Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Artificiell intelligens metoder för att bedöma primära Cilia

Published: May 1, 2021 doi: 10.3791/62521
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 2Nikon Instruments Inc., 3Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University, 4Center for Diabetes and Metabolic Diseases, Indiana University School of Medicine

Summary

Användningen av artificiell intelligens (Ai) för att analysera bilder framträder som ett kraftfullt, mindre partiskt och snabbt tillvägagångssätt jämfört med vanliga metoder. Här tränade vi Ai att känna igen en cellulär organell, primär cilia, och analysera egenskaper som längd och färgningsintensitet på ett rigoröst och reproducerbart sätt.

Abstract

Cilia är mikrotubulebaserade cellulära bilagor som fungerar som signalcentra för en mångfald av signalvägar i många däggdjurscelltyper. Cilialängden är mycket bevarad, hårt reglerad och varierar mellan olika celltyper och vävnader och har varit inblandad i att direkt påverka deras signalkapacitet. Till exempel har cilia visat sig ändra sina längder som svar på aktivering av ciliary G protein-kopplade receptorer. Men att noggrant och reproducerbart mäta längden på många cilier är ett tidskrävande och arbetsintensivt förfarande. Nuvarande tillvägagångssätt är också fel- och partiska. Ai-program (Artificial Intelligence) kan användas för att övervinna många av dessa utmaningar på grund av funktioner som tillåter assimilering, manipulering och optimering av omfattande datauppsättningar. Här visar vi att en Ai-modul kan tränas att känna igen cilia i bilder från både in vivo- och in vitro-prover. Efter att ha använt den utbildade Ai för att identifiera cilia kan vi designa och snabbt använda applikationer som analyserar hundratals cilier i ett enda prov för längd, fluorescensintensitet och samlokalisering. Detta opartiska tillvägagångssätt ökade vårt självförtroende och stringens när vi jämförde prover från olika primära neuronala preps in vitro samt över olika hjärnregioner inom ett djur och mellan djur. Dessutom kan denna teknik användas för att tillförlitligt analysera cilia dynamik från alla celltyper och vävnad på ett sätt med hög genomströmning över flera prover och behandlingsgrupper. I slutändan kommer Ai-baserade metoder sannolikt att bli standard eftersom de flesta fält rör sig mot mindre partiska och mer reproducerbara metoder för bildförvärv och analys.

Introduction

Primära cilier är sensoriska organeller som sticker ut från de flesta däggdjurscelltyper1,2,3,4. De är i allmänhet ensamma bilagor som är kritiska för att samordna olika cellsignaleringsvägar genom att integrera extracellulära signaler5,6,7. Primära cilia spelar viktiga roller under embryonal utveckling och vuxna vävnad homeostas, och störningar av deras funktion eller morfologi är associerad med flera genetiska störningar, som kollektivt kallas ciliopathies. På grund av cilias nästan allestädes närvarande natur är ciliopatier förknippade med ett brett spektrum av kliniska funktioner som kan påverka alla organsystem8,9,10,11,12. I djurmodeller av ciliopatier manifesteras förlust av ciliär struktur eller signalkapacitet i flera kliniskt relevanta fenotyper inklusive hyperfagiassocierad fetma3,13,14,15. I många modellsystem har cilialängdsändringar visat sig påverka deras signalkapacitet och funktioner16,17,18,19. Det finns dock flera tidskrävande och tekniska utmaningar förknippade med att noggrant och reproducerbart bedöma cilia längd och sammansättning.

Det vuxna däggdjurets centrala nervsystem (CNS) är ett biologiskt sammanhang som har inneburit en utmaning för att förstå cilia morfologi och funktion. Medan det verkar som om nervceller och celler i hela CNS har cilier, på grund av de begränsade verktygen och förmågorna att observera och analysera dessa cilier förblir en förståelse av deras funktioner svårfångad20. Till exempel märker den prototypiska ciliamarkören, acetylerad α-tubulin, inte neuronala cilia20. Svårigheten att studera dessa cilier löstes delvis med upptäckten av flera G-proteinkopplade receptorer (GPCR), signalmaskiner och membranassocierade proteiner som berikas på membranet av neuronal cilia21,22. Alla dessa enkla grundläggande observationer antyder vikten och mångfalden av CNS cilia, som hittills verkar oöverträffad av andra vävnader. Till exempel kan variation i cilialängd och GPCR-lokalisering observeras i hela hjärnan, med längder i vissa neuronala kärnor som är olika jämfört med andra kärnor19,23. På samma sätt visar deras GPCR-innehåll och signalmaskiner komplimanger mångfald baserat på neuroanatomisk plats och neuronal typ2,24,25,26,27,28,29. Dessa enkla observationer visar att däggdjur CNS cilia längd och sammansättning är tätt reglerade, precis som i modellorganismer, som Chlamydomonas reinhardtii, men effekten av dessa längdskillnader på cilifunktion, signalering och i slutändan beteende förblir oklart16,30,31,32.

Att noggrant mäta cililängd och sammansättning visar sig vara en teknisk utmaning som är benägen för användarfel och irreproduktivitet. För närvarande identifieras cilia in vivo och in vitro oftast med hjälp av immunofluorescent metoder som märker ciliary proteiner eller cilia-berikade fluorescerande reporter alleler33,34,35. Längden på dessa fluorescerande taggade cilia mäts sedan från en 2-dimensionell (2D) bild med hjälp av linjemätningsverktyg i bildanalysprogram som ImageJ36. Denna process är inte bara tråkig och arbetsintensiv utan också benägen för partiskhet och fel. Samma hinder uppstår vid mätning av cilia-intensiteter, vilket hjälper till att indikera förändringar i cilia struktur37. För att minimera inkonsekvenserna i dessa typer av bildanalyser blir ai-program (artificiell intelligens) allt vanligare och billigare alternativ38.

Ai är utvecklingen av datorsystem som använder fördelen med datoralgoritmer och programmering för att utföra uppgifter som vanligtvis skulle kräva mänsklig intelligens39. Ai-enheter lär sig att uppfatta återkommande mönster, parametrar och egenskaper och vidta åtgärder för att maximera oddsen för att skapa framgångsrika resultat. Ai är mångsidigt och kan tränas för att känna igen specifika objekt eller strukturer av intresse, till exempel cilia, och sedan programmeras för att köra en mängd olika analyser på de identifierade objekten. Därför kan komplexa bilddata genereras snabbt och reproducerbart av Ai38. Automatisering och Ai-analys av tagna bilder kommer att öka effektiviteten och effektiviteten samtidigt som eventuella mänskliga fel och partiskhetbegränsas 39. Att etablera en Ai-baserad metodik för ciliaidentifiering skapar ett konsekvent sätt för alla forskargrupper att analysera och tolka ciliadata.

Här använder vi en Ai-modul för att identifiera cilia både in vivo och in vitro på 2D-bilder. Med hjälp av en uppsättning exempelbilder tränas Ai:n för att identifiera cilia. När träningen är klar används den angivna Ai för att tillämpa en binär mask över Ai-identifierade cilia i en bild. De binärfiler som tillämpas av Ai är modifierbara, om det behövs, för att säkerställa att alla cilia i bilderna identifieras korrekt och att icke-specifik identifiering elimineras. Efter att ha använt Ai för att identifiera cilia används specialbyggda allmänna analysprogram (GA) för att utföra olika analyser som att mäta cililängd och fluorescensintensitet. De insamlade uppgifterna exporteras till en tabell som lätt kan läsas, tolkas och användas för statistiska analyser (figur 1). Användningen av automatiserad teknik och Ai för att identifiera cilia och få specifika mätningar mellan experimentella grupper kommer att hjälpa till i framtida studier som syftar till att förstå effekten av CNS cilia-funktion och morfologi på cellcellskommunikation och beteende.

Protocol

1. Skaffa råa bilder

  1. Fix och immunolabel prover efter behov20.
    1. Bildcilia med hjälp av ett konfokalt mikroskop på maximalt bitdjup med samma pixelstorlek med Nyquistupplösning.
    2. Exportera bilder som monokroma taggade bildformat (.tif) filer.
      OBS: Det här protokollet beskriver hur du använder Ai-modulen specifikt i NIS Elements-programvaran. Om bilder har förvärvats som .nd2-filer är det inte nödvändigt att exportera bilder som .tif filer och användaren kan gå direkt till steg 2.3. Om bilder har förvärvats i ett annat system kan en NIS Elements-licens köpas separat och .tif filer kan konverteras enligt beskrivningen i nästa steg.

2. Träna Ai för att identifiera cilia

  1. Öppna tränings data uppsättningen.
    1. Välj cirka 50 exempelbilder med minst ett cilium per bildruta för att träna programvaran och kopiera dem i en enda mapp. Den här mappen används för att styra programvaran när du öppnar bilderna. Öppna dessa 50 bildrutor i ett enda ND2-dokument med minst ett cilium per ram. Välj Arkiv > Importera/exportera > Skapa ND-fil från Filsekvens.
    2. Välj mappen som innehåller utbildnings data uppsättningen. Detta öppnar listan över filer i mitten av dialogfönstret. Definiera manuellt hur filerna organiseras med minst ett alternativ i den nedrullningsbar menyn ovan. Alternativen är multipunkt (för flera maximala projektionsfiler), Z-serien (för en z stackbild), tid (för en tidsfördröjningsbild) och våglängd (för filer från flera kanaler).
    3. Ange motsvarande numeriska värden under varje markerat alternativ. Välj Ingen där alternativen inte är markerade. Öppna ND-dokumentet genom att klicka på Konvertera.
  2. Kalibrera bilder.
    1. Ange pixelstorleken i bildens nedre vänstra hörn: Högerklicka på Oavlånat > Kalibrera dokument > Pixelstorlek.
  3. Identifiera cilia.
    1. Handidentifiera cilierna genom att exakt spåra enskilda ciliarystrukturer på alla öppnade bildrutor med antingen AutoDetect eller Draw Object i det binära verktygsfältet. Detta kommer att rita binära masker på objekt av intresse. Dessa binärer kommer att fungera som exempelobjekt för att träna programvaran för att identifiera cilia på pixelbaserade egenskaper i framtida experimentell bildanalys. Välj Visa > analyskontroller > binärt verktygsfält > Rita objekt.
      OBS: Ta bort alla ramar som inte har några binärfiler eftersom programvaran inte börjar tränas om den inte kan identifiera binärfiler på alla öppnade ramar.
  4. Träna Ai.
    1. Börja träna programvaran. Detta öppnar tåget Segment.ai låda. Välj NIS.ai > Träna Segment.ai.
    2. Välj den källkanal som ska användas för träning i rutan Tåg Segment.ai. Om filer från flera kanaler är öppna väljer du bara en kanal som källkanal. Välj sedan lämpliga mark sanning binärer som du ska träna Ai. Välj slutligen antalet iterationer som behövs för att träna Ai beroende på binaries storlek och distribution.
      OBS: Om binärfilerna lätt kan upptäckas från omgivningen och distribueras väl i hela bilden kan programvaran behöva mindre än 1000 iterationer för att tränas för att identifiera bilderna. Om bilderna har ett lågt signal-till-brus-förhållande är det idealiskt att köra minst 1000 iterationer under träning för att Ai ska kunna identifiera cilia i testprover med hög konfidens.
    3. Välj målmappen för att spara den tränade Ai-filen (.sai) och klicka på Träna för att träna programvaran. Programvaran kommer nu att fortsätta att träna sig själv för att identifiera cilia baserat på de spårade binärerna. Den här processen tar flera timmar.
      OBS: Under träning visar programvaran ett diagram som visar träningsförlust. Diagrammet kommer inledningsvis att visa en spik innan den avsmalnar till idealiskt cirka 1% förlust där den platåer under resten av träningen. Spara diagrammet för framtida referens genom att markera rutan för Spara diagram skärmdump på rutan Tåg Segment.ai(Kompletterande bild 1).
    4. Om ytterligare förfining av utbildningen krävs fortsätter du att träna på samma data uppsättning. Alternativt kan du träna på en ny data uppsättning med exakt samma parametrar. Det är inte tillrådligt att träna en redan utbildad Ai på en ny datauppsättning med olika parametrar eller olika objekt av intresse. Välj Träna segment.ai > Fortsätt träna på > Välj utbildad Ai-fil.

3. Identifiera cilier med utbildad Ai

  1. Öppna den experimentella datauppsättningen.
    1. Öppna de experimentella konfokala bilderna av cilia i programvaran genom att konvertera exemplet .tif filer till .nd2-filer, liknande steg 2.1. Välj Arkiv > Importera/exportera > Skapa ND-fil från Filsekvens.
      Bilderna ska ha samma pixelstorlek som de som används för att träna Ai. Om bilderna redan är i ND2-format hoppar du till steg 3.3.
  2. Kalibrera bilder.
    1. Ange pixelstorleken i bildens nedre vänstra hörn. Högerklicka på Uncalibrated > Kalibrera dokument > Pixelstorlek.
  3. Kör den tränade Ai på de öppnade filerna.
    1. Börja identifiera cilierna med Ai. Programvaran kommer nu att rita binärer på cilierna baserat på den utbildning den fick i föregående steg. Den här processen tar några sekunder. Välj NIS.ai > Segment.ai.
      Obs: Programvaran kommer att uppmanas att välja kanalen om flera kanaler är öppna. Kanaler listas efter sina respektive namn här. Om inte, markeras rutan "Mono" automatiskt.
  4. Kontrollera om det finns felidentifierade binärfiler.
    1. När Ai:n har identifierat cilia och ritat binärfiler kontrollerar du bilderna efter eventuella felaktigt identifierade objekt. Om så önskas tar du bort felidentifierade binärfiler manuellt. Välj Visa > analyskontroller > Binärt verktygsfält > Ta bort objekt.

4. Mätning av cililängd och intensitet

  1. Skapa ett nytt recept på allmän analys 3 (GA3).
    1. Nu när cilierna har identifierats och segmenterats, fortsätt att analysera olika parametrar för cilia som längder och intensiteter med GA3-verktyget. Detta öppnar ett nytt fönster med ett tomt utrymme i mitten där analysen ska definieras. Välj Bild > nytt GA3-recept.
  2. Välj de binärfiler som ska analyseras.
    1. Eftersom clia redan är segmenterade med Segment.ai kommer GA3 automatiskt att upptäcka binärfilerna som är korrekt märkta enligt Ai och inkludera noden. Välj "Binärfiler > automatiskt Detect_AI" eller "Binärer > Rita Object_AI".
  3. Välj de kanaler som krävs för analys. GA3 kommer också automatiskt att upptäcka kanalerna i bilderna och visa sina flikar under Kanaler.
  4. Ta bort objekt som vidrör ramens kant.
    1. Eftersom Ai kommer att segmentera alla cilier som objekt i ramen, kommer den också att upptäcka ofullständiga cili längs ramens kanter. Dessa objekt kan antingen tas bort manuellt i steg 3.4 eller så kan de tas bort automatiskt i GA3. Välj Binär bearbetning > Ta bort objekt > Vidröra kantlinjer.
  5. Välj parametrar för att mäta cilia.
    1. Dra och släpp parametrarna för att mäta till exempel cililängd (längd) och intensitet(Summa objektintensitet). Anslut noderna till lämpliga binära noder (anslutning A) och kanalnoder (anslutning B). Hovra över nodanslutningen för ett verktygstips för att visa vilken anslutning noden tillhör. Välj Mät > objektstorlek > längd och mätning > objektintensitet > Summa Obj-intensitet.
      Nodens längd ansluts endast till den binära noden, medan Sum Obj Intensity ansluter till både binära noder och kanalnoderna.
  6. Lägg till måtten i en enda tabell.
    1. Kombinera alla mått i en enda utdatatabell genom att dra och släppa noden Lägg till kolumn till analysflödesdiagrammet och anslut den till mätnoderna Längd och Summa Obj-intensitet. Välj Datahantering > grundläggande > tilläggskolumn.
  7. Mät cilia.
    1. Mät cilia genom att klicka på Kör. Denna process tar en liten stund att mäta alla cilier i de experimentella bilderna. Längder och intensiteter visas i ett nytt analysresultatfönster.
      OBS: Tabellen kan ibland innehålla data från masker som Ai kände igen som cilier men var för små för att upptäckas av det mänskliga ögat och elimineras i steg 3.4. Dessa objekt kan tas bort från datauppsättningen med hjälp av ett filter före statistisk analys. Här användes ett filter på 1 μm för mätningar av in vitro-cilialängd i figur 2 och 2 μm för in vivo cilia. Detta kan göras innan du exporterar data med hjälp av vägen nedan. Välj Fönstret Analysresultat > Definiera filter > Ange värde > använda filter.
  8. Exportdata för statistisk analys.

5. Colocalization studier

OBS: Colocalization analys kan ingå i samma GA3 recept som används för mätningar av cilia längd och intensitet analys. Om du använder samma recept öppnar du filer enligt beskrivningen nedan och mäter längden och intensiteten för båda kanalerna tillsammans med colocaliseringskoefficienterna i samma analyspipeline.

  1. Öppna den experimentella datauppsättningen.
    1. Öppna de experimentella konfokala bilderna av cilia i programvaran genom att konvertera exemplet .tif filer till .nd2-filer. Välj Arkiv > Importera/exportera > Skapa ND-fil från Filsekvens.
    2. I popup-fönstret väljer du de 16-bitars djup monokroma filerna från alla kanaler av intresse från fönsterutforskaren som finns i den första kolumnen i popup-fönstret. Välj Multipoint- eller Z-serie på den första rullgardinsmenyn och ange ett värde som motsvarar det totala antalet bilder eller staplar.
    3. I den andra listrutan väljer du Våglängd och ändrar värdet till det totala antalet kanaler i mappen. Programvaran låser automatiskt upp ett våglängdsvalsfönster längst ner till höger i popup-fönstret. Använd listrutan Färg för att välja färg på varje kanal. Ge varje kanal ett annat namn under kolumnen Namn. När all information har uppdaterats klickar du på Konvertera. Programvaran genererar automatiskt en All image fil överlagd med alla enskilda bilder från alla valda kanaler.
  2. Kalibrera bilder.
    1. Ange pixelstorleken i bildens nedre vänstra hörn. Högerklicka på Uncalibrated > Kalibrera dokument > Pixelstorlek.
  3. Kör den tränade Ai på den första kanalen.
    1. Börja identifiera cilierna på en av de öppnade kanalerna (t.ex. ACIII; Bild 5A) använda Ai. Programvaran kommer nu att rita binärer på ACIII-märkta cilia baserat på den utbildning den fick för denna kanal. Den här processen tar några sekunder. Välj NIS.ai > Segment.ai > källkanaler > ACIII.
  4. Kör den tränade Ai på den andra kanalen.
    1. Börja identifiera cilia på den andra öppnade kanalen (t.ex. MCHR1; Bild 5B) använda Ai. Programvaran kommer nu att rita binärer på MCHR1-märkta cilia baserat på den utbildning den fick för denna kanal. Denna process kommer att ta en liten stund. Välj NIS.ai > Segment.ai > källkanaler > MCHR1.
  5. Kontrollera om det finns felidentifierade binärfiler.
    1. När Ai:n har identifierat cilia och ritat binärfiler kontrollerar du bilderna efter felidentifierade objekt. Ta bort felidentifierade binärfiler manuellt om det behövs. Välj Visa > analyskontroller > binärt verktygsfält > Ta bort objekt.
  6. Skapa nytt GA3-recept.
    1. Nu när cilierna har identifierats och segmenterats, fortsätt till colocalization-analysen med GA3-verktyget. Detta öppnar ett nytt fönster med ett tomt utrymme i mitten där analysen ska definieras. Ett fönster med alla identifierade binärfiler och kanaler genereras. Kontrollera att alla önskade kanaler och binärfiler som krävs för analys finns och väljs. Välj Bild > nytt GA3-recept.
  7. Ta bort objekt som vidrör ramens kant.
    1. Eftersom Ai kommer att segmentera alla cilia-liknande objekt i ramen, kommer den också att upptäcka ofullständiga cilier längs ramens kanter. Dessa objekt kan antingen tas bort manuellt i steg 5.5 eller så kan de tas bort automatiskt i GA3. Välj Binär bearbetning > Ta bort objekt > Vidröra kantlinjer.
  8. Ställ in colocalization-vägen i GA3.
    1. Om du vill mäta överlappningen mellan de två kanalerna inom cilia använder du Manders koefficientkorrelation. Dra och släpp noden Manders Coefficient i det tomma utrymmet i GA3-receptet och anslut den till lämpliga binära och kanaler. Här ansluter "anslutning A" till ACIII-binärfilen, "anslutning B" med MCHR1-kanalen och "anslutning C" med ACIII-kanalen för att bestämma överlappningen av MCHR1 inom ACIII binär. Välj Mät > objekt ratiometry > Manders Coefficient.
      OBS: Programvaran gör det möjligt att mäta colocalization med Pearson Coefficient Correlation med samma steg som beskrivs i detta protokoll40.
  9. Lägg till måtten i en enda tabell.
    1. Kombinera alla mått i en enda utdatatabell. Välj Datahantering > grundläggande > tilläggskolumn.
  10. Mät colocalization.
    1. Mät cilia genom att klicka på Kör. Denna process tar en liten stund att mäta alla cilier i de experimentella bilderna. Data visas i ett nytt analysresultatfönster.
  11. Exportdata för statistisk analys.

Representative Results

Träna Ai för att identifiera cilia
Mätning och bedömning av cilia strukturell längd och sammansättning kan vara en tråkig, tidskrävande och felbenägen process. Här använder vi Ai för att noggrant segmentera cilia från en stor pool av bilder och analysera deras längder och intensiteter med ett analysverktyg (bild 1). Alla Ai-metoder kräver utbildningssteg för genomförandet. Vi etablerade en utbildningspipeline för att känna igen cilia, som utfördes genom att manuellt tillämpa binära masker på ciliary strukturer. Den här informationen används sedan för att träna Ai baserat på pixelegenskaper under de tillämpade binärfilerna. Som en allmän riktlinje innebär utbildningen att programvaran går igenom flera iterationer, cirka 1000, och anses vara optimal om träningsförlusten eller felfrekvensen är mindre än 1%. Antalet iterationer och fel i utbildningsprocessen kan dock variera beroende på vilka exempelbilder som används för träning. Till exempel, efter våra träningspass med in vitro neuronala cilia bilder, felfrekvensen var 1.378% jämfört med 3.36% för in vivo hjärnan avsnitt bilder(Kompletterande figur 1). När träningen är klar kan Ai sedan användas för att segmentera cilia från experimentella bilder inom några sekunder och de resulterande binära maskerna används för att mäta strukturella parametrar. Detta eliminerar behovet av att segmentera objekt med den traditionella metoden för intensitetströskeltröskel som kan vara svårt i bilder med högt bakgrundsbrus eller när objekt är i närheten av varandra. Ai minskar också risken för fel och partiskhet genom att tillämpa samma algoritm på alla bilder, oavsett användare.

Mätning av clialängd med GA3
Cilia längd är hårt reglerad och är förknippad med funktionella effekter på ciliary signalering16,19. Här mätte vi cilialängder med hjälp av en analyspipeline inom NIS Elements programvara som heter General Analysis 3 eller GA3. GA3 hjälper till att kombinera flera verktyg i ett enda arbetsflöde för att skapa anpassade rutiner för varje experiment. Vi började med att mäta cilialängder i en cellinje. Cilia på musen inre medullary samla kanal (IMCD-3) celler var immunmärkta med acetylated tubulin och avbildas med hjälp av ett confocal mikroskop. Vi mätte cililängder med GA3 efter segmentering med segment.ai (Kompletterande figur 3A). Medan acetylerad α-tubulin finns företrädesvis i det primära ciliumet, det finns också i andra microtubule rika regioner såsom cytoskeleton samt cytokinetiska bron. Den tränade Ai identifierade cilia korrekt i bilden men inte andra icke-ciliary, acetylerade tubulin positiva strukturer. Cilia på IMCD-celler varierade från 0,5 μm till 4,5 μm med en genomsnittlig längd på 1,8 ± 0,04 μm (figur 2A). Vi testade därefter Ai: s förmåga att mäta cililängder i primära neuronala kulturer. Vi odlade nervceller från hypotalamus och hippocampus av neonatal möss i 10 dagar och immunmärkte dem med ciliamarkören adenylatcyklas III (ACIII)21,41. När vi analyserade neuronala kulturer fann vi det användbart att applicera ett filter innan vi statistiskt analyserade längderna. På grund av ett lägre signal-brusförhållande identifierades flera objekt mindre än 1 μm som inte var cilia. Därför filtrerade vi data för att eliminera alla objekt som var mindre än 1 μm långa för att säkerställa att endast cilia analyserades. I odlade hypotalamus nervceller varierade cilialängderna från 2 μm till 7 μm med en genomsnittlig längd på 3,8 ± 0,19 μm (figur 2B). Intressant nog var odlade hippocampala neuronala cilia längre med en genomsnittlig längd på 6,73 ±0,15μm (figur 2C). Det har rapporterats att olika neuronala kärnor inom hypotalamus visar distinkta cilialängder och att dessa cilia ändrar sina längder som svar på fysiologiska förändringar på ett nucleusspecifikt sätt19,23. Därför märkte vi också hypotalamus hjärnan avsnitt från vuxna manliga C57BL/6J möss med ACIII och bild arcuate kärnan (ARC) och paraventricular kärnan (PVN). Med hjälp av GA3 för att mäta cilia längder observerade vi att in vivo hypotalamus cilia uppträdde längre än in vitro cilia. Specifikt varierar hypotalamus cilia in vivo från 1 μm till ca 15 μm (figur 3). Det fanns inga signifikanta skillnader mellan längden på cili i PVN (5,54 ± 0,0,42 μm) och cengens längd (6,16 ± 0,27 μm)(figur 3C)23. På samma sätt visar cilia i cornu ammonis (CA1) regionen i hippocampus ett smalare längdintervall från 1 μm till 10 μm med en genomsnittlig längd på 5,28 ± 0,33 μm (figur 3). I enlighet med tidigare publicerade studier visade vår analys med Ai- och GA3-verktyg att cilia från olika hjärnregioner visar mångfald i längd19,23. Dessutom kan vi med hjälp av denna Ai-metod snabbt bedöma ett stort antal cilier.

Mätning av ciliakomposition med GA3
Det primära ciliumet är ett signalnav för många vägar som använder olika typer av proteiner för att utföra unika funktioner som motorproteiner, intraflagellar transportproteiner och GPCR för att nämna några3,24,42,43. Att upprätthålla lämpliga nivåer av dessa proteiner inom ciliumet är viktigt för korrekt funktion och verkar ofta cellkontextberoende. Fluorescerande märkning av dessa proteiner har inte bara gjort det möjligt för oss att visualisera dem utan också kvantifiera deras intensitet som ett mått på mängden märkt protein inom det relativt lilla delområdet20. Därför försökte vi bestämma intensiteterna hos en ciliary GPCR, Melanin Koncentrera hormonreceptor 1 (MCHR1), in vivo i både ARC och PVN av hypotalamus hos vuxna manliga möss24,44. Med hjälp av Ai och GA3 mätte vi längderna på MCHR1 positiv cilia tillsammans med intensiteter för att säkerställa att de objekt som räknades var cilia (Kompletterande figur 3A). Vi eliminerade objekt efter analys som var mindre än 2 μm i längd och analyserade intensiteter av återstående binära masker. Intressant nog fann vi att intensiteten av ciliary MCHR1 i PVN är betydligt högre än i ARC vilket indikerar en starkare närvaro av ciliary MCHR1 i PVN (figur 4). Ytterligare studier krävs för att fastställa betydelsen av ciliary MCHR1 i dessa neuronala kretsar. Vi mätte också intensiteterna av ciliary MCHR1 i primära odlade nervceller av hypotalamus och hippocampus. Cilia från båda kulturerna uppvisar en bred fördelning av MCHR1-intensiteter som tyder på förekomst av heterogena neuronala populationer(kompletterande figur 2). Således, med hjälp av sofistikerade analysverktyg som Ai och GA3 möjliggör utvärdering av cilia heterogenitet inom samma vävnad eller mellan flera vävnader. Det kommer att bli intressant att se om andra neuronala GPCR visar liknande skillnader i deras lokalisering inom nervceller av samma vävnad och om detta förändras som svar på fysiologiska förändringar.

Colocalization
Även om mätning av fluorescensintensiteter inom ett komplett bildfält kan ge ett intryck av protein, ger det inte information som rumslig fördelning eller närhet till andra närliggande proteiner och cellulära strukturer. Här mätte vi överlappningen av MCHR1 med ACIII som en ciliamarkör genom att plotta MCHR1:s intensitet mot ACIII:s för varje binär mask(figur 5). Diagrammet visar att majoriteten av cilierna är positiva för båda, ACIII och MCHR1, även om vissa cilia visar starkare uttryck för en kanal över den andra. Dessutom finns det några cilia som visar närvaron av antingen ACIII eller MCHR1 vilket framgår av de punkter som ligger direkt på x-axeln respektive y-axeln. För att kvantifiera denna överlappning mätte vi Manders överlappningskoefficient och jämförde omfattningen av MCHR1-uttryck i neuronala cilier i ARC och PVN40. Intressant nog visade vår analys att pvn-koefficienterna (0,6382 ± 0,0151) ökade avsevärt än i ARC (0,5430 ± 0,0181) (figur 5C). Detta överensstämmer med våra tidigare data där vi observerade högre MCHR1-intensiteter i PVN jämfört med ARC (figur 4). Dessa data tyder på att som cilia längd, uttryck mönstret för MCHR1 i ciliary facket varierar i olika regioner i hjärnan. Med hjälp av samma analyspipeline kommer det att vara möjligt att avgöra om andra ciliary GPCRs såsom Neuropeptide Y Receptor Type 2 (NPY2R) och Somatostatin Receptor Type 3 (SSTR3) visar liknande mängder mångfald.

Mätintensitetsprofil längs ciliumet
När cilia har identifierats med hjälp av segment.ai kan GA3 receptet ändras för att kombinera cilia analys med identifiering av andra strukturer av intresse för bilden. Till exempel är märkning med basala kroppsmarkörer användbar för identifiering av cilia polaritet. För att göra denna analys avbildade vi hypotalamus hjärnsektioner från P0-möss som uttrycker ARL13B-mCherry och Centrin2-GFP och avbildade ARC och PVN34. Här identifierades cilia med Ai som tidigare men nu innehåller det modifierade GA3-receptet identifiering av Centrin2-GFP, ett centriolära protein som finns vid basen av cilia (Kompletterande figur 3B). Genom märkning av Centrin2-GFP kan ciliabasen särskiljas från spetsarna i ARL13B-mCherry positiv cilia (figur 6A). Sedan, istället för att mäta intensitet inom hela cilierna, kan vi mäta förändringar i ARL13B-intensiteten längs ciliaens längd (figur 6B). Vi kan också jämföra skillnader i intensiteten av ARL13B mellan de proximala ändarna och de distala ändarna av cilierna. För att göra detta delade vi ciliumlängden i 1-mikron bins från basen och betecknade den första mikronbehållaren som den proximala änden och den sista mikronbehållaren som den distala änden. Vår analys visade att det finns betydligt mer ARL13B närvarande närmare basen än spetsen av cilium i både ARC och PVN, och detta överensstämmer med tidigare publicerade studier i mänskliga kondrocyter45 (figur 6C). I denna typ av analys analyseras endast cilia i samband med Centrin2-GFP-märkning i stället för att tillämpa ett längdfilter för att utesluta små icke-ciliära objekt från analys. Detta kan vara fördelaktigt i situationer där genetiska mutationer återger mycket kort cilia, eller om förändringar i cilia subdomäner som övergångszonen eller spetsen har varit inblandade. Identifiering av cilia med hjälp av Ai- och GA3-analys är mycket anpassningsbar och kan skräddarsys för att passa en mängd komplexa forskningsfrågor.

Figure 1
Bild 1. Arbetsflöde för mätning av cililängd och intensitet med Ai. (A) För att träna Ai ritas binärer runt föremål av intresse (cilia) på de råa träningsbilderna. Med hjälp av de ritade binärfilerna tränas Segment Ai att känna igen formen och pixelintensiteterna i cilierna. (B) Därefter tillämpas det utbildade segment Ai på råa experimentella bilder. Den ritar binärfiler på objekt som den känner igen som cilia. Dessa binärfiler kan förfinas för att se till att alla och endast cilia analyseras. (C) Ett GA3-program är konstruerat för att analysera intensiteten och längden på objekt som känns igen av Ai. ( D) Posterna importeras till en tabell i programvaran. Den här tabellen kan sedan exporteras för vidare analys. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2. In vitro cilia längd mätningar. Representativa bilder av cilier i (A) IMCD-celler (gröna, acetylerade tubulin) (B) primära hypotalamuskulturer (gröna, ACIII) och (C) hippocampala kulturer (grön, ACIII). En tränad Ai användes för att känna igen cilia som visas i den binära masken (magenta) och sedan användes GA3 för att mäta cilialängd. Fördelningen av cililängden graferas i procent av cili i 0,5 eller 1,0 mikron bin. * indikerar cytokinetisk bro som inte känns igen ordentligt av Ai. n=225 cilia i IMCD celler från 3 replikerar, 54 cilia i hypotalamus och 139 cilia i hippocampal kulturer från 3 djur. Skalningsstaplar 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3. In vivo cilia längd mätningar. ( A) Representativa bilder av cilia (grön, ACIII) i ARC, PVN och CA1 av vuxna mushjärnsektioner. (B) En utbildad Ai i NIS Elements användes för att känna igen cilia som visas i den binära masken (magenta) och sedan användes GA3 för att mäta cilialängd. c)Fördelningen av cililängden graferas i procent av cili i en mikronfack. n= 68 cilier i ARC, 36 i PVN och 29 i CA1 från 3 djur. Skalningsstaplar 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Ai assisterade cilia färgning intensitet mätningar av hypotalamus neuronal cilier. (A) Representativa bilder av cili (MCHR1, röd) i ARC och PVN för vuxna mushjärnsektioner. En utbildad Ai i NIS Elements användes för att känna igen cilia som visas i den binära masken (cyan) och sedan användes GA3 för att mäta intensiteten av MCHR1 färgning i cilia. b)MCHR1-intensiteter graferas som genomsnittliga ± S.E.M. Varje prick representerar ett cilium. * p < 0,05, Studentens t-test. c)Fördelningen av MCHR1-intensiteten visas i procent av cili i fack med 0,2 x 107 godtyckliga enheter (A. U.). n= 53 cilier i ARC, 78 i PVN från 3 djur. Skalningsstaplar 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Ai assisterad cilia colocalization analys. (A, B) Representativa bilder av cilier i ARC respektive PVN. Cilia är märkta med ACIII (grön) och MCHR1 (röd). En utbildad Ai i NIS Elements användes för att känna igen cilia som visas i den binära masken (magenta för ACIII märkt cilia, cyan för MCHR1 märkt cilia). GA3 användes för att känna igen cilia som innehöll både ACIII och MCHR1. c)MOC-värden (Manders overlap coefficient) anges som genomsnittliga ± S.E.M. Varje prick representerar ett cilium. * p < 0,05, Studentens t-test. D)Spridningsdiagram med MCHR1-intensitet jämfört med ACIII-intensiteten i ARC och PVN. Varje prick representerar ett cilium. n= 72 cilier i ARC, 47 i PVN från 3 djur. Skalningsstaplar 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Cilia och basal kroppsanalys. ( A) Representativa bilder av cilia (röd, ARL13B-mCherry) och basal kroppsmarkör (grön, Centrin2-GFP) i ARC och PVN för P0-möss. En tränad Ai användes för att känna igen cilia som visas i den binära masken (cyan). Den binära masken för basal kropp (magenta) ritades genom tröskel i GA3 recept. b)Representativ linjeskanningsintensitet för ett cilium. (C)ARL13B-intensiteter i de proximala och distala ändarna av Ai identifierade cilia graferade som genomsnittliga ± S.E.M. De proximala och distala ändarna definieras som regionen inom den första 1 μm-längden respektive den sista 1 μm-längden från ciliumets botten. Varje prick representerar ett cilium. * p < 0,05. n = 6 cilier i ARC från 2 djur och 21 cilier i PVN från 3 djur. Skalningsstaplar 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1. Ai-träningsförlustdiagram. (A, B) Diagram som visar träningsförlust av segment.ai på neuronal cilia in vitro respektive in vivo. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2. Ai Assisterad Cilia färgning intensitet mätningar av in vitro neuronala cilia. (A, B) Representativa bilder av cilia (MCHR1, röd) i primära hypotalamus och hippocampal kulturer, respektive. En utbildad Ai i NIS Elements användes för att känna igen cilia som visas i den binära masken (cyan) och sedan användes GA3 för att mäta intensiteten av MCHR1 färgning i cilia. Distribution av MCHR1 intensitet är diagram som procentandel av cili i 1000 A.U. bins för hypotalamus och 2000 A. U. bins för hippocampal kulturer. n= 30 cilia i hypotalamus och 106 cilia i hippocampala kulturer från 3 djur. Skala staplar 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3. Allmän analys 3 recept för cilia analys. ( A) Enkel allmän analys (GA3) recept för mätning av cililängd, intensitet och Manders koefficient. (B) Komplext GA3-recept för mätning av intensitet längsciliets längd med hjälp av en markör för basalkropp. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Längd- och intensitetsmätningar är vanliga sätt som primära cilia analyseras, men det finns ingen standardiserad konventionell metod som används i fältet. Identifiering och kvantifiering av primära cilier med hjälp av programvara som ImageJ är tidskrävande och benägen för användarens partiskhet och fel. Detta gör det svårt att noggrant analysera stora datamängder. Här visar vi att användning av ett Ai-program kan övervinna många av dessa utmaningar vilket gör hög genomströmningsanalys av primära cilia uppnåeliga. Här beskriver vi proceduren för att träna en Ai-baserad applikation för att känna igen primära cilier och beskriva de steg som krävs för att analysera längd och intensitet.

Medan den inledande utbildningen av Ai för att känna igen cilia kräver betydande tid från användaren, kan den användas på alla datauppsättningar som förvärvats med samma parametrar när den är klar. Den binära masken som genereras av Ai:n kan ändras så att eventuella fel kan korrigeras. Fel i cilia-identifieringen bör dock signalera användaren att Ai behöver ytterligare tränas med ytterligare bilder. En stor fördel med denna metod är att Ai kan tränas att känna igen cilia i olika provtyper i både 2D och 3D. Tidigare analysmetoder som genereras inom laboratorier har olika begränsningar, inklusive att kräva manuell tröskel för identifiering och problem med att identifiera cilia avbildade från vävnadssektioner där celltätheten är hög36,46,47. Dessa metoder är också specialiserade för cilia-analys medan analys med NIS Elements programvara kan utvärdera flera aspekter av bilderna samtidigt. Eftersom Ai som beskrivs här är en del av NIS Elements mjukvarupaket kan bilder som förvärvats med hjälp av ett Nikon-mikroskop enkelt fortsättas till analys. Avbildning med Nikon krävs dock inte för användning av denna metod. Oavsett det infångade rådatafilformatet kan ".tif" filer öppnas av NIS Elements att använda i Ai.

Denna Ai-applikation inom NIS Elements är allmänt tillgänglig och möjligen redan en del av bildanalysprogramvara som används av laboratorier som studerar primära cilier. När förekomsten av Ai-teknik expanderar kan annan bildbehandlingsprogramvara utöka sina analysalternativ till att omfatta en liknande Ai-modul. Att tillämpa Ai-analys på ciliaidentifiering kan användas för flera olika aspekter av ciliaanalys. Medan vi skisserade metoder för några enkla analyser som längd (figur 2 och 3), intensitet (figur 4) och colocalization (figur 5) kan mer sofistikerad analys läggas till GA3-analysarbetsflödet som i figur 6. I stället för att mäta intensiteten hos ett komplett cilium kan till exempel skillnader i intensitet inom en delregion av ett cilium vara av intresse för att bedöma sub-ciliary lokalisering. Skillnader i intensitet inom en underregion av ett cilium kan tyda på att proteinet ackumuleras vid spetsen eller basen av ciliumet, till exempel hur Gli-proteiner berikas vid spetsen av cilia48. Dessutom kan denna Ai-applikation användas för att enkelt identifiera skillnader mellan genotyper eller behandlingsgrupper. Medan vårt labb främst använder denna metod för att analysera cilia avbildade från hjärnsektioner eller neuronala kulturer, kan det tillämpas på bilder som förvärvats från olika cellinjer eller andra vävnadstyper. Flexibiliteten hos provtyp som denna applikation kan användas på gör denna analysmetod värdefull för många olika grupper som studerar primära cilier eller någon diskret organell som bedöms såsom mitokondrier, kärna eller ER.

Disclosures

Medförfattaren Wesley Lewis är anställd av Nikon. Det finns inga finansiella upplysningar.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 till NFB och American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 till RB. Vi tackar Rich Gruskin General Manager för Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft och Teresa Mastracci för insiktsfulla kommentarer om manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM Intel Corporation W-2123 Processor used for running NIS Elements.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Inc. - Ai and GA3 software
Quadro RTX 4000 Graphics card NVIDIA Corporation Quadro RTX 4000
Windows 10 Professional 64-bit Microsoft Inc. - Operating system used for running NIS Elements
Workstation HP Development Company, L.P. HP Z4G4 Workstation used for running NIS Elements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., et al. Ciliary gene RPGRIP1L is required for hypothalamic arcuate neuron development. JCI Insight. 4 (3), (2019).
  2. Siljee, J. E., et al. Subcellular localization of MC4R with ADCY3 at neuronal primary cilia underlies a common pathway for genetic predisposition to obesity. Nature Genetics. 50 (2), 180-185 (2018).
  3. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Current Biology. 17 (18), 1586-1594 (2007).
  4. Berbari, N. F., O'Connor, A. K., Haycraft, C. J., Yoder, B. K. The primary cilium as a complex signaling center. Current Biology. 19 (13), 526-535 (2009).
  5. Walz, G. Role of primary cilia in non-dividing and post-mitotic cells. Cell Tissue Research. 369 (1), 11-25 (2017).
  6. Nachury, M. V., Mick, D. U. Establishing and regulating the composition of cilia for signal transduction. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (7), 389-405 (2019).
  7. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  8. Engle, S. E., Bansal, R., Antonellis, P. J., Berbari, N. F. Cilia signaling and obesity. Seminars in Cell and Developmental Biology. , (2020).
  9. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
  10. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatric Nephrology. 26 (7), Berlin, Germany. 1039-1056 (2011).
  11. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. New England Journal of Medicine. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  12. Vaisse, C., Reiter, J. F., Berbari, N. F. Cilia and Obesity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), (2017).
  13. Berbari, N. F., et al. Leptin resistance is a secondary consequence of the obesity in ciliopathy mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), 7796-7801 (2013).
  14. Jacobs, D. T., et al. Dysfunction of intraflagellar transport-A causes hyperphagia-induced obesity and metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 789-798 (2016).
  15. Arsov, T., et al. Fat aussie--a new Alström syndrome mouse showing a critical role for ALMS1 in obesity, diabetes, and spermatogenesis. Molecular Endocrinology. 20 (7), 1610-1622 (2006).
  16. Tam, L. W., Ranum, P. T., Lefebvre, P. A. CDKL5 regulates flagellar length and localizes to the base of the flagella in Chlamydomonas. Molecular Biology of the Cell. 24 (5), 588-600 (2013).
  17. Rajagopalan, V., Subramanian, A., Wilkes, D. E., Pennock, D. G., Asai, D. J. Dynein-2 affects the regulation of ciliary length but is not required for ciliogenesis in Tetrahymena thermophila. Molecular Biology of the Cell. 20 (2), 708-720 (2009).
  18. Bengs, F., Scholz, A., Kuhn, D., Wiese, M. LmxMPK9, a mitogen-activated protein kinase homologue affects flagellar length in Leishmania mexicana. Molecular Microbiology. 55 (5), 1606-1615 (2005).
  19. Han, Y. M., et al. Leptin-promoted cilia assembly is critical for normal energy balance. Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2193-2197 (2014).
  20. Caspary, T., Marazziti, D., Berbari, N. F. Cilia: Methods and Protocols. Satir, P., Tvorup Christensen, S. , Springer. New York. 203-214 (2016).
  21. Bishop, G. A., Berbari, N. F., Lewis, J., Mykytyn, K. Type III adenylyl cyclase localizes to primary cilia throughout the adult mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 505 (5), 562-571 (2007).
  22. Domire, J. S., Mykytyn, K. Markers for neuronal cilia. Methods in Cell Biology. 91, 111-121 (2009).
  23. Sun, J. S., et al. Ventromedial hypothalamic primary cilia control energy and skeletal homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), (2021).
  24. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
  25. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Research. 872 (1-2), 271-275 (2000).
  26. Domire, J. S., et al. Dopamine receptor 1 localizes to neuronal cilia in a dynamic process that requires the Bardet-Biedl syndrome proteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (17), 2951-2960 (2011).
  27. Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89 (3), 909-926 (1999).
  28. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), 10335-10340 (2014).
  29. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  30. Berman, S. A., Wilson, N. F., Haas, N. A., Lefebvre, P. A. A novel MAP kinase regulates flagellar length in Chlamydomonas. Current Biology. 13 (13), 1145-1149 (2003).
  31. Nguyen, R. L., Tam, L. W., Lefebvre, P. A. The LF1 gene of Chlamydomonas reinhardtii encodes a novel protein required for flagellar length control. Genetics. 169 (3), 1415-1424 (2005).
  32. Tam, L. W., Wilson, N. F., Lefebvre, P. A. A CDK-related kinase regulates the length and assembly of flagella in Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 176 (6), 819-829 (2007).
  33. O'Connor, A. K., et al. An inducible CiliaGFP mouse model for in vivo visualization and analysis of cilia in live tissue. Cilia. 2 (1), 8 (2013).
  34. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (2), 113-122 (2015).
  35. Delling, M., et al. Primary cilia are not calcium-responsive mechanosensors. Nature. 531 (7596), 656-660 (2016).
  36. Saggese, T., Young, A. A., Huang, C., Braeckmans, K., McGlashan, S. R. Development of a method for the measurement of primary cilia length in 3D. Cilia. 1 (1), 11 (2012).
  37. Kobayashi, Y., Hamamoto, A., Saito, Y. Analysis of ciliary status via G-protein-coupled receptors localized on primary cilia. Microscopy. 69 (5), 277-285 (2020).
  38. Zhou, L. Q., et al. Artificial intelligence in medical imaging of the liver. World Journal of Gastroenterology. 25 (6), 672-682 (2019).
  39. Naugler, C., Church, D. L. Automation and artificial intelligence in the clinical laboratory. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 56 (2), 98-110 (2019).
  40. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  41. Bansal, R., et al. Hedgehog Pathway Activation Alters Ciliary Signaling in Primary Hypothalamic Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 266 (2019).
  42. Jin, H., et al. The conserved Bardet-Biedl syndrome proteins assemble a coat that traffics membrane proteins to cilia. Cell. 141 (7), 1208-1219 (2010).
  43. Liew, G. M., et al. The intraflagellar transport protein IFT27 promotes BBSome exit from cilia through the GTPase ARL6/BBS3. Developmental Cell. 31 (3), 265-278 (2014).
  44. Engle, S. E., et al. A CreER Mouse to Study Melanin Concentrating Hormone Signaling in the Developing Brain. Genesis. , (2018).
  45. Thorpe, S. D., et al. Reduced primary cilia length and altered Arl13b expression are associated with deregulated chondrocyte Hedgehog signaling in alkaptonuria. Journal of Cellular Physiology. 232 (9), 2407-2417 (2017).
  46. Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8, 1 (2019).
  47. Dummer, A., Poelma, C., DeRuiter, M. C., Goumans, M. J., Hierck, B. P. Measuring the primary cilium length: improved method for unbiased high-throughput analysis. Cilia. 5, 7 (2016).
  48. Haycraft, C. J., et al. Gli2 and Gli3 localize to cilia and require the intraflagellar transport protein polaris for processing and function. PLoS Genetics. 1 (4), 53 (2005).

Tags

Biologi nummer 171
Artificiell intelligens metoder för att bedöma primära Cilia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T.… More

Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T. K., Brewer, K. M., Lewis, W. R., Berbari, N. F. Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia. J. Vis. Exp. (171), e62521, doi:10.3791/62521 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter