A.U. bakken voor hypothalamische en 2000 A. U. bakken voor hippocampusculturen. n= 30 trilharen in hypothalamische en 106 trilharen in hippocampusculturen van 3 dieren. Schaalbalken 10 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3. Algemene analyse 3 recepten voor trilharenanalyse. (A) Simple General Analysis (GA3) recept voor het meten van de lengte, intensiteit en Mander's coëfficiënt van trilharen. (B) Complex GA3-recept voor het meten van de intensiteit over de lengte van het cilium met behulp van een marker voor basaal lichaam. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Lengte- en intensiteitsmetingen zijn gebruikelijke manieren waarop primaire trilharen worden geanalyseerd, maar er is geen gestandaardiseerde conventionele methode die in het veld wordt gebruikt. Identificatie en kwantificering van primaire trilharen met behulp van software zoals ImageJ is tijdrovend en gevoelig voor gebruikersbias en fouten. Dit maakt het moeilijk om grote datasets nauwkeurig te analyseren. Hier laten we zien dat het gebruik van een Ai-programma veel van deze uitdagingen kan overwinnen, waardoor een hoge doorvoeranalyse van primaire trilharen haalbaar is. Hierin beschrijven we de procedure voor het trainen van een Ai-gebaseerde applicatie om primaire trilharen te herkennen en schetsen we de stappen die nodig zijn om lengte en intensiteit te analyseren.

Hoewel de initiële training van de Ai om trilharen te herkennen veel tijd van de gebruiker vereist, kan deze, eenmaal voltooid, worden gebruikt op elke dataset die met dezelfde parameters is verkregen. Het binaire masker dat door de Ai wordt gegenereerd, kan zodanig worden gewijzigd dat eventuele fouten kunnen worden gecorrigeerd. Fouten in de identificatie van trilharen moeten de gebruiker echter het signaal geven dat de Ai verder moet worden getraind met extra beelden. Een groot voordeel van deze methode is dat de Ai getraind kan worden om trilhaartjes in verschillende monstertypen te herkennen in zowel 2D als 3D. Eerdere analysemethoden die in laboratoria zijn gegenereerd, hebben verschillende beperkingen, waaronder het vereisen van handmatige drempels voor identificatie en problemen met het identificeren van trilharen die zijn afgebeeld uit weefselsecties waar de celdichtheid hoog is36,46,47. Deze methoden zijn ook gespecialiseerd voor trilharenanalyse, terwijl analyse met behulp van NIS Elements-software verschillende aspecten van de beelden tegelijkertijd kan evalueren. Omdat de hier beschreven Ai deel uitmaakt van het NIS Elements-softwarepakket, kunnen beelden die met een Nikon-microscoop zijn verkregen, eenvoudig worden voortgezet tot analyse. Beeldvorming met Nikon is echter niet vereist voor het gebruik van deze methode. Ongeacht het vastgelegde raw data-bestandsformaat, kunnen ".tif" -bestanden door NIS Elements worden geopend om te gebruiken in de Ai.

Deze Ai-toepassing binnen NIS Elements is breed beschikbaar en mogelijk al onderdeel van beeldanalysesoftware die wordt gebruikt door laboratoria die primaire trilharen bestuderen. Nu de prevalentie van Ai-technologie toeneemt, kunnen andere beeldvormingssoftware hun analyseopties uitbreiden met een vergelijkbare Ai-module. Het toepassen van Ai-analyse op trilharenidentificatie kan worden gebruikt voor verschillende aspecten van trilharenanalyse. Hoewel we methoden hebben geschetst voor een paar eenvoudige analyses zoals lengte(figuur 2 en 3),intensiteit(figuur 4)en colocalisatie(figuur 5),kan meer geavanceerde analyse worden toegevoegd aan de GA3-analyseworkflow zoals in figuur 6. In plaats van bijvoorbeeld de intensiteit van een volledig cilium te meten, kunnen verschillen in intensiteit binnen een subregio van een cilium van belang zijn om subciliaire lokalisatie te beoordelen. Verschillen in intensiteit binnen een subregio van een cilium kunnen erop wijzen dat het eiwit zich ophoopt aan de punt of de basis van het cilium, zoals hoe Gli-eiwitten worden verrijkt aan de punt van trilharen48. Bovendien kan deze Ai-toepassing worden gebruikt om gemakkelijk verschillen tussen genotypen of behandelingsgroepen te identificeren. Hoewel ons laboratorium deze methode voornamelijk gebruikt om trilharen uit hersensecties of neuronale culturen te analyseren, kan deze worden toegepast op afbeeldingen die zijn verkregen uit verschillende cellijnen of andere weefseltypen. De flexibiliteit van het monstertype waarop deze toepassing kan worden gebruikt, maakt deze analysemethode waardevol voor veel verschillende groepen die primaire trilharen of afzonderlijke organellen bestuderen die worden beoordeeld, zoals mitochondriën, kern of ER.

Disclosures

Co-auteur Wesley Lewis is een medewerker van Nikon. Er zijn geen financiële toelichtingen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 aan NFB en de American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 aan RB. We bedanken Rich Gruskin General Manager van Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft en Teresa Mastracci voor inzichtelijke opmerkingen over het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM Intel Corporation W-2123 Processor used for running NIS Elements.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Inc. - Ai and GA3 software
Quadro RTX 4000 Graphics card NVIDIA Corporation Quadro RTX 4000
Windows 10 Professional 64-bit Microsoft Inc. - Operating system used for running NIS Elements
Workstation HP Development Company, L.P. HP Z4G4 Workstation used for running NIS Elements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., et al. Ciliary gene RPGRIP1L is required for hypothalamic arcuate neuron development. JCI Insight. 4 (3), (2019).
  2. Siljee, J. E., et al. Subcellular localization of MC4R with ADCY3 at neuronal primary cilia underlies a common pathway for genetic predisposition to obesity. Nature Genetics. 50 (2), 180-185 (2018).
  3. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Current Biology. 17 (18), 1586-1594 (2007).
  4. Berbari, N. F., O'Connor, A. K., Haycraft, C. J., Yoder, B. K. The primary cilium as a complex signaling center. Current Biology. 19 (13), 526-535 (2009).
  5. Walz, G. Role of primary cilia in non-dividing and post-mitotic cells. Cell Tissue Research. 369 (1), 11-25 (2017).
  6. Nachury, M. V., Mick, D. U. Establishing and regulating the composition of cilia for signal transduction. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (7), 389-405 (2019).
  7. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  8. Engle, S. E., Bansal, R., Antonellis, P. J., Berbari, N. F. Cilia signaling and obesity. Seminars in Cell and Developmental Biology. , (2020).
  9. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
  10. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatric Nephrology. 26 (7), Berlin, Germany. 1039-1056 (2011).
  11. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. New England Journal of Medicine. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  12. Vaisse, C., Reiter, J. F., Berbari, N. F. Cilia and Obesity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), (2017).
  13. Berbari, N. F., et al. Leptin resistance is a secondary consequence of the obesity in ciliopathy mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), 7796-7801 (2013).
  14. Jacobs, D. T., et al. Dysfunction of intraflagellar transport-A causes hyperphagia-induced obesity and metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 789-798 (2016).
  15. Arsov, T., et al. Fat aussie--a new Alström syndrome mouse showing a critical role for ALMS1 in obesity, diabetes, and spermatogenesis. Molecular Endocrinology. 20 (7), 1610-1622 (2006).
  16. Tam, L. W., Ranum, P. T., Lefebvre, P. A. CDKL5 regulates flagellar length and localizes to the base of the flagella in Chlamydomonas. Molecular Biology of the Cell. 24 (5), 588-600 (2013).
  17. Rajagopalan, V., Subramanian, A., Wilkes, D. E., Pennock, D. G., Asai, D. J. Dynein-2 affects the regulation of ciliary length but is not required for ciliogenesis in Tetrahymena thermophila. Molecular Biology of the Cell. 20 (2), 708-720 (2009).
  18. Bengs, F., Scholz, A., Kuhn, D., Wiese, M. LmxMPK9, a mitogen-activated protein kinase homologue affects flagellar length in Leishmania mexicana. Molecular Microbiology. 55 (5), 1606-1615 (2005).
  19. Han, Y. M., et al. Leptin-promoted cilia assembly is critical for normal energy balance. Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2193-2197 (2014).
  20. Caspary, T., Marazziti, D., Berbari, N. F. Cilia: Methods and Protocols. Satir, P., Tvorup Christensen, S. , Springer. New York. 203-214 (2016).
  21. Bishop, G. A., Berbari, N. F., Lewis, J., Mykytyn, K. Type III adenylyl cyclase localizes to primary cilia throughout the adult mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 505 (5), 562-571 (2007).
  22. Domire, J. S., Mykytyn, K. Markers for neuronal cilia. Methods in Cell Biology. 91, 111-121 (2009).
  23. Sun, J. S., et al. Ventromedial hypothalamic primary cilia control energy and skeletal homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), (2021).
  24. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
  25. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Research. 872 (1-2), 271-275 (2000).
  26. Domire, J. S., et al. Dopamine receptor 1 localizes to neuronal cilia in a dynamic process that requires the Bardet-Biedl syndrome proteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (17), 2951-2960 (2011).
  27. Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89 (3), 909-926 (1999).
  28. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), 10335-10340 (2014).
  29. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  30. Berman, S. A., Wilson, N. F., Haas, N. A., Lefebvre, P. A. A novel MAP kinase regulates flagellar length in Chlamydomonas. Current Biology. 13 (13), 1145-1149 (2003).
  31. Nguyen, R. L., Tam, L. W., Lefebvre, P. A. The LF1 gene of Chlamydomonas reinhardtii encodes a novel protein required for flagellar length control. Genetics. 169 (3), 1415-1424 (2005).
  32. Tam, L. W., Wilson, N. F., Lefebvre, P. A. A CDK-related kinase regulates the length and assembly of flagella in Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 176 (6), 819-829 (2007).
  33. O'Connor, A. K., et al. An inducible CiliaGFP mouse model for in vivo visualization and analysis of cilia in live tissue. Cilia. 2 (1), 8 (2013).
  34. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (2), 113-122 (2015).
  35. Delling, M., et al. Primary cilia are not calcium-responsive mechanosensors. Nature. 531 (7596), 656-660 (2016).
  36. Saggese, T., Young, A. A., Huang, C., Braeckmans, K., McGlashan, S. R. Development of a method for the measurement of primary cilia length in 3D. Cilia. 1 (1), 11 (2012).
  37. Kobayashi, Y., Hamamoto, A., Saito, Y. Analysis of ciliary status via G-protein-coupled receptors localized on primary cilia. Microscopy. 69 (5), 277-285 (2020).
  38. Zhou, L. Q., et al. Artificial intelligence in medical imaging of the liver. World Journal of Gastroenterology. 25 (6), 672-682 (2019).
  39. Naugler, C., Church, D. L. Automation and artificial intelligence in the clinical laboratory. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 56 (2), 98-110 (2019).
  40. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  41. Bansal, R., et al. Hedgehog Pathway Activation Alters Ciliary Signaling in Primary Hypothalamic Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 266 (2019).
  42. Jin, H., et al. The conserved Bardet-Biedl syndrome proteins assemble a coat that traffics membrane proteins to cilia. Cell. 141 (7), 1208-1219 (2010).
  43. Liew, G. M., et al. The intraflagellar transport protein IFT27 promotes BBSome exit from cilia through the GTPase ARL6/BBS3. Developmental Cell. 31 (3), 265-278 (2014).
  44. Engle, S. E., et al. A CreER Mouse to Study Melanin Concentrating Hormone Signaling in the Developing Brain. Genesis. , (2018).
  45. Thorpe, S. D., et al. Reduced primary cilia length and altered Arl13b expression are associated with deregulated chondrocyte Hedgehog signaling in alkaptonuria. Journal of Cellular Physiology. 232 (9), 2407-2417 (2017).
  46. Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8, 1 (2019).
  47. Dummer, A., Poelma, C., DeRuiter, M. C., Goumans, M. J., Hierck, B. P. Measuring the primary cilium length: improved method for unbiased high-throughput analysis. Cilia. 5, 7 (2016).
  48. Haycraft, C. J., et al. Gli2 and Gli3 localize to cilia and require the intraflagellar transport protein polaris for processing and function. PLoS Genetics. 1 (4), 53 (2005).

Tags

Biologie Nummer 171
Kunstmatige intelligentie benaderingen voor het beoordelen van primaire trilharen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T.… More

Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T. K., Brewer, K. M., Lewis, W. R., Berbari, N. F. Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia. J. Vis. Exp. (171), e62521, doi:10.3791/62521 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter