Summary
Il foglio di alluminio è stato inserito microchirurgicamente tra i testicoli di Spodoptera litura per ostruire la fusione del testicolo. La procedura include congelamento, fissaggio, disinfezione, incisione, posizionamento della barriera, sutura, alimentazione postoperatoria e ispezione. Questo approccio fornisce un metodo per interferire con la formazione dei tessuti.
Abstract
Invece di utilizzare metodi genetici come l'interferenza dell'RNA (RNAi) e le brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) / endonucleasi associate a CRISPR Cas9, una barriera fisica è stata inserita microchirurgicamente tra i testicoli di Spodoptera litura per studiare l'impatto di questa microchirurgia sulla sua crescita e riproduzione. Dopo aver inserito un foglio di alluminio tra i testicoli, la muta degli insetti durante la metamorfosi procedeva normalmente. La crescita e lo sviluppo degli insetti non sono stati notevolmente alterati; tuttavia, il numero di fasci di spermatozoi è cambiato se la fusione dei testicoli è stata interrotta dalla microchirurgia. Questi risultati implicano che il blocco della fusione testicolare può influenzare la capacità di riproduzione maschile. Il metodo può essere ulteriormente applicato per interrompere la comunicazione tra gli organi per studiare la funzione di specifiche vie di segnalazione. Rispetto alla chirurgia convenzionale, la microchirurgia richiede solo l'anestesia congelante, che è preferibile all'anestesia con anidride carbonica. La microchirurgia riduce anche al minimo l'area del sito chirurgico e facilita la guarigione delle ferite. Tuttavia, la selezione di materiali con funzioni specifiche richiede ulteriori indagini. Evitare lesioni tissutali è fondamentale quando si praticano incisioni durante l'operazione.
Introduction
La fusione è un fenomeno comune nello sviluppo di tessuti o organi. Gli esempi includono la chiusura dorsale e la chiusura del torace in Drosophila1 e morfogenesi del palato, morfogenesi del tubo neurale e morfogenesi cardiaca in topi e polli2. CRISPR e RNAi sono stati applicati per studiare i ruoli dei geni nel processo di fusione2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) è un parassita polifago dannoso che è ampiamente distribuito nelle aree tropicali e subtropicali dell'Asia, tra cui la Cina4,5,6. L'ampia distribuzione di S. litura è in parte attribuita alla sua potente capacità riproduttiva, che è rilevante per lo sviluppo delle gonadi. L'infertilità maschile è un approccio per controllare questo parassita. Come mostrato nella figura schematica della struttura testicolare, i testicoli sono racchiusi dalla guaina testicolare, compresa la guaina esterna (guaina peritoneale) e la lamina basale interna. La lamina basale si estende internamente per formare l'epitelio follicolare e separa l'area interna del testicolo in quattro camere chiamate follicoli (Figura 1).
Nei follicoli, gli spermatogoni si sviluppano in spermatozoi dopo mitosi e meiosi, e quindi gli spermatozoi nelle sacche spermatiche si allineano nella stessa direzione per formare fasci di spermatozoi7. Durante la spermatogenesi, gli spermatociti primari si differenziano in spermatozoi eupireni o spermatozoi apireni. Gli spermatociti nella fase larvale si sviluppano in spermatozoi eupireni con una lunga coda collegata a una testa di un nucleo allungato; questi possono fecondare le uova. Al contrario, gli spermatociti nella fase mid-pupal si sviluppano in spermatozoi apireni con un nucleo scartato; questi spermatozoi aiutano la sopravvivenza, il movimento e la fecondazione degli spermatozoi eupireni9,10. Il 6 ° giorno della pupa è il periodo durante il quale i testicoli hanno abbondanti fasci di spermatozoi eupirene e apirene.
Figura 1: Diagramma schematico della struttura testicolare degli insetti lepidotteri11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La fusione testicolare si verifica nella maggior parte degli insetti dell'ordine dei lepidotteri11,12, specialmente in quelle specie che sono parassiti agricoli. La fusione testicolare si riferisce a una coppia di testicoli che crescono bilateralmente nella fase larvale, avvicinandosi e aderendo l'uno all'altro, integrandosi infine in una singola gonade11. In Spodoptera litura, accade durante la metamorfosi dallo stadio larvale a quello pupale. Dal giorno 1 del 5 ° instar (L5D1) al giorno 4 del 6 ° instar (L6D4), la coppia di testicoli cresce gradualmente di dimensioni e il colore diventa giallo chiaro da bianco avorio. Diventa rosso tenue quando raggiunge la fase prepupale (da L6D5 a L6D6). Due testicoli simmetrici bilaterali si avvicinano l'un l'altro durante lo stadio prepupale, si fondono in uno e ruotano in senso antiorario (vista dorale) per produrre un singolo testicolo nelle fasi pupale e adulta11. Questo fenomeno non si verifica nei bachi da seta, che hanno una notevole importanza economica e sono stati addomesticati per 5000 anni13. Pertanto, si presume che la fusione dei testicoli migliori la capacità riproduttiva.
Per determinare il significato della fusione testicolare di Spodoptera litura , è importante indagare gli effetti del blocco del processo. In questo protocollo, il foglio di alluminio è stato inserito microchirurgicamente tra i testicoli per tenerli separati e sono stati studiati i conseguenti cambiamenti nello sviluppo degli insetti e dei loro testicoli.
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Protocol
1. Allevamento e manutenzione degli insetti
- Coltivare le larve di Spodoptera litura in camere di simulazione ambientale con una dieta artificiale fino al raggiungimento del giorno 4 del 6° instar (L6D4). Seleziona le larve maschili quando i vermi entrano nel primo giorno del 6 ° instar (L6D0) in base alla struttura a forma di triangolo inverso sull'ottavo addome14.
NOTA: Le tecniche di allevamento e manutenzione delle larve sono state pubblicate in precedenza4,14.
2. Preparazione prechirurgica
- Tagliare il foglio di alluminio in pezzi rettangolari con angoli arrotondati (1 mm x 2 mm, Figura 2).
- Sterilizzare la piattaforma chirurgica e gli elementi correlati (superficie del tavolo, microscopio, ghiacciaia, scatola degli insetti, vassoio di cera, spilli e filo) spruzzando il 75% di alcol sulla loro superficie e pulendoli.
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici (incluso il foglio di alluminio) con uno sterilizzatore a vapore ad alta pressione per 30 minuti e metterli in un forno di riscaldamento e asciugatura a 120 °C.
- Assicurarsi che gli operatori indossino abiti da laboratorio puliti, maschere chirurgiche e guanti sterili.
3. Posizionamento microchirurgico di una barriera tra i testicoli
NOTA: Il flusso di lavoro generale è il seguente: congelamento → fissaggio → disinfezione → incisione → posizionamento della barriera → sutura→ alimentazione e ispezione postoperatoria
- Posizionare le larve maschili (L6D4) sul ghiaccio per 10-30 minuti per tenerle anestetizzate durante l'operazione.
- Posizionare una larva sul vassoio di cera con il lato dorsale verso l'alto, quindi fissare la testa e la coda della larva con spilli e fili, mostrando l'area chirurgica che è la superficie dorsale sul 9 ° segmento del corpo (Figura 3A).
- Disinfettare l'area chirurgica applicando la tintura di iodio al 3% con un batuffolo di cotone sull'epidermide (9 ° segmento del corpo), seguito da alcol al 70% per rimuovere lo iodio (Figura 3B).
NOTA: Concentrarsi sulla larva attraverso la regolazione grossolana e fine del microscopio chirurgico (Figura 3C). Posizionare il vassoio di cera su un piatto di coltura più grande pieno di ghiaccio per mantenere l'anestesia. - Fai un'incisione lunga 2 mm sull'epidermide dorsale del 9 ° segmento del corpo. Successivamente, utilizzare un batuffolo di cotone sterile per rimuovere eventuali perdite di emolinfa e corpi grassi e ottenere una visione chiara dell'area chirurgica.
NOTA: È importante evitare il cuore durante la procedura. Questo può essere fatto facendo l'incisione leggermente vicino alla linea mediana nel 9 ° segmento del corpo o all'articolazione tra il 9 ° e il 10 ° segmento del corpo per evitare che i testicoli fuoriescano a causa della pressione interna larvale. Durante l'utilizzo del bisturi, fare prima una fessura verticale con la lama (Figura 4A), quindi ruotarla di 45 ° verso l'epidermide prima di tagliare uniformemente e continuamente l'epidermide (Figura 4B). - Utilizzare una pinzetta chirurgica per inserire un foglio di alluminio tra i testicoli (Figura 5).
- Alla fine dell'intervento chirurgico, chiudere l'incisione per evitare l'infezione e consentire alle larve di riprendersi dall'intervento chirurgico.
- Chiudere l'epidermide con una sutura in esecuzione (Figura 6).
- Utilizzare un portaago e una pinzetta chirurgica per legare un nodo quadrato chirurgico, richiedendo due nodi semplici a immagine speculare opposti (Figura 6D, E).
- Usa le forbici per tagliare la sutura in eccesso dalle code del cappio, lasciando dietro di sé un filo di 2 mm.
- Dopo la sutura, posare delicatamente la larva nella scatola di allevamento e mantenerla in una camera di simulazione ambientale pulita. Continua a osservare le larve.
NOTA: La ferita smette di perdere emolinfa e le larve si riprendono gradualmente dopo l'intervento chirurgico. I vermi continuano a completare la loro metamorfosi.
Figura 2: Barriera fisica preparata utilizzando un foglio di alluminio (1 mm x 2 mm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Prima dell'incisione. (A) Fissare la larva. (B) Disinfezione dell'epidermide dell'area chirurgica. C) Esecuzione di interventi chirurgici al microscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Incisione. (A) Tagliare le larve verticalmente con la lama. (B) Ruotare la lama di 45° verso l'epidermide prima di tagliarla. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Inserimento della barriera fisica (foglio di alluminio) tra i testicoli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Sutura. (A) Inserire l'ago. (B) Ritirare l'ago. (C) Prelevare e bloccare l'ago. (D) Legare il primo nodo semplice. (E) Legare il nodo semplice opposto con immagini speculari. (F) Tagliare il filo di sutura in eccesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Gli effetti della microchirurgia sulla crescita e lo sviluppo di Spodoptera litura
La microchirurgia ha lasciato una ferita lunga 2 mm sull'epidermide larvale dorsale che alla fine ha smesso di perdere emolinfa ed è guarita. Le larve hanno attraversato fasi prepupali e pupali e si sono chiuse, indicando che la microchirurgia non ha avuto un impatto importante sulla crescita e sullo sviluppo. Quando le larve si sono fuse in pupe, i fili di sutura sono stati scartati insieme all'epidermide. Non c'erano differenze evidenti nell'aspetto delle pupe che hanno subito e non hanno subito un intervento chirurgico. Dopo l'eclosione, le femmine adulte si sono accoppiate con successo con i maschi adulti precedentemente operati, con conseguente uova fecondate e larve da cova (Figura 7).
Figura 7: Sviluppo di Spodoptera litura dopo microchirurgia. (A) Larva maschile a L6D4. (B) Larva L6D4 immediatamente dopo l'intervento chirurgico. (C) Pre-pupa (L6D6). (D) P0, la freccia rossa indica la posizione dell'intervento chirurgico; la freccia gialla mostra l'epidermide scartata con filo di sutura. (E) Accoppiamento di adulti. (F) Uova e larve tratteggiate da una femmina adulta che si accoppia con un maschio sottoposto a intervento chirurgico. Barre della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le larve hanno attraversato lo stadio pupale e si sono chiuse dopo il posizionamento microchirurgico del foglio di alluminio tra i testicoli. I risultati dettagliati a seguito di questa operazione sono stati pubblicati in precedenza11. Sebbene la barriera abbia impedito ai testicoli di fondersi in alcune larve, la maggior parte delle larve ha subito la fusione testicolare durante la metamorfosi larvale-pupale.
In questa ricerca, gli individui sono stati raggruppati per tre trattamenti: sperimentale (Exp), Sham-operation (Ctl-sham) e nessuna operazione (Ctl). Gli individui del gruppo Exp sono stati sottoposti a microchirurgia per inserire una barriera fisica e i loro testicoli sono rimasti separati durante le fasi pupale e adulta. Gli individui del gruppo Ctl-sham hanno subito la stessa microchirurgia; tuttavia, i loro testicoli non sono stati bloccati e fusi per ragioni sconosciute. Il gruppo Ctl conteneva le larve che crescevano naturalmente senza chirurgia; i loro due testicoli si fusero normalmente durante la fase prepupale.
Il gruppo di microchirurgia conteneva due sottogruppi: le larve che hanno subito un microchirurgia per porre una barriera tra i due testicoli (Gruppo A) e quelle che hanno subito un microchirurgia per rimuovere un testicolo (Gruppo B: testicolo sinistro rimosso nel Gruppo B-1; testicolo destro rimosso nel Gruppo B-2). La Tabella 1 mostra il numero di larve operative, i tassi di mortalità larvale, il numero di pupe, la percentuale di pupa, il numero di adulti, le percentuali di emergenza adulta, le percentuali di accoppiamento riuscito e le percentuali di operazioni riuscite in diversi gruppi. Il gruppo A comprende le larve che hanno subito un microchirurgia per inserire una barriera tra i testicoli. Il successo di questa procedura poteva essere determinato solo dopo la dissezione, che è quando sono stati ulteriormente divisi nei gruppi Exp e Ctl-sham.
Come mostrato nella Figura 8, il tasso di mortalità larvale era leggermente più alto nel gruppo chirurgico, mentre le percentuali di pupa, emergenza adulta e accoppiamento riuscito erano leggermente inferiori nel gruppo chirurgico rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, nessuna delle differenze era significativamente diversa, indicando che la microchirurgia non ha influenzato marcatamente la crescita e lo sviluppo delle larve di Spodoptera litura .
| Gruppo | Numero di larve | Tasso di mortalità larvale/% | Numero di Pupe | Percentuale di pupa/% | Numero di adulti | Percentuale di emergenza adulta/% | Percentuale di accoppiamento riuscito/% | Percentuale di operazioni riuscite/% | |||||
| Microchirurgia gruppo A-1* | 79 | 35.4 | 39 | 76.5 | N | N | N | 10.3 | |||||
| Microchirurgia gruppo A-2* | 117 | 12.8 | 102 | 100 | N | N | N | 11.8 | |||||
| Microchirurgia gruppo A-3* | 73 | 13.7 | 57 | 90.5 | N | N | N | 10.5 | |||||
| Microchirurgia gruppo A-4 | 101 | 4 | 97 | 96 | 29 | 29.9 | N | 26.9 | |||||
| Microchirurgia gruppo A-5 | 176 | 20.1 | 140 | 79.5 | 28 | 20 | 44.4 | 25 | |||||
| Microchirurgia gruppo A-6 | 434 | 12.4 | 376 | 98.9 | 209 | 55.6 | 26.8 | 14.3 | |||||
| Microchirurgia gruppo A-7 | 260 | 10.8 | 135 | 58.2 | 66 | 48.9 | 47 | 48.4 | |||||
| Microchirurgia gruppo A-8 | 49 | 24.5 | 37 | 100 | 21 | 56.8 | 81 | 58.8 | |||||
| Microchirurgia gruppo B-1 | 117 | 29.1 | 71 | 85.5 | 30 | 42.3 | 23.3 | N | |||||
| Gruppo di microchirurgia B-2 | 188 | 6.9 | 172 | 98.3 | 115 | 66.9 | 35.7 | N | |||||
| Media del gruppo di microchirurgia (media± SD) | 159 | 17±10,1 | 123 | 88,3±13,7 | 71 | 45,8±16,3 | 43±20,8 | 25.8±18.5 | |||||
| Gruppo di controllo 1* | 40 | 17 | 37 | 100 | N | N | N | N | |||||
| Gruppo di controllo 2 | 300 | 0 | 281 | 93.7 | 184 | 65.5 | N | N | |||||
| Gruppo di controllo 3 | 354 | 11 | 305 | 96.8 | 127 | 41.6 | N | N | |||||
| Gruppo di controllo 4 | 679 | 2.7 | 638 | 96.5 | 534 | 83.7 | 41.2 | N | |||||
| Gruppo di controllo 5 | 448 | 4.2 | 399 | 93 | 232 | 58.1 | 60 | N | |||||
| Gruppo di controllo 6 | 490 | 7.1 | 448 | 98.5 | 355 | 79.2 | 48 | N | |||||
| Media del gruppo di controllo (media± SD) | 385 | 5.4±6.2 | 351 | 96,4±2,7 | 286 | 65,6±15,1 | 50±9,5 | N | |||||
Tabella 1: Gli effetti della microchirurgia sullo sviluppo di Spodoptera litura. I gruppi di microchirurgia B-1 e B-2 sono stati sottoposti a microchirurgia per rimuovere il testicolo unilaterale (a sinistra nel gruppo di microchirurgia B-1 e a destra nel gruppo di microchirurgia B-2). Nota: i gruppi di microchirurgia da A-1 ad A-8 sono stati sottoposti a microchirurgia per inserire una barriera tra i testicoli; I gruppi di microchirurgia B-1 e B-2 sono stati sottoposti a microchirurgia per rimuovere il testicolo unilaterale (a sinistra nel gruppo di microchirurgia B-1 e a destra nel gruppo di microchirurgia B-2); i tassi e le percentuali sono indicati come ± SD. Gli asterischi indicano che gli individui del gruppo sono stati sezionati nella fase pupale e non c'erano statistiche sul numero di adulti, sulla percentuale di emergenza adulta o sulla percentuale di accoppiamento riuscito; N non indica dati.
Figura 8: L'influenza della microchirurgia sulla crescita e lo sviluppo di Spodoptera litura di (n ≥ 6). Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
L'influenza della microchirurgia sul numero di fasci di spermatozoi di Spodoptera litura
La microchirurgia è stata eseguita per inserire una barriera fisica per fermare la fusione dei testicoli o rimuovere il testicolo unilaterale in Spodoptera litura. I fasci di spermatozoi eupirene e apirene sono stati contati per calcolare la percentuale di fasci di spermatozoi eupirene al sesto giorno dello stadio pupale. Gli individui sono stati raggruppati per trattamento, come descritto sopra. Il numero di fasci di spermatozoi (fasci di spermatozoi eupireni, fasci di spermatozoi di apirene e totale) era significativamente più basso nel gruppo Exp rispetto ai gruppi Ctl-sham e Ctl. Il numero medio di fasci di spermatozoi di eupirene da due testicoli separati nel gruppo Exp era di 2082 ± 599. Nei gruppi Ctl-sham e Ctl con testicoli fusi, il numero di fasci di spermatozoi eupireni variava da 4652 a 6200.
Il numero di fasci di spermatozoi di apirene nel gruppo Exp era di 1602 ± 703, mentre variava da 3299 a 4632 nei gruppi Ctl-Sham e Ctl. Il totale dei fasci di spermatozoi nel gruppo Exp era di 3684 ± 985; variava da 9284 a 10832 nei gruppi Ctl-Sham e Ctl. Pertanto, le percentuali di fasci di spermatozoi eupireni variavano dal 50% al 60%, senza differenze significative tra tutti e tre i gruppi. La figura 9 mostra che quando la fusione è impedita, la quantità di fasci di spermatozoi eupirene e apirene è diminuita, mentre la percentuale di fasci di spermatozoi eupirene è rimasta invariata.
Figura 9: Il numero di fasci di spermatozoi e le percentuali di fasci di spermatozoi eupireni in diversi gruppi. (A) Il numero di fasci di spermatozoi nel gruppo Exp era significativamente inferiore rispetto ai gruppi Ctl-sham e Ctl. (B) Le percentuali di fasci di spermatozoi eupirene non erano significativamente diverse tra i tre gruppi. L'asterisco indica una differenza significativa rispetto a Ctl. P < 0,05, ± media SD (n ≥5). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Dopo aver rimosso un testicolo unilaterale delle larve, il numero di fasci di spermatozoi di eupirene e apirene è stato contato per calcolare la percentuale di fasci di spermatozoi eupirene il sesto giorno dello stadio pupale. Il numero di fasci di spermatozoi di eupirene e apirene variava da 1286 a 1638 e da 720 a 850, rispettivamente, il che significa che il numero totale variava da 2006 a 2488, corrispondente a una percentuale di fascio di spermatozoi eupireni dal 63% al 65%. La figura 10 mostra che il numero di fasci di spermatozoi è diminuito significativamente dopo la rimozione unilaterale del testicolo (ridotta dal 60% al 70%), senza molta influenza sulla percentuale di fasci di spermatozoi eupireni.
Figura 10: Il numero di fasci di spermatozoi e le percentuali di fasci di spermatozoi eupireni dopo la rimozione del testicolo unilaterale. (A) Il numero di fasci di spermatozoi nelle pupe sottoposte a rimozione unilaterale del testicolo era significativamente diverso tra i tre gruppi (testicolo sinistro e destro rimossi rispettivamente nel gruppo di microchirurgia B-1 e nel gruppo di microchirurgia B-2) (B La percentuale di fasci di spermatozoi di eupirene nelle pupe sottoposte a rimozione unilaterale del testicolo non era significativamente diversa rispetto alla Ctl. L'asterisco indica una differenza significativa rispetto a Ctl. P < 0,05, Media ± SD (n ≥8). Gruppo di controllo = nessun intervento chirurgico, i testicoli si fondono naturalmente durante la fase prepupale; Gruppo Ctl-Sham = operazione non riuscita e testicoli fusi dopo microchirurgia; Exp. Group = microchirurgia eseguita per inserire una barriera fisica tra i due testicoli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Dopo aver ostruito microchirurgicamente la fusione dei testicoli in Spodoptera litura, il numero di fasci di spermatozoi è diminuito, il che ha supportato l'ipotesi che questa fusione sia benefica per la capacità riproduttiva. La manipolazione chirurgica è stata utilizzata per studiare lo sviluppo fisiologico degli insetti sin dall'inizio del 20 ° secolo. Per determinare se il nervo cranico è regolato dalla metamorfosi degli insetti, alcuni ricercatori hanno eseguito procedure come la legatura e la decapitazione su diversi insetti (tra cui Rhodnius prolixus di Hemiptera, Lymantria dispar di Lepidoptera)15,16. Il processo di decapitazione comporta la rimozione della testa con un bisturi, la disinfezione con antibiotici e la sigillatura con cera di paraffina della ferita dopo l'operazione17. Dopo l'estrazione e il trapianto delle ghiandole protoraciche di Bombyx mori, la ferita è stata sigillata con cera di paraffina18. Tuttavia, le inevitabili conseguenze di questi trattamenti convenzionali sono l'infezione e un alto tasso di mortalità, che rende difficile analizzare lo stato fisiologico durante le ultime fasi di sviluppo dell'insetto.
Pertanto, questo protocollo è stato progettato per garantire un intervento chirurgico minimamente invasivo eseguito al microscopio per ridurre al minimo la ferita. Inoltre, rispetto all'anestesia con anidride carbonica, l'anestesia congelante è più fattibile e conveniente. Il foglio di alluminio, usato come ostruzionista, è stato tagliato in una dimensione di 1 mm x 2 mm, un'area equivalente allo spazio tra i testicoli. Dopo la microchirurgia, i fili di sutura cadono con l'epidermide precoce durante la muta, consentendo alla metamorfosi e allo sviluppo di procedere normalmente. I risultati della riproduzione suggeriscono che la microchirurgia di successo non ha influenzato in modo significativo lo sviluppo degli insetti. Quando i testicoli non si fondevano, il numero di fasci di spermatozoi totali, eupirene e apirene era significativamente inferiore a quelli del gruppo Ctl. Questi risultati indicano che la capacità riproduttiva maschile è influenzata dalla fusione dei testicoli. La valutazione della qualità e della vitalità delle cellule spermatiche ha indici e metodi diversi in vari animali, tra cui lo stato acrosomiale degli spermatozoi nei mammiferi19, la motilità degli spermatozoi20, l'attività mitocondriale21, l'integrità della membrana plasmatica22 e altri marcatori23,24 . A causa dello sviluppo unico delle cellule spermatiche degli insetti, gli studi futuri devono esaminare i cambiamenti nella capacità riproduttiva (accoppiamento, incubazione25).
I passaggi critici in questo protocollo richiedono particolare attenzione per garantire risultati affidabili. Evitare lesioni ad altri tessuti è importante quando si effettuano le incisioni. In secondo luogo, la selezione del materiale barriera deve essere basata sulle sue proprietà non tossiche e sterili e sulla mancanza di confini netti. Infine, l'incisione è stata chiusa con una sutura in esecuzione e un nodo quadrato chirurgico, seguito da sigillatura nell'area chirurgica per prevenire efficacemente l'infezione postoperatoria. Le operazioni sulla struttura interna dell'insetto come il trapianto, l'estrazione e l'applicazione di farmaci possono ancora essere eseguite, seguite dalla sigillatura nell'area chirurgica.
Alti tassi di successo richiedono competenze competenti e questa tecnica presenta alcuni svantaggi. In primo luogo, non è efficiente, poiché le operazioni vengono eseguite una per una, a causa della quale la variazione individuale è inevitabile. Studi preliminari hanno dimostrato che quando si utilizzano tubi trasfusionali venosi medici, diaframmi di gomma, perline assorbenti e materiali dentali per separare i testicoli, i risultati non hanno avuto il successo previsto. Inoltre, la tecnica non ha successo quando l'ostruzionista è alla deriva. Le possibili ragioni per una diminuzione del tasso di successo chirurgico includono la barriera che scivola via quando gli insetti si muovono, si restringono, muta e riorganizzano gli organi durante la fase prepupal. In alternativa, il foglio di alluminio può essere inserito troppo vicino all'intestino lubrico, causando il galleggiamento della barriera. Pertanto, un materiale adatto dovrebbe essere ulteriormente ottimizzato.
Nonostante i limiti della microchirurgia, fornisce un metodo per ottenere risultati preliminari sui fenomeni biologici prima di stabilire un sistema modello transgenico. Sweeney e Waterson hanno analizzato lo sviluppo del rid negli embrioni di pulcino inserendo blocchi di lamina di tantalio26, mentre Wilde e Logan hanno usato il foglio di alluminio come barriera impermeabile per studiare il ruolo della segnalazione dell'acido retinoico nell'induzione e nella successiva iniziazione degli arti anteriori e posteriori27. Negli invertebrati Spodoptera litura, questa microchirurgia consente con successo la normale crescita e lo sviluppo dei vermi, fornendo un modo per studiare i fenomeni fisiologici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Nos.:31772519, 31720103916; ) e da una sovvenzione aperta dello State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (No.: sklsgb2013003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
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