Summary
एल्यूमीनियम पन्नी microsurgically स्पोडोप्टेरा litura के वृषण के बीच डाला गया था वृषण के संलयन में बाधा डालने के लिए. प्रक्रिया में ठंड, फिक्सिंग, कीटाणुशोधन, चीरा, बाधा रखना, suturing, पश्चात खिला, और निरीक्षण शामिल हैं। यह दृष्टिकोण ऊतक गठन के साथ हस्तक्षेप करने के लिए एक विधि प्रदान करता है।
Abstract
आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) जैसे आनुवांशिक तरीकों का उपयोग करने के बजाय और नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (CRISPR)/ CRISPR-संबद्ध एंडोन्यूक्लिएज Cas9 को क्लस्टर किया गया था, इसके विकास और प्रजनन पर इस माइक्रोसर्जरी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए स्पोडोप्टेरा लिटुरा के वृषण के बीच एक भौतिक बाधा माइक्रोसर्जिकल रूप से डाली गई थी। वृषण के बीच एल्यूमीनियम पन्नी डालने के बाद, कायापलट के दौरान कीट मोल्टिंग सामान्य रूप से आगे बढ़ी। कीट वृद्धि और विकास उल्लेखनीय रूप से परिवर्तित नहीं किए गए थे; हालांकि, शुक्राणु बंडलों की संख्या बदल गई अगर वृषण संलयन microsurgery द्वारा बंद कर दिया गया था. इन निष्कर्षों का तात्पर्य है कि वृषण संलयन को अवरुद्ध करने से पुरुष प्रजनन क्षमता प्रभावित हो सकती है। विशिष्ट सिग्नलिंग मार्गों के कार्य का अध्ययन करने के लिए अंगों के बीच संचार को बाधित करने के लिए विधि को आगे लागू किया जा सकता है। पारंपरिक सर्जरी की तुलना में, माइक्रोसर्जरी को केवल ठंड एनेस्थेटाइजेशन की आवश्यकता होती है, जो कार्बन डाइऑक्साइड एनेस्थेटाइजेशन से बेहतर है। Microsurgery भी सर्जरी साइट क्षेत्र को कम करता है और घाव भरने की सुविधा देता है। हालांकि, विशिष्ट कार्यों के साथ सामग्री के चयन को आगे की जांच की आवश्यकता है। ऑपरेशन के दौरान चीरों को बनाते समय ऊतक की चोट से बचना महत्वपूर्ण है।
Introduction
संलयन ऊतक या अंग विकास में एक सामान्य घटना है। उदाहरणों में ड्रोसोफिला 1 और तालू मॉर्फोजेनेसिस, न्यूरल ट्यूब मॉर्फोजेनेसिस, और चूहों और चिकन 2 में दिल के मॉर्फोजेनेसिस में पृष्ठीय क्लोजर और थोरेक्स क्लोजर शामिल हैं। CRISPR और RNAI को संलयन 2,3,4 की प्रक्रिया में जीन की भूमिकाओं की जांच करने के लिए लागू किया गया है।
स्पोडोप्टेरा लिटुरा (एस लिटुरा, लेपिडोप्टेरा: नोक्टुइडी) एक हानिकारक पॉलीफैगस कीट है जो व्यापक रूप से एशिया के उष्णकटिबंधीय और उपोष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में वितरित किया जाता है, जिसमें चीन 4,5,6 शामिल हैं। एस लिटुरा के व्यापक वितरण को आंशिक रूप से इसकी शक्तिशाली प्रजनन क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जो गोनाड विकास के लिए प्रासंगिक है। पुरुष बांझपन इस कीट को नियंत्रित करने के लिए एक दृष्टिकोण है। जैसा कि वृषण संरचना के योजनाबद्ध आंकड़े में दिखाया गया है, वृषण वृषण म्यान द्वारा संलग्न होते हैं, जिसमें बाहरी म्यान (पेरिटोनियल म्यान) और आंतरिक बेसल लामिना शामिल हैं। बेसल लामिना कूपिक उपकला बनाने के लिए आंतरिक रूप से फैली हुई है और वृषण के आंतरिक क्षेत्र को रोम नाम के चार कक्षों में अलग करती है (चित्रा 1)।
रोम में, माइटोसिस और अर्धसूत्रीविभाजन के बाद शुक्राणुओं में शुक्राणुओं का विकास होता है, और फिर शुक्राणु की थैलियों में शुक्राणुओं को शुक्राणु बंडल बनाने के लिए एक ही दिशा में संरेखित किया जाता है। शुक्राणुजनन के दौरान, प्राथमिक शुक्राणुकोशिकाएं यूपाइरीन शुक्राणुओं या एपिरीन शुक्राणुओं में अंतर करती हैं। लार्वा चरण में शुक्राणुकोशिकाएं एक लम्बी नाभिक के सिर से जुड़ी एक लंबी पूंछ के साथ यूपाइरीन शुक्राणु में विकसित होती हैं; ये अंडे को निषेचित कर सकते हैं। इसके विपरीत, मध्य-प्यूपल चरण में शुक्राणुओं को एक त्यागे गए नाभिक के साथ एपिरीन शुक्राणु में विकसित किया जाता है; ये शुक्राणु eupyrene शुक्राणु9,10 के अस्तित्व, गति और निषेचन में सहायता करते हैं। प्यूपा का 6 वां दिन वह अवधि है जिसके दौरान वृषण में प्रचुर मात्रा में यूपाइरीन और एपिरीन शुक्राणु बंडल होते हैं।
चित्र 1: लेपिडोप्टेरा कीटों की वृषण संरचना का योजनाबद्ध आरेख11. कृपया इस आकृति के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वृषण संलयन लेपिडोप्टेरा ऑर्डर 11,12 के अधिकांश कीड़ों में होता है, खासकर उन प्रजातियों में जो कृषि कीट हैं। वृषण संलयन लार्वा चरण में द्विपक्षीय रूप से बढ़ने वाले वृषणों की एक जोड़ी को संदर्भित करता है, एक दूसरे के पास आता है और एक दूसरे का पालन करता है, अंततः एक एकल गोनाड 11 में एकीकृत होता है। स्पोडोप्टेरा लिटुरा में, यह लार्वा से प्यूपल चरण तक कायापलट के दौरान होता है। 5 वें इंस्टार (L5D1) के दिन 1 से 6 वें इंस्टार (L6D4) के दिन 4 तक, वृषण की जोड़ी धीरे-धीरे आकार में बढ़ती है, और रंग हाथीदांत-सफेद से हल्का पीला हो जाता है। यह बेहोश लाल हो जाता है क्योंकि यह प्रीपुपल चरण (L6D5 से L6D6) तक पहुंचता है। दो द्विपक्षीय सममित वृषण prepupal चरण के दौरान एक दूसरे से संपर्क करते हैं, एक में फ्यूज, और मोड़ anticlockwise (doral दृश्य) pupal और वयस्क चरणों में एक एकल वृषण का उत्पादन करने के लिए11. यह घटना रेशम के कीड़ों में नहीं होती है, जिनका काफी आर्थिक महत्व है और 5000 वर्षों से पालतू बनाया गया है। इस प्रकार, यह माना जाता है कि वृषण का संलयन प्रजनन क्षमता में सुधार करता है।
स्पोडोप्टेरा लिटुरा वृषण संलयन के महत्व को निर्धारित करने के लिए, प्रक्रिया को अवरुद्ध करने के प्रभावों की जांच करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, एल्यूमीनियम पन्नी को अंडकोष के बीच माइक्रोसर्जिकल रूप से डाला गया था ताकि उन्हें अलग रखा जा सके, और कीड़ों और उनके वृषणों के विकास में परिणामस्वरूप परिवर्तनों का अध्ययन किया गया था।
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Protocol
1. कीट पालन और रखरखाव
- संस्कृति एक कृत्रिम आहार के साथ पर्यावरण सिमुलेशन कक्षों में स्पोडोप्टेरा लिटुरा लार्वा जब तक वे 6 वें इंस्टार (L6D4) के दिन 4 तक नहीं पहुंच जाते। पुरुष लार्वा का चयन करें जब कीड़े आठवें पेट पर व्युत्क्रम त्रिभुज के आकार की संरचना के आधार पर 6 वें इंस्टार (L6D0) के पहले दिन में प्रवेश करते हैं।
नोट: लार्वा पालन और रखरखाव तकनीकों को पहले प्रकाशित किया गया था4,14.
2. Presurgical तैयारी
- गोल कोनों के साथ आयताकार टुकड़ों में एल्यूमीनियम पन्नी ट्रिम (1 मिमी x 2 मिमी, चित्रा 2).
- सर्जरी प्लेटफ़ॉर्म और संबंधित वस्तुओं (टेबल सतह, माइक्रोस्कोप, आइसबॉक्स, कीट बॉक्स, मोम ट्रे, पिन और थ्रेड) को उनकी सतह पर 75% अल्कोहल का छिड़काव करके और उन्हें पोंछकर स्टरलाइज़ करें।
- 30 मिनट के लिए एक उच्च दबाव भाप sterilizer के साथ सर्जिकल उपकरण (एल्यूमीनियम पन्नी सहित) sterilize, और उन्हें 120 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग और सुखाने ओवन में जगह है।
- सुनिश्चित करें कि ऑपरेटर स्वच्छ प्रयोगशाला कपड़े, सर्जिकल मास्क और बाँझ दस्ताने पहनते हैं।
3. वृषण के बीच एक बाधा के Microsurgical प्लेसमेंट
नोट: सामान्य कार्य-प्रवाह निम्नानुसार है: ठंड → फिक्सिंग → कीटाणुशोधन → चीरा → बाधा प्लेसमेंट → Suturing→ पश्चात खिला और निरीक्षण → चीरा → फिक्सिंग
- पुरुष लार्वा (L6D4) को 10-30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें ताकि उन्हें ऑपरेशन के दौरान बेहोश किया जा सके।
- मोम ट्रे पर एक लार्वा रखें जिसमें पृष्ठीय पक्ष ऊपर की ओर होता है, और फिर सिर और लार्वा की पूंछ को पिन और धागे के साथ ठीक किया जाता है, सर्जिकल क्षेत्र दिखाता है जो 9 वें शरीर खंड (चित्रा 3 ए) पर पृष्ठीय सतह है।
- एपिडर्मिस (9 वें शरीर खंड) के लिए कपास झाड़ू के साथ 3% आयोडीन टिंचर लागू करके सर्जिकल क्षेत्र को कीटाणुरहित करें, इसके बाद आयोडीन को हटाने के लिए 70% अल्कोहल (चित्रा 3 बी)।
नोट: सर्जिकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 सी) के मोटे और ठीक समायोजन के माध्यम से लार्वा पर ध्यान केंद्रित करें। संज्ञाहरण रखने के लिए बर्फ से भरे एक बड़े संस्कृति पकवान पर मोम ट्रे रखें। - 9 वें शरीर खंड के पृष्ठीय एपिडर्मिस पर 2 मिमी लंबा चीरा बनाएं। इसके बाद, किसी भी लीक हेमोलिम्फ और वसा निकायों को हटाने और सर्जिकल क्षेत्र का एक स्पष्ट दृश्य प्राप्त करने के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करें।
नोट: प्रक्रिया के दौरान दिल से बचना महत्वपूर्ण है। यह 9 वें शरीर खंड में मध्य-रेखा के बगल में या 9 वें और 10 वें शरीर खंडों के बीच संयुक्त में चीरा को थोड़ा सा बनाकर किया जा सकता है ताकि वृषण को लार्वा आंतरिक दबाव के कारण बाहर निकलने से रोका जा सके। स्केलपेल का उपयोग करते समय, पहले ब्लेड के साथ एक ऊर्ध्वाधर भट्ठा बनाएं (चित्रा 4 ए), और फिर एपिडर्मिस (चित्रा 4 बी) के माध्यम से समान रूप से और लगातार काटने से पहले एपिडर्मिस की ओर इसे 45 डिग्री चालू करें। - वृषण के बीच एल्यूमीनियम पन्नी का एक टुकड़ा डालने के लिए सर्जिकल चिमटी का उपयोग करें (चित्रा 5)।
- सर्जरी के अंत में, संक्रमण से बचने के लिए चीरा बंद करें, और लार्वा को सर्जरी से ठीक होने की अनुमति दें।
- एक चल रहे टांके के साथ एपिडर्मिस को बंद करें (चित्र6)।
- एक सर्जिकल स्क्वायर गाँठ बांधने के लिए एक सुई धारक और सर्जिकल चिमटी का उपयोग करें, जिसके लिए दो विरोधी दर्पण-छवि सरल समुद्री मील (चित्रा 6 डी, ई) की आवश्यकता होती है।
- लूप पूंछ से अतिरिक्त टांका काटने के लिए कैंची का उपयोग करें, एक 2 मिमी धागे को पीछे छोड़ दें।
- suturing के बाद, धीरे से पालन बॉक्स में लार्वा रखना और उन्हें एक साफ पर्यावरण सिमुलेशन कक्ष में बनाए रखने. लार्वा का निरीक्षण जारी रखें।
नोट: घाव हेमोलिम्फ का रिसाव बंद कर देता है, और सर्जरी के बाद लार्वा धीरे-धीरे ठीक हो जाता है। कीड़े अपने कायापलट को पूरा करना जारी रखते हैं।
चित्र 2: एल्यूमीनियम पन्नी (1 मिमी x 2 मिमी) का उपयोग करके तैयार भौतिक बाधा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: चीरा से पहले। (ए) लार्वा को ठीक करना। (बी) सर्जिकल क्षेत्र के एपिडर्मिस का कीटाणुशोधन। (C) सूक्ष्मदर्शी के नीचे सर्जरी करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: चीरा. (ए) ब्लेड के साथ लंबवत रूप से लार्वा को काटें। (बी) ब्लेड के माध्यम से काटने से पहले एपिडर्मिस की ओर 45 डिग्री घुमाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: वृषण के बीच भौतिक बाधा (एल्यूमीनियम पन्नी) सम्मिलित करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: Suturing. (A) सुई डालें। (b) सुई को वापस ले लो। (c) सुई को वापस लेना और दबाना। (d) पहली साधारण गाँठ बाँधें। (ई) विरोधी दर्पण-प्रतिबिंबित सरल गाँठ बांधें। (च) अतिरिक्त टांका धागे को काटें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Representative Results
Spodoptera litura वृद्धि और विकास पर microsurgery के प्रभाव
माइक्रोसर्जरी ने पृष्ठीय लार्वा एपिडर्मिस पर 2 मिमी लंबा घाव छोड़ दिया जो अंततः हेमोलिम्फ को लीक करना बंद कर दिया और चंगा हो गया। लार्वा prepupal और pupal चरणों के माध्यम से चला गया और eclosed, यह दर्शाता है कि microsurgery विकास और विकास पर कोई बड़ा प्रभाव नहीं पड़ा। जब लार्वा प्यूपे में पिघला हुआ था, तो सिवनी धागे को एपिडर्मिस के साथ छोड़ दिया गया था। प्यूपे की उपस्थिति में कोई स्पष्ट अंतर नहीं था जो सर्जरी से गुजरा था और नहीं किया था। eclosion के बाद, वयस्क मादाओं ने पहले से संचालित वयस्क पुरुषों के साथ सफलतापूर्वक संभोग किया, जिसके परिणामस्वरूप निषेचित अंडे और हैचिंग लार्वा (चित्रा 7)।
चित्रा 7: माइक्रोसर्जरी के बाद स्पोडोप्टेरा लिटुरा विकास। (ए) एल 6 डी 4 पर पुरुष लार्वा। (बी) सर्जरी के तुरंत बाद एल 6 डी 4 लार्वा। (c) प्री-प्यूपा (L6D6)। (डी) पी 0, लाल तीर सर्जरी के स्थान को इंगित करता है; पीला तीर सीवन धागे के साथ छोड़े गए एपिडर्मिस को दिखाता है। (ई) संभोग वयस्कों। (च) एक मादा वयस्क से अंडे और हैच किए गए लार्वा जो एक पुरुष के साथ संभोग करते हैं जिसकी सर्जरी हुई थी। स्केल बार = 1 सेमी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
लार्वा प्यूपल चरण के माध्यम से चला गया और वृषण के बीच एल्यूमीनियम पन्नी के microsurgical प्लेसमेंट के बाद eclosed। इस कार्रवाई के बाद विस्तृत परिणाम पहले प्रकाशित किए जा चुके हैं11. यद्यपि बाधा ने वृषण को कुछ लार्वा में फ्यूज करने से रोक दिया, लेकिन अधिकांश लार्वा लार्वा के दौरान अंडकोष संलयन से प्यूपल कायापलट के दौरान हुए।
इस शोध में, व्यक्तियों को तीन उपचारों द्वारा वर्गीकृत किया गया था: प्रयोगात्मक (एक्सपी), शाम-ऑपरेशन (सीटीएल-शाम), और कोई ऑपरेशन नहीं (सीटीएल)। एक्सपी समूह के व्यक्तियों को एक शारीरिक बाधा डालने के लिए माइक्रोसर्जरी से गुजरना पड़ा, और उनके वृषण प्यूपल और वयस्क चरणों के दौरान अलग-अलग रहे। सीटीएल-शाम समूह के व्यक्तियों ने एक ही माइक्रोसर्जरी की; हालांकि, उनके वृषण को अवरुद्ध नहीं किया गया था और अज्ञात कारणों से फ्यूज किया गया था। सीटीएल समूह में लार्वा शामिल थे जो सर्जरी के बिना स्वाभाविक रूप से बढ़े थे; उनके दो वृषण prepupal चरण के दौरान सामान्य रूप से जुड़े.
माइक्रोसर्जरी समूह में दो उपसमूह शामिल थे: लार्वा जो दो वृषण (समूह ए) और उन लोगों के बीच एक बाधा रखने के लिए माइक्रोसर्जरी से गुजरे थे जो एक वृषण को हटाने के लिए माइक्रोसर्जरी से गुजरे थे (समूह बी: समूह बी -1 में बाएं वृषण को हटा दिया गया था; समूह बी -2 में दाएं वृषण को हटा दिया गया था)। तालिका 1 ऑपरेशन लार्वा की संख्या, लार्वा मृत्यु दर, प्यूपे की संख्या, प्यूपेशन का प्रतिशत, वयस्कों की संख्या, वयस्कों के उद्भव के प्रतिशत, सफल संभोग के प्रतिशत, और विभिन्न समूहों में सफल संचालन के प्रतिशत को दर्शाती है। समूह ए में लार्वा शामिल हैं जो वृषण के बीच एक बाधा डालने के लिए माइक्रोसर्जरी से गुजरते हैं। इस प्रक्रिया की सफलता केवल विच्छेदन के बाद निर्धारित की जा सकती है, जो तब होती है जब उन्हें एक्सपी और सीटीएल-शाम समूहों में विभाजित किया गया था।
जैसा कि चित्रा 8 में दिखाया गया है, लार्वा मृत्यु दर सर्जिकल समूह में थोड़ी अधिक थी, जबकि पिल्ला, वयस्क उद्भव और सफल संभोग का प्रतिशत नियंत्रण समूह की तुलना में सर्जिकल समूह में थोड़ा कम था। हालांकि, कोई भी अंतर काफी अलग नहीं था, यह दर्शाता है कि माइक्रोसर्जरी ने स्पोडोप्टेरा लिटुरा लार्वा के विकास और विकास को स्पष्ट रूप से प्रभावित नहीं किया था।
| समूह | लार्वा की संख्या | लार्वा मृत्यु दर/ | Pupae की संख्या | Pupation का प्रतिशत/ % | वयस्कों की संख्या | वयस्क उद्भव का प्रतिशत / % | सफल संभोग का प्रतिशत / % | सफल ऑपरेशन का प्रतिशत / % | |||||
| माइक्रोसर्जरी समूह ए -1 * | 79 | 35.4 | 39 | 76.5 | N | N | N | 10.3 | |||||
| माइक्रोसर्जरी समूह ए -2 * | 117 | 12.8 | 102 | 100 | N | N | N | 11.8 | |||||
| माइक्रोसर्जरी समूह ए -3 * | 73 | 13.7 | 57 | 90.5 | N | N | N | 10.5 | |||||
| माइक्रोसर्जरी समूह A-4 | 101 | 4 | 97 | 96 | 29 | 29.9 | N | 26.9 | |||||
| माइक्रोसर्जरी समूह ए -5 | 176 | 20.1 | 140 | 79.5 | 28 | 20 | 44.4 | 25 | |||||
| माइक्रोसर्जरी समूह ए -6 | 434 | 12.4 | 376 | 98.9 | 209 | 55.6 | 26.8 | 14.3 | |||||
| माइक्रोसर्जरी समूह ए -7 | 260 | 10.8 | 135 | 58.2 | 66 | 48.9 | 47 | 48.4 | |||||
| माइक्रोसर्जरी समूह ए -8 | 49 | 24.5 | 37 | 100 | 21 | 56.8 | 81 | 58.8 | |||||
| माइक्रोसर्जरी समूह बी -1 | 117 | 29.1 | 71 | 85.5 | 30 | 42.3 | 23.3 | N | |||||
| माइक्रोसर्जरी समूह बी -2 | 188 | 6.9 | 172 | 98.3 | 115 | 66.9 | 35.7 | N | |||||
| Microsurgery समूह का औसत (मतलब± एसडी) | 159 | 17±10.1 | 123 | 88.3±13.7 | 71 | 45.8±16.3 | 43±20.8 | 25.8±18.5 | |||||
| नियंत्रण समूह 1* | 40 | 17 | 37 | 100 | N | N | N | N | |||||
| नियंत्रण समूह 2 | 300 | 0 | 281 | 93.7 | 184 | 65.5 | N | N | |||||
| नियंत्रण समूह 3 | 354 | 11 | 305 | 96.8 | 127 | 41.6 | N | N | |||||
| नियंत्रण समूह 4 | 679 | 2.7 | 638 | 96.5 | 534 | 83.7 | 41.2 | N | |||||
| नियंत्रण समूह 5 | 448 | 4.2 | 399 | 93 | 232 | 58.1 | 60 | N | |||||
| नियंत्रण समूह 6 | 490 | 7.1 | 448 | 98.5 | 355 | 79.2 | 48 | N | |||||
| नियंत्रण समूह का औसत (माध्य± एसडी) | 385 | 5.4±6.2 | 351 | 96.4±2.7 | 286 | 65.6±15.1 | 50±9.5 | N | |||||
तालिका 1: स्पोडोप्टेरा लिटुरा विकास पर माइक्रोसर्जरी के प्रभाव। माइक्रोसर्जरी समूह बी -1 और बी -2 ने एकतरफा वृषण को हटाने के लिए माइक्रोसर्जरी से गुजरा (माइक्रोसर्जरी ग्रुप बी -1 में छोड़ दिया गया और माइक्रोसर्जरी ग्रुप बी -2 में दाएं)। नोट: माइक्रोसर्जरी समूह ए -1 से ए -8 को वृषण के बीच एक बाधा डालने के लिए माइक्रोसर्जरी से गुजरना पड़ा; माइक्रोसर्जरी समूह बी -1 और बी -2 ने एकतरफा वृषण को हटाने के लिए माइक्रोसर्जरी से गुजरा (माइक्रोसर्जरी ग्रुप बी -1 में छोड़ दिया गया और माइक्रोसर्जरी ग्रुप बी -2 में दाएं); दरों और प्रतिशत को माध्य ± एसडी के रूप में दिया गया है तारांकन से संकेत मिलता है कि समूह के व्यक्तियों को प्यूपल चरण में विच्छेदित किया गया था, और वयस्कों की संख्या, वयस्क उद्भव के प्रतिशत, या सफल संभोग के प्रतिशत पर कोई आंकड़ा नहीं था; N कोई डेटा इंगित नहीं करता है।
चित्रा 8: स्पोडोप्टेरा लिटुरा वृद्धि और (एन ≥ 6) के विकास पर माइक्रोसर्जरी का प्रभाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
स्पोडोप्टेरा लिटुरा के शुक्राणु बंडलों की संख्या पर माइक्रोसर्जरी का प्रभाव
माइक्रोसर्जरी को वृषण संलयन को रोकने या स्पोडोप्टेरा लिटुरा में एकतरफा वृषण को हटाने के लिए एक भौतिक बाधा डालने के लिए किया गया था। Eupyrene और apyrene शुक्राणु बंडलों को प्यूपल चरण के छठे दिन eupyrene शुक्राणु बंडलों के प्रतिशत की गणना करने के लिए गिना गया था। व्यक्तियों को उपचार द्वारा समूहीकृत किया गया था, जैसा कि ऊपर वर्णित है। शुक्राणु बंडलों की संख्या (eupyrene शुक्राणु बंडल, apyrene शुक्राणु बंडल, और कुल) Ctl-sham और Ctl समूहों की तुलना में Exp समूह में काफी कम थे। Exp समूह में दो अलग-अलग वृषणों से eupyrene शुक्राणु बंडलों की औसत संख्या 2082 ± 599 थी। फ्यूज्ड वृषण के साथ सीटीएल-शाम और सीटीएल समूहों में, यूपाइरीन शुक्राणु बंडलों की संख्या 4652 से 6200 तक थी।
एक्सपी समूह में एपिरीन शुक्राणु बंडलों की संख्या 1602 ± 703 थी, जबकि सीटीएल-शाम और सीटीएल समूहों में यह 3299 से 4632 तक थी। एक्सपी समूह में शुक्राणु बंडलों की कुल संख्या 3684 ± 985 थी; यह Ctl-Sham और Ctl समूहों में 9284 से 10832 तक था। इस प्रकार, यूपाइरीन शुक्राणु बंडलों का प्रतिशत 50% से 60% तक था, जिसमें सभी तीन समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। चित्रा 9 से पता चलता है कि जब संलयन को रोका जाता है, तो यूपाइरीन और एपाइरीन शुक्राणु बंडलों की मात्रा कम हो जाती है, जबकि यूपाइरीन शुक्राणु बंडलों का प्रतिशत अपरिवर्तित था।
चित्र 9: शुक्राणु बंडलों की संख्या और विभिन्न समूहों में यूपाइरीन शुक्राणु बंडलों के प्रतिशत। (A) Exp समूह में शुक्राणु बंडलों की संख्या Ctl-sham और Ctl समूहों की तुलना में काफी कम थी। (बी) यूपाइरीन शुक्राणु बंडलों का प्रतिशत तीन समूहों के बीच काफी अलग नहीं था। Ctl. P < 0.05, Mean ± SD (n ≥5) की तुलना में तारांकन चिह्न एक महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
लार्वा के एक पक्षीय वृषण को हटाने के बाद, प्यूपल चरण के छठे दिन यूपाइरीन शुक्राणु बंडलों के प्रतिशत की गणना करने के लिए यूपाइरीन और एपाइरीन शुक्राणु बंडलों की संख्या की गणना की गई थी। यूपाइरीन और एपाइरीन शुक्राणु बंडलों की संख्या क्रमशः 1286 से 1638 और 720 से 850 तक थी, जिसका अर्थ है कि कुल संख्या 2006 से 2488 तक थी, जो 63% से 65% के यूपाइरीन शुक्राणु बंडल प्रतिशत के अनुरूप थी। चित्रा 10 से पता चलता है कि एकतरफा वृषण हटाने के बाद शुक्राणु बंडलों की संख्या में काफी कमी आई है (60% से 70% तक कम हो गया है), यूपाइरीन शुक्राणु बंडलों के प्रतिशत पर बहुत प्रभाव के बिना।
चित्र 10: एकतरफा वृषण को हटाने के बाद शुक्राणु बंडलों की संख्या और यूपाइरीन शुक्राणु बंडलों के प्रतिशत। (A) एकतरफा वृषण हटाने वाले प्यूपे में शुक्राणु बंडलों की संख्या तीन समूहों के बीच काफी भिन्न थी (क्रमशः माइक्रोसर्जरी समूह B-1 और माइक्रोसर्जरी समूह B-2 में हटाए गए बाएं और दाएं वृषण) (B) ) प्यूपे में यूपाइरीन शुक्राणु बंडलों का प्रतिशत जो एकतरफा वृषण हटाने से गुजरा था, सीटीएल की तुलना में काफी अलग नहीं था। तारांकन सीटीएल की तुलना में एक महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है। पी < 0.05, माध्य ± एसडी (एन ≥8)। नियंत्रण समूह = कोई सर्जरी नहीं, वृषण prepupal चरण के दौरान स्वाभाविक रूप से फ्यूज; सीटीएल-शाम समूह = ऑपरेशन असफल और वृषण माइक्रोसर्जरी के बाद फ्यूज्ड; Exp. समूह = microsurgery दो वृषण के बीच एक शारीरिक बाधा डालने के लिए प्रदर्शन किया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
स्पोडोप्टेरा लिटुरा में अंडकोष संलयन को माइक्रोसर्जिक रूप से बाधित करने के बाद, शुक्राणु बंडलों की संख्या में कमी आई, जिसने इस परिकल्पना का समर्थन किया कि यह संलयन प्रजनन क्षमता के लिए फायदेमंद है। सर्जिकल हेरफेर का उपयोग 20 वीं शताब्दी की शुरुआत से कीड़ों के शारीरिक विकास का अध्ययन करने के लिए किया गया है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कपाल तंत्रिका को कीट कायापलट द्वारा विनियमित किया जाता है, कुछ शोधकर्ताओं ने विभिन्न कीड़ों पर बंधाव और विच्छेदन जैसी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया (हेमिप्टेरा के रोडनियस प्रोलिक्सस, लेपिडोप्टेरा के लिमंत्रिया डिस्पार सहित)15,16। डिकैपिटेशन की प्रक्रिया में एक स्केलपेल के साथ सिर को हटाना, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ कीटाणुशोधन, और ऑपरेशन 17 के बाद घाव की पैराफिन मोम सीलिंग शामिल है। बॉम्बिक्स मोरी के प्रोथोरेसिक ग्रंथियों के निष्कर्षण और प्रत्यारोपण के बाद, घाव को पैराफिन मोम 18 के साथ सील कर दिया गया था। हालांकि, इन पारंपरिक उपचारों के अपरिहार्य परिणाम संक्रमण और एक उच्च मृत्यु दर हैं, जो कीट के विकास के अंतिम चरणों के दौरान शारीरिक स्थिति का विश्लेषण करना मुश्किल बनाता है।
इसलिए, इस प्रोटोकॉल को घाव को कम करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे की गई न्यूनतम इनवेसिव सर्जरी सुनिश्चित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसके अलावा, कार्बन डाइऑक्साइड एनेस्थेटाइजेशन की तुलना में, ठंड एनेस्थेटाइजेशन अधिक व्यवहार्य और सुविधाजनक है। एल्यूमिनियम पन्नी, अवरोधक के रूप में उपयोग किया जाता है, 1 मिमी x 2 मिमी के आकार में काटा गया था, जो वृषण के बीच की जगह के बराबर एक क्षेत्र था। माइक्रोसर्जरी के बाद, सीवन धागे मोल्टिंग के दौरान शुरुआती एपिडर्मिस के साथ गिर जाते हैं, जिससे कायापलट और विकास सामान्य रूप से आगे बढ़ता है। प्रजनन परिणाम बताते हैं कि सफल माइक्रोसर्जरी ने कीट विकास को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया। जब वृषण फ्यूज नहीं करते थे, तो कुल, यूपाइरीन और एपिरीन शुक्राणु बंडलों की संख्या सीटीएल समूह में उन लोगों की तुलना में काफी कम थी। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि पुरुष प्रजनन क्षमता वृषण संलयन से प्रभावित होती है। शुक्राणु कोशिका की गुणवत्ता और जीवन शक्ति के मूल्यांकन में विभिन्न जानवरों में अलग-अलग अनुक्रमणिका और तरीके हैं, जिनमें स्तनधारियों में शुक्राणु एक्रोसोमल की स्थिति, शुक्राणु गतिशीलता 20, माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि 21, प्लाज्मा झिल्ली अखंडता 22, और अन्य मार्कर 23,24 शामिल हैं। कीड़ों के अद्वितीय शुक्राणु कोशिका विकास के कारण, भविष्य के अध्ययनों को प्रजनन क्षमता में परिवर्तन की जांच करने की आवश्यकता है (संभोग, इनक्यूबेशन 25)।
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों को विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। चीरों को बनाते समय अन्य ऊतकों को चोट से बचना महत्वपूर्ण है। दूसरा, बाधा सामग्री का चयन इसके नॉनटॉक्सिक और बाँझ गुणों और तेज सीमाओं की कमी पर आधारित होना चाहिए। अंत में, चीरा को एक चल रहे टांके और एक सर्जिकल स्क्वायर गाँठ के साथ बंद कर दिया गया था, जिसके बाद शल्य चिकित्सा क्षेत्र में सीलिंग प्रभावी ढंग से पश्चात के संक्रमण को रोकने के लिए। कीट की आंतरिक संरचना जैसे प्रत्यारोपण, निष्कर्षण और दवाओं के आवेदन पर ऑपरेशन अभी भी किए जा सकते हैं, इसके बाद सर्जिकल क्षेत्र में सीलिंग होती है।
उच्च सफलता दर के लिए कुशल कौशल की आवश्यकता होती है, और इस तकनीक के कुछ नुकसान हैं। सबसे पहले, यह कुशल नहीं है, क्योंकि संचालन एक-एक करके किए जाते हैं, जिसके कारण व्यक्तिगत भिन्नता अपरिहार्य है। प्रारंभिक अध्ययनों से पता चला है कि वृषण को अलग करने के लिए चिकित्सा शिरापरक आधान ट्यूब, रबर डायाफ्राम, शोषक मोतियों और दंत सामग्री का उपयोग करते समय, परिणाम अपेक्षित रूप से सफल नहीं थे। इसके अलावा, तकनीक सफल नहीं होती है जब अवरोधक बहाव होता है। सर्जिकल सफलता दर में कमी के संभावित कारणों में बाधा शामिल है जब कीड़े चलते हैं, सिकुड़ते हैं, पिघलते हैं, और प्रीपुपल चरण के दौरान अंगों को फिर से व्यवस्थित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, एल्यूमीनियम पन्नी को स्नेहक आंत के बहुत करीब डाला जा सकता है, जिससे बाधा दूर तैरती है। इसलिए, एक उपयुक्त सामग्री को आगे अनुकूलित किया जाना चाहिए।
माइक्रोसर्जरी की सीमाओं के बावजूद, यह एक ट्रांसजेनिक मॉडल सिस्टम स्थापित करने से पहले जैविक घटनाओं के बारे में प्रारंभिक परिणाम प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। स्वीनी और वाटरसन ने टैंटलम फॉइल ब्लॉक्स 26 को सम्मिलित करके चिक भ्रूण में विकास से छुटकारा पाने का विश्लेषण किया, जबकि वाइल्ड और लोगान ने प्रेरण में रेटिनोइक एसिड सिग्नलिंग की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग एक अपारगम्य बाधा के रूप में किया और बाद में आगे और हिंदलाइम्ब्स 27 की दीक्षा। अकशेरुकी स्पोडोप्टेरा लिटुरा में, यह माइक्रोसर्जरी सफलतापूर्वक सामान्य कृमि वृद्धि और विकास को सक्षम बनाता है, जो शारीरिक घटनाओं का अध्ययन करने का एक तरीका प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (Nos.: 31772519, 31720103916; ) और सिल्कवर्म जीनोम जीव विज्ञान, दक्षिण पश्चिम विश्वविद्यालय (No.: sklsgb2013003) की राज्य कुंजी प्रयोगशाला से एक खुला अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
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