Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Birincil Cilia'yı Değerlendirmede Yapay Zeka Yaklaşımları

Published: May 1, 2021 doi: 10.3791/62521
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 2Nikon Instruments Inc., 3Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University, 4Center for Diabetes and Metabolic Diseases, Indiana University School of Medicine

Summary

Görüntüleri analiz etmek için yapay zekanın (Ai) kullanımı, yaygın olarak kullanılan yöntemlere kıyasla güçlü, daha az önyargılı ve hızlı bir yaklaşım olarak ortaya çıkıyor. Burada Ai'yi hücresel bir organel, birincil cilia'yı tanıması ve uzunluk ve lekelenme yoğunluğu gibi özellikleri titiz ve tekrarlanabilir bir şekilde analiz etmesi için eğitdik.

Abstract

Cilia, birçok memeli hücre tipinde sinyal yolları çeşitliliği için sinyal merkezleri olarak işlev gösteren mikrotübül bazlı hücresel uzantılardır. Cilia uzunluğu yüksek oranda korunmuş, sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ve farklı hücre tipleri ve dokular arasında değişir ve sinyal kapasitelerini doğrudan etkilemede suçlanmıştır. Örneğin, cilia'nın silier G protein bağlantılı reseptörlerin aktivasyonuna yanıt olarak uzunluklarını değiştirdiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, çok sayıda cilia'nın uzunluklarını doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek zaman alıcı ve emek yoğun bir prosedürdür. Mevcut yaklaşımlar da hata ve önyargıya eğilimlidir. Yapay zeka (Ai) programları, kapsamlı veri kümelerinin asimilasyonuna, manipülasyonuna ve optimizasyonuna izin veren yetenekler nedeniyle bu zorlukların çoğunun üstesinden gelmek için kullanılabilir. Burada, bir Ai modülün hem in vivo hem de in vitro örneklerden görüntülerdeki cilia'yı tanımak için eğitilebileceğini gösteriyoruz. Cilia'yı tanımlamak için eğitilmiş Ai'yi kullandıktan sonra, uzunluk, floresan yoğunluğu ve birlikte lokalizasyon için yüzlerce cilia'yı tek bir örnekte analiz eden uygulamalar tasarlayabilir ve hızla kullanabiliriz. Bu tarafsız yaklaşım, farklı primer nöronal preps in vitro'dan ve bir hayvan içindeki ve hayvanlar arasındaki farklı beyin bölgelerinden örnekleri karşılaştırırken güvenimizi ve katılığımızı artırdı. Ayrıca, bu teknik, herhangi bir hücre tipinden ve dokudan cilia dinamiklerini birden fazla örnek ve tedavi grubunda yüksek verimli bir şekilde güvenilir bir şekilde analiz etmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, çoğu alan görüntü alma ve analiz için daha az önyargılı ve daha tekrarlanabilir yaklaşımlara doğru ilerledikçe yapay zeka tabanlı yaklaşımlar büyük olasılıkla standart hale gelecektir.

Introduction

Birincil cilia, çoğu memeli hücre tipi 1 , 2,3,4'tençıkıntılı duyusal organellerdir. Genellikle hücre dışı sinyalleri entegre ederek çeşitli hücre sinyal yollarını koordine etmek için kritik olan yalnız ekler5,6,7. Primer cilia embriyonik gelişim ve erişkin doku homeostazı sırasında önemli roller oynar ve işlevlerinin veya morfolojilerinin bozulması, toplu olarak ciliopatiler olarak adlandırılan çeşitli genetik bozukluklarla ilişkilidir. Cilia'nın neredeyse her yerde bulunan doğası nedeniyle, ciliopatiler tüm organ sistemlerini etkileyebilecek çok çeşitli klinik özelliklerle ilişkilidir 8,9,10,11,12. Ciliopatilerin hayvan modellerinde, silier yapı kaybı veya sinyal kapasitesi, hiperfaji ile ilişkili obezite 3,13,14,15dahil olmak üzere klinik olarak ilgili çeşitli fenotiplerde kendini gösterir. Birçok model sisteminde, cilia uzunluk değişikliklerinin sinyal kapasitelerini ve işlevlerini etkilediği gösterilmiştir16,17,18,19. Bununla birlikte, cilia uzunluğu ve bileşimini doğru ve tekrar tekrar değerlendirmekle ilişkili birkaç zaman alıcı ve teknik zorluk vardır.

Yetişkin memeli merkezi sinir sistemi (CNS), cilia morfolojisini ve işlevini anlamak için bir zorluk oluşturan biyolojik bir bağlamdır. CNS'deki nöronların ve hücrelerin cilia'ya sahip olduğu görünse de, bu cilia'yı gözlemlemek ve analiz etmek için sınırlı araçlar ve yetenekler nedeniyle işlevlerinin anlaşılması zor kalır20. Örneğin, asetillenmiş α-tubulin olan prototipik cilia işaretleyicisi nöronal cilia20'yi etiketlemez. Bu cilia'yı incelemenin zorluğu, nöronal cilia21,22membranında zenginleştirilmiş birkaç G protein bağlantılı reseptör (GPCR), sinyal makineleri ve membran ilişkili proteinlerin keşfi ile kısmen çözüldü. Tüm bu basit temel gözlemler, şimdiye kadar diğer dokular tarafından benzersiz görünen CNS cilia'nın önemine ve çeşitliliğine işaret ediyor. Örneğin, cilia uzunluğu ve GPCR lokalizasyonundaki varyasyon beyin boyunca gözlenebilir, bazı nöronal çekirdeklerdeki uzunluklar diğer çekirdeklerle karşılaştırıldığında farklıdır19,23. Benzer şekilde, GPCR içeriği ve sinyal makineleri iltifatı nöroanatomik konuma ve nöroanal tip 2,24,25,26,27,28,29'agöre çeşitlilik gösterir. Bu basit gözlemler, memeli CNS cilia uzunluğunun ve bileşiminin, Chlamydomonas reinhardtiigibi model organizmalarda olduğu gibi sıkı bir şekilde düzenlendiğini göstermektedir, ancak bu uzunluk farklılıklarının cilia işlevi, sinyalizasyon ve nihayetinde davranış üzerindeki etkisi belirsizliğini korumaktadır16,30,31,32.

Cilia uzunluğu ve bileşiminin doğru bir şekilde ölçülmesi, kullanıcı hatasına ve geri alınamazlığa eğilimli teknik bir zorluk olduğunu kanıtlamaktadır. Şu anda cilia in vivo ve in vitro en sık silier proteinleri veya cilia ile zenginleştirilmiş floresan muhabir alellerini etiketleyen immünofluoresan yaklaşımlar kullanılarak tanımlanır33,34,35. Floresan olarak etiketlenen bu cilia'nın uzunlukları daha sonra ImageJ 36 gibi görüntü analiz programlarında çizgi ölçüm araçları kullanılarak 2 boyutlu (2D) bir görüntüdenölçülür. Bu süreç sadece sıkıcı ve emek yoğun değil, aynı zamanda önyargı ve hataya da eğilimlidir. Bu aynı engeller, cilia yapısındaki değişiklikleri göstermeye yardımcı olan cilia yoğunluklarını ölçerken ortaya çıkar37. Bu tür görüntü analizlerindeki tutarsızlıkları en aza indirmek için, yapay zeka (Ai) programları daha yaygın ve uygun fiyatlı seçenekler haline geliyor38.

Ai, genellikle insan zekası gerektiren görevleri yürütmek için bilgisayar algoritmalarının ve programlamanın avantajını kullanan bilgisayar sistemlerininilerlemesidir 39. Ai cihazlarına yinelenen kalıpları, parametreleri ve özellikleri algılamaları ve başarılı sonuçlar yaratma olasılığını en üst düzeye çıkarmak için eylemlerde bulunanlar öğretilir. Ai çok yönlüdür ve cilia gibi belirli nesneleri veya ilgi çekici yapıları tanımak için eğitilebilir ve daha sonra tanımlanan nesneler üzerinde çeşitli analizler yapmak üzere programlanabilir. Bu nedenle, karmaşık görüntü verileri Ai38tarafından hızlı ve tekrarlanabilir . Yakalanan görüntülerin otomasyonu ve Ai analizi, herhangi bir potansiyel insan hatasını ve önyargısını sınırlarken etkinliği ve verimliliği artıracaktır39. Cilia tanımlaması için Ai tabanlı bir metodoloji oluşturmak, tüm araştırma gruplarının cilia verilerini analiz etmesi ve yorumlaması için tutarlı bir yol oluşturur.

Burada, 2D görüntülerde hem in vivo hem de in vitro cilia'yı tanımlamak için bir Ai modülü kullanıyoruz. Bir dizi örnek görüntü kullanan Ai, cilia'yı tanımlamak için eğitilir. Eğitim tamamlandıktan sonra, belirlenen Ai, bir görüntüde Ai tanımlanan cilia üzerine ikili maske uygulamak için kullanılır. Ai tarafından uygulanan ikili dosyalar, gerekirse görüntülerdeki tüm cilia'nın düzgün bir şekilde tanımlanmasını ve spesifik olmayan tanımlamanın ortadan kaldırılmasını sağlamak için değiştirilebilir. Cilia'yı tanımlamak için Ai'yi kullandıktan sonra, cilia uzunluğu ve floresan yoğunluğunu ölçmek gibi farklı analizleri gerçekleştirmek için özel olarak oluşturulmuş genel analiz (GA) programları kullanılır. Toplanan veriler kolayca okunabilen, yorumlanabilen ve istatistiksel analizler için kullanılabilecek bir tabloya dışa aktarılıyor (Şekil 1). Cilia'yı tanımlamak ve deneysel gruplar arasında belirli ölçümler elde etmek için otomatik teknoloji ve Ai'nin kullanılması, CNS cilia fonksiyonu ve morfolojisinin hücre-hücre iletişimi ve davranışı üzerindeki etkisini anlamaya yönelik gelecekteki çalışmalarda yardımcı olacaktır.

Protocol

1. Ham görüntüler elde edin

  1. Gerektiğinde düzeltme ve immünoloji örnekleri20.
    1. Nyquist çözünürlüğüyle aynı piksel boyutunu kullanarak maksimum bit derinliğinde konfokal mikroskop kullanan görüntü cilia.
    2. Görüntüleri tek renkli Etiketli Görüntü Biçimi (.tif) dosyaları olarak dışa aktarma.
      NOT: Bu protokol, Ai modülünün özellikle NIS Elements yazılımı içinde nasıl kullanılacağını özetlemektedir. Görüntüler .nd2 dosyaları olarak alınmışsa, görüntüleri .tif dosyaları olarak dışa aktarma gerekli değildir ve kullanıcı doğrudan 2.3 adımına devam edebilir. Görüntüler farklı bir sistemde edinilmişse, NIS Elements lisansı ayrı olarak satın alınabilir ve .tif dosyalar sonraki adımlarda özetlendiği gibi dönüştürülebilir.

2. Cilia'yı tanımlamak için Ai'yi eğitin

  1. Eğitim veri kümesini açın.
    1. Yazılımı eğitmek ve tek bir klasörde kopyalamak için kare başına en az bir cilium içeren yaklaşık 50 örnek görüntü seçin. Bu klasör, görüntüleri açarken yazılımı yönlendirmek için kullanılır. Bu 50 kareyi tek bir ND2 belgesinde, kare başına en az bir cilium ile açın. Dosya > Al/Ver > Dosya Sırasından ND Dosyası Oluştur 'useçin.
    2. Eğitim veri kümesini içeren klasörü seçin. Bu, iletişim penceresinin ortasındaki dosyaların listesini açar. Yukarıdaki açılır menüde en az bir seçenek kullanarak dosyaların organizasyonunu el ile tanımlayın. Seçenekler çok noktalı (birden fazla maksimum projeksiyon dosyası için), Z serisi (z yığın görüntüsü için), zaman (zaman atlamalı görüntü için) ve dalga boyudur (birden çok kanaldaki dosyalar için).
    3. Seçili her seçeneğin altına karşılık gelen sayısal değerleri girin. Seçeneklerin seçilmediği her yerde Yok'u seçin. ND belgesini açmak için Dönüştür'ü tıklatın.
  2. Görüntüleri kalibre edin.
    1. Görüntünün sol alt köşesine piksel boyutunu girin: Belgeyi Piksel Boyutu > Kalibre > Sağtıklatın.
  3. Cilia'yı teşhis edin.
    1. İkili Araç Çubuğu'ndaki Otomatik Algıla veya Nesne Çiz 'i kullanarak tüm açılan çerçevelerdeki tek tek siliary yapıları tam olarak izleyerek cilia'yı el ile tanımlayın. Bu, ilgi çekici nesnelere ikili maskeler çizecektir. Bu ikili dosyalar, gelecekteki deneysel görüntü analizinde piksel tabanlı özellikler üzerinde cilia'yı tanımlamak için yazılımı eğitmek için örnek nesneler olarak hizmet edecektir. nesne çizmek > İkili Araç Çubuğu > > Analiz Denetimlerini Görüntüle 'yiseçin.
      NOT: Yazılım, açılan çerçevelerin tümünde ikili dosyaları algılayamadığı sürece eğitime başlanmayacağından, ikili dosyaları olmayan herhangi bir çerçeveyi kaldırın.
  4. Ai'yi eğit.
    1. Yazılımı eğitmeye başlayın. Bu, treni Segment.ai kutusunu açacaktır. NIS.ai > Tren Segment.ai 'niseçin.
    2. Tren Segment.ai kutusunda, eğitim için kullanılacak kaynak kanalı seçin. Birden çok kanaldaki dosyalar açıksa, kaynak kanal olarak yalnızca bir kanal seçin. Ardından, Ai'nin eğitilmesi için uygun zemin gerçeği ikili dosyalarını seçin. Son olarak, ikili dosyaların boyutuna ve dağıtımına bağlı olarak Ai'yi eğitmek için gereken yineleme sayısını seçin.
      NOT: İkili dosyalar çevreden kolayca algılanabilir ve görüntü boyunca iyi dağıtılırsa, yazılımın görüntüleri tanımlamak için eğitilmek için 1000'den az yinelemeye ihtiyacı olabilir. Görüntüler düşük sinyal-gürültü oranına sahipse, Ai'nin test örneklerinde cilia'yı yüksek güvenle tanımlamasını sağlamak için eğitim sırasında en az 1000 yineleme çalıştırmak idealdir.
    3. Eğitilen Ai dosyasını (.sai) kaydetmek için hedef klasörü seçin ve yazılımı eğitmek için Eğit'i tıklatın. Yazılım şimdi izlenen ikili dosyalara dayanarak cilia tanımlamak için kendini eğitmeye devam edecek. Bu işlem birkaç saat sürer.
      NOT: Eğitim sırasında, yazılım eğitim kaybını gösteren bir grafik görüntüler. Grafik başlangıçta, eğitimin geri kalanı için platolaştığı ideal olarak% 1'lik bir kayba koniklemeden önce bir ani artış gösterecektir. Tren Segment.ai kutusunda grafiği kaydet ekran görüntüsü kutusunu işaretleyerek grafiği ileridebaşvurmaküzere kaydedin ( Ek Şekil 1 ).
    4. Eğitimde daha fazla iyileştirme gerekiyorsa, aynı veri kümesinde eğitime devam edin. Alternatif olarak, aynı parametrelere sahip yeni bir veri kümesi üzerinde eğitim. Zaten eğitilmiş bir Ai'yi farklı parametrelere veya farklı ilgi çekici nesnelere sahip yeni bir veri kümesi üzerinde eğitmeniz tavsiye edilmez. Eğit'i seçin segment.ai > Eğitime Devam > Eğitimli Ai Dosyasını Seçin.

3. Eğitimli Ai kullanarak cilia'yı tanımlayın

  1. Deneysel veri kümesini açın.
    1. Örnek .tif dosyalarını 2.1 adımına benzer şekilde .nd2 dosyalarına dönüştürerek yazılımdaki cilia'nın deneysel konfokal görüntülerini açın. Dosya > Al/Ver > Dosya Sırasından ND Dosyası Oluştur 'useçin.
      NOT: Görüntüler, Ai'yi eğitmek için kullanılan piksel boyutunda olmalıdır. Görüntüler zaten ND2 biçimindeyse, 3.3 adımına atlayın.
  2. Görüntüleri kalibre edin.
    1. Görüntünün sol alt köşesine piksel boyutunu girin. Belgeyi Piksel Boyutu > Kalibre > Ayarlanmamış 'ısağ tıklatın.
  3. Açılan dosyalarda eğitilmiş Ai'yi çalıştırın.
    1. Ai kullanarak cilia tanımlamaya başlayın. Yazılım şimdi önceki adımda aldığı eğitime dayanarak cilia üzerinde ikili dosyalar çizecek. Bu işlem birkaç saniye sürecektir. NIS.ai > Segment.aiseçin.
      NOT: Birden fazla kanal açıksa yazılım kanalı seçmesini ister. Kanallar burada kendi adlarıyla listelenir. Değilse, 'Mono' işaretli kutu otomatik olarak seçilir.
  4. Yanlış tanımlamalı ikili dosyalar için görüntüleri denetleyin.
    1. Ai cilia'yı tanımladıktan ve ikili dosyalar çizdikten sonra, yanlışlıkla tanımlanan nesneler için görüntüleri kontrol edin. İsterseniz, yanlış tanımlamalı ikili dosyaları el ile silin. Nesneyi Sil > İkili Araç Çubuğu > > Çözümleme Denetimlerini Görüntüle 'yiseçin.

4. Cilia uzunluğu ve yoğunluğunun ölçülmesi

  1. Yeni bir Genel Analiz 3 (GA3) tarifi oluşturun.
    1. Şimdi cilia tanımlandı ve segmentlere, GA3 aracını kullanarak uzunluklar ve yoğunluklar gibi farklı cilia parametrelerini analiz etmeye devam edin. Bu, analizin tanımlanacağı merkezde boş bir alan içeren yeni bir pencere açacaktır. Resim > Yeni GA3 Tarifi 'niseçin.
  2. Çözümlemek için ikili dosyaları seçin.
    1. Cilia zaten Segment.ai kullanılarak segmentlere ayrıştırıldığından, GA3 Ai'ye göre uygun şekilde etiketlenmiş ikili dosyaları otomatik olarak algılar ve düğümü içerir. 'İkiliDosyalar > Otomatik Detect_AI' veya 'İkili Dosyalar > Object_AI Çiz' seçeneğini belirleyin.
  3. Analiz için gereken kanalları seçin. GA3 ayrıca görüntülerdeki kanalları otomatik olarak algılar ve sekmelerini Kanallaraltında görüntüler.
  4. Çerçevenin kenarlık kısmına dokunan nesneleri kaldırın.
    1. Ai, çerçevedeki nesneler gibi tüm cilia'yı segmentlere ayıracağından, çerçevenin kenarları boyunca tamamlanmamış cilia'yı da algılayacaktır. Bu nesneler adım 3.4'te el ile kaldırılabilir veya GA3'te otomatik olarak kaldırılabilir. İkili İşleme'yi seçin > Kenarlıklara Dokunan nesneler > kaldırın.
  5. Cilia'yı ölçmek için parametreleri seçin.
    1. Cilia uzunluğu (Uzunluk) ve yoğunluklar (Toplam Nesne Yoğunluğu) gibi ölçüm için parametreleri sürükleyip bırakın. Düğümleri uygun ikili düğüme (bağlantı A) ve kanal düğümlerine (B bağlantısı) bağlayın. Düğümün hangi bağlantıya ait olduğunu göstermek için araç ipucu için düğüm bağlantısının üzerine gelin. Nesne Boyutu > Uzunluğu > Ölçüm'> ve Nesne Yoğunluğunu Toplam Toplam Yoğunluğu > Ölçü'leriseçin.
      NOT: Düğüm Uzunluğu yalnızca ikili düğüme bağlanırken, Toplam Obj Yoğunluğu hem ikili hem de kanal düğümlerine bağlanır.
  6. Ölçümleri tek bir tabloya ekle.
    1. Düğüm Ekleme Sütununu analiz akış grafiğine sürükleyip bırakarak tüm ölçümleri tek bir çıktı tablosunda birleştirin ve ölçüm düğümlerine, Uzunluk ve Toplam Obj Yoğunluğunabağlayın. Temel > Ekleme Sütunu > Veri Yönetimi 'niseçin.
  7. Cilia'yı ölçün.
    1. Çalıştır'ı tıklatarak cilia'yı ölçün. Bu işlem, deneysel görüntülerdeki tüm cilia'yı ölçmek için birkaç dakika sürer. Uzunluklar ve yoğunluklar yeni bir Analiz Sonuçları penceresinde görünür.
      NOT: Tablo bazen Ai'nin cilia olarak tanıdığı ancak insan gözüyle tespit edilemeyecek kadar küçük olan ve 3.4. Bu nesneler istatistiksel çözümlemeden önce bir filtre kullanılarak veri kümesinden kaldırılabilir. Burada Şekil 2'de in vitro cilia uzunluk ölçümleri için 1 μm, in vivo cilia için 2 μm filtre kullanılmıştır. Bu, aşağıdaki yolu kullanarak veri dışa aktarmadan önce yapılabilir. Analiz Sonuçları penceresini seçin > Filtre tanımlayın > Filtreyi > Girin.
  8. İstatistiksel analiz için verileri dışa aktar.

5. Kolokalizasyon çalışmaları

NOT: Kolikalizasyon analizi, cilia uzunluğu ve yoğunluk analizi ölçümleri için kullanılan aynı GA3 tarifine dahil edilebilir. Aynı tarifi kullanıyorsanız, dosyaları aşağıda açıklandığı gibi açın ve aynı analiz işlem hattındaki colocalization katsayılarıyla birlikte her iki kanalın uzunluklarını ve yoğunluklarını ölçün.

  1. Deneysel veri kümesini açın.
    1. Örnek .tif dosyalarını .nd2 dosyalarına dönüştürerek yazılımdaki cilia'nın deneysel konfokal görüntülerini açın. Dosya > Al/Ver > Dosya Sırasından ND Dosyası Oluştur 'useçin.
    2. Açılır pencerede, açılır pencerenin ilk sütununda bulunan pencere gezgininden tüm ilgi çekici kanallardan 16 bit derinlik tek renkli dosyaları seçin. İlk açılan menüden Multipoint veya Z Serisi'ni seçin ve sırasıyla toplam görüntü veya yığın sayısına karşılık gelen bir değer girin.
    3. İkinci açılan kutuda Dalga Boyu'nu seçin ve değeri klasördeki toplam kanal sayısına değiştirin. Yazılım, açılır pencerenin sağ alt ucunda bulunan bir Dalga Boyu seçim penceresinin kilidini otomatik olarak açar. Her kanalın rengini seçmek için Renk açılır menüsünü kullanın. Ad sütununun altında her kanala farklı bir ad sağlayın. Tüm bilgiler güncelleştirildikten sonra Dönüştür 'ütıklatın. Yazılım otomatik olarak tüm seçilen kanallardan tüm tek tek görüntülerle üst üste bindirilmiş bir Tüm görüntü dosyası oluşturur.
  2. Görüntüleri kalibre edin.
    1. Görüntünün sol alt köşesine piksel boyutunu girin. Belgeyi Piksel Boyutu > Kalibre > Ayarlanmamış 'ısağ tıklatın.
  3. Eğitimli Ai'yi ilk kanaldan çalıştırın.
    1. Açılan kanallardan birinde (örneğin, ACIII; Şekil 5A) Ai kullanarak. Yazılım artık bu kanal için aldığı eğitime dayanarak ACIII etiketli cilia üzerine ikili dosyalar çizecek. Bu işlem birkaç saniye sürecektir. ACIII > NIS.ai > Segment.ai > Kaynak kanallarınıseçin.
  4. Eğitimli Ai'yi ikinci kanalda çalıştır.
    1. Diğer açılan kanalda (örneğin, MCHR1; Şekil 5B) Ai kullanarak. Yazılım şimdi bu kanal için aldığı eğitime dayanarak MCHR1 etiketli cilia'ya ikili dosyalar çizecek. Bu işlem birkaç dakika sürecektir. MCHR1 > NIS.ai > Segment.ai > Kaynak kanallarınıseçin.
  5. Yanlış tanımlamalı ikili dosyalar için görüntüleri denetleyin.
    1. Ai cilia'yı tanımladıktan ve ikili dosyalar çizdikten sonra, yanlış tanımlanmış nesneler için görüntüleri kontrol edin. Gerekirse yanlış tanımlamalı ikili dosyaları el ile silin. Nesneyi Sil > İkili Araç Çubuğu > > Çözümleme Denetimlerini Görüntüle 'yiseçin.
  6. Yeni GA3 tarifi oluşturun.
    1. Şimdi cilia tanımlandı ve segmentlere, GA3 aracını kullanarak kolokalizasyon analizine devam edin. Bu, analizin tanımlanacağı merkezde boş bir alan içeren yeni bir pencere açacaktır. Tanımlanan tüm ikili dosyaların ve kanalların yer alacağı bir pencere oluşturulur. Analiz için gereken tüm istenen kanalların ve ikili dosyaların mevcut ve seçili olduğunu doğrulayın. Resim > Yeni GA3 Tarifi 'niseçin.
  7. Çerçevenin kenarlık kısmına dokunan nesneleri kaldırın.
    1. Ai, çerçevedeki tüm cilia benzeri nesneleri segmentlere ayıracağından, çerçevenin kenarları boyunca tamamlanmamış cilia'yı da algılayacaktır. Bu nesneler adım 5.5'te el ile kaldırılabilir veya GA3'te otomatik olarak kaldırılabilir. İkili İşleme'yi seçin > Kenarlıklara Dokunma > nesneleri kaldırın.
  8. GA3'te kolokalizasyon yolunu kurun.
    1. Cilia içindeki iki kanalın çakışmasını ölçmek için Mander'in Katsayı Korelasyonunu kullanın. Manders Katsayı düğümünü GA3 tarifinin boş alanına sürükleyip bırakın ve uygun ikili ve kanallara bağlayın. Burada ,'connection A', ACIII ikilisi içinde MCHR1'in çakışmasını belirlemek için ACIII ikilisine, MCHR1 kanalıyla 'B bağlantısına' ve ACIII kanalına 'C bağlantısına' bağlanır. Manders Katsayısı > Ölçüm > Nesne OranMetrisi 'niseçin.
      NOT: Yazılım, bu protokolde açıklandığı adımları kullanarak Pearson Katsayı Korelasyonunu kullanarak kolokalizasyonun ölçülmesine izin verir40.
  9. Ölçümleri tek bir tabloya ekle.
    1. Tüm ölçümleri tek bir çıktı tablosunda birleştirin. Temel > Ekleme Sütunu > Veri Yönetimi 'niseçin.
  10. Kolokalizasyonu ölçün.
    1. Çalıştır'ı tıklatarak cilia'yı ölçün. Bu işlem, deneysel görüntülerdeki tüm cilia'yı ölçmek için birkaç dakika sürer. Veriler yeni bir Analiz Sonuçları penceresinde görünecektir.
  11. İstatistiksel analiz için verileri dışa aktar.

Representative Results

Cilia'yı tanımlamak için Ai'yi eğitmek
Cilia yapısal uzunluğunu ve bileşimini ölçmek ve değerlendirmek sıkıcı, zaman alıcı ve hataya eğilimli bir süreç olabilir. Burada, cilia'yı geniş bir görüntü havuzundan doğru bir şekilde segmentlere ayırıp uzunluklarını ve yoğunluklarını bir analiz aracıyla analiz etmek için Ai kullanıyoruz (Şekil 1). Tüm Ai yaklaşımları, uygulamaları için eğitim adımları gerektirir. Siliary yapılara manuel olarak ikili maskeler uygulanarak gerçekleştirilen cilia'yı tanımak için bir eğitim boru hattı kurduk. Bu bilgiler daha sonra uygulanan ikili dosyalar altındaki piksel özelliklerine göre Ai'yi eğitmek için kullanılır. Genel bir kılavuz olarak, eğitim yazılımın yaklaşık 1000 olmak üzere çeşitli yinelemelerden geçmesiyle içerir ve eğitim kaybı veya hata oranı% 1'den azsa en uygun olarak kabul edilir. Ancak, eğitim sürecindeki yinelemelerin ve hataların sayısı, eğitim için kullanılan örnek görüntülere bağlı olarak değişebilir. Örneğin, in vitro nöronal cilia görüntülerini kullanarak yaptığımız eğitim seansları sonrasında in vivo beyin kesiti görüntüleri için hata oranı %3,36 iken %1,378 olarak gerçeklenmiştir ( EkŞekil 1). Eğitim tamamlandıktan sonra, Ai daha sonra deneysel görüntülerden cilia'yı saniyeler içinde segmentlere ayırmak için kullanılabilir ve elde edilen ikili maskeler yapısal parametreleri ölçmek için kullanılır. Bu, yüksek arka plan gürültüsüne sahip görüntülerde veya nesneler birbirine yakın olduğunda zor olabilecek geleneksel yoğunluk eşiği yöntemini kullanarak nesneleri segmentlere ayırma ihtiyacını ortadan kaldırır. Ai ayrıca, kullanıcıdan bağımsız olarak tüm görüntülere aynı algoritmayı uygulayarak hata ve önyargı potansiyelini azaltır.

GA3 kullanarak cilia uzunluğunu ölçme
Cilia uzunluğu sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ve silier sinyal16,19üzerindeki fonksiyonel etkilerle ilişkilidir. Burada, Nis Elements yazılımı içinde Genel Analiz 3 veya GA3 adlı bir analiz ardışık düzeni kullanarak cilia uzunluklarını ölçtük. GA3, her deneme için özelleştirilmiş yordamlar oluşturmak üzere birden fazla aracı tek bir iş akışında birleştirmede yardımcı olur. Bir hücre hattındaki cilia uzunluklarını ölçerek başladık. Fare iç medüller toplama kanalında (IMCD-3) Cilia asetillenmiş tubulin ile immünolabelled ve konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi. segment.ai ile segmente ettikten sonra GA3 kullanarak cilia uzunluklarını ölçtük(Ek Şekil 3A). Asetilasyonlu α-tubulin tercihen birincil sesiyumda bulunurken, sitoskeleton gibi diğer mikrotübül zengin bölgelerinde ve sitokintik köprüde de bulunur. Eğitimli Ai, görüntüdeki cilia'yı düzgün bir şekilde tanımladı, ancak diğer siliyer olmayan, asetillenmiş tübulin pozitif yapıları tanımlamadı. IMCD hücrelerinde Cilia, ortalama uzunluğu 1,8 ± 0,04 μm olan 0,5 μm ile 4,5 μm arasında değişmektedir (Şekil 2A). Daha sonra Ai'nin birincil nöronal kültürlerde cilia uzunluklarını ölçme yeteneğini test ettik. Yenidoğan farelerinin hipotalamus ve hipokampusundan nöronları 10 gün boyunca kültürledik ve cilia marker adenilit siklaz III (ACIII)21,41ile immünoplabelled. Nöronal kültürleri analiz ederken, uzunlukları istatistiksel olarak analiz etmeden önce bir filtre uygulamayı yararlı bulduk. Gürültü oranı daha düşük bir sinyal nedeniyle, 1 μm'den daha az cilia olmayan birkaç nesne tanımlanmıştır. Bu nedenle, sadece cilia'nın analiz edildiğinden emin olmak için 1 μm'den daha kısa olan nesneleri ortadan kaldırmak için verileri filtreledik. Kültürlü hipotalamik nöronlarda, cilia uzunlukları ortalama uzunluğu 3,8 ± 0,19 μm olan 2 μm ila 7 μm arasında değişmektedir (Şekil 2B). İlginçtir ki, kültürlü hipokampal nöronal cilia ortalama uzunluğu 6.73 ±0.15μm (Şekil 2C)ile daha uzundu. Hipotalamus içindeki farklı nöronal çekirdeklerin farklı cilia uzunlukları gösterdiği ve bu ciliaların çekirdeğe özgü bir şekilde fizyolojik değişikliklere yanıt olarak uzunluklarını değiştirdiği bildirilmiştir19,23. Bu nedenle, yetişkin erkek C57BL/6J farelerden hipotalamik beyin bölümlerini ACIII ile etiketledik ve arcuate çekirdeğini (ARC) ve paraventriküler çekirdeği (PVN) görüntüledik. Cilia uzunluklarını ölçmek için GA3 kullanarak, in vivo hipotalamik cilia'nın in vitro cilia'dan daha uzun göründüğünü gözlemledik. Özellikle, hipotalamik cilia in vivo 1 μm ila yaklaşık 15 μm arasında değişmektedir (Şekil 3). PVN'deki (5,54 ± 0,0,42 μm) cilia uzunlukları ile ARC'dakiler (6,16 ± 0,27 μm) (Şekil 3C)23arasında anlamlı bir fark yoktu. Benzer şekilde, hipokampus'un cornu ammonis (CA1) bölgesindeki cilia, ortalama uzunluğu 5,28 ± 0,33 μm olan 1 μm ila 10 μm arasında daha dar bir uzunluk aralığı gösterir (Şekil 3). Daha önce yayınlanan çalışmalara uygun olarak, Ai ve GA3 araçlarını kullanarak yaptığımız analizler, farklı beyin bölgelerinden gelen cilia'nın19,23uzunluğunda çeşitlilik gösterdiğini gösterdi. Ayrıca, bu Ai yaklaşımını kullanarak çok sayıda cilia'yı hızla değerlendirebiliyoruz.

GA3 kullanarak cilia bileşimini ölçme
Birincil eksiyum, motor proteinleri, intraflageller taşıma proteinleri veGPCR'ler gibi benzersiz işlevleri yerine getirmek için çeşitli proteintürlerini kullanan birçok yol için bir sinyal merkezidir. Bu proteinlerin uygun seviyelerinin sezyum içinde tutulması uygun çalışma için önemlidir ve genellikle hücre bağlamına bağımlı olarak görünür. Bu proteinlerin floresan etiketlemesi sadece onları görselleştirmemizi sağlamakla kalmadı, aynı zamanda nispeten küçük bölmedeki etiketli protein miktarının bir ölçüsü olarak yoğunluklarını da ölçtü20. Bu nedenle, yetişkin erkek farelerin hipotalamusunun hem ARC hem de PVN in vivo'sunda silier GPCR, Melanin Konsantre Hormon Reseptörü 1 (MCHR1) yoğunluklarını belirlemeye çalıştık24,44. Ai ve GA3 kullanarak, sayılan nesnelerin cilia olduğundan emin olmak için yoğunluklarla birlikte MCHR1 pozitif cilia uzunluklarını ölçtük (Ek Şekil 3A). Analiz sonrası 2 μm'den daha kısa olan nesneleri ortadan kaldırdık ve kalan ikili maskelerin yoğunluklarını analiz ettik. İlginçtir ki, PVN'de silier MCHR1 yoğunluğunun ARC'dakinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ve PVN'de silier MCHR1'in daha güçlü bir varlığını gösterdiğini gördük(Şekil 4). Bu nöronal devrelerde siliary MCHR1'in önemini belirlemek için daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Ayrıca hipotalamus ve hipokampüsün birincil kültürlü nöronlarında siliary MCHR1'in yoğunluklarını ölçtük. Her iki kültürden Cilia, heterojen nöronal popülasyonların varlığını düşündüren MCHR1 yoğunluklarının geniş bir dağılımını gösterir (Ek Şekil 2). Bu nedenle, Ai ve GA3 gibi sofistike analitik araçlar kullanmak, aynı doku içinde veya birden fazla doku arasında cilia heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlar. Diğer nöronal GPCR'lerin aynı dokunun nöronları içinde lokalizasyonlarında benzer farklılıklar gösterip göstermediğini ve bunun fizyolojik değişikliklere yanıt olarak değişip değişmediğini görmek ilginç olacaktır.

Kolokalizasyon
Tam bir görüntü alanı içindeki floresan yoğunluklarını ölçmek protein izlenimi verebilirken, mekansal dağılım veya yakındaki diğer proteinlere ve hücresel yapılara yakınlık gibi bilgileri sağlayamaz. Burada, MCHR1'in yoğunluklarını her ikili maske için ACIII'ninkine göre çizerek bir cilia işaretleyicisi olarak ACIII ile MCHR1'in çakışmasını ölçtük (Şekil 5). Grafik, cilia'nın çoğunluğunun hem ACIII hem de MCHR1 için olumlu olduğunu, ancak bazı ciliaların bir kanalın diğerine göre daha güçlü bir şekilde ifade ettiğini göstermektedir. Ayrıca, sırasıyla doğrudan x ekseni ve y ekseninde yatan noktalardan da görüldüğü gibi ACIII veya MCHR1'in varlığını gösteren bazı cilia vardır. Bu çakışmayı ölçmek için Mander'in örtüşme katsayısını ölçtük ve ARC ve PVN40'ınnöronal cilia'sında MCHR1 ekspresyonunun kapsamını karşılaştırdık. İlginçtir ki, analizimiz PVN katsayılarında (0.6382 ± 0.0151) ARC'dakilere göre önemli bir artış olduğunu ortaya koydu (0.5430 ± 0.0181) (Şekil 5C). Bu, PVN'de ARC'a kıyasla daha yüksek MCHR1 yoğunlukları gözlemlediğimiz önceki verilerimizle tutarlıdır (Şekil 4). Bu veriler, cilia uzunluğu gibi, Siliary kompartımandaki MCHR1'in ifade deseninin beynin farklı bölgelerinde değiştiğini göstermektedir. Aynı analiz boru hattını kullanarak, Nöropeptid Y Reseptör Tip 2 (NPY2R) ve Somatostatin Reseptör Tip 3 (SSTR3) gibi diğer silier GPCR'lerin benzer miktarda çeşitlilik gösterip göstermediğini belirlemek mümkün olacaktır.

Esiyum boyunca yoğunluk profilinin ölçülmesi
Cilia segment.ai kullanılarak tanımlandıktan sonra, GA3 tarifi, cilia analizini görüntüdeki diğer ilgi çekici yapıların tanımlanmasıyla birleştirmek için değiştirilebilir. Örneğin, bazal gövde işaretleyicileri ile etiketleme, cilia polaritesinin tanımlanması için yararlıdır. Bu analizi yapmak için, ARL13B-mCherry ve Centrin2-GFP'yi ifade eden P0 farelerinden hipotalamik beyin bölümlerini görüntüledik ve ARC ve PVN34'ü görüntüledik. Burada, cilia daha önce olduğu gibi Ai kullanılarak tanımlandı, ancak şimdi değiştirilmiş GA3 tarifi, cilia tabanında bulunan centrin2-GFP'nin tanımlanmasını içerir (Ek Şekil 3B). Centrin2-GFP etiketlenerek, cilia tabanı ARL13B-mCherry pozitif cilia ipuçlarından ayırt edilebilir (Şekil 6A). Daha sonra, tüm cilia içindeki yoğunluğu ölçmek yerine, cilia uzunluğu boyunca ARL13B yoğunluğundaki değişiklikleri ölçebiliyoruz (Şekil 6B). Ayrıca, cilia'nın proksimal uçları ve distal uçları arasındaki ARL13B yoğunluğundaki farklılıkları karşılaştırabiliriz. Bunu yapmak için, ekyum uzunluğunu tabandan başlayarak 1 mikronluk kutulara ayırdık ve ilk mikron kutusunu proksimal uç, son mikron kutusunu distal uç olarak belirledik. Analizimiz, tabana hem ARC hem de PVN'deki ssiyumun ucundan önemli ölçüde daha fazla ARL13B bulunduğunu ve bunun insan kondrositleri45'te daha önce yayınlanan çalışmalarla tutarlı olduğunu ortaya koydu (Şekil 6C). Bu tür analizlerde, küçük silier olmayan nesneleri analizden dışlamak için uzunluk filtresi uygulamak yerine, yalnızca Centrin2-GFP etiketlemesiyle ilişkili cilia analiz edilir. Bu, genetik mutasyonların çok kısa cilia yaptığı durumlarda veya geçiş bölgesi veya uç gibi cilia alt etki alanlarındaki değişikliklerin bulaştığı durumlarda avantajlı olabilir. Ai ve GA3 analizi kullanılarak cilia'nın tanımlanması son derece uyarlanabilir ve çeşitli karmaşık araştırma sorularına uyacak şekilde uyarlanabilir.

Figure 1
Şekil 1. Ai kullanarak cilia uzunluğunu ve yoğunluğunu ölçmek için iş akışı. (A) Ai'yi eğitmek için ikili dosyalar, ham eğitim görüntüleri üzerinde ilgi çekici nesnelerin (cilia) etrafına çizilir. Çizilen ikili dosyaları kullanarak Segment Ai, cilia'nın şekil ve piksel yoğunluklarını tanımak için eğitilir. (B) Daha sonra, eğitimli Segment Ai ham deneysel görüntülere uygulanır. Cilia olarak tanıdığı nesnelere ikili dosyalar çizer. Bu ikili dosyalar, tüm ve yalnızca cilia'nın analiz edildiğinden emin olmak için geliştirilebilir. (C) Ai tarafından tanınan nesnelerin yoğunluğunu ve uzunluğunu analiz etmek için bir GA3 programı oluşturulur. (D) Kayıtlar yazılımdaki bir tabloya alınır. Bu tablo daha sonra daha fazla analiz için dışa aktarılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. In vitro cilia uzunluk ölçümleri. Cilia'nın (A)IMCD hücrelerindeki (yeşil, asetillenmiş tubulin) (B) birincil hipotalamik kültürler (yeşil, ACIII) ve (C) hipokampal kültürlerdeki (yeşil, ACIII) temsili görüntüleri. İkili maskede (macenta) gösterildiği gibi cilia'yı tanımak için eğitimli bir Ai kullanıldı ve daha sonra cilia uzunluğunu ölçmek için GA3 kullanıldı. Cilia uzunluğunun dağılımı, 0,5 veya 1,0 mikron kutularda cilia yüzdesi olarak grafiklendirilir. * Sitokintik köprünün Ai tarafından düzgün tanınmadığını gösterir. n=IMCD hücrelerinde 3'ten 225 cilia, hipotalamikte 54 cilia ve hipokampal kültürlerde 3 hayvandan 139 cilia. Ölçek çubukları 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. In vivo cilia uzunluk ölçümleri. (A) Yetişkin fare beyin bölümlerinin ARC, PVN ve CA1'deki cilia (yeşil, ACIII) temsili görüntüleri. (B) nis elemanlarında eğitimli bir Ai, ikili maskede (macenta) gösterildiği gibi cilia'yı tanımak için kullanıldı ve daha sonra cilia uzunluğunu ölçmek için GA3 kullanıldı. (C) Cilia uzunluğunun dağılımı, tek mikronlu kutularda cilia yüzdesi olarak grafiklendirilir. n= ARC'da 68, PVN'de 36 ve CA1'de 3 hayvandan 29. Ölçek çubukları 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. Ai, hipotalamik nöronal cilia'nın cilia boyama yoğunluğu ölçümlerine yardımcı oldu. (A) Yetişkin fare beyin bölümlerinin ARC ve PVN'sinde cilia (MCHR1, kırmızı) temsili görüntüleri. Nis Elementlerinde eğitimli bir Ai, ikili maskede (siyan) gösterildiği gibi cilia'yı tanımak için kullanıldı ve daha sonra cilia'daki MCHR1 lekelemenin yoğunluğunu ölçmek için GA3 kullanıldı. (B) MCHR1 yoğunlukları ortalama ± S.E.M olarak grafiklendirilir. Her nokta bir esiyumu temsil eder. * s < 0.05, Öğrenci t-testi. (C) MCHR1 yoğunluğunun dağılımı, 0,2 x 107 Rasgele Birim (A. U.) kutularında cilia yüzdesi olarak grafiklendirilir. n= ARC'da 53 cilia, 3 hayvandan PVN'de 78. Ölçek çubukları 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5. Ai destekli cilia colocalization analizi. (A, B) Sırasıyla ARC ve PVN'deki cilia'nın temsili görüntüleri. Cilia, ACIII (yeşil) ve MCHR1 (kırmızı) ile etiketlenmiştir. NIS Elements'ta eğitimli bir Ai, ikili maskede gösterildiği gibi cilia'yı tanımak için kullanıldı (ACIII için macenta cilia etiketli, MCHR1 için siyan cilia etiketli). GA3, hem ACIII hem de MCHR1 içeren cilia'yı tanımak için kullanıldı. (C) Manders örtünür katsayısı (MOC) değerleri ortalama ± S.E.M olarak grafiklendirilir. Her nokta bir esiyumu temsil eder. * s < 0.05, Öğrenci t-testi. (D) ARC ve PVN'de MCHR1 yoğunluğunun ACIII yoğunluğuna karşı saçılma grafiği. Her nokta bir esiyumu temsil eder. n= ARC'da 72 cilia, 3 hayvandan PVN'de 47. Ölçek çubukları 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6. Cilia ve bazal vücut analizi. (A) ARC ve P0 farelerinin PVN'sinde cilia (kırmızı, ARL13B-mCherry) ve bazal gövde işaretleyicisinin (yeşil, Centrin2-GFP) temsili görüntüleri. İkili maskede (siyan) gösterildiği gibi cilia'yı tanımak için eğitimli bir Ai kullanıldı. Bazal gövde (macenta) için ikili maske GA3 tarifinde eşik yapılarak çizilmiştir. (B) Bir sezyumun temsili hat tarama yoğunluğu. (C) Ai'nin proksimal ve distal uçlarında ARL13B yoğunlukları, S.E.M ortalama ± olarak grafiklenmiş cilia'yı tanımladı. Proksimal ve distal uçlar, silyumun tabanından sırasıyla ilk 1 μm uzunluk ve son 1 μm uzunluk içindeki bölge olarak tanımlanır. Her nokta bir esiyumu temsil eder. * s < 0.05. n = 2 hayvandan ARC'da 6 cilia ve 3 hayvandan PVN'de 21 cilia. Ölçek çubukları 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı Şekil 1. Ai eğitim kaybı grafikleri. (A, B) Sırasıyla nöronal cilia in vitro ve in vivo üzerinde segment.ai eğitim kaybını gösteren grafikler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 2. Ai Yardımcı Cilia in vitro nöronal ciliaboyama yoğunluğu ölçümleri . (A, B) Birincil hipotalamik ve hipokampal kültürlerde sırasıyla cilia (MCHR1, kırmızı) temsili görüntüleri. Nis Elementlerinde eğitimli bir Ai, ikili maskede (siyan) gösterildiği gibi cilia'yı tanımak için kullanıldı ve daha sonra cilia'daki MCHR1 lekelemenin yoğunluğunu ölçmek için GA3 kullanıldı. MCHR1 yoğunluğunun dağılımı hipotalamik için 1000 A.U. kutularında ve hipokampal kültürler için 2000 A. U. kutularında cilia yüzdesi olarak grafiklenmiştir. n= Hipotalamikte 30 cilia ve 3 hayvandan hipokampal kültürlerde 106 cilia. Ölçek çubukları 10 μm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı Şekil 3. Cilia analizi için Genel Analiz 3 tarifleri. (A) Cilia uzunluğu, yoğunluğu ve Mander katsayısının ölçümü için Basit Genel Analiz (GA3) tarifi. (B) Bazal gövde için bir işaretleyici kullanarak sicim uzunluğu boyunca yoğunluğun ölçümü için karmaşık GA3 tarifi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Uzunluk ve yoğunluk ölçümleri birincil cilia'nın analiz edildiği yaygın yollardır, ancak alanda kullanılan standartlaştırılmış bir geleneksel yöntem yoktur. ImageJ gibi yazılımlar kullanılarak birincil cilia'nın tanımlanması ve ölçülmesi zaman alıcıdır ve kullanıcı önyargısına ve hatasına eğilimlidir. Bu, büyük veri kümelerini doğru bir şekilde analiz etmeyi zorlaştırır. Burada, bir Ai programı kullanmanın, birincil cilia'nın yüksek verim analizini ulaşılabilir hale getiren bu zorlukların çoğunun üstesinden gelebileceğini gösteriyoruz. Burada, birincil cilia'yı tanımak ve uzunluğu ve yoğunluğu analiz etmek için gereken adımları özetlemek için Ai tabanlı bir uygulamayı eğitme prosedürünü açıklıyoruz.

Ai'nin cilia'yı tanımak için ilk eğitimi kullanıcıdan önemli bir zaman gerektirirken, tamamlandığında aynı parametrelerle elde edilen herhangi bir veri kümesinde kullanılabilir. Ai tarafından oluşturulan ikili maske, herhangi bir hatanın düzeltilebileceği şekilde değiştirilebilir. Bununla birlikte, cilia tanımlamadaki hatalar kullanıcıya Ai'nin ek görüntülerle daha fazla eğitilmesi gerektiğini işaret etmelidir. Bu yöntemin en büyük avantajlarından biri, Ai'nin hem 2D hem de 3D olarak farklı örnek türlerinde cilia'yı tanımak için eğitilebilmesidir. Laboratuvarlarda oluşturulan önceki analiz yöntemleri, hücre yoğunluğunun yüksek olduğu doku bölümlerinden görüntülenen cilia'yı tanımlamak için manuel eşikleme ve problemler dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalara sahiptir36,46,47. Nis Elements yazılımı kullanılarak yapılan analizler görüntülerin çeşitli yönlerini aynı anda değerlendirebilirken, bu yöntemler cilia analizi için de uzmanlaşmıştır. Burada açıklanan Ai, NIS Elements yazılım paketinin bir parçası olduğundan, Nikon mikroskobu kullanılarak elde edilen görüntüler analize kolayca devam edilebilir. Ancak, bu yöntemin kullanımı için Nikon ile görüntüleme gerekli değildir. Yakalanan ham veri dosyası biçiminden bağımsız olarak, ".tif" dosyaları Ai'de kullanmak için NIS Elements tarafından açılabilir.

NIS Elements içindeki bu Ai uygulaması yaygın olarak mevcuttur ve muhtemelen birincil cilia'yı inceleyen laboratuvarlar tarafından kullanılan görüntü analizi yazılımının bir parçasıdır. Ai teknolojisinin yaygınlığı genişlerken, diğer görüntüleme yazılımları analiz seçeneklerini benzer bir Ai modülünü içerecek şekilde genişletebilir. Cilia tanımlamasına Ai analizi uygulamak, cilia analizinin birkaç farklı yönü için kullanılabilir. Uzunluk (Şekil 2 ve 3 ), yoğunluk ( Şekil 4) ve kolokalizasyon (Şekil 5) gibi birkaç basit analiz için yöntemleri özetlerken, GA3 analiz iş akışına Şekil 6'daolduğu gibi daha sofistike analizler eklenebilir. Örneğin, tam bir siliyumun yoğunluğunu ölçmek yerine, bir siliyumun bir alt bölgesindeki yoğunluk farklılıkları, sub-siliary lokalizasyonunu değerlendirmek için ilgi çekici olabilir. Bir sicim alt bölgesinde yoğunluktaki farklılıklar, gli proteinlerinin cilia48'inucunda nasıl zenginleştirilmesi gibi, proteinin siciumun ucunda veya tabanında biriktiğini gösterebilir. Ek olarak, bu Ai uygulaması genotipler veya tedavi grupları arasındaki farklılıkları kolayca tanımlamak için kullanılabilir. Laboratuvarımız öncelikle beyin bölümlerinden veya nöronal kültürlerden alınan cilia'yı analiz etmek için bu yöntemi kullanırken, çeşitli hücre çizgilerinden veya diğer doku türlerinden elde edilen görüntülere uygulanabilir. Bu uygulamanın kullanılabileceği örnek türünün esnekliği, bu analiz yöntemini birincil cilia veya mitokondri, çekirdek veya ER gibi değerlendirilen herhangi bir ayrı organel üzerinde çalışan birçok farklı grup için değerli kılar.

Disclosures

Ortak yazar Wesley Lewis Nikon'un bir çalışanıdır. Herhangi bir finansal açıklama yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü R01 DK114008 tarafından NFB'ye ve Amerikan Kalp Derneği Bursu Rb'ye #18PRE34020122 finanse edildi. Nikon Software'in Rich Gruskin Genel Müdürü Melissa Bentley, Courtney Haycraft ve Teresa Mastracci'ye el yazması hakkındaki içgörülü yorumları için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM Intel Corporation W-2123 Processor used for running NIS Elements.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Inc. - Ai and GA3 software
Quadro RTX 4000 Graphics card NVIDIA Corporation Quadro RTX 4000
Windows 10 Professional 64-bit Microsoft Inc. - Operating system used for running NIS Elements
Workstation HP Development Company, L.P. HP Z4G4 Workstation used for running NIS Elements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., et al. Ciliary gene RPGRIP1L is required for hypothalamic arcuate neuron development. JCI Insight. 4 (3), (2019).
  2. Siljee, J. E., et al. Subcellular localization of MC4R with ADCY3 at neuronal primary cilia underlies a common pathway for genetic predisposition to obesity. Nature Genetics. 50 (2), 180-185 (2018).
  3. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Current Biology. 17 (18), 1586-1594 (2007).
  4. Berbari, N. F., O'Connor, A. K., Haycraft, C. J., Yoder, B. K. The primary cilium as a complex signaling center. Current Biology. 19 (13), 526-535 (2009).
  5. Walz, G. Role of primary cilia in non-dividing and post-mitotic cells. Cell Tissue Research. 369 (1), 11-25 (2017).
  6. Nachury, M. V., Mick, D. U. Establishing and regulating the composition of cilia for signal transduction. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (7), 389-405 (2019).
  7. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  8. Engle, S. E., Bansal, R., Antonellis, P. J., Berbari, N. F. Cilia signaling and obesity. Seminars in Cell and Developmental Biology. , (2020).
  9. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
  10. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatric Nephrology. 26 (7), Berlin, Germany. 1039-1056 (2011).
  11. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. New England Journal of Medicine. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  12. Vaisse, C., Reiter, J. F., Berbari, N. F. Cilia and Obesity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), (2017).
  13. Berbari, N. F., et al. Leptin resistance is a secondary consequence of the obesity in ciliopathy mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), 7796-7801 (2013).
  14. Jacobs, D. T., et al. Dysfunction of intraflagellar transport-A causes hyperphagia-induced obesity and metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 789-798 (2016).
  15. Arsov, T., et al. Fat aussie--a new Alström syndrome mouse showing a critical role for ALMS1 in obesity, diabetes, and spermatogenesis. Molecular Endocrinology. 20 (7), 1610-1622 (2006).
  16. Tam, L. W., Ranum, P. T., Lefebvre, P. A. CDKL5 regulates flagellar length and localizes to the base of the flagella in Chlamydomonas. Molecular Biology of the Cell. 24 (5), 588-600 (2013).
  17. Rajagopalan, V., Subramanian, A., Wilkes, D. E., Pennock, D. G., Asai, D. J. Dynein-2 affects the regulation of ciliary length but is not required for ciliogenesis in Tetrahymena thermophila. Molecular Biology of the Cell. 20 (2), 708-720 (2009).
  18. Bengs, F., Scholz, A., Kuhn, D., Wiese, M. LmxMPK9, a mitogen-activated protein kinase homologue affects flagellar length in Leishmania mexicana. Molecular Microbiology. 55 (5), 1606-1615 (2005).
  19. Han, Y. M., et al. Leptin-promoted cilia assembly is critical for normal energy balance. Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2193-2197 (2014).
  20. Caspary, T., Marazziti, D., Berbari, N. F. Cilia: Methods and Protocols. Satir, P., Tvorup Christensen, S. , Springer. New York. 203-214 (2016).
  21. Bishop, G. A., Berbari, N. F., Lewis, J., Mykytyn, K. Type III adenylyl cyclase localizes to primary cilia throughout the adult mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 505 (5), 562-571 (2007).
  22. Domire, J. S., Mykytyn, K. Markers for neuronal cilia. Methods in Cell Biology. 91, 111-121 (2009).
  23. Sun, J. S., et al. Ventromedial hypothalamic primary cilia control energy and skeletal homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), (2021).
  24. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
  25. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Research. 872 (1-2), 271-275 (2000).
  26. Domire, J. S., et al. Dopamine receptor 1 localizes to neuronal cilia in a dynamic process that requires the Bardet-Biedl syndrome proteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (17), 2951-2960 (2011).
  27. Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89 (3), 909-926 (1999).
  28. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), 10335-10340 (2014).
  29. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  30. Berman, S. A., Wilson, N. F., Haas, N. A., Lefebvre, P. A. A novel MAP kinase regulates flagellar length in Chlamydomonas. Current Biology. 13 (13), 1145-1149 (2003).
  31. Nguyen, R. L., Tam, L. W., Lefebvre, P. A. The LF1 gene of Chlamydomonas reinhardtii encodes a novel protein required for flagellar length control. Genetics. 169 (3), 1415-1424 (2005).
  32. Tam, L. W., Wilson, N. F., Lefebvre, P. A. A CDK-related kinase regulates the length and assembly of flagella in Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 176 (6), 819-829 (2007).
  33. O'Connor, A. K., et al. An inducible CiliaGFP mouse model for in vivo visualization and analysis of cilia in live tissue. Cilia. 2 (1), 8 (2013).
  34. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (2), 113-122 (2015).
  35. Delling, M., et al. Primary cilia are not calcium-responsive mechanosensors. Nature. 531 (7596), 656-660 (2016).
  36. Saggese, T., Young, A. A., Huang, C., Braeckmans, K., McGlashan, S. R. Development of a method for the measurement of primary cilia length in 3D. Cilia. 1 (1), 11 (2012).
  37. Kobayashi, Y., Hamamoto, A., Saito, Y. Analysis of ciliary status via G-protein-coupled receptors localized on primary cilia. Microscopy. 69 (5), 277-285 (2020).
  38. Zhou, L. Q., et al. Artificial intelligence in medical imaging of the liver. World Journal of Gastroenterology. 25 (6), 672-682 (2019).
  39. Naugler, C., Church, D. L. Automation and artificial intelligence in the clinical laboratory. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 56 (2), 98-110 (2019).
  40. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  41. Bansal, R., et al. Hedgehog Pathway Activation Alters Ciliary Signaling in Primary Hypothalamic Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 266 (2019).
  42. Jin, H., et al. The conserved Bardet-Biedl syndrome proteins assemble a coat that traffics membrane proteins to cilia. Cell. 141 (7), 1208-1219 (2010).
  43. Liew, G. M., et al. The intraflagellar transport protein IFT27 promotes BBSome exit from cilia through the GTPase ARL6/BBS3. Developmental Cell. 31 (3), 265-278 (2014).
  44. Engle, S. E., et al. A CreER Mouse to Study Melanin Concentrating Hormone Signaling in the Developing Brain. Genesis. , (2018).
  45. Thorpe, S. D., et al. Reduced primary cilia length and altered Arl13b expression are associated with deregulated chondrocyte Hedgehog signaling in alkaptonuria. Journal of Cellular Physiology. 232 (9), 2407-2417 (2017).
  46. Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8, 1 (2019).
  47. Dummer, A., Poelma, C., DeRuiter, M. C., Goumans, M. J., Hierck, B. P. Measuring the primary cilium length: improved method for unbiased high-throughput analysis. Cilia. 5, 7 (2016).
  48. Haycraft, C. J., et al. Gli2 and Gli3 localize to cilia and require the intraflagellar transport protein polaris for processing and function. PLoS Genetics. 1 (4), 53 (2005).

Tags

Biyoloji Sayı 171
Birincil Cilia'yı Değerlendirmede Yapay Zeka Yaklaşımları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T.… More

Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T. K., Brewer, K. M., Lewis, W. R., Berbari, N. F. Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia. J. Vis. Exp. (171), e62521, doi:10.3791/62521 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter