Summary
Aluminiumfolie wurde mikrochirurgisch zwischen die Hoden von Spodoptera litura eingeführt, um die Verschmelzung der Hoden zu behindern. Das Verfahren umfasst Einfrieren, Befestigen, Desinfizieren, Einschneiden, Platzieren der Barriere, Nähen, postoperative Fütterung und Inspektion. Dieser Ansatz bietet eine Methode, um die Gewebebildung zu stören.
Abstract
Anstatt genetische Methoden wie RNA-Interferenz (RNAi) und regelmäßig interspaced kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 zu verwenden, wurde eine physikalische Barriere mikrochirurgisch zwischen den Hoden von Spodoptera litura eingeführt, um die Auswirkungen dieser Mikrochirurgie auf ihr Wachstum und ihre Fortpflanzung zu untersuchen. Nach dem Einlegen von Aluminiumfolie zwischen den Hoden verlief die Häutung von Insekten während der Metamorphose normal. Das Wachstum und die Entwicklung von Insekten wurden nicht nennenswert verändert; Die Anzahl der Spermienbündel änderte sich jedoch, wenn die Hodenfusion durch die Mikrochirurgie gestoppt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Blockierung der Hodenfusion die männliche Fortpflanzungsfähigkeit beeinflussen kann. Die Methode kann weiter angewendet werden, um die Kommunikation zwischen Organen zu unterbrechen, um die Funktion spezifischer Signalwege zu untersuchen. Im Vergleich zur konventionellen Chirurgie erfordert die Mikrochirurgie nur eine Gefrieranästhesie, die der Kohlendioxidanästhesie vorzuziehen ist. Die Mikrochirurgie minimiert auch den Bereich der Operationsstelle und erleichtert die Wundheilung. Die Auswahl von Materialien mit spezifischen Funktionen bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. Die Vermeidung von Gewebeverletzungen ist bei Einschnitten während der Operation von entscheidender Bedeutung.
Introduction
Fusion ist ein häufiges Phänomen in der Gewebe- oder Organentwicklung. Beispiele hierfür sind der dorsale Verschluss und der Thoraxverschluss bei Drosophila1 und der Gaumenmorphogenese, die Neuralrohrmorphogenese und die Herzmorphogenese bei Mäusen und Hühnern2. CRISPR und RNAi wurden angewendet, um die Rolle von Genen im Fusionsprozess zu untersuchen2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) ist ein schädlicher polyphager Schädling, der in tropischen und subtropischen Gebieten Asiens, einschließlich China, weit verbreitet ist4,5,6. Die weite Verbreitung von S. litura wird zum Teil auf seine starke Fortpflanzungsfähigkeit zurückgeführt, die für die Entwicklung von Gonaden relevant ist. Männliche Unfruchtbarkeit ist ein Ansatz, um diesen Schädling zu kontrollieren. Wie in der schematischen Abbildung der Hodenstruktur gezeigt, sind die Hoden von der Hodenscheide umgeben, einschließlich der äußeren Scheide (Peritonealscheide) und der inneren Basallamina. Die Basallamina erstreckt sich intern zur Bildung des Follikelepits und trennt den inneren Bereich des Hodens in vier Kammern, die Follikel genannt werden (Abbildung 1).
In den Follikeln entwickeln sich Spermatogonien nach Mitose und Meiose zu Spermatozoen, und dann richten sich die Spermatozoen in den Spermiensäcken in der gleichen Richtung aus, um Spermienbündel zu bilden7. Während der Spermatogenese differenzieren sich die primären Spermatozyten in Eupyrenspermien oder Apyrenspermien. Spermatozyten in der Larvenphase entwickeln sich zu Eupyrenspermien mit einem langen Schwanz, der mit einem Kopf eines länglichen Kerns verbunden ist; Diese können Eier befruchten. Umgekehrt entwickeln sich Spermatozyten in der mittleren Puppenphase zu Apyrenspermien mit einem verworfenen Kern; Diese Spermien unterstützen das Überleben, die Bewegung und die Befruchtung von Eupyrenspermien9,10. Der 6. Tag der Puppe ist der Zeitraum, in dem die Hoden reichlich Eupyren- und Apyren-Spermienbündel haben.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Hodenstruktur von Lepidoptera-Insekten11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Hodenfusion tritt bei den meisten Insekten der Lepidoptera-Ordnung auf11,12, insbesondere bei Arten, die landwirtschaftliche Schädlinge sind. Hodenfusion bezieht sich auf ein Hodenpaar, das in der Larvenphase bilateral wächst, sich einander nähert und anhaftet und sich schließlich in eine einzelne Gonade integriert11. Bei Spodoptera litura geschieht dies während der Metamorphose vom Larven- zum Puppenstadium. Von Tag 1 des 5. Instar (L5D1) bis Tag 4 des 6. Instar (L6D4) wächst das Hodenpaar allmählich an Größe, und die Farbe färbt sich hellgelb von elfenbeinweiß. Es wird schwach rot, wenn es die präpupale Phase erreicht (L6D5 bis L6D6). Zwei bilaterale symmetrische Hoden nähern sich während des präpupalen Stadiums aneinander, verschmelzen zu einem und drehen sich gegen den Uhrzeigersinn (dorale Ansicht), um in der Puppen- und Erwachsenenphase einen einzigen Hoden zu erzeugen11. Dieses Phänomen tritt bei Seidenraupen nicht auf, die eine beträchtliche wirtschaftliche Bedeutung haben und seit 5000 Jahren domestiziert sind13. Daher wird angenommen, dass die Fusion der Hoden die Fortpflanzungsfähigkeit verbessert.
Um die Bedeutung der Hodenfusion von Spodoptera litura zu bestimmen, ist es wichtig, die Auswirkungen der Blockierung des Prozesses zu untersuchen. In diesem Protokoll wurde Aluminiumfolie mikrochirurgisch zwischen die Hoden gelegt, um sie getrennt zu halten, und die daraus resultierenden Veränderungen in der Entwicklung der Insekten und ihrer Hoden wurden untersucht.
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Protocol
1. Aufzucht und Pflege von Insekten
- Kultivieren Sie die Spodoptera litura Larven in Umweltsimulationskammern mit einer künstlichen Diät, bis sie Tag 4 des 6. Instadiums (L6D4) erreichen. Wählen Sie männliche Larven aus, wenn die Würmer in den ersten Tag des 6. Instadiums (L6D0) eintreten, basierend auf der inversen dreieckigen Struktur am achten Bauch14.
HINWEIS: Larvenaufzucht- und -pflegetechniken wurden bereits veröffentlicht4,14.
2. Prächirurgische Vorbereitung
- Schneiden Sie die Aluminiumfolie in rechteckige Stücke mit abgerundeten Ecken (1 mm x 2 mm, Abbildung 2).
- Sterilisieren Sie die Operationsplattform und verwandte Gegenstände (Tischoberfläche, Mikroskop, Eisfach, Insektenkasten, Wachsschale, Stifte und Faden), indem Sie 75% Alkohol auf ihre Oberfläche sprühen und abwischen.
- Sterilisieren Sie chirurgische Werkzeuge (einschließlich der Aluminiumfolie) mit einem Hochdruck-Dampfsterilisator für 30 min und stellen Sie sie in einen Heiz- und Trockenofen bei 120 ° C.
- Stellen Sie sicher, dass die Bediener saubere Laborkleidung, chirurgische Masken und sterile Handschuhe tragen.
3. Mikrochirurgische Platzierung einer Barriere zwischen den Hoden
HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf ist wie folgt: Einfrieren → Fixieren → Desinfektion → Schneiden → Platzieren → Nähen von Barrieren→ Postoperative Fütterung und Inspektion
- Legen Sie männliche Larven (L6D4) für 10-30 Minuten auf Eis, um sie während der Operation betäubt zu halten.
- Legen Sie eine Larve mit der dorsalen Seite nach oben auf die Wachsschale und fixieren Sie dann den Kopf und den Schwanz der Larve mit Stiften und Fäden, wobei der Operationsbereich, der die dorsale Oberfläche des 9. Körpersegments ist, gezeigt wird (Abbildung 3A).
- Desinfizieren Sie den Operationsbereich, indem Sie 3% Jodtinktur mit einem Wattestäbchen auf die Epidermis (9. Körpersegment) auftragen, gefolgt von 70% Alkohol, um das Jod zu entfernen (Abbildung 3B).
HINWEIS: Konzentrieren Sie sich auf die Larve durch grobe und feine Einstellung des Operationsmikroskops (Abbildung 3C). Legen Sie die Wachsschale auf eine größere Kulturschale, die mit Eis gefüllt ist, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. - Machen Sie einen 2 mm langen Schnitt an der dorsalen Epidermis des 9. Körpersegments. Als nächstes verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um undichte Hämolymph- und Fettkörper zu entfernen und eine klare Sicht auf den Operationsbereich zu erhalten.
HINWEIS: Es ist wichtig, das Herz während des Eingriffs zu vermeiden. Dies kann geschehen, indem der Schnitt leicht neben der Mittellinie im 9. Körpersegment oder am Gelenk zwischen dem 9. und 10. Körpersegment gemacht wird, um zu verhindern, dass die Hoden aufgrund des Larveninnendrucks herausspringen. Während Sie das Skalpell verwenden, machen Sie zuerst einen vertikalen Schlitz mit der Klinge (Abbildung 4A) und drehen Sie ihn dann um 45° in Richtung der Epidermis, bevor Sie gleichmäßig und kontinuierlich durch die Epidermis schneiden (Abbildung 4B). - Verwenden Sie eine chirurgische Pinzette, um ein Stück Aluminiumfolie zwischen die Hoden einzuführen (Abbildung 5).
- Schließen Sie am Ende der Operation den Einschnitt, um eine Infektion zu vermeiden, und lassen Sie die Larven sich von der Operation erholen.
- Schließen Sie die Epidermis mit einer laufenden Naht (Abbildung 6).
- Verwenden Sie einen Nadelhalter und eine chirurgische Pinzette, um einen chirurgischen quadratischen Knoten zu binden, wobei zwei gegenüberliegende spiegelbildliche einfache Knoten erforderlich sind (Abbildung 6D, E).
- Verwenden Sie eine Schere, um die überschüssige Naht von den Schlaufenschwänzen zu schneiden und ein 2 mm langes Gewinde zurückzulassen.
- Legen Sie die Larve nach dem Nähen vorsichtig in die Aufzuchtbox und pflegen Sie sie in einer sauberen Umweltsimulationskammer. Beobachten Sie die Larven weiter.
HINWEIS: Die Wunde hört auf, Hämolymphe auszutreten, und die Larven erholen sich allmählich nach der Operation. Die Würmer schließen ihre Metamorphose weiter ab.
Abbildung 2: Physische Barriere, die mit Aluminiumfolie (1 mm x 2 mm) hergestellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vor dem Schnitt. (A) Fixierung der Larve. (B) Desinfektion der Epidermis des Operationsbereichs. (C) Durchführung von Operationen unter dem Mikroskop. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Einschnitt . (A) Schneiden Sie die Larven vertikal mit der Klinge auf. (B) Drehen Sie die Klinge vor dem Durchschneiden um 45° in Richtung Epidermis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Einsetzen der physischen Barriere (Aluminiumfolie) zwischen den Hoden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Nähen . (A) Führen Sie die Nadel ein. (B) Ziehen Sie die Nadel zurück. (C) Ziehen Sie die Nadel zurück und klemmen Sie sie ein. (D) Binden Sie den ersten einfachen Knoten. (E) Binden Sie den gegenüberliegenden spiegelbildlichen einfachen Knoten. (F) Schneiden Sie überschüssiges Nahtgewinde ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Representative Results
Die Auswirkungen der Mikrochirurgie auf das Wachstum und die Entwicklung von Spodoptera litura
Die Mikrochirurgie hinterließ eine 2 mm lange Wunde an der dorsalen Larvenepidermis, die schließlich aufhörte, Hämolymphe auszulaufen und heilte. Die Larven durchliefen präpupale und pupale Stadien und schlossen sich ein, was darauf hindeutet, dass die Mikrochirurgie keinen großen Einfluss auf Wachstum und Entwicklung hatte. Als sich die Larven zu Puppen häuteten, wurden die Nahtfäden zusammen mit der Epidermis verworfen. Es gab keine offensichtlichen Unterschiede im Aussehen der Puppen, die operiert wurden und nicht operiert wurden. Nach der Eklosion paarten sich erwachsene Weibchen erfolgreich mit den zuvor operierten erwachsenen Männchen, was zu befruchteten Eiern und schlüpfenden Larven führte (Abbildung 7).
Abbildung 7: Entwicklung der Spodoptera litura nach der Mikrochirurgie. (A) Männliche Larve bei L6D4. (B) L6D4-Larve unmittelbar nach der Operation. (C) Präpupa (L6D6). (D) P0, der rote Pfeil zeigt den Ort der Operation an; Der gelbe Pfeil zeigt die weggeworfene Epidermis mit Nahtfaden. (E) Sich paarende Erwachsene. (F) Eier und geschlüpfte Larven von einem weiblichen Erwachsenen, der sich mit einem Männchen paart, das operiert wurde. Maßstabsstäbe = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Larven durchliefen das Puppenstadium und schlossen sich nach der mikrochirurgischen Platzierung von Aluminiumfolie zwischen den Hoden ein. Detaillierte Ergebnisse nach diesem Vorgang wurden bereits veröffentlicht11. Obwohl die Barriere die Hoden daran hinderte, in einigen Larven zu verschmelzen, durchliefen die meisten Larven während der Metamorphose von Larven zu Puppen eine Hodenfusion.
In dieser Forschung wurden die Individuen nach drei Behandlungen gruppiert: Experimentell (Exp), Schein-Operation (Ctl-sham) und keine Operation (Ctl). Individuen der Exp-Gruppe wurden einer Mikrooperation unterzogen, um eine physische Barriere einzuführen, und ihre Hoden blieben während des Puppen- und Erwachsenenstadiums getrennt. Individuen der Ctl-Scheingruppe unterzogen sich der gleichen Mikrochirurgie; Ihre Hoden wurden jedoch aus unbekannten Gründen nicht blockiert und verschmolzen. Die Ctl-Gruppe enthielt die Larven, die ohne Operation natürlich wuchsen; Ihre beiden Hoden verschmolzen normal während des präpupalen Stadiums.
Die mikrochirurgische Gruppe umfasste zwei Untergruppen: Larven, die einer Mikrochirurgie unterzogen wurden, um eine Barriere zwischen den beiden Hoden zu platzieren (Gruppe A) und diejenigen, die einer Mikrooperation unterzogen wurden, um einen Hoden zu entfernen (Gruppe B: linker Hoden in Gruppe B-1 entfernt; rechter Hoden in Gruppe B-2 entfernt). Tabelle 1 zeigt die Anzahl der Operationslarven, die Larvensterblichkeitsraten, die Anzahl der Puppen, den Prozentsatz der Verpuppung, die Anzahl der Erwachsenen, die Prozentsätze der erwachsenen Emergenz, die Prozentsätze der erfolgreichen Paarung und die Prozentsätze der erfolgreichen Operationen in verschiedenen Gruppen. Gruppe A umfasst Larven, die einer Mikrooperation unterzogen wurden, um eine Barriere zwischen den Hoden einzuführen. Der Erfolg dieses Verfahrens konnte erst nach der Dissektion festgestellt werden, als sie weiter in die Exp- und Ctl-Scheingruppen unterteilt wurden.
Wie in Abbildung 8 gezeigt, war die Larvensterblichkeitsrate in der chirurgischen Gruppe etwas höher, während die Prozentsätze der Verpuppung, des Auftretens von Erwachsenen und der erfolgreichen Paarung in der chirurgischen Gruppe etwas niedriger waren als in der Kontrollgruppe. Keiner der Unterschiede unterschied sich jedoch signifikant, was darauf hindeutet, dass die Mikrochirurgie das Wachstum und die Entwicklung der Larven von Spodoptera litura nicht merklich beeinflusste.
| Gruppe | Anzahl der Larven | Larvensterblichkeitsrate/% | Anzahl der Puppen | Prozentsatz der Verpuppung/% | Anzahl der Erwachsenen | Prozentsatz der erwachsenen Emergenz/% | Prozentsatz der erfolgreichen Paarung/% | Prozentsatz des erfolgreichen Betriebs/% | |||||
| Mikrochirurgie Gruppe A-1* | 79 | 35.4 | 39 | 76.5 | N | N | N | 10.3 | |||||
| Mikrochirurgie Gruppe A-2* | 117 | 12.8 | 102 | 100 | N | N | N | 11.8 | |||||
| Mikrochirurgie Gruppe A-3* | 73 | 13.7 | 57 | 90.5 | N | N | N | 10.5 | |||||
| Mikrochirurgie Gruppe A-4 | 101 | 4 | 97 | 96 | 29 | 29.9 | N | 26.9 | |||||
| Mikrochirurgie Gruppe A-5 | 176 | 20.1 | 140 | 79.5 | 28 | 20 | 44.4 | 25 | |||||
| Mikrochirurgie Gruppe A-6 | 434 | 12.4 | 376 | 98.9 | 209 | 55.6 | 26.8 | 14.3 | |||||
| Mikrochirurgie Gruppe A-7 | 260 | 10.8 | 135 | 58.2 | 66 | 48.9 | 47 | 48.4 | |||||
| Mikrochirurgie Gruppe A-8 | 49 | 24.5 | 37 | 100 | 21 | 56.8 | 81 | 58.8 | |||||
| Mikrochirurgie Gruppe B-1 | 117 | 29.1 | 71 | 85.5 | 30 | 42.3 | 23.3 | N | |||||
| Mikrochirurgie Gruppe B-2 | 188 | 6.9 | 172 | 98.3 | 115 | 66.9 | 35.7 | N | |||||
| Durchschnitt der Gruppe Mikrochirurgie (Mittelwert± SD) | 159 | 17±10,1 | 123 | 88,3±13,7 | 71 | 45,8±16,3 | 43±20,8 | 25,8±18,5 | |||||
| Kontrollgruppe 1* | 40 | 17 | 37 | 100 | N | N | N | N | |||||
| Kontrollgruppe 2 | 300 | 0 | 281 | 93.7 | 184 | 65.5 | N | N | |||||
| Kontrollgruppe 3 | 354 | 11 | 305 | 96.8 | 127 | 41.6 | N | N | |||||
| Kontrollgruppe 4 | 679 | 2.7 | 638 | 96.5 | 534 | 83.7 | 41.2 | N | |||||
| Kontrollgruppe 5 | 448 | 4.2 | 399 | 93 | 232 | 58.1 | 60 | N | |||||
| Kontrollgruppe 6 | 490 | 7.1 | 448 | 98.5 | 355 | 79.2 | 48 | N | |||||
| Durchschnitt der Kontrollgruppe (Mittelwert± SD) | 385 | 5,4±6,2 | 351 | 96,4±2,7 | 286 | 65,6±15,1 | 50±9,5 | N | |||||
Tabelle 1: Die Auswirkungen der Mikrochirurgie auf die Entwicklung von Spodoptera litura . Die Mikrochirurgiegruppen B-1 und B-2 wurden einer Mikrochirurgie unterzogen, um einseitige Hoden zu entfernen (links in der Mikrochirurgiegruppe B-1 und rechts in der Mikrochirurgiegruppe B-2). Hinweis: Die Mikrochirurgiegruppen A-1 bis A-8 wurden einer Mikrochirurgie unterzogen, um eine Barriere zwischen den Hoden einzuführen; Die Mikrochirurgiegruppen B-1 und B-2 wurden einer Mikrochirurgie unterzogen, um einseitige Hoden zu entfernen (links in der Mikrochirurgiegruppe B-1 und rechts in der Mikrochirurgiegruppe B-2); Die Raten und Prozentsätze werden als Mittelwert ± SD angegeben. Sternchen weisen darauf hin, dass die Individuen in der Gruppe im Puppenstadium seziert wurden, und es gab keine Statistiken über die Anzahl der Erwachsenen, den Prozentsatz des erwachsenen Auftretens oder den Prozentsatz der erfolgreichen Paarung; N gibt an, dass keine Daten vorliegen.
Abbildung 8: Der Einfluss der Mikrochirurgie auf das Wachstum und die Entwicklung von Spodoptera litura (n ≥ 6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Der Einfluss der Mikrochirurgie auf die Anzahl der Spermienbündel von Spodoptera litura
Es wurde eine Mikrochirurgie durchgeführt, um eine physikalische Barriere einzuführen, um die Hodenfusion zu stoppen oder einseitige Hoden in Spodoptera litura zu entfernen. Eupyren- und Apyren-Spermienbündel wurden gezählt, um den Prozentsatz der Eupyren-Spermienbündel am sechsten Tag des Puppenstadiums zu berechnen. Die Personen wurden nach Behandlung gruppiert, wie oben beschrieben. Die Anzahl der Spermienbündel (Eupyren-Spermienbündel, Apyren-Spermienbündel und insgesamt) war in der Exp-Gruppe signifikant niedriger als in den Ctl-Schein- und Ctl-Gruppen. Die mittlere Anzahl der Eupyren-Spermienbündel aus zwei getrennten Hoden in der Exp-Gruppe betrug 2082 ± 599. In den Ctl-Schein- und Ctl-Gruppen mit verschmolzenen Hoden lag die Anzahl der Eupyren-Spermienbündel zwischen 4652 und 6200.
Die Anzahl der Apyren-Spermienbündel in der Exp-Gruppe betrug 1602 ± 703, während sie in den Ctl-Sham- und Ctl-Gruppen zwischen 3299 und 4632 lag. Die Gesamtzahl der Spermienbündel in der Exp-Gruppe betrug 3684 ± 985; sie reichte von 9284 bis 10832 in den Gruppen Ctl-Sham und Ctl. So reichten die Prozentsätze der Eupyren-Spermienbündel zwischen 50% und 60%, ohne signifikante Unterschiede zwischen allen drei Gruppen. Abbildung 9 zeigt, dass, wenn die Fusion verhindert wird, die Menge an Eupyren- und Apyren-Spermienbündeln abnahm, während der Prozentsatz der Eupyren-Spermienbündel unverändert blieb.
Abbildung 9: Die Anzahl der Spermienbündel und der Prozentsatz der Eupyren-Spermienbündel in verschiedenen Gruppen. (A) Die Anzahl der Spermienbündel in der Exp-Gruppe war signifikant niedriger als in den Ctl-Schein- und Ctl-Gruppen. (B) Die Prozentsätze der Eupyren-Spermienbündel unterschieden sich zwischen den drei Gruppen nicht signifikant. Das Sternchen zeigt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu Ctl. P < 0,05, Mittelwert ± SD (n ≥5) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Nach der Entfernung eines einseitigen Hodens der Larven wurde die Anzahl der Eupyren- und Apyren-Spermienbündel gezählt, um den Prozentsatz der Eupyren-Spermienbündel am sechsten Tag des Puppenstadiums zu berechnen. Die Anzahl der Eupyren- und Apyren-Spermienbündel reichte von 1286 bis 1638 bzw. 720 bis 850, was bedeutet, dass die Gesamtzahl von 2006 bis 2488 reichte, was einem Eupyren-Spermienbündelanteil von 63% bis 65% entspricht. Abbildung 10 zeigt, dass die Anzahl der Spermienbündel nach einseitiger Hodenentfernung signifikant abnahm (reduziert um 60% bis 70%), ohne großen Einfluss auf den Prozentsatz der Eupyren-Spermienbündel.
Abbildung 10: Die Anzahl der Spermienbündel und der Prozentsatz der Eupyren-Spermienbündel nach der Entfernung des einseitigen Hodens. (A) Die Anzahl der Spermienbündel in Puppen, die einer einseitigen Hodenentfernung unterzogen wurden, unterschied sich signifikant zwischen den drei Gruppen (linker und rechter Hoden wurden in der Mikrochirurgiegruppe B-1 bzw. der Mikrochirurgiegruppe B-2 entfernt) (B ) Der Prozentsatz der Eupyren-Spermienbündel in Puppen, die einer einseitigen Hodenentfernung unterzogen wurden, unterschied sich nicht signifikant von Ctl. Das Sternchen zeigt einen signifikanten Unterschied zu Ctl. P < 0,05, Mittelwert ± SD (n ≥8) an. Kontrollgruppe = keine Operation, die Hoden verschmolzen während des präpupalen Stadiums auf natürliche Weise; Ctl-Sham-Gruppe = Operation erfolglos und Hoden nach Mikrochirurgie verschmolzen; Exp. Gruppe = Mikrochirurgie, die durchgeführt wird, um eine physikalische Barriere zwischen den beiden Hoden einzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Nach der mikrochirurgischen Behinderung der Hodenfusion in Spodoptera litura nahm die Anzahl der Spermienbündel ab, was die Hypothese stützte, dass diese Fusion für die Fortpflanzungsfähigkeit von Vorteil ist. Die chirurgische Manipulation wird seit dem frühen 20. Jahrhundert verwendet, um die physiologische Entwicklung von Insekten zu untersuchen. Um festzustellen, ob der Hirnnerv durch Insektenmetamorphose reguliert wird, führten einige Forscher Verfahren wie Ligatur und Enthauptung an verschiedenen Insekten durch (einschließlich Rhodnius prolixus von Hemiptera, Lymantria dispar von Lepidoptera)15,16. Der Prozess der Enthauptung umfasst das Entfernen des Kopfes mit einem Skalpell, die Desinfektion mit Antibiotika und die Paraffinwachsversiegelung der Wunde nach der Operation17. Nach der Extraktion und Transplantation der Brustdrüsen von Bombyx mori wurde die Wunde mit Paraffinwachs verschlossen18. Die unvermeidlichen Folgen dieser konventionellen Behandlungen sind jedoch Infektionen und eine hohe Sterblichkeitsrate, die es schwierig macht, den physiologischen Zustand in den späten Stadien der Entwicklung des Insekts zu analysieren.
Daher wurde dieses Protokoll entwickelt, um eine minimal-invasive Operation unter dem Mikroskop zu gewährleisten, um die Wunde zu minimieren. Darüber hinaus ist die Gefrieranästhesie im Vergleich zur Kohlendioxidanästhesie praktikabler und bequemer. Aluminiumfolie, die als Obstruktionsmittel verwendet wurde, wurde in eine Größe von 1 mm x 2 mm geschnitten, eine Fläche, die dem Abstand zwischen den Hoden entspricht. Nach der Mikrochirurgie fallen die Nahtfäden während der Häutung mit der frühen Epidermis ab, so dass Metamorphose und Entwicklung normal ablaufen können. Die Reproduktionsergebnisse deuten darauf hin, dass eine erfolgreiche Mikrochirurgie die Insektenentwicklung nicht wesentlich beeinflusst hat. Wenn die Hoden nicht verschmolzen, war die Anzahl der Gesamt-, Eupyren- und Apyren-Spermienbündel signifikant niedriger als in der Ctl-Gruppe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die männliche Fortpflanzungsfähigkeit durch die Hodenfusion beeinträchtigt wird. Die Beurteilung der Qualität und Vitalität der Samenzellen hat unterschiedliche Indizes und Methoden bei verschiedenen Tieren, einschließlich des akrosomalen Status der Spermien bei Säugetieren19, der Spermienmotilität20, der mitochondrialen Aktivität21, der Integrität der Plasmamembran22 und anderer Marker23,24 . Aufgrund der einzigartigen Samenzellentwicklung von Insekten müssen zukünftige Studien Veränderungen der Fortpflanzungsfähigkeit (Paarung, Inkubation25) untersuchen.
Kritische Schritte in diesem Protokoll erfordern besondere Aufmerksamkeit, um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten. Die Vermeidung von Verletzungen anderer Gewebe ist wichtig, wenn Sie die Einschnitte machen. Zweitens muss die Auswahl des Barrierematerials auf seinen ungiftigen und sterilen Eigenschaften und dem Fehlen scharfer Grenzen basieren. Schließlich wurde der Schnitt mit einer laufenden Naht und einem chirurgischen quadratischen Knoten verschlossen, gefolgt von einer Versiegelung im chirurgischen Bereich, um eine postoperative Infektion effektiv zu verhindern. Operationen an der inneren Struktur des Insekts wie Transplantation, Extraktion und Anwendung von Medikamenten können weiterhin durchgeführt werden, gefolgt von einer Versiegelung im chirurgischen Bereich.
Hohe Erfolgsraten erfordern kompetente Fähigkeiten, und diese Technik hat einige Nachteile. Erstens ist es nicht effizient, da die Operationen einzeln durchgeführt werden, wodurch individuelle Variationen unvermeidlich sind. Vorläufige Studien zeigten, dass bei der Verwendung von medizinischen venösen Transfusionsröhrchen, Gummimembranen, saugfähigen Perlen und Dentalmaterialien zur Trennung der Hoden die Ergebnisse nicht so erfolgreich waren wie erwartet. Darüber hinaus ist die Technik nicht erfolgreich, wenn der Obstrukator driftet. Mögliche Gründe für eine verminderte chirurgische Erfolgsrate sind das Abrutschen der Barriere, wenn sich die Insekten während der präpupalen Phase bewegen, schrumpfen, häuten und Organe neu organisieren. Alternativ kann die Aluminiumfolie zu nahe am Schmierdarm eingelegt werden, wodurch die Barriere wegschwimmt. Daher sollte ein geeignetes Material weiter optimiert werden.
Trotz der Einschränkungen der Mikrochirurgie bietet es eine Methode, um vorläufige Ergebnisse über biologische Phänomene zu erhalten, bevor ein transgenes Modellsystem etabliert wird. Sweeney und Waterson analysierten die Entwicklung von Kükenembryonen durch Einsetzen von Tantalfolienblöcken26, während Wilde und Logan Aluminiumfolie als undurchlässige Barriere verwendeten, um die Rolle der Retinsäuresignalisierung bei der Induktion und anschließenden Initiierung von Vorder- und Hinterbeinen zu untersuchen27. Bei wirbellosen Spodoptera litura ermöglicht diese Mikrochirurgie erfolgreich ein normales Wurmwachstum und eine normale Entwicklung und bietet eine Möglichkeit, physiologische Phänomene zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr.: 31772519, 31720103916; ) und einem offenen Stipendium des State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (Nr.: sklsgb2013003) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
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