Summary
Aluminiumsfolie blev mikrokirurgisk indsat mellem testiklerne af Spodoptera litura for at hindre fusionen af testikler. Proceduren omfatter frysning, fastgørelse, desinfektion, snit, placering af barrieren, suturering, postoperativ fodring og inspektion. Denne tilgang giver en metode til at forstyrre vævsdannelsen.
Abstract
I stedet for at anvende genetiske metoder som RNA-interferens (RNAi) og grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / CRISPR-associeret endonuklease Cas9, blev en fysisk barriere mikrokirurgisk indsat mellem testiklerne af Spodoptera litura for at studere virkningen af denne mikrokirurgi på dens vækst og reproduktion. Efter indsættelse af aluminiumsfolie mellem testiklerne fortsatte insektsmeltning under metamorfose normalt. Insektvækst og -udvikling blev ikke bemærkelsesværdigt ændret; Antallet af sædbundter ændrede sig imidlertid, hvis testiklernes fusion blev stoppet af mikrooperationen. Disse resultater indebærer, at blokering af testikelfusion kan påvirke mandlig reproduktionsevne. Metoden kan yderligere anvendes til at afbryde kommunikationen mellem organer for at studere funktionen af specifikke signalveje. Sammenlignet med konventionel kirurgi kræver mikrokirurgi kun frysende anæstesi, hvilket foretrækkes frem for kuldioxidanæstetisering. Mikrokirurgi minimerer også operationsstedets område og letter sårheling. Udvælgelsen af materialer med specifikke funktioner kræver dog yderligere undersøgelse. Undgå vævsskade er afgørende, når du laver snit under operationen.
Introduction
Fusion er et almindeligt fænomen i vævs- eller organudvikling. Eksempler inkluderer dorsal lukning og thorax lukning i Drosophila1 og gane morphogenese, neuralrør morfogenese, og hjerte morfogenese i mus og kylling2. CRISPR og RNAi er blevet anvendt til at undersøge genernes roller i fusionsprocessen2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) er et skadeligt polyfagisk skadedyr, der er bredt udbredt i tropiske og subtropiske områder i Asien, herunder Kina4,5,6. Den brede fordeling af S. litura tilskrives delvis dens kraftige reproduktionsevne, som er relevant for gonadudvikling. Mandlig infertilitet er en tilgang til at kontrollere dette skadedyr. Som vist i den skematiske figur af testikelstruktur er testiklerne omgivet af testikeskeden, herunder den ydre kappe (peritoneal kappe) og indre basale lamina. Den basale lamina strækker sig internt for at danne follikulært epitel og adskiller testiklernes indre område i fire kamre ved navn follikler (figur 1).
I folliklerne udvikler spermatogonia sig til spermatozoer efter mitose og meiose, og derefter justeres spermatozoerne i sædsækkene i samme retning for at danne sædbundter7. Under spermatogenese differentierer de primære spermatocytter sig til eupyrensædceller eller apyrensædceller. Spermatocytter i larvefasen udvikler sig til eupyrensæd med en lang hale forbundet med et hoved af en langstrakt kerne; disse kan befrugte æg. Omvendt udvikler spermatocytter i midten af puppefasen sig til apyrensæd med en kasseret kerne; disse sædceller hjælper med overlevelse, bevægelse og befrugtning af eupyrensæd9,10. Den 6. dag i puppen er den periode, hvor testiklerne har rigelige eupyren- og apyrensædbundter.
Figur 1: Skematisk diagram over testikelstrukturen af Lepidoptera insekter11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Testikelfusion forekommer i de fleste insekter af Lepidoptera-ordenen11,12, især i de arter, der er landbrugsskadedyr. Testikelfusion refererer til et par testikler, der vokser bilateralt i larvefasen, nærmer sig og klæber til hinanden og til sidst integreres i en enkelt gonad11. I Spodoptera litura sker det under metamorfose fra larven til puppestadiet. Fra dag 1 i den 5. instar (L5D1) til dag 4 i den 6. instar (L6D4) vokser parret testikler gradvist i størrelse, og farven bliver lysegul fra elfenbenshvid. Det bliver svagt rødt, når det når prepupalfasen (L6D5 til L6D6). To bilaterale symmetriske testikler nærmer sig hinanden i præpuppestadiet, smelter sammen til en og vrider mod uret (doral visning) for at producere en enkelt testikler i puppe- og voksenfasen11. Dette fænomen forekommer ikke i silkeorme, som har stor økonomisk betydning og er blevet tæmmet i 5000 år13. Det antages således, at testiklernes fusion forbedrer reproduktionsevnen.
For at bestemme betydningen af Spodoptera litura testikelfusion er det vigtigt at undersøge virkningerne af at blokere processen. I denne protokol blev aluminiumsfolie mikrokirurgisk indsat mellem testiklerne for at holde dem adskilt, og de deraf følgende ændringer i udviklingen af insekterne og deres testikler blev undersøgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insektopdræt og vedligeholdelse
- Kultur Spodoptera litura larverne i miljøsimuleringskamre med en kunstig kost, indtil de når dag 4 i den 6. instar (L6D4). Vælg hanlarver, når ormene kommer ind på den første dag i den 6. instar (L6D0) baseret på den omvendte trekantformede struktur på den ottende mave14.
BEMÆRK: Larver opdræt og vedligeholdelsesteknikker blev offentliggjort tidligere4,14.
2. Præsurgisk forberedelse
- Trim aluminiumsfolien i rektangulære stykker med afrundede hjørner (1 mm x 2 mm, figur 2).
- Steriliser operationsplatformen og relaterede genstande (bordoverflade, mikroskop, isboks, insektkasse, voksbakke, stifter og tråd) ved at sprøjte 75% alkohol på deres overflade og tørre dem af.
- Steriliser kirurgiske værktøjer (inklusive aluminiumsfolien) med en højtryksdampsterilisator i 30 minutter, og anbring dem i en varme- og tørreovn ved 120 °C.
- Sørg for, at operatørerne bærer rent laboratorietøj, kirurgiske masker og sterile handsker.
3. Mikrokirurgisk placering af en barriere mellem testiklerne
BEMÆRK: Det generelle arbejdsflow er som følger: Frysning → fastgørelse → desinfektion → snit → barriereplacering → suturering→ Postoperativ fodring og inspektion
- Læg hanlarver (L6D4) på is i 10-30 min for at holde dem aetiseret under operationen.
- Placer en larve på voksbakken med den dorsale side opad, og fastgør derefter larvens hoved og hale med stifter og tråde, der viser det kirurgiske område, der er den dorsale overflade på det 9. kropssegment (figur 3A).
- Desinficere det kirurgiske område ved at anvende 3% jodtinktur med en vatpind på epidermis (9. kropssegment) efterfulgt af 70% alkohol for at fjerne jod (figur 3B).
BEMÆRK: Fokuser på larven gennem grov og finjustering af det kirurgiske mikroskop (figur 3C). Læg voksbakken på et større kulturfad fyldt med is for at holde bedøvelsen. - Lav et 2 mm langt snit på den dorsale epidermis i det 9. kropssegment. Brug derefter en steril vatpind til at fjerne enhver lækkende hæmolymfe og fedtlegemer og få et klart overblik over det kirurgiske område.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå hjertet under proceduren. Dette kan gøres ved at lave snittet lidt ved siden af midterlinjen i det 9. kropssegment eller ved leddet mellem det 9. og 10. kropssegment for at forhindre, at testiklerne springer ud på grund af larvens indre tryk. Mens du bruger skalpellen, skal du først lave en lodret slids med bladet (figur 4A) og derefter dreje den 45 ° mod epidermis, før den jævnt og kontinuerligt skærer gennem epidermis (figur 4B). - Brug kirurgisk pincet til at indsætte et stykke aluminiumsfolie mellem testiklerne (figur 5).
- I slutningen af operationen skal du lukke snittet for at undgå infektion og lade larverne komme sig efter operationen.
- Luk epidermis med en løbende sutur (figur 6).
- Brug en nåleholder og kirurgisk pincet til at binde en kirurgisk firkantet knude, hvilket kræver to modsatte spejlbillede enkle knuder (figur 6D, E).
- Brug en saks til at skære den overskydende sutur fra løkkehalerne, hvilket efterlader en 2 mm gevind bagved.
- Efter suturering skal du forsigtigt lægge larven i opdrætskassen og vedligeholde dem i et rent miljøsimuleringskammer. Fortsæt med at observere larverne.
BEMÆRK: Såret holder op med at lække hæmolymfe, og larverne kommer sig gradvist efter operationen. Ormene fortsætter med at fuldføre deres metamorfose.
Figur 2: Fysisk barriere fremstillet ved hjælp af aluminiumsfolie (1 mm x 2 mm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Før snit. A) Fastgørelse af larven. (B) Desinfektion af epidermis i det kirurgiske område. (C) Udførelse af kirurgi under mikroskopet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Snit. (A) Skær larverne lodret med bladet. (B) Drej bladet 45° mod epidermis, før du skærer igennem. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Indsættelse af den fysiske barriere (aluminiumsfolie) mellem testiklerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Suturering. (A) Indsæt nålen. (B) Træk nålen tilbage. (C) Træk nålen tilbage og fastspænd den. (D) Bind den første enkle knude. (E) Bind den modsatte spejlbilledede enkle knude. (F) Skær overskydende suturtråd. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkningerne af mikrokirurgi på Spodoptera litura vækst og udvikling
Mikrooperationen efterlod et 2 mm langt sår på den dorsale larveepidermis, der til sidst stoppede med at lække hæmolymfe og helede. Larverne gennemgik præpuppe- og puppestadier og lukkede, hvilket indikerer, at mikrooperationen ikke havde nogen større indflydelse på vækst og udvikling. Når larverne smeltede i pupper, blev suturtrådene kasseret sammen med epidermis. Der var ingen åbenlyse forskelle i udseendet af pupperne, der gjorde og ikke gennemgik operation. Efter eklosion parrede voksne hunner sig med succes med de voksne hanner, der tidligere var blevet opereret, hvilket resulterede i befrugtede æg og rugelarver (figur 7).
Figur 7: Spodoptera litura Udvikling efter mikrokirurgi. A) Hanlarve ved L6D4. (B) L6D4 larve umiddelbart efter operationen. C) Forpuppe (L6D6). (D) P0, angiver den røde pil placeringen af operationen; den gule pil viser den kasserede epidermis med suturtråd. (E) Parring af voksne. (F) Æg og klækkede larver fra en kvindelig voksen, der parrer sig med en han, der gennemgik en operation. Skalabjælker = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Larverne gik gennem puppestadiet og lukkede efter den mikrokirurgiske placering af aluminiumsfolie mellem testiklerne. Detaljerede resultater efter denne operation er blevet offentliggjort tidligere11. Selvom barrieren stoppede testiklerne fra at smelte sammen i nogle larver, gennemgik de fleste larver testikelfusion under larve til puppemetamorfose.
I denne forskning blev individer grupperet efter tre behandlinger: Eksperimentel (Exp), Sham-operation (Ctl-sham) og ingen operation (Ctl). Personer i Exp-gruppen gennemgik mikrokirurgi for at indsætte en fysisk barriere, og deres testikler forblev adskilt under puppe- og voksenstadierne. Personer i Ctl-sham-gruppen gennemgik den samme mikrokirurgi; deres testikler blev dog ikke blokeret og smeltet sammen af ukendte årsager. Ctl-gruppen indeholdt larverne, der voksede naturligt uden kirurgi; deres to testikler smeltede normalt sammen under prepupal-fasen.
Mikrokirurgigruppen indeholdt to undergrupper: larver, der gennemgik mikrokirurgi for at placere en barriere mellem de to testikler (gruppe A) og dem, der gennemgik mikrokirurgi for at fjerne en testikler (gruppe B: venstre testikler fjernet i gruppe B-1; højre testikler fjernet i gruppe B-2). Tabel 1 viser antallet af operationslarver, larvedødelighed, antal pupper, procentdel af hvalp, antal voksne, procentdele af voksenfremkomst, procentdele af vellykket parring og procentdele af vellykkede operationer i forskellige grupper. Gruppe A omfatter larver, der gennemgik mikrokirurgi for at indsætte en barriere mellem testiklerne. Succesen med denne procedure kunne kun bestemmes efter dissektion, hvilket var da de yderligere blev opdelt i Exp- og Ctl-sham-grupperne.
Som vist i figur 8 var larvedødeligheden lidt højere i den kirurgiske gruppe, mens procentdelene af hvalp, voksenfremkomst og vellykket parring var lidt lavere i den kirurgiske gruppe end kontrolgruppen. Ingen af forskellene var imidlertid signifikant forskellige, hvilket indikerer, at mikrooperationen ikke markant påvirkede væksten og udviklingen af Spodoptera litura larver.
| Gruppe | Antal larver | Larvedødelighed/% | Antal pupper | Procentdel af hvalp /% | Antal voksne | Procentdel af voksnes fremkomst/% | Procentdel af vellykket parring /% | Procentdel af vellykket drift/% | |||||
| Mikrokirurgisk gruppe A-1* | 79 | 35.4 | 39 | 76.5 | N | N | N | 10.3 | |||||
| Mikrokirurgisk gruppe A-2* | 117 | 12.8 | 102 | 100 | N | N | N | 11.8 | |||||
| Mikrokirurgisk gruppe A-3* | 73 | 13.7 | 57 | 90.5 | N | N | N | 10.5 | |||||
| Mikrokirurgisk gruppe A-4 | 101 | 4 | 97 | 96 | 29 | 29.9 | N | 26.9 | |||||
| Mikrokirurgi gruppe A-5 | 176 | 20.1 | 140 | 79.5 | 28 | 20 | 44.4 | 25 | |||||
| Mikrokirurgisk gruppe A-6 | 434 | 12.4 | 376 | 98.9 | 209 | 55.6 | 26.8 | 14.3 | |||||
| Mikrokirurgisk gruppe A-7 | 260 | 10.8 | 135 | 58.2 | 66 | 48.9 | 47 | 48.4 | |||||
| Mikrokirurgi gruppe A-8 | 49 | 24.5 | 37 | 100 | 21 | 56.8 | 81 | 58.8 | |||||
| Mikrokirurgi gruppe B-1 | 117 | 29.1 | 71 | 85.5 | 30 | 42.3 | 23.3 | N | |||||
| Mikrokirurgi gruppe B-2 | 188 | 6.9 | 172 | 98.3 | 115 | 66.9 | 35.7 | N | |||||
| Gennemsnit af mikrokirurgisk gruppe (middel± SD) | 159 | 17±10.1 | 123 | 88.3±13.7 | 71 | 45.8±16.3 | 43±20,8 | 25.8±18.5 | |||||
| Kontrolgruppe 1* | 40 | 17 | 37 | 100 | N | N | N | N | |||||
| Kontrolgruppe 2 | 300 | 0 | 281 | 93.7 | 184 | 65.5 | N | N | |||||
| Kontrolgruppe 3 | 354 | 11 | 305 | 96.8 | 127 | 41.6 | N | N | |||||
| Kontrolgruppe 4 | 679 | 2.7 | 638 | 96.5 | 534 | 83.7 | 41.2 | N | |||||
| Kontrolgruppe 5 | 448 | 4.2 | 399 | 93 | 232 | 58.1 | 60 | N | |||||
| Kontrolgruppe 6 | 490 | 7.1 | 448 | 98.5 | 355 | 79.2 | 48 | N | |||||
| Gennemsnit af kontrolgruppe (middel± SD) | 385 | 5.4±6.2 | 351 | 96.4±2.7 | 286 | 65.6±15.1 | 50±9,5 | N | |||||
Tabel 1: Virkningerne af mikrokirurgi på Spodoptera litura udvikling. Mikrokirurgiske grupper B-1 og B-2 gennemgik mikrokirurgi for at fjerne ensidige testiklerne (venstre i mikrokirurgisk gruppe B-1 og højre i mikrokirurgi gruppe B-2). Bemærk: Mikrokirurgiske grupper A-1 til A-8 gennemgik mikrokirurgi for at indsætte en barriere mellem testiklerne; Mikrokirurgiske grupper B-1 og B-2 gennemgik mikrokirurgi for at fjerne ensidige testiklerne (venstre i mikrokirurgi gruppe B-1 og højre i mikrokirurgi gruppe B-2); satserne og procentsatserne er angivet som mean ± SD. Stjerner angiver, at individerne i gruppen blev dissekeret på puppestadiet, og der var ingen statistikker over antallet af voksne, procentdelen af voksenfremkomst eller procentdelen af vellykket parring; N angiver ingen data.
Figur 8: Mikrokirurgiens indflydelse på Spodoptera litura vækst og udvikling af (n ≥ 6). Klik her for at se en større version af denne figur.
Mikrokirurgiens indflydelse på antallet af sædbundter af Spodoptera litura
Mikrokirurgi blev udført for at indsætte en fysisk barriere for at stoppe testiklernes fusion eller fjerne ensidige testikler i Spodoptera litura. Eupyren og apyren sædbundter blev talt for at beregne procentdelen af eupyren sædbundter på den sjette dag i puppestadiet. Individerne blev grupperet efter behandling, som beskrevet ovenfor. Antallet af sædbundter (eupyrensædbundter, apyrensædbundter og total) var signifikant lavere i Exp-gruppen end i Ctl-sham- og Ctl-grupperne. Det gennemsnitlige antal eupyrensædbundter fra to adskilte testikler i Exp-gruppen var 2082 ± 599. I Ctl-sham- og Ctl-grupperne med smeltede testikler varierede antallet af eupyren-sædbundter fra 4652 til 6200.
Antallet af apyren-sædbundter i Exp-gruppen var 1602 ± 703, mens det varierede fra 3299 til 4632 i Ctl-Sham- og Ctl-grupperne. Det samlede antal sædbundter i Exp-gruppen var 3684 ± 985; det varierede fra 9284 til 10832 i Ctl-Sham og Ctl grupperne. Således varierede procentdelene af eupyren sædbundter fra 50% til 60%, uden signifikante forskelle mellem alle tre grupper. Figur 9 viser, at når fusion forhindres, faldt mængden af eupyren og apyrensædbundter, mens procentdelen af eupyrensædbundter var uændret.
Figur 9: Antallet af sædbundter og procentdele af eupyrensædbundter i forskellige grupper. (A) Antallet af sædbundter i Exp-gruppen var signifikant lavere end i Ctl-sham- og Ctl-grupperne. (B) Procentdelen af eupyrensædbundter var ikke signifikant forskellige mellem de tre grupper. Stjerne angiver en signifikant forskel sammenlignet med Ctl. P < 0,05, Mean ± SD (n ≥5). Klik her for at se en større version af denne figur.
Efter fjernelse af en ensidig testis af larverne blev antallet af eupyren- og apyrensædbundter talt for at beregne procentdelen af eupyrensædbundter på den sjette dag i puppestadiet. Antallet af eupyren- og apyrensædbundter varierede fra henholdsvis 1286 til 1638 og 720 til 850, hvilket betyder, at det samlede antal varierede fra 2006 til 2488, svarende til en eupyrensædbundtprocent på 63% til 65%. Figur 10 viser, at antallet af sædbundter faldt signifikant efter ensidig fjernelse af testikler (reduceret med 60% til 70%) uden stor indflydelse på procentdelen af eupyren sædbundter.
Figur 10: Antallet af sædbundter og procentdele af eupyrensædbundter efter fjernelse af ensidige testikler. (A) Antallet af sædbundter i pupper, der gennemgik ensidig fjernelse af testikler, var signifikant forskelligt mellem de tre grupper (venstre og højre testikler fjernet i henholdsvis mikrokirurgigruppe B-1 og mikrokirurgi gruppe B-2) (B ) Procentdelen af eupyrensædbundter i pupper, der gennemgik ensidig fjernelse af testikler, var ikke signifikant forskellig sammenlignet med Ctl. Stjernen angiver en signifikant forskel i forhold til Ctl. P < 0,05, Mean ± SD (n ≥8). Kontrolgruppe = ingen kirurgi, testiklerne smeltede naturligt sammen under prepupalfasen; Ctl-Sham-gruppe = operation mislykket og testikler smeltet sammen efter mikrokirurgi; Gruppe = mikrokirurgi udført for at indsætte en fysisk barriere mellem de to testikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efter mikrokirurgisk obstruktion af testiklernes fusion i Spodoptera litura faldt antallet af sædbundter, hvilket understøttede hypotesen om, at denne fusion er gavnlig for reproduktionsevnen. Kirurgisk manipulation er blevet brugt til at studere den fysiologiske udvikling af insekter siden begyndelsen af det 20. århundrede. For at afgøre, om kranialnerven er reguleret af insektmetamorfose, udførte nogle forskere procedurer såsom ligation og halshugning på forskellige insekter (herunder Rhodnius prolixus af Hemiptera, Lymantria dispar af Lepidoptera)15,16. Halshugningsprocessen indebærer fjernelse af hovedet med en skalpel, desinfektion med antibiotika og paraffinvoksforsegling af såret efter operation17. Efter ekstraktion og transplantation af de prothoraciske kirtler i Bombyx mori blev såret forseglet med paraffinvoks18. De uundgåelige konsekvenser af disse konventionelle behandlinger er imidlertid infektion og en høj dødelighed, hvilket gør det vanskeligt at analysere den fysiologiske tilstand i de sene stadier af insektets udvikling.
Derfor blev denne protokol designet til at sikre en minimalt invasiv operation udført under mikroskopet for at minimere såret. Sammenlignet med kuldioxidanæstetisering er frysning af anæstesi desuden mere gennemførlig og praktisk. Aluminiumsfolie, der blev brugt som obstruktør, blev skåret i en størrelse på 1 mm x 2 mm, et område svarende til mellemrummet mellem testiklerne. Efter mikrokirurgi falder suturtrådene af med den tidlige epidermis under smeltning, hvilket gør det muligt for metamorfose og udvikling at fortsætte normalt. Reproduktionsresultaterne tyder på, at vellykket mikrokirurgi ikke signifikant påvirkede insektudviklingen. Når testiklerne ikke smeltede sammen, var antallet af totale, eupyren og apyren sædbundter signifikant lavere end dem i Ctl-gruppen. Disse resultater tyder på, at mandlig reproduktionsevne påvirkes af testiklernes fusion. Vurdering af sædcellernes kvalitet og vitalitet har forskellige indekser og metoder hos forskellige dyr, herunder sæd akrosomale status hos pattedyr19, sædmotilitet20, mitokondrieaktivitet21, plasmamembranintegritet22 og andre markører23,24 . På grund af insekternes unikke sædcelleudvikling skal fremtidige undersøgelser undersøge ændringer i reproduktionsevnen (parring, inkubation25).
Kritiske trin i denne protokol kræver særlig opmærksomhed for at sikre pålidelige resultater. Undgåelse af skade på andre væv er vigtig, når man laver snittene. For det andet skal udvælgelsen af barrierematerialet baseres på dets ugiftige og sterile egenskaber og mangel på skarpe grænser. Endelig blev snittet lukket med en løbende sutur og en kirurgisk firkantet knude efterfulgt af forsegling i det kirurgiske område for effektivt at forhindre postoperativ infektion. Operationer på insektets indre struktur såsom transplantation, ekstraktion og anvendelse af lægemidler kan stadig udføres, efterfulgt af forsegling i det kirurgiske område.
Høje succesrater kræver dygtige færdigheder, og denne teknik har nogle ulemper. For det første er det ikke effektivt, da operationerne udføres en efter en, hvorfor individuel variation er uundgåelig. Foreløbige undersøgelser viste, at når man brugte medicinske venøse transfusionsrør, gummimembraner, absorberende perler og tandmaterialer til at adskille testiklerne, var resultaterne ikke så vellykkede som forventet. Desuden er teknikken ikke vellykket, når obstruktøren er i drift. Mulige årsager til en nedsat kirurgisk succesrate omfatter barrieren, der glider af, når insekterne bevæger sig, krymper, smelter og omorganiserer organer i prepupalfasen. Alternativt kan aluminiumsfolien indsættes for tæt på smøreindvolden, hvilket får barrieren til at flyde væk. Derfor bør et egnet materiale optimeres yderligere.
På trods af mikrokirurgiens begrænsninger giver det en metode til at opnå foreløbige resultater om biologiske fænomener, inden der etableres et transgent modelsystem. Sweeney og Waterson analyserede udviklingen i kyllingembryoner ved at indsætte tantalfolieblokke26, mens Wilde og Logan brugte aluminiumsfolie som en uigennemtrængelig barriere for at studere retinsyresignaleringens rolle i induktionen og efterfølgende initiering af for- og bagben27. I hvirvelløse Spodoptera litura muliggør denne mikrokirurgi med succes normal ormvækst og udvikling, hvilket giver en måde at studere fysiologiske fænomener på.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr.:31772519, 31720103916; ) og et åbent tilskud fra State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (nr.: sklsgb2013003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. Physiological systems in insects. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam, NL; Boston, MA. (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and 'metamorphosis' in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).
