Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kunstig intelligens tilnærminger til vurdering av primær Cilia

Published: May 1, 2021 doi: 10.3791/62521
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 2Nikon Instruments Inc., 3Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University, 4Center for Diabetes and Metabolic Diseases, Indiana University School of Medicine

Summary

Bruken av kunstig intelligens (Ai) for å analysere bilder fremstår som en kraftig, mindre partisk og rask tilnærming sammenlignet med vanlige metoder. Her trente vi Ai til å gjenkjenne en cellulær organell, primær cilia, og analysere egenskaper som lengde og fargingsintensitet på en streng og reproduserbar måte.

Abstract

Cilia er mikrotubulebaserte cellulære vedlegg som fungerer som signalsentre for et mangfold av signalveier i mange pattedyrcelletyper. Cilia lengde er svært bevart, tett regulert, og varierer mellom ulike celletyper og vev og har vært involvert i direkte innvirkning av deres signalkapasitet. For eksempel har cilia vist seg å endre lengdene som svar på aktivering av ciliary G protein-koblede reseptorer. Men nøyaktig og reprodusert måling av lengdene på mange cilia er en tidkrevende og arbeidsintensiv prosedyre. Nåværende tilnærminger er også feil- og biasutsatte. Kunstig intelligens (Ai) programmer kan brukes til å overvinne mange av disse utfordringene på grunn av evner som tillater assimilering, manipulering og optimalisering av omfattende datasett. Her demonstrerer vi at en Ai-modul kan trenes til å gjenkjenne cilia i bilder fra både in vivo- og in vitro-prøver. Etter å ha brukt den opplærte Ai til å identifisere cilia, er vi i stand til å designe og raskt bruke applikasjoner som analyserer hundrevis av cilia i en enkelt prøve for lengde, fluorescensintensitet og samlokalisering. Denne objektive tilnærmingen økte vår selvtillit og strenghet når vi sammenlignet prøver fra forskjellige primære nevronale preps in vitro så vel som på tvers av forskjellige hjerneregioner i et dyr og mellom dyr. Videre kan denne teknikken brukes til pålitelig å analysere ciliadynamikk fra hvilken som helst celletype og vev på en høy gjennomstrømningsmåte på tvers av flere prøver og behandlingsgrupper. Til syvende og sist vil Ai-baserte tilnærminger sannsynligvis bli standard etter hvert som de fleste felt beveger seg mot mindre partiske og mer reproduserbare tilnærminger for bildeanskaffelse og analyse.

Introduction

Primær cilia er sensoriske organeller som stikker ut fra de fleste pattedyrcelletyper1,2,3,4. De er generelt ensomme vedlegg som er kritiske for koordinering av ulike cellesignalveier ved å integrere ekstracellulære signaler5,6,7. Primær cilia spiller viktige roller under embryonal utvikling og voksenvev homeostase, og forstyrrelse av deres funksjon eller morfologi er forbundet med flere genetiske lidelser, som kollektivt kalles ciliopatier. På grunn av ciliaens nær allestedsnærværende natur er ciliopatier forbundet med et bredt spekter av kliniske egenskaper som kan påvirke alle organsystemer8,9,10,11,12. I dyremodeller av ciliopatier manifesterer tap av ciliary-struktur eller signalkapasitet i flere klinisk relevante fenotyper, inkludert hyperfagi-assosiert fedme3,13,14,15. I mange modellsystemer har cilia lengdeendringer vist seg å påvirke deres signalkapasitet og funksjoner16,17,18,19. Det er imidlertid flere tidkrevende og tekniske utfordringer knyttet til nøyaktig og reprodusering av cilia lengde og sammensetning.

Det voksne pattedyrets sentralnervesystem (CNS) er en biologisk kontekst som har utgjort en utfordring for å forstå cilia morfologi og funksjon. Mens det ser ut til at nevroner og celler i hele CNS har cilia, på grunn av de begrensede verktøyene og evnene til å observere og analysere disse cilia, forblir en forståelse av deres funksjoner unnvikende20. For eksempel merker den prototypiske ciliamarkøren, acetylert α-tubulin, ikke nevronal cilia20. Vanskeligheten med å studere disse cilia ble delvis løst med oppdagelsen av flere G protein-koblede reseptorer (GPCR), signalmaskiner og membran assosierte proteiner som er beriket på membranen av nevronal cilia21,22. Alle disse enkle grunnleggende observasjonene antyder viktigheten og mangfoldet av CNS cilia, som så langt fremstår uten sidestykke av andre vev. For eksempel kan variasjon i cilia lengde og GPCR lokalisering observeres i hele hjernen, med lengder i visse nevronale kjerner som er forskjellige sammenlignet med andre kjerner19,23. På samme måte viser deres GPCR-innhold og signalmaskiner mangfold basert på nevroanatomisk plassering og nevronal type2,24,25,26,27,28,29. Disse enkle observasjonene viser at pattedyr CNS cilia lengde og sammensetning er tett regulert, akkurat som i modellorganismer, som Chlamydomonas reinhardtii, men virkningen av disse lengdeforskjellene på cilia-funksjon, signalering og til slutt oppførsel forblir uklar16,30,31,32.

Nøyaktig måling av cilia lengde og sammensetning viser seg å være en teknisk utfordring utsatt for brukerfeil og irreproducibility. For tiden er cilia in vivo og in vitro oftest identifisert ved hjelp av immunfluorescerende tilnærminger som merker ciliary proteiner eller cilia-beriket fluorescerende reporter alleler33,34,35. Lengdene på disse fluorescerende kodede cilia måles deretter fra et 2-dimensjonalt (2D) bilde ved hjelp av linjemålingsverktøy i bildeanalyseprogrammer som ImageJ36. Denne prosessen er ikke bare kjedelig og arbeidsintensiv, men også utsatt for fordommer og feil. De samme hindringene oppstår ved måling av cilia-intensiteter, noe som bidrar til å indikere endringer i cilia struktur37. For å minimere inkonsekvensene i denne typen bildeanalyser, blir kunstig intelligens (Ai) -programmer mer utbredte og rimelige alternativer38.

Ai er fremskrittet av datasystemer som bruker fordelen med dataalgoritmer og programmering for å utføre oppgaver som vanligvis krever menneskelig intelligens39. Ai-enheter læres å oppfatte tilbakevendende mønstre, parametere og egenskaper og iverksette tiltak for å maksimere oddsen for å skape vellykkede resultater. Ai er allsidig og kan trenes til å gjenkjenne spesifikke objekter eller strukturer av interesse, for eksempel cilia, og deretter programmeres til å kjøre en rekke analyser på de identifiserte objektene. Derfor kan komplekse bildedata raskt og reproduseres av Ai38. Automatisering og Ai-analyse av innspilte bilder vil øke effektiviteten og effektiviteten samtidig som potensielle menneskelige feil ogskjevheter begrenses. Etablering av en Ai-basert metodikk for ciliaidentifikasjon skaper en konsistent måte for alle forskningsgrupper å analysere og tolke ciliadata på.

Her bruker vi en Ai-modul for å identifisere cilia både in vivo og in vitro på 2D-bilder. Ved hjelp av et sett med prøvebilder er ai opplært til å identifisere cilia. Når opplæringen er fullført, brukes den angitte ai-en til å bruke en binær maske over Ai identifisert cilia i et bilde. Binærfilene som brukes av ai er modifiserbare, om nødvendig, for å sikre at alle cilia i bildene er riktig identifisert og ikke-spesifikk identifikasjon elimineres. Etter å ha brukt Ai til å identifisere cilia, brukes spesialbygde generelle analyseprogrammer (GA) til å utføre forskjellige analyser som måling av cilia lengde og fluorescensintensitet. Dataene som samles inn, eksporteres til en tabell som enkelt kan leses, tolkes og brukes til statistiske analyser (figur 1). Bruk av automatisert teknologi og ai for å identifisere cilia og oppnå spesifikke målinger mellom eksperimentelle grupper vil hjelpe i fremtidige studier med sikte på å forstå effekten av CNS cilia-funksjon og morfologi på cellecellekommunikasjon og atferd.

Protocol

1. Skaff deg rå bilder

  1. Fiks og immunmerkede prøver etter behov20.
    1. Bildesilia ved hjelp av et konfokalt mikroskop med maksimal bitdybde med samme pikselstørrelse med Nyquist-oppløsning.
    2. Eksporter bilder som monokrome kodede bildeformatfiler (.tif).
      MERK: Denne protokollen beskriver hvordan du bruker Ai-modulen spesielt i NIS Elements-programvaren. Hvis bilder ble anskaffet som .nd2-filer, er det ikke nødvendig å eksportere bilder som .tif filer, og brukeren kan fortsette direkte til trinn 2.3. Hvis bilder ble anskaffet på et annet system, kan en NIS Elements-lisens kjøpes separat, og .tif filer kan konverteres som beskrevet i de neste trinnene.

2. Tren Ai for å identifisere cilia

  1. Åpne treningsdatasettet.
    1. Velg omtrent 50 eksempelbilder med minst ett cilium per ramme for å trene programvaren og kopiere dem i en enkelt mappe. Denne mappen brukes til å dirigere programvaren når du åpner bildene. Åpne disse 50 rammene i ett enkelt ND2-dokument med minst ett cilium per ramme. Velg Fil > Importer/eksporter > Opprett ND-fil fra filsekvens .
    2. Velg mappen som inneholder treningsdatasettet. Dette åpner listen over filer midt i dialogvinduet. Definer manuelt organiseringen av filene ved hjelp av minst ett alternativ i rullegardinmenyen ovenfor. Alternativene er multipunkt (for flere maksimale projeksjonsfiler), Z-serier (for et z-stakkbilde), tid (for et tidsforløpbilde) og bølgelengde (for filer fra flere kanaler).
    3. Angi de tilsvarende numeriske verdiene under hvert valgte alternativ. Velg Ingen der alternativer ikke er valgt. Klikk Konverter for å åpne ND-dokumentet.
  2. Kalibrere bilder.
    1. Angi pikselstørrelsen nederst til venstre i bildet: Høyreklikk Påklikalert > Kalibrer dokument > Pikselstørrelse.
  3. Identifiser cilia.
    1. Hånddentifisere cilia ved å spore individuelle ciliary strukturer nøyaktig på alle åpnede rammer ved hjelp av enten Automatisk gjenkjenning eller Tegn objekt på binær verktøylinje. Dette vil tegne binære masker på objekter av interesse. Disse binærfilene vil fungere som eksempelobjekter for opplæring av programvaren for å identifisere cilia på pikselbaserte egenskaper i fremtidig eksperimentell bildeanalyse. Velg Vis > analysekontroller > binær verktøylinje > Tegne objekt.
      MERK: Fjern alle rammer som ikke har binærfiler, da programvaren ikke vil begynne å trene med mindre den er i stand til å oppdage binærfiler på alle åpnede rammer.
  4. Tren ai.
    1. Begynn å lære opp programvaren. Dette åpner Segment.ai boksen. Velg NIS.ai > Tog Segment.ai.
    2. Velg kildekanalen som skal brukes til trening, i boksen Tog Segment.ai . Hvis filer fra flere kanaler er åpne, velger du bare én kanal som kildekanal. Velg deretter de riktige grunn sannhetsbinærene som ai-en skal trenes på. Til slutt velger du antall gjentakelser som trengs for å trene ai avhengig av størrelsen og fordelingen av binærfilene.
      MERK: Hvis binærfilene lett kan oppdages fra omgivelsene og distribueres godt gjennom hele bildet, kan det hende at programvaren trenger mindre enn 1000 gjentakelser for å bli opplært til å identifisere bildene. Hvis bildene har et lavt signal-til-støy-forhold, er det ideelt å kjøre minst 1000 gjentakelser mens du trener for å gjøre det mulig for Ai å identifisere cilia i testprøver med høy tillit.
    3. Velg målmappen for å lagre den opplærte Ai-filen (SAI), og klikk Tog for å lære opp programvaren. Programvaren vil nå fortsette å trene seg selv til å identifisere cilia basert på de sporede binærfilene. Denne prosessen tar flere timer.
      MERK: Når du trener, viser programvaren en graf som viser treningstap. Grafen vil i utgangspunktet vise en spike før den taper til ideelt rundt 1% tap der den platåer for resten av treningen. Lagre diagrammet for fremtidig referanse ved å merke av i boksen for Lagre grafskjermbilde på boksen Tog Segment.ai (Tilleggsfigur 1).
    4. Hvis ytterligere forbedring av opplæringen er nødvendig, fortsett å trene på samme datasett. Alternativt kan du trene på et nytt datasett med nøyaktig de samme parametrene. Det er ikke tilrådelig å trene en allerede opplært Ai på et nytt datasett med forskjellige parametere eller forskjellige objekter av interesse. Velg Lær opp segment.ai > Fortsett opplæring > Velg opplært ai-fil.

3. Identifiser cilia ved hjelp av opplært Ai

  1. Åpne det eksperimentelle datasettet.
    1. Åpne de eksperimentelle confocal bilder av cilia i programvaren ved å konvertere eksemplet .tif filer til .nd2 filer, ligner trinn 2.1. Velg Fil > Importer/eksporter > Opprett ND-fil fra filsekvens .
      MERK: Bildene skal ha samme pikselstørrelse som de som brukes til å trene ai-en. Hvis bildene allerede er i ND2-format, går du til trinn 3.3.
  2. Kalibrere bilder.
    1. Angi pikselstørrelsen nederst til venstre i bildet. Høyreklikk Ikke-kalibrert > Kalibrer dokument > pikselstørrelse.
  3. Kjør den opplærte Ai-en på de åpne filene.
    1. Begynn å identifisere cilia ved hjelp av Ai. Programvaren vil nå trekke binærfiler på cilia basert på opplæringen den mottok i forrige trinn. Denne prosessen vil ta noen sekunder. Velg NIS.ai > Segment.ai.
      MERK: Programvaren vil be om å velge kanalen hvis flere kanaler er åpne. Kanaler er oppført etter deres respektive navn her. Hvis ikke, velges boksen merket 'Mono'automatisk.
  4. Sjekk bilder for misidentifiserte binærfiler.
    1. Når Ai har identifisert cilia og tegnet binærfiler, sjekk bildene for eventuelle feilaktig identifiserte objekter. Hvis ønskelig, sletter du eventuelle misidentifiserte binærfiler manuelt. Velg Vis > analysekontroller > binær verktøylinje > Slett objekt.

4. Måling av cilia lengde og intensitet

  1. Opprett en ny GA3-oppskrift (General Analysis 3).
    1. Nå som cilia er identifisert og segmentert, fortsett å analysere forskjellige parametere for cilia som lengder og intensiteter ved hjelp av GA3-verktøyet. Dette åpner et nytt vindu med et tomt mellomrom i midten der analysen skal defineres. Velg Bilde > Ny GA3-oppskrift.
  2. Velg binærfilene som skal analyseres.
    1. Siden cilia allerede er segmentert ved hjelp av Segment.ai, vil GA3 automatisk oppdage binærfilene som er riktig merket i henhold til ai og inkludere noden. VelgBinærfiler > Automatisk Detect_AI eller Binærfiler > Tegn Object_AI.
  3. Velg kanalene som kreves for analyse. GA3 vil også automatisk oppdage kanalene i bildene og vise kategoriene sine under Kanaler.
  4. Fjern objekter som berører rammens kantlinje.
    1. Siden Ai vil segmentere alle cilia som objekter i rammen, vil den også oppdage ufullstendig cilia langs kantene av rammen. Disse objektene kan enten fjernes manuelt i trinn 3.4, eller de kan fjernes automatisk i GA3. Velg Binær behandling > Fjern objekter > berøringskantlinjer.
  5. Velg parametere for å måle cilia.
    1. Dra og slipp parameterne for å måle, for eksempel cilia lengde (Lengde) og intensiteter (Sum Objektintensitet). Koble nodene til riktig binær node (tilkobling A) og kanalnoder (tilkobling B). Hold pekeren over nodetilkoblingen for et verktøytips for å vise hvilken tilkobling noden tilhører. Velg Mål > objektstørrelse > lengde og mål > objektintensitet > Sum Obj-intensitet.
      MERK: Nodelengden kobles bare til den binære noden, mens Sum Obj Intensity kobles til både binær- og kanalnodene.
  6. Føye til målene i én enkelt tabell.
    1. Kombiner alle målene i en enkelt utdatatabell ved å dra og slippe noden Tilføy kolonne i analyseflytskjemaet og koble den til målnodene Lengde og Sum Obj-intensitet. Velg Databehandling > grunnleggende > tilføyingskolonne.
  7. Mål cilia.
    1. Mål cilia ved å klikke Kjør. Denne prosessen tar noen øyeblikk å måle alle cilia i eksperimentelle bilder. Lengdene og intensitetene vises i et nytt Analyseresultater-vindu.
      MERK: Tabellen kan noen ganger inneholde data fra masker som Ai anerkjente som cilia, men som var for små til å bli oppdaget av det menneskelige øye og eliminert i trinn 3.4. Disse objektene kan fjernes fra datasettet ved hjelp av et filter før statistisk analyse. Her ble et filter på 1 μm brukt til in vitro cilia lengdemålinger i figur 2 og 2 μm for in vivo cilia. Dette kan gjøres før du eksporterer data ved hjelp av banen nedenfor. Velg Analyseresultater -vinduet > Definer filter > Angi verdi > Bruk filter.
  8. Eksporter data for statistisk analyse.

5. Colocalization studier

MERK: Colocalization analyse kan inkluderes i samme GA3 oppskrift som brukes til målinger av cilia lengde og intensitet analyse. Hvis du bruker samme oppskrift, åpner du filer som beskrevet nedenfor og måler lengdene og intensitetene til begge kanalene sammen med colokaliseringskoeffisientene i samme analyserørledning.

  1. Åpne det eksperimentelle datasettet.
    1. Åpne de eksperimentelle confocal bilder av cilia i programvaren ved å konvertere prøven .tif filer til .nd2 filer. Velg Fil > Importer/eksporter > Opprett ND-fil fra filsekvens .
    2. I popup-vinduet velger du 16-biters dybde monokrome filer fra alle kanaler av interesse fra vindusutforskeren som ligger i den første kolonnen i popup-vinduet. Velg Multipoint eller Z Series fra den første rullegardinmenyen, og skriv inn en verdi som tilsvarer henholdsvis totalt antall bilder eller stabler.
    3. I den andre rullegardinlisten velger du Bølgelengde og endrer verdien til totalt antall kanaler i mappen. Programvaren vil automatisk låse opp et Wavelength-valgvindu som ligger nederst til høyre i popup-vinduet. Bruk rullegardinmenyen Farge til å velge fargen på hver kanal. Gi hver kanal et eget navn under Navn-kolonnen. Når all informasjon er oppdatert, klikker du Konverter. Programvaren vil automatisk generere en All bildefil overleggt med alle individuelle bilder fra alle de valgte kanalene.
  2. Kalibrere bilder.
    1. Angi pikselstørrelsen nederst til venstre i bildet. Høyreklikk Ikke-kalibrert > Kalibrer dokument > pikselstørrelse.
  3. Kjør den trente Ai-en på den første kanalen.
    1. Begynn å identifisere cilia på en av de åpnede kanalene (f.eks. Figur 5A) ved hjelp av Kunstig intelligens. Programvaren vil nå trekke binærfiler på ACIII merket cilia basert på opplæringen den mottok for denne kanalen. Denne prosessen vil ta noen sekunder. Velg NIS.ai > Segment.ai > Kildekanaler > ACIII.
  4. Kjør den trente Ai-en på den andre kanalen.
    1. Begynn å identifisere cilia på den andre åpnede kanalen (f.eks. Figur 5B) ved hjelp av Kunstig intelligens. Programvaren vil nå tegne binærfiler på MCHR1 merket cilia basert på opplæringen den mottok for denne kanalen. Denne prosessen vil ta litt tid. Velg NIS.ai > Segment.ai > Kildekanaler > MCHR1.
  5. Sjekk bilder for misidentifiserte binærfiler.
    1. Når Ai har identifisert cilia og tegnet binærfiler, sjekk bildene for eventuelle feilidentifiserte objekter. Slett eventuelle misidentifiserte binærfiler manuelt om nødvendig. Velg Vis > analysekontroller > binær verktøylinje > Slett objekt.
  6. Opprett ny GA3-oppskrift.
    1. Nå som cilia er identifisert og segmentert, fortsett til colokaliseringsanalysen ved hjelp av GA3-verktøyet. Dette åpner et nytt vindu med et tomt mellomrom i midten der analysen skal defineres. Det genereres et vindu med alle identifiserte binærfiler og kanaler. Kontroller at alle ønskede kanaler og binærfiler som kreves for analyse, finnes og velges. Velg Bilde > Ny GA3-oppskrift.
  7. Fjern objekter som berører rammens kantlinje.
    1. Siden Ai vil segmentere alle cilia-lignende objekter i rammen, vil den også oppdage ufullstendig cilia langs kantene på rammen. Disse objektene kan enten fjernes manuelt i trinn 5.5, eller de kan fjernes automatisk i GA3. Velg Binær behandling > Fjern objekter > Berøringsrammer.
  8. Sett opp colocalization-banen i GA3.
    1. Hvis du vil måle overlapping av de to kanalene i cilia, bruker du Manders koeffisientkorrelasjon. Dra og slipp Manders Coefficient -noden i det tomme området i GA3-oppskriften, og koble den til riktig binær og kanal. Her kobles tilkobling A til ACIII-binæren, tilkobling B med MCHR1-kanalen og tilkobling C med ACIII-kanalen for å fastslå overlappingen av MCHR1 i ACIII-binæren. Velg Mål > objektforholdsmetri > Manders Koeffisient.
      MERK: Programvaren gjør det mulig å måle colocalization ved hjelp av Pearson Coefficient Correlation ved hjelp av de samme trinnene som beskrevet i denne protokollen40.
  9. Føye til målene i én enkelt tabell.
    1. Kombiner alle målene i én enkelt utdatatabell. Velg Databehandling > grunnleggende > tilføyingskolonne.
  10. Mål colokalisering.
    1. Mål cilia ved å klikke Kjør. Denne prosessen tar noen øyeblikk å måle alle cilia i eksperimentelle bilder. Dataene vises i et nytt Analyseresultater-vindu.
  11. Eksporter data for statistisk analyse.

Representative Results

Opplæring ai for å identifisere cilia
Måling og vurdering av cilia strukturell lengde og sammensetning kan være en kjedelig, tidkrevende og feilutsatt prosess. Her bruker vi Ai for nøyaktig segmentering av cilia fra et stort utvalg av bilder og analysere deres lengder og intensiteter med et analyseverktøy (figur 1). Alle Ai-tilnærminger krever opplæringstrinn for implementeringen. Vi etablerte en opplæringsrørledning for å gjenkjenne cilia, som ble utført ved å manuelt bruke binære masker på ciliary strukturer. Denne informasjonen brukes deretter til å lære opp kunstig intelligens basert på pikselegenskaper under de brukte binærfilene. Som en generell retningslinje innebærer opplæringen at programvaren går gjennom flere gjentakelser, omtrent 1000, og anses som optimal hvis treningstapet eller feilfrekvensen er mindre enn 1%. Antallet gjentakelser og feil i treningsprosessen kan imidlertid variere avhengig av eksempelbildene som brukes til opplæring. For eksempel, etter treningsøktene våre ved hjelp av in vitro neuronal cilia-bilder, var feilfrekvensen 1,378% sammenlignet med 3,36% for in vivo hjerneseksjonsbilder (Supplerende figur 1). Når opplæringen er fullført, kan Ai deretter brukes til å segmentere cilia fra eksperimentelle bilder i løpet av sekunder, og de resulterende binære maskene brukes til å måle strukturelle parametere. Dette eliminerer behovet for å segmentere objekter ved hjelp av den tradisjonelle metoden for intensitetsterskel, noe som kan være vanskelig i bilder med høy bakgrunnsstøy eller når objekter er i nærheten av hverandre. Ai reduserer også potensialet for feil og skjevheter ved å bruke den samme algoritmen på tvers av alle bilder, uavhengig av bruker.

Måling av cilia lengde ved hjelp av GA3
Cilia lengde er tett regulert og er forbundet med funksjonelle konsekvenser på ciliary signalering16,19. Her målte vi cilia lengder ved hjelp av en analysepipeline i NIS Elements programvare kalt General Analysis 3 eller GA3. GA3 hjelper deg med å kombinere flere verktøy i én enkelt arbeidsflyt for å bygge tilpassede rutiner for hvert eksperiment. Vi begynte med å måle cilia lengder i en cellelinje. Cilia på musen indre medullary samle kanal (IMCD-3) celler ble immunolabelled med acetylert tubulin og avbildet ved hjelp av en konfokal mikroskop. Vi målte cilialengder ved hjelp av GA3 etter segmentering med segment.ai (Tilleggs figur 3A). Mens acetylert α-tubulin er fortrinnsvis funnet i det primære ciliumet, finnes det også i andre mikrotubule rike regioner som cytoskjelettet så vel som den cytokinetiske broen. Den trente Ai identifiserte cilia riktig i bildet, men ikke andre ikke-ciliary, acetylerte tubulin positive strukturer. Cilia på IMCD-celler varierte fra 0,5 μm til 4,5 μm med en gjennomsnittlig lengde på 1,8 ± 0,04 μm (figur 2A). Vi testet deretter Ais evne til å måle cilialengder i primære nevronkulturer. Vi dyrket nevroner fra hypothalamus og hippocampus av neonatale mus i 10 dager og immunolabelled dem med cilia markøren adenylate cyclase III (ACIII)21,41. Når vi analyserte nevronkulturer, fant vi det nyttig å bruke et filter før vi statistisk analyserte lengdene. På grunn av et lavere signal-til-støy-forhold ble det identifisert flere objekter under 1 μm som ikke var cilia. Derfor filtrerte vi dataene for å eliminere objekter som var mindre enn 1 μm lange for å sikre at bare cilia ble analysert. I dyrkede hypothalamus nevroner varierte cilialengdene fra 2 μm til 7 μm med en gjennomsnittlig lengde på 3,8 ± 0,19 μm (Figur 2B). Interessant nok var kultivert hippocampal neuronal cilia lengre med en gjennomsnittlig lengde på 6,73 ±0,15μm (figur 2C). Det har blitt rapportert at forskjellige nevronkjerner i hypothalamus viser tydelige cilialengder og at disse cilia endrer lengdene som svar på fysiologiske endringer på en kjernespesifikk måte19,23. Derfor merket vi også hypothalamus hjerneseksjoner fra voksne mannlige C57BL/6J-mus med ACIII og avbildet den buede kjernen (ARC) og paraventrikulær kjerne (PVN). Ved hjelp av GA3 for å måle cilia lengder, observerte vi at in vivo hypothalamus cilia dukket opp lenger enn in vitro cilia. Spesielt varierer hypothalamus cilia in vivo fra 1 μm til ca. 15 μm (figur 3). Det var ingen signifikante forskjeller mellom lengdene på cilia i PVN (5,54 ± 0,0,42 μm) og lengdene i ARC (6,16 ± 0,27 μm) (figur 3C)23. På samme måte viser cilia i cornu ammonis (CA1)-regionen i hippocampus et smalere lengdeområde fra 1 μm til 10 μm med en gjennomsnittlig lengde på 5,28 ± 0,33 μm (figur 3). I samsvar med tidligere publiserte studier viste vår analyse ved hjelp av Ai- og GA3-verktøy at cilia fra forskjellige hjerneregioner viser mangfold i lengde19,23. Videre, ved hjelp av denne Ai-tilnærmingen, er vi i stand til raskt å vurdere et stort antall cilia.

Måling av ciliasammensetning ved hjelp av GA3
Det primære cilium er et signalknutepunkt for mange veier som bruker forskjellige typer proteiner for å utføre unike funksjoner som motorproteiner, intraflagellar transportproteiner og GPCRs for å nevne noen3,24,42,43. Å opprettholde de riktige nivåene av disse proteinene i ciliumet er viktig for riktig funksjon og vises ofte cellekontekstavhengig. Fluorescerende merking av disse proteinene har ikke bare gjort det mulig for oss å visualisere dem, men også kvantifisere deres intensiteter som et mål på mengden av det merkede proteinet i det relativt små rommet20. Derfor forsøkte vi å bestemme intensitetene til en ciliary GPCR, Melanin Konsentrerende hormonreseptor 1 (MCHR1), in vivo i både ARC og PVN av hypothalamus av voksne mannlige mus24,44. Ved hjelp av Ai og GA3 målte vi lengdene på MCHR1 positiv cilia sammen med intensiteter for å sikre at gjenstandene som telles var cilia (Supplerende figur 3A). Vi eliminerte objekter etter analyse som var mindre enn 2 μm i lengde og analyserte intensiteter av gjenværende binære masker. Interessant nok fant vi ut at intensiteten av ciliary MCHR1 i PVN er betydelig høyere enn det i ARC som indikerer en sterkere tilstedeværelse av ciliary MCHR1 i PVN (Figur 4). Videre studier er nødvendig for å bestemme betydningen av ciliary MCHR1 i disse nevronale kretsene. Vi målte også intensitetene av ciliary MCHR1 i primærkulturerte nevroner av hypothalamus og hippocampus. Cilia fra begge kulturer viser en bred fordeling av MCHR1-intensiteter som tyder på tilstedeværelsen av heterogene nevronpopulasjoner (Supplerende figur 2). Ved hjelp av sofistikerte analytiske verktøy som Ai og GA3 kan det derfor evalueres cilia heterogenitet i samme vev eller mellom flere vev. Det vil være interessant å se om andre nevronale GPCRs viser lignende forskjeller i lokalisering innen nevroner av samme vev, og om dette endres som svar på fysiologiske endringer.

Colokalisering
Mens måling av fluorescensintensiteter innenfor et komplett bildefelt kan gi et inntrykk av protein, klarer det ikke å gi informasjon som romlig distribusjon eller nærhet til andre nærliggende proteiner og cellulære strukturer. Her målte vi overlappingen av MCHR1 med ACIII som en ciliamarkør ved å plotte intensitetene til MCHR1 mot ACIII for hver binær maske (figur 5). Grafen viser at flertallet av cilia er positive for både ACIII og MCHR1, selv om noen cilia viser sterkere uttrykk for den ene kanalen over den andre. Videre er det noen cilia som viser tilstedeværelsen av enten ACIII eller MCHR1 som det fremgår av punktene som ligger direkte på henholdsvis x-aksen og y-aksen. For å kvantifisere denne overlappingen målte vi Manders overlappingskoeffisient og sammenlignet omfanget av MCHR1-uttrykket i nevronal cilia i ARC og PVN40. Interessant nok viste vår analyse at det var en betydelig økning i PVNs koeffisienter (0,6382 ± 0,0151) enn de i ARC (0,5430 ± 0,0181) (figur 5C). Dette er i samsvar med våre tidligere data der vi observerte høyere MCHR1-intensiteter i PVN sammenlignet med ARC (figur 4). Disse dataene antyder at i likhet med cilia lengde, varierer uttrykksmønsteret til MCHR1 i ciliary-rommet i forskjellige områder av hjernen. Ved hjelp av samme analyserørledning vil det være mulig å avgjøre om andre ciliary GPCRs som Neuropeptide Y Receptor Type 2 (NPY2R) og Somatostatin Receptor Type 3 (SSTR3) viser lignende mengder mangfold.

Måleintensitetsprofil langs ciliumet
Når cilia er identifisert ved hjelp av segment.ai, kan GA3-oppskriften endres for å kombinere ciliaanalyse med identifisering av andre strukturer av interesse i bildet. For eksempel er merking med basale kroppsmarkører nyttig for identifisering av cilia polaritet. For å gjøre denne analysen avbildet vi hypothalamus hjerneseksjoner fra P0-mus som uttrykker ARL13B-mCherry og Centrin2-GFP og avbildet ARC og PVN34. Her ble cilia identifisert ved hjelp av Ai som før, men nå inkluderer den modifiserte GA3-oppskriften identifikasjon av Centrin2-GFP, et centriolarprotein som finnes ved foten av cilia (Supplerende figur 3B). Ved å merke Centrin2-GFP kan bunnen av cilia skille seg fra spissene til ARL13B-mCherry positive cilia (Figur 6A). Deretter, i stedet for å måle intensitet i hele cilia, er vi i stand til å måle endringer i ARL13B intensitet langs lengden av cilia (Figur 6B). Vi kan også sammenligne forskjeller i intensiteten av ARL13B mellom de proksimale endene og distale ender av cilia. For å gjøre dette delte vi ciliumlengden i 1-mikronbeholdere fra basen og utpekte den første mikronbeholderen som den proksimale enden og den siste mikronbeholderen som den distale enden. Vår analyse viste at det er betydelig mer ARL13B til stede nærmere basen enn spissen av cilium i både ARC og PVN, og dette er i samsvar med tidligere publiserte studier i humane kondrocytter45 (Figur 6C). I denne typen analyse analyseres bare cilia forbundet med Centrin2-GFP-merking i stedet for å bruke et lengdefilter for å utelukke små ikke-ciliary objekter fra analyse. Dette kan være fordelaktig i situasjoner der genetiske mutasjoner gjør svært korte cilia, eller hvis endringer i cilia underdomener som overgangssonen eller spissen har blitt implisert. Identifisering av cilia ved hjelp av Ai- og GA3-analyse er svært tilpasningsdyktig og kan skreddersys for å passe til en rekke komplekse forskningsspørsmål.

Figure 1
Figur 1. Arbeidsflyt for måling av cilia lengde og intensitet ved hjelp av Ai. (A) For å trene Ai tegnes binærfiler rundt gjenstandene av interesse (cilia) på rå treningsbildene. Ved hjelp av de tegnede binærfilene er Segment Ai opplært til å gjenkjenne formen og pikselintensitetene til cilia. (B) Deretter brukes den opplærte Segment Ai på rå eksperimentelle bilder. Den tegner binærfiler på objekter den gjenkjenner som cilia. Disse binærfilene kan raffineres for å sikre at alle og bare cilia blir analysert. (C) Et GA3-program er konstruert for å analysere intensiteten og lengden på objekter som gjenkjennes av ai. (D) Postene importeres til en tabell i programvaren. Denne tabellen kan deretter eksporteres for videre analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. In vitro cilia lengde målinger. Representative bilder av cilia i (A) IMCD celler (grønn, acetylert tubulin) (B) primære hypothalamus kulturer (grønn, ACIII) og (C) hippocampal kulturer (grønn, ACIII). En opplært Ai ble brukt til å gjenkjenne cilia som vist i binærmasken (magenta) og deretter GA3 ble brukt til å måle cilia lengde. Fordeling av cilia lengde er grafert som prosentandel av cilia i 0,5 eller 1,0-mikron bins. * indikerer at cytokinetisk bro ikke gjenkjennes riktig av Ai. n=225 cilia i IMCD-celler fra 3 replikerer, 54 cilia i hypothalamus og 139 cilia i hippocampal kulturer fra 3 dyr. Skalastenger 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. In vivo cilia lengde målinger. (A) Representative bilder av cilia (grønn, ACIII) i ARC, PVN og CA1 av voksne mus hjerne seksjoner. (B) En opplært Ai i NIS Elements ble brukt til å gjenkjenne cilia som vist i binærmasken (magenta) og deretter GA3 ble brukt til å måle cilia lengde. (C) Fordelingen av cilia lengde er grafert som prosentandel av cilia i en-micron bins. n= 68 cilia i ARC, 36 i PVN og 29 i CA1 fra 3 dyr. Skalastenger 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Ai assistert cilia farging intensitet målinger av hypothalamus nevronal cilia. (A) Representative bilder av cilia (MCHR1, rød) i ARC og PVN av voksne mus hjerne seksjoner. En opplært Ai i NIS Elements ble brukt til å gjenkjenne cilia som vist i binærmasken (cyan), og deretter ble GA3 brukt til å måle intensiteten av MCHR1-farging i cilia. (B) MCHR1-intensiteter er grafert som gjennomsnittlig ± S.E.M. Hver prikk representerer et cilium. * p < 0,05, Student t-test. (C) Fordelingen av MCHR1-intensiteten er grafert som prosentandel av cilia i skuffer på 0,2 x 107 vilkårlige enheter (A. U.). n= 53 cilia i ARC, 78 i PVN fra 3 dyr. Skalastenger 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5. Ai assistert cilia colocalization analyse. (A, B) Representative bilder av cilia i henholdsvis ARC og PVN. Cilia er merket med ACIII (grønn) og MCHR1 (rød). En opplært Ai i NIS Elements ble brukt til å gjenkjenne cilia som vist i binærmasken (magenta for ACIII merket cilia, cyan for MCHR1 merket cilia). GA3 ble brukt til å gjenkjenne cilia som inneholdt både ACIII og MCHR1. (C) Manders overlapper koeffisientverdier (MOC) er grafert som gjennomsnittlig ± S.E.M. Hver prikk representerer et cilium. * p < 0,05, Student t-test. (D) Punktplott av MCHR1-intensitet kontra ACIII-intensitet i ARC og PVN. Hver prikk representerer et cilium. n= 72 cilia i ARC, 47 i PVN fra 3 dyr. Skalastenger 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6. Cilia og basal kroppsanalyse. (A) Representative bilder av cilia (rød, ARL13B-mCherry) og basal kroppsmarkør (grønn, Centrin2-GFP) i ARC og PVN av P0 mus. En opplært Ai ble brukt til å gjenkjenne cilia som vist i binærmasken (cyan). Den binære masken for basal kropp (magenta) ble tegnet ved terskel i GA3 oppskrift. (B) Representativ linjeskanningsintensitet for et cilium. (C) ARL13B-intensiteter i de proksimale og distale endene av Ai identifiserte cilia som gjennomsnittlig ± S.E.M. De proksimale og distale endene er definert som regionen innenfor henholdsvis den første 1 μm lengden og den siste 1 μm lengden fra bunnen av ciliumet. Hver prikk representerer et cilium. * p < 0,05. n = 6 cilia i ARC fra 2 dyr og 21 cilia i PVN fra 3 dyr. Skalastenger 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1. Grafer for ai-treningstap. (A, B) Grafer som viser treningstap på henholdsvis segment.ai på nevronal cilia in vitro og in vivo. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2. Ai Assistert Cilia fargeintensitet målinger av in vitro neuronal cilia. (A, B) Representative bilder av cilia (MCHR1, rød) i henholdsvis primære hypothalamus- og hippocampale kulturer. En opplært Ai i NIS Elements ble brukt til å gjenkjenne cilia som vist i binærmasken (cyan), og deretter ble GA3 brukt til å måle intensiteten av MCHR1-farging i cilia. Distribusjon av MCHR1 intensitet er grafert som prosentandel av cilia i 1000 A.U. bins for hypothalamus og 2000 A. U. bins for hippocampal kulturer. n = 30 cilia i hypothalamus og 106 cilia i hippocampal kulturer fra 3 dyr. Skalalinjer 10 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3. Generell analyse 3 oppskrifter for cilia analyse. (A) Enkel generell analyse (GA3) oppskrift på måling av cilia lengde, intensitet og Manders koeffisient. (B) Kompleks GA3 oppskrift på måling av intensitet langs lengden av cilium ved hjelp av en markør for basal kropp. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Lengde- og intensitetsmålinger er vanlige måter primære cilia analyseres på, men det er ikke en standardisert konvensjonell metode som brukes i feltet. Identifisering og kvantifisering av primær cilia ved hjelp av programvare som ImageJ er tidkrevende og utsatt for brukerforskjeller og feil. Dette gjør det vanskelig å analysere store datasett nøyaktig. Her viser vi at bruk av et Ai-program kan overvinne mange av disse utfordringene som gjør høy gjennomstrømningsanalyse av primære cilia oppnåelige. Her beskriver vi prosedyren for opplæring av en Ai-basert applikasjon for å gjenkjenne primære cilia og skissere trinnene som kreves for å analysere lengde og intensitet.

Mens den første opplæringen av Ai for å gjenkjenne cilia krever betydelig tid fra brukeren, når den er fullført, kan den brukes på et hvilket som helst datasett som er anskaffet med de samme parametrene. Den binære masken som genereres av ai er modifiserbar slik at eventuelle feil kan rettes. Feil i ciliaidentifikasjon bør imidlertid signalisere brukeren at Ai-en må trenes videre med flere bilder. En stor fordel med denne metoden er at Ai kan trenes til å gjenkjenne cilia i forskjellige utvalgstyper i både 2D og 3D. Tidligere analysemetoder generert i laboratorier har ulike begrensninger, inkludert å kreve manuell tersklering for identifisering og problemer med å identifisere cilia avbildet fra vevsseksjoner der celletettheten er høy36,46,47. Disse metodene er også spesialisert for cilia analyse mens analyse ved hjelp av NIS Elements programvare kan evaluere flere aspekter av bildene samtidig. Fordi Ai beskrevet her er en del av NIS Elements programvarepakke, kan bilder som er anskaffet ved hjelp av et Nikon-mikroskop enkelt fortsettes gjennom til analyse. Avbildning med Nikon er imidlertid ikke nødvendig for bruk av denne metoden. Uavhengig av det fangede rådatafilformatet, kan ".tif" -filer åpnes av NIS Elements for bruk i Ai.

Denne Ai-applikasjonen i NIS Elements er allment tilgjengelig og muligens allerede en del av bildeanalyseprogramvare som brukes av laboratorier som studerer primære cilia. Når utbredelsen av Ai-teknologi utvides, kan annen bildebehandlingsprogramvare utvide analysealternativene til å omfatte en lignende Ai-modul. Bruk av Ai-analyse på ciliaidentifikasjon kan brukes til flere forskjellige aspekter ved ciliaanalyse. Mens vi skisserte metoder for noen få enkle analyser som lengde (figur 2 og 3), kan intensitet (figur 4) og colokalisering (figur 5) mer sofistikert analyse legges til i GA3-analysearbeidsflyten som i figur 6. For eksempel, i stedet for å måle intensiteten til et komplett cilium, kan forskjeller i intensitet i en underregion av et cilium være av interesse for å vurdere sub-ciliary lokalisering. Forskjeller i intensitet i en underregion av et cilium kan indikere at proteinet akkumuleres på spissen eller bunnen av ciliumet, for eksempel hvordan Gli-proteiner er beriket på spissen av cilia48. I tillegg kan denne Ai-applikasjonen brukes til å enkelt identifisere forskjeller mellom genotyper eller behandlingsgrupper. Mens laboratoriet vårt først og fremst bruker denne metoden til å analysere cilia avbildet fra hjerneseksjoner eller nevronkulturer, kan den brukes på bilder anskaffet fra ulike cellelinjer eller andre vevstyper. Fleksibiliteten til utvalgstype som denne applikasjonen kan brukes på, gjør denne analysemetoden verdifull for mange forskjellige grupper som studerer primær cilia eller en diskret organelle som vurderes som mitokondrier, kjerne eller ER.

Disclosures

Medforfatter Wesley Lewis er ansatt i Nikon. Det er ingen økonomiske avsløringer.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 til NFB og American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 til RB. Vi takker Rich Gruskins daglige leder for Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft og Teresa Mastracci for innsiktsfulle kommentarer til manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM Intel Corporation W-2123 Processor used for running NIS Elements.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Inc. - Ai and GA3 software
Quadro RTX 4000 Graphics card NVIDIA Corporation Quadro RTX 4000
Windows 10 Professional 64-bit Microsoft Inc. - Operating system used for running NIS Elements
Workstation HP Development Company, L.P. HP Z4G4 Workstation used for running NIS Elements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., et al. Ciliary gene RPGRIP1L is required for hypothalamic arcuate neuron development. JCI Insight. 4 (3), (2019).
  2. Siljee, J. E., et al. Subcellular localization of MC4R with ADCY3 at neuronal primary cilia underlies a common pathway for genetic predisposition to obesity. Nature Genetics. 50 (2), 180-185 (2018).
  3. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Current Biology. 17 (18), 1586-1594 (2007).
  4. Berbari, N. F., O'Connor, A. K., Haycraft, C. J., Yoder, B. K. The primary cilium as a complex signaling center. Current Biology. 19 (13), 526-535 (2009).
  5. Walz, G. Role of primary cilia in non-dividing and post-mitotic cells. Cell Tissue Research. 369 (1), 11-25 (2017).
  6. Nachury, M. V., Mick, D. U. Establishing and regulating the composition of cilia for signal transduction. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (7), 389-405 (2019).
  7. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  8. Engle, S. E., Bansal, R., Antonellis, P. J., Berbari, N. F. Cilia signaling and obesity. Seminars in Cell and Developmental Biology. , (2020).
  9. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
  10. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatric Nephrology. 26 (7), Berlin, Germany. 1039-1056 (2011).
  11. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. New England Journal of Medicine. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  12. Vaisse, C., Reiter, J. F., Berbari, N. F. Cilia and Obesity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), (2017).
  13. Berbari, N. F., et al. Leptin resistance is a secondary consequence of the obesity in ciliopathy mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), 7796-7801 (2013).
  14. Jacobs, D. T., et al. Dysfunction of intraflagellar transport-A causes hyperphagia-induced obesity and metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 789-798 (2016).
  15. Arsov, T., et al. Fat aussie--a new Alström syndrome mouse showing a critical role for ALMS1 in obesity, diabetes, and spermatogenesis. Molecular Endocrinology. 20 (7), 1610-1622 (2006).
  16. Tam, L. W., Ranum, P. T., Lefebvre, P. A. CDKL5 regulates flagellar length and localizes to the base of the flagella in Chlamydomonas. Molecular Biology of the Cell. 24 (5), 588-600 (2013).
  17. Rajagopalan, V., Subramanian, A., Wilkes, D. E., Pennock, D. G., Asai, D. J. Dynein-2 affects the regulation of ciliary length but is not required for ciliogenesis in Tetrahymena thermophila. Molecular Biology of the Cell. 20 (2), 708-720 (2009).
  18. Bengs, F., Scholz, A., Kuhn, D., Wiese, M. LmxMPK9, a mitogen-activated protein kinase homologue affects flagellar length in Leishmania mexicana. Molecular Microbiology. 55 (5), 1606-1615 (2005).
  19. Han, Y. M., et al. Leptin-promoted cilia assembly is critical for normal energy balance. Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2193-2197 (2014).
  20. Caspary, T., Marazziti, D., Berbari, N. F. Cilia: Methods and Protocols. Satir, P., Tvorup Christensen, S. , Springer. New York. 203-214 (2016).
  21. Bishop, G. A., Berbari, N. F., Lewis, J., Mykytyn, K. Type III adenylyl cyclase localizes to primary cilia throughout the adult mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 505 (5), 562-571 (2007).
  22. Domire, J. S., Mykytyn, K. Markers for neuronal cilia. Methods in Cell Biology. 91, 111-121 (2009).
  23. Sun, J. S., et al. Ventromedial hypothalamic primary cilia control energy and skeletal homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), (2021).
  24. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
  25. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Research. 872 (1-2), 271-275 (2000).
  26. Domire, J. S., et al. Dopamine receptor 1 localizes to neuronal cilia in a dynamic process that requires the Bardet-Biedl syndrome proteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (17), 2951-2960 (2011).
  27. Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89 (3), 909-926 (1999).
  28. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), 10335-10340 (2014).
  29. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  30. Berman, S. A., Wilson, N. F., Haas, N. A., Lefebvre, P. A. A novel MAP kinase regulates flagellar length in Chlamydomonas. Current Biology. 13 (13), 1145-1149 (2003).
  31. Nguyen, R. L., Tam, L. W., Lefebvre, P. A. The LF1 gene of Chlamydomonas reinhardtii encodes a novel protein required for flagellar length control. Genetics. 169 (3), 1415-1424 (2005).
  32. Tam, L. W., Wilson, N. F., Lefebvre, P. A. A CDK-related kinase regulates the length and assembly of flagella in Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 176 (6), 819-829 (2007).
  33. O'Connor, A. K., et al. An inducible CiliaGFP mouse model for in vivo visualization and analysis of cilia in live tissue. Cilia. 2 (1), 8 (2013).
  34. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (2), 113-122 (2015).
  35. Delling, M., et al. Primary cilia are not calcium-responsive mechanosensors. Nature. 531 (7596), 656-660 (2016).
  36. Saggese, T., Young, A. A., Huang, C., Braeckmans, K., McGlashan, S. R. Development of a method for the measurement of primary cilia length in 3D. Cilia. 1 (1), 11 (2012).
  37. Kobayashi, Y., Hamamoto, A., Saito, Y. Analysis of ciliary status via G-protein-coupled receptors localized on primary cilia. Microscopy. 69 (5), 277-285 (2020).
  38. Zhou, L. Q., et al. Artificial intelligence in medical imaging of the liver. World Journal of Gastroenterology. 25 (6), 672-682 (2019).
  39. Naugler, C., Church, D. L. Automation and artificial intelligence in the clinical laboratory. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 56 (2), 98-110 (2019).
  40. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  41. Bansal, R., et al. Hedgehog Pathway Activation Alters Ciliary Signaling in Primary Hypothalamic Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 266 (2019).
  42. Jin, H., et al. The conserved Bardet-Biedl syndrome proteins assemble a coat that traffics membrane proteins to cilia. Cell. 141 (7), 1208-1219 (2010).
  43. Liew, G. M., et al. The intraflagellar transport protein IFT27 promotes BBSome exit from cilia through the GTPase ARL6/BBS3. Developmental Cell. 31 (3), 265-278 (2014).
  44. Engle, S. E., et al. A CreER Mouse to Study Melanin Concentrating Hormone Signaling in the Developing Brain. Genesis. , (2018).
  45. Thorpe, S. D., et al. Reduced primary cilia length and altered Arl13b expression are associated with deregulated chondrocyte Hedgehog signaling in alkaptonuria. Journal of Cellular Physiology. 232 (9), 2407-2417 (2017).
  46. Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8, 1 (2019).
  47. Dummer, A., Poelma, C., DeRuiter, M. C., Goumans, M. J., Hierck, B. P. Measuring the primary cilium length: improved method for unbiased high-throughput analysis. Cilia. 5, 7 (2016).
  48. Haycraft, C. J., et al. Gli2 and Gli3 localize to cilia and require the intraflagellar transport protein polaris for processing and function. PLoS Genetics. 1 (4), 53 (2005).

Tags

Biologi utgave 171
Kunstig intelligens tilnærminger til vurdering av primær Cilia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T.… More

Bansal, R., Engle, S. E., Kamba, T. K., Brewer, K. M., Lewis, W. R., Berbari, N. F. Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia. J. Vis. Exp. (171), e62521, doi:10.3791/62521 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter