Summary
アルミニウム箔は、精巣の融合を妨げるために 、Spodoptera litura の精巣の間に微小外科的に挿入された。この手順には、凍結、固定、消毒、切開、バリアの配置、縫合、術後の摂食、および検査が含まれる。このアプローチは、組織形成を妨害する方法を提供する。
Abstract
RNA干渉(RNAi)のような遺伝的方法や、規則正しく間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)/CRISPR関連エンドヌクレアーゼCas9などの遺伝的方法を使用する代わりに、物理的な障壁を Spodoptera litura の精巣間に微小外科的に挿入し、この微小手術がその成長と生殖に及ぼす影響を研究した。精巣間にアルミ箔を挿入した後、変態中の昆虫の脱皮は正常に進行した。昆虫の成長と発達は著しく変化しなかった。しかし、精巣融合が顕微手術によって停止された場合、精子束の数は変化した。この新知見は、精巣融合を遮断することが男性の生殖能力に影響を与える可能性があることを示唆している。この方法は、特定のシグナル伝達経路の機能を研究するために、器官間の通信を遮断するためにさらに適用することができる。従来の手術と比較して、マイクロサージャリーは凍結麻酔のみを必要とし、二酸化炭素麻酔よりも好ましい。マイクロサージャリーはまた、手術部位面積を最小限に抑え、創傷治癒を促進する。しかし、特定の機能を持つ材料の選択は、さらなる調査が必要です。組織損傷を避けることは、手術中に切開を行う際に重要です。
Introduction
融合は、組織または器官の発達における一般的な現象である。例としては、ショウジョウバエ1および口蓋形態形成における背部閉鎖および胸郭閉鎖、マウスおよびニワトリにおける神経管形態形成、ならびに心臓形態形成2が含まれる。CRISPRとRNAiは、融合の過程における遺伝子の役割を調べるために応用されています2,3,4。
スポドプテラ・リチュラ(S. litura, 鱗翅目: Noctuidae)は、中国を含むアジアの熱帯および亜熱帯地域に広く分布している有害な多食性害虫である4,5,6。S. lituraの広い分布は、生殖腺の発達に関連するその強力な生殖能力に部分的に起因しています。男性不妊症は、この害虫を防除するための1つのアプローチです。精巣構造の模式図に示すように、精巣は精巣鞘によって囲まれ、外鞘(腹膜鞘)および内側基底薄板を含む。基底薄層は内部に伸びて濾胞上皮を形成し、精巣の内側領域を卵胞という名前の4つのチャンバーに分離する(図1)。
卵胞では、精子は有糸分裂と減数分裂の後に精子に発達し、精子嚢内の精子は同じ方向に整列して精子束を形成します7。精子形成の間、初代精子細胞はユーピレン精子またはアピレン精子に分化する。幼虫期の精子細胞は、細長い核の頭部に接続された長い尾を有するユーピレン精子に発達する。これらは卵を受精させることができます。逆に、蛹期半ばの精子細胞は、廃棄された核を有するアピレン精子に発達する。これらの精子は、ユーピレン精子の生存、運動、受精を助ける9,10。蛹の6日目は、精巣が豊富なユーピレンとアピレンの精子束を有する期間である。
図1:鱗翅目昆虫の精巣構造の模式図11。この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
精巣融合は、鱗翅目秩序のほとんどの昆虫11,12、特に農業害虫である種において起こる。精巣融合は、幼虫期に両側に成長し、互いに接近して接着し、最終的に単一の生殖腺11に統合する一対の精巣を指す。スポドプテラ・リチュラでは、幼虫から蛹期への変態中に起こる。5齢(L5D1)の1日目から6齢(L6D4)の4日目まで、精巣のペアは徐々にサイズが大きくなり、色は象牙白色から淡黄色に変わります。蛹期(L6D5~L6D6)に達するとかすかな赤色になります。2つの両側対称精巣は、蛹準備段階で互いに接近し、1つに融合し、反時計回り(肩面図)にねじれて、蛹期と成虫期に単一の精巣を生成する11。この現象は、経済的にかなり重要であり、5000年間家畜化されてきたカイコでは発生しません13。したがって、精巣の融合は生殖能力を改善すると仮定される。
Spodoptera litura testicular fusionの重要性を決定するには、このプロセスをブロックする効果を調べることが重要です。このプロトコルでは、精巣の間にアルミニウム箔を微小外科的に挿入して分離させ、その結果として昆虫および精巣の発生の変化を研究した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 昆虫の飼育と維持管理
- スポドプテラ典礼幼虫を人工食を用いた環境シミュレーションチャンバーで、6齢(L6D4)の4日目に達するまで培養する。ワームが第6齢(L6D0)の初日に入ったときに、第8腹部の逆三角形の構造に基づいて雄幼虫を選択します14。
注:幼虫の飼育と維持技術は以前に公開されました4,14。
2. 手術前準備
- アルミ箔を角が丸みを帯びた長方形にトリミングします(1 mm x 2 mm、 図2)。
- 手術台および関連アイテム(テーブル表面、顕微鏡、アイスボックス、昆虫ボックス、ワックストレイ、ピン、糸)を、その表面に75%アルコールを噴霧し、拭き取って滅菌する。
- 手術器具(アルミ箔を含む)を高圧蒸気滅菌器で30分間滅菌し、120°Cの加熱乾燥オーブンに入れます。
- オペレータは、清潔な実験服、手術用マスク、滅菌手袋を着用してください。
3.精巣間の障壁の顕微手術的配置
注:一般的なワークフローは次のとおりです:凍結→固定→消毒→切開→バリア配置→縫合→術後の給餌および検査
- 雄の幼虫(L6D4)を氷の上に10〜30分間置き、手術中に麻酔をかけたままにします。
- 背側を上にしてワックストレイに幼虫を置き、幼虫の頭部と尾部をピンと糸で固定し、9番目の 体セグメントの背側表面である手術領域を示す(図3A)。
- 表皮に綿棒で3%ヨウ素チンキを塗布して手術領域を消毒し(9番目の 体セグメント)、続いて70%アルコールを適用してヨウ素を除去します(図3B)。
注:手術用顕微鏡の粗い微調整を通して幼虫に焦点を合わせます(図3C)。ワックストレイを氷で満たされた大きな培養皿の上に置き、麻酔を保つ。 - 第9体節の背側表皮に長さ2mmの切開を行う。次に、滅菌綿棒を使用して、漏れている血リンパ液および脂肪体を除去し、手術領域の明確な視界を得る。
注:手順中に心臓を避けることが重要です。これは、幼虫の内圧のために精巣が飛び出すのを防ぐために、第9の身体セグメントの中間線のわずかに隣り、または第9および第10の身体セグメントの間の関節で切開を行うことによって行うことができる。メスを使用しながら、まず刃で縦スリットを作り(図4A)、次に表皮に向かって45°回してから、表皮を均等かつ連続的に切断します(図4B)。 - 手術用ピンセットを使用して、精巣の間にアルミホイルを挿入します(図5)。
- 手術の終わりに、感染を避けるために切開部を閉じ、幼虫が手術から回復するのを許す。
- ランニング縫合糸で表皮を閉じます(図6)。
- ニードルホルダーと外科用ピンセットを使用して外科用正方形の結び目を結び、2つの対向する鏡像の単純な結び目が必要です(図6D、E)。
- はさみを使用してループテールから余分な縫合糸を切断し、2mmの糸を残します。
- 縫合後、幼虫を飼育箱に静かに敷き詰め、清潔な環境シミュレーションチャンバーに保管してください。幼虫を観察し続ける。
注:創傷は血リンパ液の漏れを止め、幼虫は手術後に徐々に回復する。ワームは変態を完了し続けます。
図 2: アルミ箔 (1 mm x 2 mm) を使用して作成した物理的な障壁。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:切開前 (A)幼虫を固定する。(B)手術領域の表皮の消毒。(ハ)顕微鏡下で手術を行う。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:切開 (A)幼虫を刃で垂直にスリットする。(B)切り裂く前に刃を表皮に向かって45°回します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:精巣間に物理的な障壁(アルミニウム箔)を挿入する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:縫合。 (A)針を挿入します。(B)針を抜く。(C)針を引っ込めて締め付けます。(D)最初の単純な結び目を結びます。(E)対向する鏡像の単純な結び目を結びます。(F)余分な縫合糸を切る。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
鞘翅目典礼の成長と発達に対するマイクロサージャリーの影響
マイクロサージャリーは背側幼虫表皮に長さ2mmの傷を残し、最終的に血リンパ液の漏出を止めて治癒した。幼虫は蛹前期と蛹期を経て閉鎖され、マイクロサージャリーが成長と発達に大きな影響を及ぼさなかったことを示している。幼虫が蛹に脱皮したとき、縫合糸は表皮とともに捨てられた。手術を受けた蛹と受けなかった蛹の外観に明らかな違いはなかった。開卵後、成体雌は以前に手術を受けた成体雄と交配することに成功し、受精卵および孵化幼虫をもたらした(図7)。
図7: 鞘翅目典礼 マイクロサージャリー後の発達 (A) L6D4の雄幼虫。(B)手術直後のL6D4幼虫。(C)プレパパ(L6D6)。(d)P0、赤色矢印は手術の場所を示す;黄色い矢印は、縫合糸で廃棄された表皮を示す。(E)大人を交配する。(F)手術を受けた雄と交配した雌成虫の卵および孵化した幼虫。スケール バー = 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
幼虫は蛹期を経て、精巣間にアルミニウム箔を顕微手術的に配置した後に閉鎖された。この操作後の詳細な結果は、以前に公開されています11。障壁は精巣がいくつかの幼虫で融合するのを止めたが、ほとんどの幼虫は幼虫から蛹への変態の間に精巣融合を受けた。
この研究では、個人を3つの治療によってグループ化した:実験的(Exp)、偽手術(Ctl-sham)、および無手術(Ctl)。Expグループの個体は、物理的障壁を挿入するためにマイクロサージャリーを受け、蛹期および成人期に精巣は分離されたままであった。Ctl-sham群の個体は、同じマイクロサージャリーを受けた。しかし、彼らの精巣はブロックされず、未知の理由で融合した。Ctl群には、手術なしで自然に成長した幼虫が含まれていました。彼らの2つの精巣は、蛹準備段階で正常に融合した。
マイクロサージャリー群には、2つの精巣の間に障壁を設けるためにマイクロサージャリーを受けた幼虫(グループA)と、1つの精巣を除去するためにマイクロサージャリーを受けた幼虫(グループB:グループB-1で左精巣が除去され、グループB-2で右精巣が除去された)の2つのサブグループが含まれていた。 表1 は、異なるグループにおける手術幼虫の数、幼虫死亡率、蛹の数、蛹化の割合、成虫の数、成虫の出現の割合、交配の成功の割合、および手術の成功の割合を示す。グループAには、精巣間に障壁を挿入するためにマイクロ手術を受けた幼虫が含まれる。この手順の成功は、解剖後にのみ決定することができ、それは彼らがさらにExpグループとCtl-shamグループに分けられたときです。
図8に示すように、幼虫死亡率は手術群でわずかに高かったが、蛹化、成虫出現、交配成功の割合は対照群よりも手術群でわずかに低かった。しかし、いずれの差異も有意に異なっておらず、マイクロサージャリーがスポドプテラ・リチュラ幼虫の成長および発達に著しく影響しなかったことを示している。
| 群 | 幼虫の数 | 幼虫死亡率/% | 蛹の数 | 蛹化の割合/% | 大人の人数 | 成人の出現率/% | 交配成功率/% | 成功した操作の割合/% | |||||
| マイクロサージャリーグループA-1* | 79 | 35.4 | 39 | 76.5 | N | N | N | 10.3 | |||||
| マイクロサージャリーグループA-2* | 117 | 12.8 | 102 | 100 | N | N | N | 11.8 | |||||
| マイクロサージャリーグループA-3* | 73 | 13.7 | 57 | 90.5 | N | N | N | 10.5 | |||||
| マイクロサージャリーグループA-4 | 101 | 4 | 97 | 96 | 29 | 29.9 | N | 26.9 | |||||
| マイクロサージャリーグループA-5 | 176 | 20.1 | 140 | 79.5 | 28 | 20 | 44.4 | 25 | |||||
| マイクロサージャリーグループA-6 | 434 | 12.4 | 376 | 98.9 | 209 | 55.6 | 26.8 | 14.3 | |||||
| マイクロサージャリーグループA-7 | 260 | 10.8 | 135 | 58.2 | 66 | 48.9 | 47 | 48.4 | |||||
| マイクロサージャリーグループA-8 | 49 | 24.5 | 37 | 100 | 21 | 56.8 | 81 | 58.8 | |||||
| マイクロサージャリーグループB-1 | 117 | 29.1 | 71 | 85.5 | 30 | 42.3 | 23.3 | N | |||||
| マイクロサージャリーグループB-2 | 188 | 6.9 | 172 | 98.3 | 115 | 66.9 | 35.7 | N | |||||
| マイクロサージャリー群の平均(平均±SD) | 159 | 17±10月1日 | 123 | 88.3±13.7 | 71 | 45.8±16.3 | 43±20.8 | 25.8±18.5 | |||||
| 制御グループ 1* | 40 | 17 | 37 | 100 | N | N | N | N | |||||
| 制御グループ 2 | 300 | 0 | 281 | 93.7 | 184 | 65.5 | N | N | |||||
| 制御グループ 3 | 354 | 11 | 305 | 96.8 | 127 | 41.6 | N | N | |||||
| 制御グループ 4 | 679 | 2.7 | 638 | 96.5 | 534 | 83.7 | 41.2 | N | |||||
| 制御グループ 5 | 448 | 4.2 | 399 | 93 | 232 | 58.1 | 60 | N | |||||
| 制御グループ 6 | 490 | 7.1 | 448 | 98.5 | 355 | 79.2 | 48 | N | |||||
| 対照群の平均(平均±SD) | 385 | 5.4±6.2 | 351 | 96.4±2.7 | 286 | 65.6±15.1 | 50±9.5 | N | |||||
表1: スポドプテラ典礼 の発達 に対するマイクロサージャリーの影響。マイクロサージャリーグループB-1およびB-2は、片側精巣を除去するためのマイクロサージャリーを受けた(マイクロサージャリーグループB-1で左、マイクロサージャリーグループB-2で右)。注:マイクロサージャリーグループA-1〜A-8は、精巣間に障壁を挿入するためにマイクロサージャリーを受けた。マイクロサージャリーグループB-1およびB-2は、片側精巣を除去するためのマイクロサージャリーを受けた(マイクロサージャリーグループB-1の左およびマイクロサージャリーグループB-2の右)。アスタリスクは±、グループ内の個体が蛹の段階で解剖され、成虫の数、成虫の出現の割合、または交配の成功率に関する統計がなかったことを示す。N はデータがないことを示します。
図8:(n≥6)のスポドプテラ典礼の成長と発達に対するマイクロサージャリーの影響。この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。
スポドプテラ典礼の精子束の数に対するマイクロサージャリーの影響
精巣融合を止めるか、または スポドプテラ・リチュラ の片側精巣を除去するための物理的障壁を挿入するためにマイクロサージャリーが行われた。ユーピレンおよびアピレン精子束を計数し、蛹期の6日目にユーピレン精子束の割合を算出した。個体を、上述のように処置によってグループ化した。精子束の数(ユーピレン精子束、アピレン精子束、および合計)は、Ctl-sham群およびCtl群よりもExp群で有意に低かった。Exp群の2つの分離精巣からのユーピレン精子束の平均数は2082±599であった。融合精巣を有するCtl-sham群およびCtl群では、ユーピレン精子束の数は4652から6200の範囲であった。
Exp群のアピレン精子束の数は1602±703であったが、Ctl-Sham群とCtl群では3299から4632の範囲であった。Expグループの精子束の合計は3684±985であった。それはCtl-ShamとCtlグループで9284から10832の範囲でした。したがって、ユーピレン精子束の割合は50%〜60%の範囲であり、3つの群すべてに有意差はなかった。 図9 は、融合が防止された場合、ユーピレンとアピレンの精子束の量が減少したのに対し、ユーピレンの精子束の割合は変化しなかったことを示している。
図9:異なる群における精子束の数およびユーピレン精子束の割合 。 (A)Exp群の精子束の数は、Ctl-sham群およびCtl群よりも有意に少なかった。(b)ユーピレン精子束の割合は、3群間で有意差はなかった。アスタリスクは、Ctl. P<0.05、平均±SD(n≥5)と比較した場合に有意差を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
幼虫の片側精巣を除去した後、ユーピレンおよびアピレン精子束の数を数え、蛹期の6日目にユーピレン精子束の割合を算出した。ユーピレンおよびアピレン精子束の数は、それぞれ1286〜1638および720〜850の範囲であり、これは、総数が2006〜2488の範囲であり、63%〜65%のユーピレン精子束の割合に対応する。 図10 は、精子束の数が片側精巣除去後に有意に減少した(60%〜70%減少)が、ユーピレン精子束の割合にあまり影響を及ぼさなかったことを示す。
(A)片側精巣摘出を受けた蛹の精子束の数とユーピレン精子束の割合は、3群で有意に異なっていた(それぞれ顕微手術群B-1と顕微手術群B-2で精巣を摘出した左と右の精巣)(B一方的な精巣除去を受けた蛹中のユーピレン精子束の割合は、Ctlと比較して有意に異ならなかった。アスタリスクは、Ctl. P<0.05、平均±SD(n≥8)と比較して有意差を示す。対照群=手術なし、精巣は蛹前段階で自然に融合した。Ctl-Sham群=手術が失敗し、精巣はマイクロ手術後に融合した。Exp. Group = 2つの精巣の間に物理的な障壁を挿入するために行われるマイクロサージャリー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spodoptera lituraの精巣融合を微小外科的に妨害した後、精子束の数は減少し、この融合が生殖能力に有益であるという仮説を支持した。外科的操作は、20世紀初頭以来、昆虫の生理学的発達を研究するために使用されてきた。脳神経が昆虫の変態によって調節されているかどうかを判断するために、一部の研究者は、異なる昆虫(半翅目のロドニウス・プロリクサス、鱗翅目のリマントリア・ディスパーを含む)に対して結紮および断頭などの処置を行った15,16。斬首のプロセスには、メスで頭部を除去し、抗生物質で消毒し、手術後に創傷をパラフィンワックスで密封することが含まれる17。ボンビックスモリの胸部腺の抽出および移植後、創傷をパラフィンワックス18で密封した。しかし、これらの従来の治療の必然的な結果は感染と高い死亡率であり、昆虫の発生後期段階での生理学的状態を分析することは困難である。
したがって、このプロトコルは、創傷を最小限に抑えるために顕微鏡下で行われる低侵襲手術を保証するように設計されました。さらに、二酸化炭素麻酔と比較して、凍結麻酔はより実現可能で便利である。閉塞器として用いたアルミ箔を、精巣間の空間に相当する面積である1mm×2mmの大きさに切断した。マイクロサージャリーの後、縫合糸は脱皮中に初期の表皮とともに脱落し、変態および発達が正常に進行することを可能にする。再現結果は、マイクロサージャリーの成功が昆虫の発生に有意に影響を及ぼさなかったことを示唆している。精巣が融合しなかったとき、総精子束、ユーピレン精子束、およびアピレン精子束の数は、Ctl群の精子束の数よりも有意に低かった。これらの結果は、男性の生殖能力が精巣融合の影響を受けていることを示している。精子細胞の質と活力の評価は、哺乳類の精子アクロソーム状態19、精子運動性20、ミトコンドリア活性21、原形質膜完全性22、および他のマーカー23,24を含む、様々な動物において異なる指標および方法を有する。昆虫のユニークな精子細胞の発生のため、今後の研究では生殖能力の変化を調べる必要があります(交配、インキュベーション25)。
このプロトコルの重要な手順では、信頼性の高い結果を得るために特に注意が必要です。切開を行う際には、他の組織への傷害の回避が重要である。第二に、バリア材料の選択は、その無毒で無菌な特性および鋭い境界の欠如に基づいていなければならない。最後に、切開部をランニング縫合糸および外科用正方形の結び目で閉じ、続いて手術後の感染を効果的に予防するために手術領域を密封した。移植、抽出、および薬物の適用などの昆虫の内部構造に対する手術は、依然として実行することができ、続いて手術領域でシーリングすることができる。
高い成功率には熟練したスキルが必要であり、この手法にはいくつかの欠点があります。まず、操作が1つずつ行われるため、個人差が避けられないため、効率的ではありません。予備的研究は、医療用静脈輸血チューブ、ゴム製ダイヤフラム、吸収ビーズ、および歯科材料を使用して精巣を分離した場合、結果は期待したほど成功しなかったことを示した。さらに、障害物が漂っているとき、この技術は成功しません。外科的成功率の低下の考えられる理由には、昆虫が蛹準備段階で移動、縮小、脱皮、および再編成されたときに障壁が滑り落ちることが含まれる。あるいは、アルミニウム箔を潤滑性の腸に近すぎるように挿入して、障壁を浮遊させる可能性があります。したがって、適切な材料をさらに最適化する必要があります。
マイクロサージャリーの制限にもかかわらず、トランスジェニックモデルシステムを確立する前に、生命現象に関する予備的な結果を得る方法を提供する。スウィーニーとウォーターソンは、タンタル箔ブロック26を挿入してひよこの胚の発育を分析し、ワイルドとローガンはアルミニウム箔を不透過性の障壁として使用して、前肢と後肢の誘導とその後の開始におけるレチノイン酸シグナル伝達の役割を研究しました27。無脊椎動物の スポドプテラ・リチュラでは、このマイクロサージャリーが正常なワームの成長と発達を可能にし、生理現象を研究する方法を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(Nos.:31772519、31720103916;)と、南西大学カイコゲノム生物学国家キーラボラトリー(No.:sklsgb2013003)からの公開助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. Physiological systems in insects. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam, NL; Boston, MA. (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and 'metamorphosis' in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).
