Summary
画像を分析する人工知能(Ai)の使用は、一般的に使用される方法と比較して、強力でバイアスが少なく、迅速なアプローチとして浮上しています。ここでは、細胞小器官、一次繊毛を認識し、厳密かつ再現可能な方法で長さや染色強度などの特性を分析するためにAiを訓練しました。
Abstract
Ciliaは、多くの哺乳類細胞型における多様なシグナル伝達経路のシグナル伝達センターとして機能する微小管ベースの細胞付属物である。繊毛の長さは、高度に保存され、厳しく調節され、異なる細胞タイプと組織間で異なり、そのシグナル伝達能力に直接影響を与える関係があります。例えば、繊毛は毛様体Gタンパク質共役受容体の活性化に応答してそれらの長さを変化させることが示されている。しかし、多数の繊毛の長さを正確かつ再現的に測定することは、時間と労力を要する手順です。現在のアプローチもエラーやバイアスが起こりやすいです。人工知能(Ai)プログラムは、広範なデータセットの同化、操作、最適化を可能にする機能により、これらの課題の多くを克服するために利用することができます。ここでは、Aiモジュールが 生体内 および インビトロ サンプルの両方からの画像で繊毛を認識するように訓練できることを実証する。訓練されたAiを使用して繊毛を同定した後、我々は、長さ、蛍光強度および共局在化のための単一のサンプルで何百もの繊毛を分析するアプリケーションを設計し、迅速に利用することができる。この公平なアプローチは、 インビトロの 異なる主要なニューロンの準備からのサンプルを比較するときだけでなく、動物内および動物間の異なる脳領域間で私たちの自信と厳しさを高めました。さらに、この技術は、複数のサンプルおよび治療群にわたって高スループットの方法で任意の細胞タイプおよび組織からの繊毛ダイナミクスを確実に分析するために使用することができる。最終的には、ほとんどの分野が画像取得と解析のためのバイアスが少なく、より再現性の高いアプローチに向かうにつれて、Aiベースのアプローチが標準になる可能性が高くなります。
Introduction
原発性繊毛は、ほとんどの哺乳類細胞タイプ1、2、3、4から突き出た感覚オルガネラである。それらは一般に細胞外シグナル5、6、7を統合することによって多様な細胞シグナル伝達経路を調整するために重要な孤独な付属物である。原発性繊毛は、胚発生および成人組織恒常性の間に重要な役割を果たし、その機能または形態の破壊は、集団的にシリオパシーと呼ばれるいくつかの遺伝性疾患に関連している。繊毛の近く遍在性のために、繊毛症は、すべての臓器系8、9、10、11、12に影響を与えることができる幅広い臨床特徴に関連付けられている。毛様症の動物モデルにおいて、毛様体構造またはシグナル伝達能力の喪失は、高phagia関連肥満3、13、14、15を含むいくつかの臨床的に関連するフェノタイプにおいて現れる。多くのモデルシステムでは、繊毛の長さの変化が信号容量と機能16、17、18、19に影響を与えることを示している。しかし、繊毛の長さと組成を正確かつ再現的に評価することに関連する、いくつかの時間と技術的な課題があります。
成人哺乳類中枢神経系(CNS)は、繊毛の形態と機能を理解するための課題を提起している1つの生物学的文脈である。CNS全体のニューロンと細胞は繊毛を持っているように見えますが、これらの繊毛を観察して分析するツールや能力が限られているため、それらの機能の理解は依然として不可解な20のままです。例えば、原型繊毛マーカーは、アセチル化α-管状リン、神経細胞繊毛20に標識しない。これらの繊毛を研究することの難しさは、いくつかのGタンパク質共役受容体(GPCR)の発見によって部分的に解決され、神経繊毛21,22の膜上に富むシグナル伝達機械および膜関連タンパク質が含まれる。これらの簡単な基本的な観察のすべては、これまでのところ他の組織によって比類のないように見えるCNS繊毛の重要性と多様性を示唆しています。例えば、繊毛の長さおよびGPCRの局在の変動は、脳全体で観察することができ、あるニューロン核の長さは他の核19,23と比較すると異なっている。同様に、GPCR含有量とシグナル伝達機械の賛辞は、神経解剖学的位置と神経タイプ2、24、25、26、27、28、29に基づいて多様性を示す。これらの単純な観察は、クロミドマス・ラインハルトイのようなモデル生物と同様に、哺乳類のCNS繊毛の長さと組成が厳しく調節されていることを示しているが、これらの長さの違いが繊毛機能、シグナリングおよび最終的な挙動に及ぼす影響は、16、30、31、32のままである。
繊毛の長さと構成を正確に測定することは、ユーザーの誤りや再現性の問題が起こりやすい技術的課題であることが証明されています。現在、生体内およびインビトロにおける繊毛は、毛様体タンパク質または繊毛濃縮蛍光レポーターアレス33、34、35を標識する免疫蛍光アプローチを用いて最も頻繁に同定される。次に、これらの蛍光タグ付き繊毛の長さは、ImageJ36などの画像解析プログラムの線測定ツールを使用して2次元(2D)画像から測定されます。このプロセスは、退屈で労働集約的であるだけでなく、偏見や誤りが生じやすくなります。これらの同じ障害は、繊毛の構造37の変化を示す繊毛強度を測定するときに発生します。これらのタイプの画像解析における不整合を最小限に抑えるため、人工知能(Ai)プログラムは、より一般的で手頃な価格のオプション38になってきています。
Aiは、コンピュータアルゴリズムとプログラミングの利点を利用して、通常は人間の知能39を必要とするタスクを実行するコンピュータシステムの進歩です。Aiデバイスは、繰り返し発生するパターン、パラメータ、特性を知覚し、成功した結果を生み出す確率を最大化するためのアクションを実行するように教えられています。Ai は汎用性が高く、特定のオブジェクトや cilia などの目的の構造を認識するようにトレーニングを受けることができ、その後、識別されたオブジェクトに対してさまざまな解析を実行するようにプログラムできます。したがって、複雑な画像データは、Ai38によって迅速かつ再現的に生成することができる。キャプチャした画像の自動化とAi分析は、潜在的な人為的ミスとバイアスを制限しながら、有効性と効率を高めます39.繊毛同定のためのAiベースの方法論を確立することは、すべての研究グループが繊毛データを分析し、解釈するための一貫した方法を作成します。
ここでは、Aiモジュールを利用して 、生体内 およびイン ビトロの両方を 2D画像で同定します。サンプル画像のセットを使用して、Aiは繊毛を識別するために訓練されます。トレーニングが完了すると、指定されたAiを使用して、画像内のAi識別繊毛の上にバイナリマスクを適用します。Aiによって適用されるバイナリは、必要に応じて変更可能であり、画像内のすべての繊毛が適切に識別され、非特異的な識別が排除されるようにします。Aiを利用して繊毛を同定した後、カスタム構築の一般分析(GA)プログラムを使用して、繊毛の長さや蛍光強度の測定など、さまざまな分析を行います。収集されたデータは、簡単に読み取り、解釈、統計分析に使用できるテーブルにエクスポートされます(図1)。自動化技術とAiを用いて繊毛を同定し、実験群間で特定の測定値を得ることが、CNS繊毛機能と形態学が細胞細胞のコミュニケーションと行動に及ぼす影響を理解することを目的とした今後の研究に役立つ。
Protocol
1. 生画像を取得する
- 必要に応じて、修正および免疫標識サンプル20.
- ナイキスト解像度と同じピクセルサイズを使用して最大ビット深度で共焦点顕微鏡を使用した画像繊毛。
- イメージをモノクロタグ付き画像フォーマット(.tif)ファイルとしてエクスポートします。
注: このプロトコルは、特にNIS Elementsソフトウェア内でAiモジュールを使用する方法を概説しています。イメージが .nd2 ファイルとして取得された場合、イメージを.tifファイルとしてエクスポートする必要はありません。別のシステムで画像を取得した場合、NIS Elementsライセンスを別途購入することができ、次の手順で説明する.tifファイルを変換できます。
2. 繊を識別するためにAiを訓練する
- トレーニング データセットを開きます。
- ソフトウェアをトレーニングし、1 つのフォルダーにコピーするには、フレームごとに少なくとも 1 つの cilium を持つサンプル イメージを約 50 個選択します。このフォルダは、イメージを開くときにソフトウェアを指示するために使用されます。1 つの ND2 ドキュメント内でこれらの 50 フレームを開き、フレームごとに少なくとも 1 つの cilium を使用します。[ ファイル>インポート/エクスポート] > [ファイル シーケンスから ND ファイルを作成] を選択します。
- トレーニング データセットを含むフォルダを選択します。ダイアログ ウィンドウの中央にファイルの一覧が表示されます。上記のドロップダウン メニューで少なくとも 1 つのオプションを使用して、ファイルの編成を手動で定義します。オプションはマルチポイント(複数の最大投影ファイルの場合)、Zシリーズ(zスタック画像の場合)、時間(タイムラプス画像の場合)、波長(複数のチャンネルのファイルの場合)です。
- 選択した各オプションの下に対応する数値を入力します。オプションが選択されていない場合は 、[なし ] を選択します。[ 変換 ] をクリックして ND ドキュメントを開きます。
- 画像を調整します。
- イメージの左下隅にピクセル サイズを入力します> >。
- 繊毛を特定する。
- バイナリ ツールバーの[自動検出] または[オブジェクトの描画] を使用して、開いているすべてのフレームの個々の毛様体構造を正確にトレースして、繊毛を手で識別します。これにより、対象のオブジェクトにバイナリマスクが描画されます。これらのバイナリは、将来の実験画像解析において、ピクセルベースの特性に関する繊毛を識別するためのソフトウェアをトレーニングするためのサンプルオブジェクトとして機能します。[オブジェクト>描画] をクリックして、[バイナリ ツールバー] > [オブジェクト>描画] を選択します。
注:ソフトウェアは、開いているすべてのフレームのバイナリを検出できない限り、トレーニングを開始しないので、バイナリを持たないフレームを削除します。
- バイナリ ツールバーの[自動検出] または[オブジェクトの描画] を使用して、開いているすべてのフレームの個々の毛様体構造を正確にトレースして、繊毛を手で識別します。これにより、対象のオブジェクトにバイナリマスクが描画されます。これらのバイナリは、将来の実験画像解析において、ピクセルベースの特性に関する繊毛を識別するためのソフトウェアをトレーニングするためのサンプルオブジェクトとして機能します。[オブジェクト>描画] をクリックして、[バイナリ ツールバー] > [オブジェクト>描画] を選択します。
- Ai列車。
- ソフトウェアのトレーニングを開始します。これで電車の Segment.ai ボックスが開きます。 [NIS.ai >列車 Segment.ai]を選択します。
- [ トレーニング Segment.ai ボックスで、トレーニングに使用するソース チャネルを選択します。複数のチャンネルのファイルが開いている場合は、送信元チャンネルとして 1 つのチャンネルのみを選択します。次に、Aiを訓練する適切な地上真理バイナリを選択します。最後に、バイナリのサイズと分布に応じて Ai のトレーニングに必要な反復回数を選択します。
注: バイナリが周囲から容易に検出でき、画像全体に十分に配布されている場合、ソフトウェアは画像を識別するためのトレーニングを受けるために 1000 回未満の反復処理が必要な場合があります。画像の信号対雑音比が低い場合は、トレーニング中に少なくとも 1000 回の反復を実行して、Ai が高い信頼度でテスト サンプル内の繊毛を識別できるようにするのが理想的です。 - トレーニング済みの Ai ファイル (.sai) を保存する保存先フォルダを選択し、[ トレーニング ] をクリックしてソフトウェアをトレーニングします。ソフトウェアは、トレースされたバイナリに基づいて繊毛を識別するために自分自身を訓練するために進みます。このプロセスには数時間かかります。
注: トレーニング時に、ソフトウェアはトレーニングの損失を示すグラフを表示します。グラフは当初、テーパリング前にスパイクを示し、理想的には残りのトレーニングでプラトースで1%の損失を出します。[トレーニング Segment.ai] ボックスの [グラフ スクリーンショットの保存 ] ボックス (補足図 1)をオンにして、グラフを後で参照するためにグラフを保存します。 - トレーニングをさらに絞り込む必要がある場合は、同じデータセットでトレーニングを続けます。または、まったく同じパラメーターを使用して新しいデータセットをトレーニングします。異なるパラメータや対象のオブジェクトが異なる新しいデータセットで、すでに訓練された Ai をトレーニングすることはお勧めしません。[ トレーニング segment.ai >トレーニングを続行>トレーニング済み Ai ファイルを選択します。
3. 訓練を受けたAiを使用して繊毛を識別する
- 実験データセットを開きます。
- 手順 2.1 と同様に、サンプル .tif ファイルを .nd2 ファイルに変換して、ソフトウェアの cilia の実験的な共焦点イメージを開きます。[ ファイル>インポート/エクスポート] > [ファイル シーケンスから ND ファイルを作成] を選択します。
注: 画像は Ai のトレーニングに使用されるものと同じピクセルサイズにする必要があります。イメージが既に ND2 形式の場合は、手順 3.3 に進みます。
- 手順 2.1 と同様に、サンプル .tif ファイルを .nd2 ファイルに変換して、ソフトウェアの cilia の実験的な共焦点イメージを開きます。[ ファイル>インポート/エクスポート] > [ファイル シーケンスから ND ファイルを作成] を選択します。
- 画像を調整します。
- イメージの左下隅にピクセル サイズを入力します。[ドキュメント>ピクセル サイズを調整 >、キャリブレーションが行されていない] を右クリックします。
- 開いたファイルに対して訓練を受けた Ai を実行します。
- Aiを使用して繊毛の識別を開始します。ソフトウェアは、前のステップで受けたトレーニングに基づいて繊毛にバイナリを描画します。このプロセスには数秒かかります。[ NIS.ai > Segment.ai] を選択します。
注:複数のチャンネルが開いている場合、ソフトウェアはチャンネルを選択するように求められます。チャンネルは、それぞれの名前でここに表示されます。選択されていない場合は、[モノ] とマークされたボックスが自動的に選択されます。
- Aiを使用して繊毛の識別を開始します。ソフトウェアは、前のステップで受けたトレーニングに基づいて繊毛にバイナリを描画します。このプロセスには数秒かかります。[ NIS.ai > Segment.ai] を選択します。
- 誤って識別されたバイナリのイメージを確認します。
- Aiが繊毛を特定し、バイナリを描画したら、誤って識別されたオブジェクトがないか画像を確認します。必要に応じて、誤って識別されたバイナリを手動で削除します。[ オブジェクト >の削除] > [バイナリ ツール バー] > [解析コントロールの表示] を選択します。
4. 繊毛の長さと強度の測定
- 新しい一般分析 3 (GA3) レシピを作成します。
- 繊毛が特定され、セグメント化されたので、GA3 ツールを使用して長さや強度などの繊毛のさまざまなパラメータの解析に進みます。これにより、新しいウィンドウが開き、中央に空白が表示され、解析が定義されます。 [イメージ>新しい GA3 レシピ]を選択します。
- 分析するバイナリを選択します。
- 繊毛はすでに Segment.ai を使用してセグメント化されているため、GA3 は Ai に従って適切にラベル付けされたバイナリを自動的に検出し、ノードを含めます。[バイナリ>自動Detect_AI ] または [ バイナリ>描画Object_AI ] を選択します。
- 解析に必要なチャンネルを選択します。GA3 は、画像内のチャネルを自動的に検出し、そのタブを [チャネル]の下に表示します。
- フレームの境界に接するオブジェクトを削除します。
- Ai はフレーム内のすべての繊毛をオブジェクトのようにセグメント化するため、フレームのエッジに沿って不完全な繊毛も検出します。これらのオブジェクトは、ステップ 3.4 で手動で削除することも、GA3 で自動的に削除することもできます。[2 進処理> [接する境界>オブジェクトを削除する] を選択します。
- 繊毛を測定するパラメータを選択します。
- パラメータをドラッグ&ドロップして、繊毛の長さ (長さ) や強度 (合計オブジェクトの強度) などの測定を行います。ノードを適切なバイナリ ノード (接続 A) とチャネル ノード (接続 B) に接続します。ノード接続にカーソルを合わせると、ノードがどの接続に属しているかを示すツールチップが表示されます。 [計測>オブジェクトサイズ>長さ ]および [計測]>[オブジェクトの強度]>[合計]を選択します。
注: ノード の長さは バイナリ ノードにのみ接続され、 合計 Obj 強度は バイナリ ノードとチャネル ノードの両方に接続されます。
- パラメータをドラッグ&ドロップして、繊毛の長さ (長さ) や強度 (合計オブジェクトの強度) などの測定を行います。ノードを適切なバイナリ ノード (接続 A) とチャネル ノード (接続 B) に接続します。ノード接続にカーソルを合わせると、ノードがどの接続に属しているかを示すツールチップが表示されます。 [計測>オブジェクトサイズ>長さ ]および [計測]>[オブジェクトの強度]>[合計]を選択します。
- 1 つのテーブルに測定値を追加します。
- ノードの 追加列を分析フローチャートにドラッグアンドドロップして、すべての測定値を単一の出力テーブルに結合し、それを測定ノードの 長さ および 合計 Obj の強度に接続します。 [ データ管理>基本>列の追加]を選択します。
- 繊毛を測定する。
- [ 実行] をクリックして、繊毛を測定します。このプロセスは、実験画像内のすべての繊毛を測定するのに少し時間がかかります。長さと強度は、新しい 解析結果 ウィンドウに表示されます。
注: テーブルには、Ai が繊毛と認識したが、小さすぎて人間の目で検出できない、ステップ 3.4 で除去されたマスクからのデータが含まれることがあります。これらのオブジェクトは、統計分析の前にフィルターを使用して、データ・セットから除去することができます。ここでは、インビボ繊毛用の図2および2μmのインビトロ繊毛長測定に1μmのフィルターを使用しました。これは、以下の経路を使用してデータをエクスポートする前に行うことができます。[解析結果] ウィンドウ>フィルタを定義>[フィルタを使用] >値を入力します。
- [ 実行] をクリックして、繊毛を測定します。このプロセスは、実験画像内のすべての繊毛を測定するのに少し時間がかかります。長さと強度は、新しい 解析結果 ウィンドウに表示されます。
- 統計分析のためにデータをエクスポートします。
5. 共同ローカリゼーション研究
注: 共局在分析は、繊毛の長さと強度分析の測定に使用される同じ GA3 レシピに含めることができます。同じレシピを使用する場合は、以下に説明するようにファイルを開き、同じ分析パイプライン内の共局在化係数とともに両方のチャネルの長さと強度を測定します。
- 実験データセットを開きます。
- サンプルファイルを.nd2ファイルに変換して、ソフトウェアのcilia .tifの実験的な共焦点画像を開きます。[ ファイル>インポート/エクスポート] > [ファイル シーケンスから ND ファイルを作成] を選択します。
- ポップアップ ウィンドウで、ポップアップ ウィンドウの最初の列にあるウィンドウ エクスプローラから、関心のあるすべてのチャネルから 16 ビットの深度モノクロ ファイルを選択します。最初のドロップダウン メニューから [マルチポイント ] または [Z シリーズ ] を選択し、それぞれイメージまたはスタックの合計数に対応する値を入力します。
- 2 番目のドロップダウン ボックスで、[波長] を選択し、値をフォルダ内のチャネルの合計数に変更します。ソフトウェアは自動的にポップアップウィンドウの右下の端にある波長選択ウィンドウのロックを解除します。[色] ドロップダウン メニューを使用して、各チャネルの色を選択します。[名前] 列に、各チャネルに異なる名前を指定します。すべての情報が更新されたら、[変換] をクリックします。ソフトウェアは自動的に選択したすべてのチャンネルからすべての個々のイメージでオーバーレイすべての画像ファイルを生成します。
- 画像を調整します。
- イメージの左下隅にピクセル サイズを入力します。[ドキュメント>ピクセル サイズを調整 >、キャリブレーションが行されていない] を右クリックします。
- 最初のチャンネルで訓練された Ai を実行します。
- 開いているチャネル(例えば、ACIII;など)の1つで繊毛の識別を開始します。 図 5A)Ai を使用します。ソフトウェアは、このチャンネルで受けたトレーニングに基づいて、ACIIIラベル付き繊毛にバイナリを描画します。このプロセスには数秒かかります。 ACIII NIS.ai > Segment.ai >ソースチャンネル>選択します。
- 訓練された Ai を 2 番目のチャンネルで実行します。
- 開いている他のチャネル (MCHR1 など) で繊毛の識別を開始します。 図 5B)Ai を使用します。ソフトウェアは、このチャンネルで受けたトレーニングに基づいて、MCHR1ラベル付き繊毛にバイナリを描画します。このプロセスには少し時間がかかります。 MCHR1 >NIS.ai > Segment.ai >ソースチャンネルを選択します。
- 誤って識別されたバイナリのイメージを確認します。
- Ai が繊毛を識別し、バイナリを描画したら、画像で誤って識別されたオブジェクトがないか確認します。誤って識別されたバイナリを必要に応じて手動で削除します。[ バイナリ ツールバー>オブジェクトの削除] > [ビュー >分析コントロール]を選択します。
- 新しい GA3 レシピを作成します。
- 繊毛が特定され、セグメント化された後、GA3 ツールを使用して共局在化分析に進みます。これにより、新しいウィンドウが開き、中央に空白が表示され、解析が定義されます。識別されたすべてのバイナリとチャネルを含むウィンドウが生成されます。解析に必要なすべてのチャネルとバイナリが存在し、選択されていることを確認します。 [イメージ>新しい GA3 レシピ] を選択します。
- フレームの境界に接するオブジェクトを削除します。
- Ai はフレーム内のすべての繊毛状オブジェクトをセグメント化するため、フレームのエッジに沿って不完全な繊毛も検出します。これらのオブジェクトは、ステップ 5.5 で手動で削除するか、GA3 で自動的に削除することができます。[2 進処理] > [接する境界線>オブジェクトを削除する] を選択します。
- GA3 で共局在化経路を設定します。
- 繊毛内の2つのチャンネルのオーバーラップを測定するには、マンダーの係数相関を使用します。 [Manders 係数 ] ノードを GA3 レシピの空白スペースにドラッグ アンド ドロップし、適切なバイナリとチャネルに接続します。ここで、「接続A」はACIIIバイナリ、MCHR1チャンネルとの「接続B」、ACIIIバイナリ内のMCHR1のオーバーラップを決定するACIIIチャンネルとの「接続C」と接続します。[ 測定>オブジェクト比測定>マダ係数] を選択します。
注: ソフトウェアは、このプロトコル40で説明されているのと同じ手順を使用してピアソン係数相関を使用して共局化を測定することができます。
- 繊毛内の2つのチャンネルのオーバーラップを測定するには、マンダーの係数相関を使用します。 [Manders 係数 ] ノードを GA3 レシピの空白スペースにドラッグ アンド ドロップし、適切なバイナリとチャネルに接続します。ここで、「接続A」はACIIIバイナリ、MCHR1チャンネルとの「接続B」、ACIIIバイナリ内のMCHR1のオーバーラップを決定するACIIIチャンネルとの「接続C」と接続します。[ 測定>オブジェクト比測定>マダ係数] を選択します。
- 1 つのテーブルに測定値を追加します。
- すべての測定値を 1 つの出力テーブルに結合します。[ データ管理>基本>列の追加]を選択します。
- 共ローカライズを測定します。
- [ 実行] をクリックして、繊毛を測定します。このプロセスは、実験画像内のすべての繊毛を測定するのに少し時間がかかります。データは新しい [解析結果] ウィンドウに表示されます。
- 統計分析のためにデータをエクスポートします。
Representative Results
繊毛を同定するAiのトレーニング
繊毛の構造長さと組成を測定および評価することは、面倒で時間がかかり、エラーが発生しやすいプロセスです。ここでは、Aiを使用して、画像の大きなプールから繊毛を正確にセグメント化し、その長さと強度を解析ツールで解析します(図1)。Ai のアプローチには、その実装に必要なトレーニングステップが必要です。毛様体構造にバイナリマスクを手動で適用して行われた繊毛を認識するためのトレーニングパイプラインを確立しました。この情報は、適用されたバイナリの下のピクセル特性に基づいて Ai をトレーニングするために使用されます。一般的なガイドラインとして、トレーニングはソフトウェアが数回の反復(約1000回)を経ることを含み、トレーニング損失またはエラー率が1%未満の場合は最適と見なされます。ただし、トレーニング プロセスの反復回数とエラー数は、トレーニングに使用するサンプル イメージによって異なります。例えば、 インビトロ 神経細胞の繊毛画像を用いたトレーニングセッションの後、イン ビボ 脳部画像の3.36%と比較してエラー率は1.378%であった(補足図1)。トレーニングが完了すると、Aiを使用して数秒以内に実験画像から繊毛をセグメント化し、結果として得られたバイナリマスクを使用して構造パラメータを測定します。これにより、バックグラウンドノイズの高い画像や、オブジェクトが近接している場合に困難な従来の強度しきい値方式を使用してオブジェクトをセグメント化する必要がなくなります。Ai は、ユーザーに関係なく、すべての画像に同じアルゴリズムを適用することで、エラーやバイアスの可能性を低減します。
GA3を使用した繊毛長の測定
繊毛の長さは厳しく規制されており、毛様体シグナル伝達に対する機能的な影響に関連しています16,19.ここでは、一般分析3またはGA3と呼ばれるNIS要素ソフトウェア内の分析パイプラインを使用して繊毛の長さを測定しました。GA3 は、複数のツールを 1 つのワークフローに組み合わせて、実験ごとにカスタマイズされたルーチンを構築する際に役立ちます。まず、細胞株中の繊毛の長さを測定しました。マウスの内側髄質収集ダクト(IMCD-3)細胞上の繊毛を、アセチル化チューブリンで免疫標識し、共焦点顕微鏡を用いて画像化した。segment.ai とのセグメント化後にGA3を使用して繊毛の長さを測定しました (補助図3A)。アセチル化されたαチューブリンは、主なシリウムに優先的に見られるが、細胞骨格およびサイトキネティック橋のような他の微小管豊かな領域にも見られる。訓練を受けたAiは、画像内の繊毛を適切に同定したが、他の非毛細動、アセチル化チューブリン陽性構造は同定しなかった。IMCD細胞の繊毛は、0.5 μmから4.5μmの範囲で、平均長さは1.8±0.04 μm(図2A)でした。次に、Aiが主要な神経細胞培養における繊毛の長さを測定する能力をテストしました。新生児マウスの視床下部および海馬から10日間培養し、繊毛マーカーアデニルシクラーゼIII(ACIII)21,41で免疫標識した。神経細胞培養を解析する際に、長さを統計的に分析する前にフィルタを適用すると便利であることがわかりました。信号対雑音比が低いため、1μm未満の物体が、繊毛でないものが同定された。そこで、長さが1μm未満のオブジェクトを除去し、繊毛のみを分析するようにデータをフィルタリングしました。培養された視床下部ニューロンでは、繊毛の長さは2μmから7μmの範囲で、平均長さは0.19μm±平均長は3.8μmである(図2B)。興味深いことに、培養海馬神経細胞繊毛は平均長6.73±0.15μmの長さを持つ長さであった(図2C)。視床下部内の異なる神経核は、異なる繊毛長を示し、これらの繊毛は、核特異的な方法で生理学的変化に応答してそれらの長さを変化することが報告されている19,23.そこで、ACIIIを有する成人雄C57BL/6Jマウスの視床下部脳切片に標識し、円弧核(ARC)およびパラベンチキュラー核(PVN)を画像化した。GA3を用いて繊毛の長さを測定し、インビボ視床下部繊毛がインビトロ繊毛よりも長く現れたことを観察した。具体的には、視床下部の視床下部のインビボの範囲は1μmから約15μm(図3)までである。PVN(5.54±0.0.42 μm)とARC(6.16±0.27 μm)の繊毛の長さとの間に有意な差はなかった(図3C)23。同様に、海馬のコルヌアンモニス(CA1)領域の繊毛は、平均長さ5.28±0.33μmの1μmから10μmまでの狭い長さの範囲を表示する(図3)。以前に発表された研究に従って、AiとGA3ツールを用いた分析は、異なる脳領域からの繊毛が長さ19、23の多様性を示していることを示した。また、このAiアプローチを用いて、多数の繊毛を迅速に評価することができる。
GA3を用いた繊毛組成の測定
一次シリウムは、さまざまな種類のタンパク質を利用して、モータタンパク質、フラベラ輸送タンパク質およびGPCRsなどのユニークな機能を実行する多くの経路のシグナル伝達ハブであり、3、24、42、43を挙げています。これらのタンパク質の適切なレベルをシリウム内で維持することは、適切な機能のために重要であり、しばしば細胞のコンテキスト依存性に見える。これらのタンパク質の蛍光標識は、それらを視覚化するだけでなく、比較的小さなコンパートメント20内の標識タンパク質の量の尺度としてそれらの強度を定量化することを可能にした。そこで、我々は、毛様体GPCR、メラニン濃縮ホルモン受容体1(MCHR1)の強度を、成人雄マウス24,44の視床下部のARC及びPVNの両方において生体内で決定することを求めた。AiとGA3を用いて、MCHR1陽性繊毛の長さを強度と共に測定し、計数される物体が繊毛であることを確認した(補助図3A)。長さが2μm未満の事後分析を除去し、残りのバイナリマスクの強度を解析しました。興味深いことに、PVNにおける毛様体MCHR1の強度は、PVNにおける毛様体MCHR1の存在が強いことを示すARCのそれよりも有意に高いことがわかった(図4)。これらの神経回路における毛様体MCHR1の重要性を決定するためには、さらなる研究が必要である。我々はまた、視床下部および海馬の一次培養ニューロンにおける毛様体MCHR1の強度を測定した。両培養物の繊毛は、異種ニューロン集団の存在を示唆するMCHR1強度の広い分布を示す(補足図2)。このように、AiやGA3のような洗練された分析ツールを使用することで、同じ組織内または複数の組織間の繊毛異質性の評価が可能になります。他の神経細胞GPCが同じ組織のニューロン内の局在に同様の違いを示しているかどうか、そしてこれが生理学的変化に応じて変化するかどうかは興味深いでしょう。
コローカリゼーション
画像分野全体で蛍光強度を測定すると、タンパク質の印象が得られますが、空間分布や他の近くのタンパク質や細胞構造への近接などの情報を提供することができません。ここでは、各バイナリマスクに対してMCHR1の強度をACIIIに対してプロットして、ACIIIを繊毛マーカーとしてMCHR1との重なり合いを測定した(図5)。グラフは、繊毛の大部分がACIIIとMCHR1の両方で正であることを示していますが、一部の繊毛は他方のチャネルの強い表現を示しています。さらに、X軸とy軸に直接位置する点から明らかなようにACIIIまたはMCHR1の存在を示す繊毛もある。この重複を定量化するために、マンダーの重なり係数を測定し、ARCとPVN40の神経膜繊毛におけるMCHR1発現の程度を比較した。興味深いことに、我々の分析は、PVNの係数(0.6382 ± 0.0151)がARC(0.5430±0.0181)の係数よりも有意に増加したことを明らかにした(図5C)。これは、ARCと比較してPVNでMCHR1強度が高い観測を行った以前のデータと一致しています(図4)。このデータは、繊毛の長さと同様に、毛様体内のMCHR1の発現パターンが脳の異なる領域で変化することを示唆している。同じ分析パイプラインを用いて、神経ペプチドY受容体2型(NPY2R)およびソマトスタチン受容体3(SSTR3)のような他の毛様体GPDRが同様の量の多様性を示すかどうかを判断することが可能となる。
シリウムに沿った強度プロファイルの測定
segment.ai を使用して繊毛が特定されると、GA3レシピを変更して、画像に関心のある他の構造の同定と繊毛分析を組み合わせることができます。たとえば、基底体マーカーによるラベリングは、繊毛極性の識別に役立ちます。この分析を行うために、ARL13B-mCherryおよびCentrin2-GFPを発現するP0マウスの視床下部脳切片を画像化し、ARCおよびPVN34を画像化した。ここでは、以前のようにAiを用いて繊毛を同定したが、現在、修飾GA3レシピには、繊毛の基部に見られるセントリオラータンパク質であるCentrin2-GFPの同定が含まれている(補助図3B)。Centrin2-GFPにラベルを付けることで、繊毛の基盤はARL13B-mCherry陽性繊毛の先端と区別することができる(図6A)。そして、繊毛全体の強度を測定する代わりに、繊毛の長さに沿ったARL13B強度の変化を測定することができる(図6B)。また、繊毛の近位端と遠位端の間のARL13Bの強度の違いを比較することもできます。これを行うために、シリウム長をベースから始まる1ミクロンビンに分割し、最初のミクロンビンを近位端に、最後のミクロンビンを遠位端として指定しました。我々の分析は、ARCおよびPVNの両方においてシリウムの先端よりも基部にかなり多くのARL13B存在があることを明らかにし、これはヒト軟骨細胞45(図6C)で以前に発表された研究と一致している。このタイプの解析では、長さフィルターを適用して小さな非毛様体系オブジェクトを分析から除外する代わりに、Centrin2-GFP ラベリングに関連する繊毛のみが分析されます。これは、遺伝子変異が非常に短い繊毛をレンダリングする状況や、遷移ゾーンや先端のような繊毛サブドメインの変化が関係している場合に有利です。AiおよびGA3分析を用いた繊毛の同定は、適応性が高く、様々な複雑な研究課題に合わせて調整することができます。
図 1.Aiを用いて繊毛の長さと強度を測定するためのワークフロー。(A) Ai を訓練するために、生のトレーニング画像上の対象物(繊毛)の周りにバイナリが描画されます。セグメント Ai は、描画されたバイナリを使用して、繊毛の形状とピクセルの強度を認識するようにトレーニングされます。(B)次に、訓練されたセグメントAiを生実験画像に適用する。これは、繊毛として認識されるオブジェクトにバイナリを描画します。これらのバイナリは、すべての繊毛のみが分析されていることを確認するために改良することができます。(C) Ai が認識するオブジェクトの強度と長さを分析するために GA3 プログラムが構築されます。(D) レコードはソフトウェアのテーブルにインポートされます。このテーブルは、さらに分析するためにエクスポートできます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.インビトロ繊毛長測定。(A)IMCD細胞(緑色、アセチル化チューブリン)(B)の主要視床下部培養(緑色、ACIII)および(C)海馬培養物(緑色、ACIII)における代表的な画像。訓練を受けたAiは、バイナリマスク(マゼンタ)に示すように繊毛を認識するために使用され、その後、GA3を使用して繊毛の長さを測定した。繊毛長の分布は、0.5または1.0ミクロンビンにおける繊毛の割合としてグラフ化されます。*は、サイトキネティックブリッジがAiによって正しく認識されないことを示します。3つの複製からIMCD細胞のn=225繊毛、視床下部の54の繊毛および3つの動物からの海馬培養の139の繊毛。スケールバー 10 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.インビボ 繊毛長測定。 (A) 成人マウス脳部のARC、PVN、CA1における繊毛(緑色、ACIII)の代表的な画像。(B) NIS要素の訓練を受けた Ai は、バイナリマスク(マゼンタ)に示すように繊毛を認識するために使用され、その後GA3を使用して繊毛の長さを測定した。(C)繊毛の長さの分布は、1ミクロンビンにおける繊毛の割合としてグラフ化される。アークではn=68繊毛、PVNでは36、CA1では3匹から29個。スケールバー 10 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.視床下部神経小体 の繊毛の繊毛染色強度測定を支援した。(A)成人マウス脳部のARCおよびPVNにおける繊毛(MCHR1、赤色)の代表的な画像。NIS要素の訓練を受けたAiは、バイナリマスク(シアン)に示すように繊毛を認識するために使用され、GA3は繊毛中のMCHR1染色の強度を測定するために使用された。(B) MCHR1 強度は平均± S.E.Mとしてグラフ化されます。各ドットは、シリウムを表します。* p < 0.05, 学生のtテスト.(C)MCHR1強度の分布は、0.2 x 107 任意単位(A.U.)のビン内の繊毛の割合としてグラフ化されます。アークではn= 53繊毛、3動物からPVNで78。スケールバー 10 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.Aiは、繊毛共局在解析を支援した。 (A, B)ARCおよびPVNにおける繊毛の代表的な画像。繊毛にはACIII(緑)とMCHR1(赤)のラベルが付いています。NISエレメントの訓練を受けたAiは、バイナリマスク(ACIIIラベル付き繊毛のマゼンタ、MCHR1ラベル付き繊毛のシアン)に示すように繊毛を認識するために使用されました。GA3は、ACIIIとMCHR1の両方を含む繊毛を認識するために使用された。(C)Mandersオーバーラップ係数(MOC)値は、平均±S.E.Mとしてグラフ化されます。各ドットは、シリウムを表します。* p < 0.05, 学生のtテスト.(D) ARC および PVN における MCHR1 強度対 ACIII 強度の散布図。各ドットは、シリウムを表します。アークではn=72繊毛、3動物からPVNで47。スケールバー 10 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.繊毛と大脳の体の分析。(A)P0マウスのARCおよびPVNにおける繊毛(赤、ARL13B-mCherry)および基底体マーカー(緑、セントリン2-GFP)の代表的な画像。訓練を受けたAiは、バイナリマスク(シアン)に示すように繊毛を認識するために使用された。基礎体(マゼンタ)のバイナリマスクは、GA3レシピの閾値によって描かれました。(B)シリウムの代表的なラインスキャン強度。(C)Arl13Bの近位および遠位端での強度は、平均±S.E.Mとしてグラフ化された繊毛を同定した。近位端と遠位端は、シリウムの基部からそれぞれ最初の1μmの長さと最後の1μmの長さの領域として定義されます。各ドットは、シリウムを表します。* p < 0.05.n= 3動物由来の2動物及びPVN中21個の繊毛からARCで6個の繊毛を含む。スケールバー 10 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助図 1.Aiトレーニングロスグラフ。(A, B)インビトロおよび生体内の神経細胞の繊毛における segment.ai のトレーニング損失を示すグラフ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補助図 2.Aiは 、インビトロ 神経性繊毛の強度測定を染色するCiliaを支援しました。(A, B)主要視床下部および海馬培養における繊毛(MCHR1、赤)の代表的な画像をそれぞれ示す。NIS要素の訓練を受けたAiは、バイナリマスク(シアン)に示すように繊毛を認識するために使用され、GA3は繊毛中のMCHR1染色の強度を測定するために使用された。MCHR1強度の分布は、視床下部の1000 A.U.ビンと海馬培養のための2000 A.U.ビンにおける繊毛の割合としてグラフ化される。n= 視床下部で30繊毛、海馬培養で106の繊毛を3匹から。スケールバー10 μm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補助図 3.繊毛分析のための一般分析3レシピ。(A)繊毛の長さ、強度、マンダー係数の測定のための簡単な一般分析 (GA3) レシピ。(B)基底体のマーカーを使用してシリウムの長さに沿って強度の測定のための複雑なGA3レシピ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
長さおよび強度の測定は、一次繊毛を分析する一般的な方法であるが、フィールドで使用される標準化された従来の方法はない。ImageJなどのソフトウェアを使用したプライマリ繊毛の同定と定量化は時間がかかり、ユーザーの偏見やエラーが発生しやすい。そのため、大規模なデータセットを正確に分析することが困難になります。ここでは、Aiプログラムを使用することで、これらの課題の多くを克服し、プライマリ繊毛の高スループット分析を達成できることを示します。ここでは、Aiベースのアプリケーションをトレーニングしてプライマリ繊毛を認識する手順を説明し、長さと強度を分析するために必要な手順を概説する。
繊毛を認識するためのAiの最初の訓練は、ユーザーからかなりの時間を必要としますが、完了したら、同じパラメータで取得した任意のデータセットで使用することができます。Ai によって生成されたバイナリ マスクは、エラーを修正できるように変更可能です。しかし、繊毛識別のエラーは、Aiが追加の画像でさらに訓練される必要があることをユーザーに知らせる必要があります。この方法の大きな利点の1つは、Aiが2Dと3Dの両方で異なるサンプルタイプで繊毛を認識するように訓練できることです。ラボ内で生成された以前の分析方法には、同定のための手動閾値の使用を必要とすることや、細胞密度が高い組織切片から画像化された繊毛を識別する問題など、さまざまな制限があります。これらの方法は、繊毛分析にも特化していますが、NIS Elementsソフトウェアを使用した解析では、画像のいくつかの側面を同時に評価できます。ここで説明するAiはNIS Elementsソフトウェアパッケージの一部であるため、ニコン顕微鏡を用いて撮影した画像を解析まで容易に継続することができます。ただし、この方法を使用するためにニコンによるイメージングは必要ありません。キャプチャされた生データファイル形式に関係なく、「.tif」ファイルは、Aiで使用するためにNIS Elementsによって開くことができます。
NIS要素内のこのAiアプリケーションは広く利用可能であり、おそらくすでに一次繊毛を研究するラボで使用されている画像解析ソフトウェアの一部です。Ai技術の普及に伴い、他のイメージングソフトウェアは、同様のAiモジュールを含むように分析オプションを拡大する可能性があります。繊毛同定にAi分析を適用することは、繊毛分析のいくつかの異なる側面に使用することができる。長さ (図 2 と 3)などの単純な分析の方法を概説しましたが 、強度 (図 4) と共局化 ( 図5) 図 6のように、より高度な分析を GA3 分析ワークフローに追加できます。例えば、完全なシリウムの強度を測定する代わりに、シリウムのサブ領域内の強度の違いは、副毛様配置を評価するために関心がある場合があります。シリウムのサブ領域内の強度の違いは、タンパク質が繊毛48の先端でグリタンパク質がどのように濃縮されるかなど、シリウムの先端または塩基に蓄積していることを示している可能性がある。さらに、このAiアプリケーションは、遺伝子型または治療群間の違いを容易に識別するために使用することができる。私たちの研究室では、主に脳の切り離しや神経細胞培養から画像化された繊毛を分析するためにこの方法を使用していますが、様々な細胞株や他の組織タイプから取得した画像に適用することができます。この応用が可能なサンプルタイプの柔軟性は、この分析方法を、一次繊毛を研究する多くの異なるグループや、ミトコンドリア、核、ERなどの評価対象となる離散オルガネラにとって有益な分析方法です。
Disclosures
共著者のウェスリー・ルイスはニコンの従業員です。財務上の開示はありません。
Acknowledgments
この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所R01 DK114008がNFBに資金を提供し、米国心臓協会フェローシップ・グラント#18PRE34020122 RBに資金提供しました。ニコンソフトウェア、メリッサ・ベントレー、コートニー・ヘイクラフト、テレサ・マストラチのリッチ・グルースキンゼネラルマネージャーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM | Intel Corporation | W-2123 | Processor used for running NIS Elements. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments Inc. | - | Ai and GA3 software |
| Quadro RTX 4000 Graphics card | NVIDIA Corporation | Quadro RTX 4000 | |
| Windows 10 Professional 64-bit | Microsoft Inc. | - | Operating system used for running NIS Elements |
| Workstation | HP Development Company, L.P. | HP Z4G4 | Workstation used for running NIS Elements |
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